專利名稱：一種新型高活性乳酸菌制品的制備方法
(一)技術(shù)領(lǐng)域 本發(fā)明涉及一種新的用于微生物轉(zhuǎn)化亞油酸生成共軛亞油酸的乳桿菌屬(Lactobacillus)的植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum HSC 235)，以及利用該乳酸菌發(fā)酵生產(chǎn)高活性乳酸菌制品的方法。
背景技術(shù)：
目前，利用微生態(tài)理論研制的益生素應(yīng)用較廣的是乳酸菌類益生素，產(chǎn)品劑型有口服糊狀劑、水溶性粉劑、液劑等。微生態(tài)制劑的功效己被公認(rèn)，它通過抑制腸道內(nèi)有害菌群，促進(jìn)有益菌群的增殖，消除腸內(nèi)毒素和增強(qiáng)免疫系統(tǒng)來預(yù)防腸道疾病，從而改善腸道內(nèi)微生態(tài)的平衡。它既無毒、無副作用、無殘留、無抗藥性，同時(shí)也不會(huì)污染環(huán)境，在食品、醫(yī)藥、飼料添加劑等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。
周德慶(我國微生態(tài)制劑的現(xiàn)狀和發(fā)展設(shè)想.工業(yè)微生物，1999，134～43)當(dāng)今以腸道微生態(tài)制劑為代表的益生菌制品，主要選用以下3類細(xì)菌。
(1)嚴(yán)格厭氧的雙歧桿菌屬據(jù)最新報(bào)道，該屬現(xiàn)有32個(gè)種，其中已被應(yīng)用于制造腸道微生態(tài)制劑者主要有5種，即長雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌、青春雙歧桿菌、兩叉雙歧桿菌和短雙歧桿菌。(2)一般厭氧即耐氧的乳桿菌屬至今已報(bào)道的有56種。常用于腸道微生態(tài)制劑中的約有10種，如嗜酸乳桿菌(L.acidophilus)、植物乳桿菌、短乳桿菌(L.brevis)、干酪乳桿菌(L.casei)和德氏乳桿菌保加利亞亞種(L.delbrueckii subsp.bulgaricus，舊稱“保加利亞乳桿菌”)等。(3)若干兼性厭氧球菌如屬于腸球菌屬(Enterococcus)中的糞腸球菌和屎腸球菌(E.faecium，舊稱“屎鏈球菌”)等；屬于乳球菌屬(Lactococcus)的乳酸乳球菌乳亞種(L.lactis subsp.lactis，舊稱“乳鏈球菌”)和乳酸乳球菌乳脂亞種(L.lactis subsp.cremoris，舊稱“酪鏈球菌”)等；以及屬于鏈球菌屬(S.treptococcus)的唾液鏈球菌嗜熱亞種(S.salivarius subsp.thermophilus，舊稱“嗜熱鏈球菌”)和中間鏈球菌(S.intermedius)等。
日本及歐美用于酸奶及益生菌劑的乳酸菌種主要是一些來自人體的乳酸菌種和雙歧桿菌如嗜酸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、羅氏乳桿菌、植物乳桿菌、酪乳桿菌、詹氏乳酸桿菌、短雙歧桿菌、長雙歧桿菌及雙歧雙歧桿菌及乳酸腸球菌等。還有酵母菌也是一頗愛注目的益生菌，酵母菌因不受一般抗生素的影響幫可與抗生素同時(shí)使用，其它優(yōu)點(diǎn)是耐酸、耐熱性較強(qiáng)，也學(xué)被膽汁殺死，在厭氧好氧環(huán)境均可生存，對(duì)于制造和貯存有利。日體還使用酪酸梭狀芽孢桿菌(Cl.butyricum)作為益生菌藥劑以治療腸道感染和腸功能異常。其芽孢耐熱耐酸性強(qiáng)，攝入后在腸道發(fā)芽增殖，1-2天后糞便中可檢出該菌，經(jīng)3-5天后完全消失。日本現(xiàn)有224種特定保健食品中有150種是整腸類保健品。主要是乳酸菌中的雙歧桿菌及相關(guān)因子(如低聚糖、菇類提取物、乳酮糖等)的復(fù)合。(胡學(xué)智，國外微生態(tài)制劑的研究與市場概況。工業(yè)微生物，2002，356-61)藥用乳酸菌活菌制劑在臨床上的應(yīng)用，目前主要用于防治腹瀉、腸炎、痢疾、肝炎、肝硬化、陰道炎、便秘、消化道功能紊亂、降血脂、皮膚病和泌尿系統(tǒng)疾病等。能作為藥用的雙歧桿菌主要有短雙歧桿菌、長雙歧桿菌、兩歧雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌和青春雙歧桿菌等?？扇胨幍娜樗釛U菌主要有嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌、短乳桿菌、植物乳桿菌等。可作藥用的腸球菌主要有糞腸球菌、屎腸球菌。
彭開松等報(bào)道(水產(chǎn)有益微生物的研究與應(yīng)用。世界農(nóng)業(yè)，2004，1151-53)認(rèn)為國內(nèi)獨(dú)立開發(fā)的主要是一些單一菌株如光合細(xì)菌，芽孢桿菌，蛭弧菌等；復(fù)合制劑主要是仿制或引進(jìn)國外的商品。
楊汝德等(用微型包囊法研制新型高效微生態(tài)活菌制劑，廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào)2003，287-90)采用流化床技術(shù)與噴嘴結(jié)合的微型包囊法，將3種雙歧桿菌、高效活菌保護(hù)劑和雙歧促生因子一起作為核心物質(zhì)，包封于無毒囊材中制成耐酸腸溶微囊(或微球)。微囊在人工模擬胃液(pH 1.5～2.0)中處理4h，其中的雙歧桿菌活菌數(shù)仍保持在44％以上；在人工腸液中處理12min，微囊全部崩解釋放出活性菌，在37℃下保存3個(gè)月(相當(dāng)于常溫下1年以上)，其中的活菌數(shù)仍大于109個(gè)/g。有效地解決了胃酸、消化酶和抗生素等對(duì)活性雙歧桿菌的滅活和產(chǎn)品常溫保存期短的問題。
劉景圣等(嗜酸乳桿菌和雙歧桿菌腸溶活菌制劑的研究，中國乳品工業(yè)，2003，114-16)對(duì)雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌進(jìn)行最適pH值流加中和培養(yǎng)，真空冷凍干燥處理后，利用相應(yīng)的機(jī)械設(shè)備及特殊的工藝處理，研制出雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌的腸溶軟膠囊、腸溶硬膠囊和普通硬膠囊等系列活菌制劑。并且對(duì)這些制劑進(jìn)行了物理性狀、胃腸崩解、模擬胃腸綜合試驗(yàn)，以及常溫保存試驗(yàn)等分析檢測，對(duì)上述各種制劑的特性及性能指標(biāo)作出了客觀評(píng)價(jià)。
陳鐵濤等[兩歧雙歧桿菌與嗜酸乳桿菌微生態(tài)制劑的工業(yè)化生產(chǎn)工藝研究，中國乳品工業(yè)，2002，30(5)]研究了兩歧雙歧桿菌與嗜酸乳桿菌微生態(tài)制劑的工業(yè)化生產(chǎn)工藝。對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件進(jìn)行了研究與優(yōu)化，并確定了發(fā)酵奶冷凍干燥工藝條件。產(chǎn)品中兩歧雙歧桿菌與嗜的活菌數(shù)達(dá)到109-1010/g。
微生態(tài)制劑不僅在在食品保健品中具有廣闊的使用，作為一種飼料添加劑有養(yǎng)殖行業(yè)也有相當(dāng)廣泛的應(yīng)用價(jià)值。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，長期使用抗生素作飼料添加劑，給畜牧業(yè)生產(chǎn)、人類健康和環(huán)境等都帶來許多嚴(yán)重的問題①破壞畜禽腸道的微生態(tài)平衡；②導(dǎo)致某些細(xì)菌產(chǎn)生抗藥性，危害人畜；③抗生素的化學(xué)殘留，威脅著人類健康。利用微生態(tài)理論研制的益生素，即畜禽用微生態(tài)制劑，是一種含活性微生物的飼料添加劑。它既無毒、無副作用、無殘留、無抗藥性，同時(shí)也不會(huì)污染環(huán)境，具有廣闊的應(yīng)用前景。目前，研究較多，應(yīng)用較廣的是乳酸菌類益生素，產(chǎn)品劑型有口服糊狀劑、水溶性粉劑、液劑等。畜禽用微生態(tài)制劑的功效己被公認(rèn)，它通過抑制畜禽腸道內(nèi)有害菌群，促進(jìn)有益菌群的增殖，消除腸內(nèi)毒素和增強(qiáng)免疫系統(tǒng)來預(yù)防腸道疾病，從而改善腸道內(nèi)微生態(tài)的平衡，達(dá)到提高畜禽生產(chǎn)性能的目的。
共軛亞油酸具有可促進(jìn)人體內(nèi)脂肪細(xì)胞蓄積的脂肪和蛋白質(zhì)，碳水化合物等輸送到肌肉、締合組織、內(nèi)臟等運(yùn)動(dòng)組織細(xì)胞內(nèi)，保持能量，調(diào)整新陳代謝功能等。具有抗氧化，抑制產(chǎn)生前列腺素E2，阻礙蛋白激酶C活化等功能(糧食與油脂，1999，153-54)。吳冀華，裘愛泳(共軛亞油酸的生理功能，中國油脂，2001，645-47)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，共軛亞油酸是一種很強(qiáng)的抗癌物質(zhì)，具有抗動(dòng)脈粥樣化形成、抗糖尿病、抗過敏、調(diào)節(jié)免疫、促進(jìn)生長、降低身體脂肪并增加瘦肉量及影響骨骼形成等生理功能。
林淑英等(中國油脂，2003，1155-57共軛亞油酸在食品工業(yè)中的應(yīng)用前景)認(rèn)為作為抗癌保健食品，CLA是一種有潛力的抗癌藥。一個(gè)70kg的人每天可能需要攝入約115～310g CLA才能降低腫瘤的發(fā)病率；作為減肥食品添加劑，人體不能合成CLA，必須從食物中獲得，反芻動(dòng)物產(chǎn)品如牛奶、奶酪及肉是CLA的主要來源。在歐美國家，特別是美國已將CLA作為運(yùn)動(dòng)食品和營養(yǎng)輔助保健食品原料，面向鍛煉身體和吸氧健身運(yùn)動(dòng)的人員銷售。若食品中添加約0.1％～0.5％的CLA，因其可進(jìn)入細(xì)胞的磷脂黏膜，使?fàn)I養(yǎng)從脂肪細(xì)胞反復(fù)運(yùn)輸?shù)竭\(yùn)動(dòng)組織細(xì)胞內(nèi)，這樣使希望減少體內(nèi)脂肪的人在進(jìn)行步行等運(yùn)動(dòng)時(shí)，不僅能減少體內(nèi)脂肪，促進(jìn)代謝，同時(shí)提高肌肉張力，使肌肉更加發(fā)達(dá)；CLA為新型的食品防腐劑。有研究認(rèn)為CLA的鈉鹽、鉀鹽可以抑制霉菌的生長，且無毒副作用，性質(zhì)相對(duì)比較穩(wěn)定，無使用上的限制，可用于食品、化妝品等行業(yè)，可作為苯甲酸的替代品。既可達(dá)到防腐抑菌的作用，又可起到良好的保健作用，這正可迎合消費(fèi)者對(duì)于無毒無害的天然防腐劑的需求。
沈繼紅等(微囊化共軛亞油酸的研究，高技術(shù)通訊，2002，497-99)利用噴霧干燥技術(shù)，使共軛亞油酸微囊化。對(duì)于不同的包埋劑和共軛亞油酸配比對(duì)微囊化產(chǎn)品質(zhì)量的影響，以及產(chǎn)品的熱穩(wěn)定性和溶出度進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，合適的共軛亞油酸和包埋劑配比，能降低產(chǎn)品的表面油；在最佳酸方共軛亞油酸∶包埋劑I∶包埋劑II＝6∶7∶4時(shí)，產(chǎn)品的抗氧化性優(yōu)于原料共軛亞油酸，溶出度也符合藥典要求。
呂桂善等研究了共軛亞油酸在液態(tài)乳制品中的應(yīng)用研究(廣州食品工業(yè)科技，Vol.20No.315-17)。在液態(tài)乳制品中添加不同含量的共軛亞油酸(Conjugated linoleic Acid，CLA)及不同的CLA產(chǎn)品形式(CLA，CLA乙酯，CLA甘油三酯)后對(duì)產(chǎn)品感官品質(zhì)(可接受度)的影響，并對(duì)CLA的貯藏穩(wěn)定性進(jìn)行了研究。研究結(jié)果表明，當(dāng)CLA的添加量超過1‰時(shí)，產(chǎn)品即有一種CLA特有的澀味，比較難以讓人接受；當(dāng)使用CLA甘油三酯時(shí)，對(duì)產(chǎn)品的感官品質(zhì)沒有影響，反而使得產(chǎn)品更加滑爽，脂肪香味更濃；CLA甘油三酯在貯藏過程中具有良好的穩(wěn)定性。
由上述文獻(xiàn)資料可見，具有較高轉(zhuǎn)化亞油酸生成共軛亞油酸活性的乳酸菌粉作為一種新型微生態(tài)活菌制劑的研究開發(fā)與制備尚未見有報(bào)道。以此高轉(zhuǎn)化活性的新型乳酸菌微生態(tài)活菌制劑再與其它成分復(fù)配后，可制得復(fù)合高效的微生態(tài)制劑，在食品、醫(yī)藥及微生態(tài)飼料工業(yè)將有十分廣泛應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的任務(wù)是提供一種能有效轉(zhuǎn)化亞油酸為共軛亞油酸的微生物菌株，以及提供一種利用該新的微生物發(fā)酵生產(chǎn)高活性乳酸菌制品的方法。
本發(fā)明的能有效轉(zhuǎn)化亞油酸為共軛亞油酸的新的微生物菌株，是乳桿菌屬(Lactobacillus)的植物乳桿菌一個(gè)種HSC235(Lactobacillusplantarum HSC 235)，此菌株是從天然發(fā)酵的蔬菜中采用MRS乳酸菌培養(yǎng)分離篩選得到。
此菌株己于2004年7月16日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，簡稱CCTCC，保存號(hào)CCTCC No.M204051。
此菌株的細(xì)菌學(xué)特征如下(1)形態(tài)1)細(xì)桿狀，直徑0.5微米～0.8微米，長1微米～5微米；2)在培養(yǎng)初始階段，細(xì)胞呈長桿狀；3)運(yùn)動(dòng)性不運(yùn)動(dòng)；4)孢子形成不形成孢子；5)革蘭氏染色陽性；6)耐酸性陽性。
(2)在各種培養(yǎng)基上生長狀態(tài)(30℃)1)MRS瓊脂平板培養(yǎng)基生長不良，菌落呈圓形，不規(guī)則，表面光滑，乳白色；2)MRS瓊脂斜面培養(yǎng)基生長不良，無光澤，乳白色；3)MRS液體培養(yǎng)基生長良好，液體混濁，有沉淀。
(3)生理特征1)木糖+2)海藻糖+3)蔗糖+4)山梨醇+
5)水楊苷+6)核糖+7)鼠李糖-8)棉子糖+9)密二糖+10)甘露糖+11)甘露醇+12)麥芽糖+13)乳糖+14)葡萄糖酸鹽+15)半乳糖+16)果糖+17)七葉靈+18)纖維二糖+19)阿拉伯糖+20)苦杏仁苷+21)乳酸旋光性DL22)接觸酶-23)產(chǎn)吲哚能力-24)分解酪素-根據(jù)以上細(xì)菌學(xué)特征，以及此菌株HSC235培養(yǎng)物基于其對(duì)底物的利用情況可確定為植物乳桿菌Lactobacillus plantarum。
該菌種在MRS培養(yǎng)基上保藏，通常所用的培養(yǎng)基含有碳源(例如葡萄糖、乳糖、乳清)，氮源(如)，有機(jī)營養(yǎng)物質(zhì)(如酵母抽提物，蛋白胨，胰白胨，植物蛋白胨，牛肉膏，玉米漿)，無機(jī)營養(yǎng)成分(如磷酸鹽、鎂、鉀、鋅、鐵、鈷和錳)，及作為誘導(dǎo)物質(zhì)的亞油酸，或者含亞油酸的其它物質(zhì)，或者亞油酸結(jié)構(gòu)類似物等。在20℃～40℃培養(yǎng)溫度下均能生長，最適的生長溫度為28℃～37℃。培養(yǎng)條件pH值4.0～7.0，最適的生長pH值為6.0～6.6。該菌種在含明亞油酸的MRS培養(yǎng)基上厭氧條件下培養(yǎng)1天～3天，所得細(xì)胞具有轉(zhuǎn)化亞油酸及亞油酸類物質(zhì)為共扼亞油酸的能力。
本發(fā)明制備高活性乳酸菌制品的方法，包括(1)將菌株CCTCC No.M204051進(jìn)行常規(guī)斜面培養(yǎng)活化和種子培養(yǎng)；(2)配制發(fā)酵培養(yǎng)基，并經(jīng)滅菌后接菌種，發(fā)酵培養(yǎng)基配方，各組分的含量均為重量體積百分比，即g/L酵母提取物5.0-15.0蛋白胨10.0-30.0氯化鈉8.5葡萄糖20.0-30.0亞油酸8-30微量元素適量吐溫801ml/L～5ml/L其余為水；(3)發(fā)酵工藝a.接種子液，接種量為發(fā)酵培養(yǎng)基溶液的5％～15％(v/v，等單位體積之比)，種子液的光密度(OD值)為1～3；b.發(fā)酵過程中，長菌溫度為28℃～30℃，時(shí)間為60h～66h；c.采取慢速加糖方式，加糖量為100g-350g(發(fā)總發(fā)酵液體積10升計(jì))，且在接種后6h開始，在48h內(nèi)加完；d.上述發(fā)酵培養(yǎng)基中亞油酸一般不能直接加入，而經(jīng)與其它分散劑混合后才能加入，且控制發(fā)酵液中亞油酸的濃度，采用緩慢加入的方式；e.發(fā)酵過程中采用添加氫氧化鈉和鹽酸自動(dòng)平衡調(diào)節(jié)pH值，使pH值維持在6.0～6.6之間；(4)菌泥收集和干燥發(fā)酵結(jié)束，發(fā)酵液通過高速冷凍離心機(jī)用去離子無菌水洗滌三次(7000轉(zhuǎn)/分，20min，4℃)，離心收集細(xì)胞，加保護(hù)劑，真空冷凍干燥，即得活菌粉。
本發(fā)明發(fā)酵培養(yǎng)基中微量元素為無水醋酸鈉5g，MgSO4·7H2O 0.2g，MnSO4·H2O 0.05g，檸檬酸二銨2g，CoCl20.002g。
本發(fā)明設(shè)計(jì)了酶誘導(dǎo)物的提供方式，一定濃度的亞油酸對(duì)于細(xì)菌的生長具有抑制作用，而且亞油酸在發(fā)酵培養(yǎng)基的溶解性較小，因此將亞油酸溶解或包埋在環(huán)糊精、淀粉、牛血清蛋白-卵磷脂、牛血清蛋白、卵磷脂、甘油、單甘脂物質(zhì)之一中，再行添加。其添加方式為發(fā)酵液中亞油酸初始濃度誘導(dǎo)濃度控制在0.4g/L以內(nèi)，在接種培養(yǎng)12h后再間歇補(bǔ)加，48h內(nèi)加完。
發(fā)酵結(jié)束，經(jīng)分離、收集、干燥，制得的凍干制品即活菌粉中活菌數(shù)可達(dá)1010個(gè)/g。菌體轉(zhuǎn)化亞油酸生成共軛亞油酸的轉(zhuǎn)化率可達(dá)42.7％。乳酸菌活菌計(jì)數(shù)按GB/T 4789.35-2003規(guī)定測定，共軛亞油酸采用氣相色譜法(GC)和紫外分光光度法測定(吳冀華，裘愛泳，氣相色譜法分析共軛亞油酸異構(gòu)體，中國油脂，2002，2765-67；Shigenobu Kishino，Jun Ogawa.Conjugated Linoleic Acid Production from Linoleic Acid by Lactic AcidBacteria.Journal of American Oil Chemistry Society.2002，79159-163；JohnAG，Roach M，Mossoba M.Chromatographic separation and identification ofconjugated linoleic acid isomers.Analytica Chimica Acia，2002，465207-226；張亞剛，樊莉等，紫外可見分光光度法在共軛亞油酸定量分析中的應(yīng)用，新疆石油學(xué)院學(xué)報(bào)，2002，1459-64)。
本發(fā)明具有如下特點(diǎn)采用本發(fā)明的菌株HSC235，菌體得率高，菌體OD值在2～6.3，所得菌粉活菌數(shù)可達(dá)1010個(gè)/g；所得菌體具有轉(zhuǎn)化亞油酸生成共軛亞油酸的能力；亞油酸采用促溶劑進(jìn)行保護(hù)溶解，降低其對(duì)細(xì)胞生長的抑制作用，另一方面增強(qiáng)了其誘導(dǎo)作用，提高了轉(zhuǎn)化率，其對(duì)亞油酸的轉(zhuǎn)化率可達(dá)17％～42.7％(底物質(zhì)量轉(zhuǎn)化率)；且發(fā)酵溫度低，降低了能耗，節(jié)省成本。采用本發(fā)明所得乳酸菌粉可作為益生菌在食品、生物飼料等方面使用，以提高突宿主體內(nèi)共軛亞油酸的含量。
(四)具體實(shí)施方案下面實(shí)施例旨在舉例說明而不是限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1菌種保藏培養(yǎng)基MRS培養(yǎng)基成分(以制備1L為計(jì)量)胰蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母浸出物5g，葡萄糖20g，吐溫80 1ml，K2HPO42g，無水醋酸鈉5g，MgSO4·7H2O 0.2g，MnSO4·H2O 0.05g，檸檬酸二銨2g。(pH＝6.0～6.2)，用蒸餾水配制，121℃濕熱滅菌20分鐘；種子培養(yǎng)基同菌種保藏培養(yǎng)基；種子液的制備經(jīng)上述斜面培養(yǎng)基活化的菌種CCTCC No.M204051，接入種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度37℃，搖床轉(zhuǎn)速120rpm，培養(yǎng)時(shí)間1天，獲得種子培養(yǎng)液，種子培養(yǎng)液中菌體密度OD值控制在1～3之間。
發(fā)酵培養(yǎng)基(以制備1L為計(jì)量，若制備10L發(fā)酵培養(yǎng)基，則相應(yīng)的組分量也增加10倍，在以下實(shí)施例中也以此類推)酵母提取物5g，蛋白胨10g，氯化鈉8.5g，葡萄糖20g，亞油酸8g，無水醋酸鈉5g，MgSO4·7H2O0.2g，MnSO4·H2O 0.05g，檸檬酸二銨2g，CoCl20.002g，吐溫-80 1ml，其余為水，pH6.5，滅菌備用。
酶誘導(dǎo)物(亞油酸)的提供方式將發(fā)酵培養(yǎng)基中的亞油酸溶解或包埋在環(huán)糊精中添加入發(fā)酵液中，發(fā)酵液中亞油酸初始濃度誘導(dǎo)濃度控制在0.2g/L；其余在發(fā)酵過程中添加入發(fā)酵液中，即在接種子液培養(yǎng)發(fā)酵12h后，剩余的溶解或包埋在環(huán)糊精中的亞油酸量，分三次間歇補(bǔ)加入發(fā)酵液中，48h內(nèi)加完，發(fā)酵液中亞油酸的總加入量為8g/L。
發(fā)酵工藝按上述配方配制10L發(fā)酵液于發(fā)酵罐中，經(jīng)滅菌后接種子培養(yǎng)液，菌種的接種量為培養(yǎng)基溶液的5％，即500mL，光密度(OD值)為1；將10L發(fā)酵培養(yǎng)基所需的亞油酸溶解或包埋在環(huán)糊精中，添加入發(fā)酵液中，控制發(fā)酵液中亞油酸初始濃度誘導(dǎo)濃度為0.2g/L；剩余的亞油酸在發(fā)酵過程中再添加入發(fā)酵液中；用氫氧化鈉來調(diào)節(jié)pH6.0，開始培養(yǎng)發(fā)酵；在開始培養(yǎng)發(fā)酵6h后把葡萄糖100g(首先配制成30％的溶液消毒)慢速加入發(fā)酵罐，在48h內(nèi)加完；在接種子液培養(yǎng)發(fā)酵12h后，將剩余的溶解或包埋在環(huán)糊精中的亞油酸量，分三次間歇補(bǔ)加入發(fā)酵液中，48h內(nèi)加完，發(fā)酵液中亞油酸的總加入量為8g/L；繼續(xù)發(fā)酵，總時(shí)間為60h，整個(gè)發(fā)酵過程中長菌培養(yǎng)及誘導(dǎo)溫度控制在30℃左右；發(fā)酵過程中采用氫氧化鈉和鹽酸調(diào)節(jié)pH，使發(fā)酵過程中的pH值維持在6.0～6.6之間。
菌泥收集和干燥發(fā)酵結(jié)束，發(fā)酵液通過高速冷凍離心機(jī)用去離子無菌水洗滌三次(7000轉(zhuǎn)/分，20min，4℃)，離心收集細(xì)胞，加保護(hù)劑(選擇甘油，脫脂奶粉，海藻糖，甘露醇中的任意一種物質(zhì)作為保護(hù)劑)，真空冷凍干燥，即得凍干制品——活菌粉。凍干制品中活菌數(shù)所得菌粉活菌數(shù)可達(dá)2.1*1010個(gè)/g，菌體轉(zhuǎn)化亞油酸生成共軛亞油酸的轉(zhuǎn)化率可達(dá)17％。
實(shí)施例2斜面培養(yǎng)基同實(shí)施例1；種子培養(yǎng)基和種子液的制備同實(shí)施例1；發(fā)酵培養(yǎng)基酵母提取物10g，蛋白胨20g，氯化鈉8.5g，葡萄糖25g，亞油酸12g，無水醋酸鈉5g，MgSO4·7H2O 0.2g，MnSO4·H2O 0.05g，檸檬酸二銨2g，CoCl20.002g，吐溫-803ml，其余為水，pH值6.0，滅菌備用。
誘導(dǎo)物的提供方式將發(fā)酵培養(yǎng)基中的亞油酸先溶解或包埋在單甘酯中，再添加入發(fā)酵液中，發(fā)酵液中亞油酸初始濃度誘導(dǎo)濃度控制在0.3g/L；接種子液培養(yǎng)12h后，將剩余的溶解或包埋在單甘酯中的亞油酸，分三次間歇補(bǔ)加入發(fā)酵液中，48h內(nèi)加完，發(fā)酵液中亞油酸的總加入量為12g/L。
發(fā)酵工藝(在下面的發(fā)酵工藝中不再重復(fù)亞油酸的加入方式)按上述配方配制10L發(fā)酵液于發(fā)酵罐中，經(jīng)滅菌后接種子培養(yǎng)液，菌種的接種量為培養(yǎng)基溶液的10％，即1L，光密度(OD值)為2；用氫氧化鈉來調(diào)節(jié)pH6.0，開始培養(yǎng)發(fā)酵；在培養(yǎng)6h后開始把葡萄糖200g(首先配制成30％的溶液消毒)慢速加入發(fā)酵罐，在48h內(nèi)加完；發(fā)酵時(shí)間72h，發(fā)酵過程中長菌及誘導(dǎo)溫度為28℃；發(fā)酵過程中采用氫氧化鈉和鹽酸調(diào)節(jié)pH，使發(fā)酵過程中的pH值始終維持在6.0～6.6之間。
菌泥收集和干燥過程同實(shí)施例1，凍干制品中活菌數(shù)所得菌粉活菌數(shù)可達(dá)5.7*1010個(gè)/g。菌體轉(zhuǎn)化亞油酸生成共軛亞油酸的轉(zhuǎn)化率可達(dá)24.1％。
實(shí)施例3斜面培養(yǎng)基同實(shí)施例1；種子培養(yǎng)基和種子液的制備同實(shí)施例1；發(fā)酵培養(yǎng)基酵母提取物15g，蛋白胨30g，氯化鈉8.5g，葡萄糖30g，亞油酸20g，無水醋酸鈉5g，MgSO4·7H2O 0.2g，MnSO4·H2O 0.05g，檸檬酸二銨2g，CoCl20.002g，吐溫-80 5ml，其余為水，pH值6.6，滅菌備用。
酶誘導(dǎo)物的提供方式將發(fā)酵培養(yǎng)基中的亞油酸溶解或包埋在牛血清蛋白-卵磷脂中，再添加入發(fā)酵液中，發(fā)酵液中亞油酸初始濃度誘導(dǎo)濃度控制在0.4g/L(即每升發(fā)酵液中含4g亞油酸)；其余在發(fā)酵過程中添加入發(fā)酵液中，即在接種子液發(fā)酵培養(yǎng)12h后，將剩余的溶解或包埋在牛血清蛋白-卵磷脂中的亞油酸再分三次間歇補(bǔ)加入發(fā)酵液中，48h內(nèi)加完，發(fā)酵液亞油酸的總加入量為20g/L。
發(fā)酵工藝(在下面的發(fā)酵工藝中不再重復(fù)亞油酸的加入方式)按上述配方配制10L發(fā)酵液于發(fā)酵罐中，經(jīng)滅菌后接種子培養(yǎng)液，菌種的接種量為培養(yǎng)基溶液的15％，即1.5L，光密度(OD值)為2.5；用氫氧化鈉來調(diào)節(jié)pH6.0，開始培養(yǎng)發(fā)酵；在開始培養(yǎng)6h后把葡萄糖350g(首先配制成30％的溶液消毒)慢速加入發(fā)酵罐，在48h內(nèi)加完；發(fā)酵過程中長菌及誘導(dǎo)溫度30℃，發(fā)酵總時(shí)間66h；發(fā)酵過程中采用氫氧化鈉和鹽酸調(diào)節(jié)pH，使發(fā)酵過程中的pH值始終維持在6.0～6.6之間。
菌泥收集和干燥過程同實(shí)施例1，凍干制品中活菌數(shù)所得菌粉活菌數(shù)可達(dá)9.7*1010個(gè)/g。菌體轉(zhuǎn)化亞油酸生成共軛亞油酸的轉(zhuǎn)化率可達(dá)42.7％。
實(shí)施例4斜面培養(yǎng)基同實(shí)施例1；種子培養(yǎng)基和種子液的制備同實(shí)施例1；發(fā)酵培養(yǎng)基酵母提取物15g，蛋白胨30g，氯化鈉8.5g，葡萄糖30g，亞油酸30g，無水醋酸鈉5g，MgSO4·7H2O 0.2g，MnSO4·H2O 0.05g，檸檬酸二銨2g，CoCl20.002g，吐溫-80 4ml，其余為水，pH值6.0，滅菌備用。
酶誘導(dǎo)物的提供方式將發(fā)酵培養(yǎng)基中的亞油酸溶解或包埋在淀粉，或卵磷脂，或甘油，或牛血清蛋白的一種物質(zhì)中，再添加入發(fā)酵液中，發(fā)酵液中亞油酸初始濃度誘導(dǎo)濃度控制在0.4g/L；接種子液培養(yǎng)12h后，將剩余的溶解或包埋在淀粉、卵磷脂中亞油酸分三次間歇補(bǔ)加入發(fā)酵液中，48h內(nèi)加完，發(fā)酵液亞油酸的總加入量為30g/L。
發(fā)酵工藝(在下面的發(fā)酵工藝中不再重復(fù)亞油酸的加入方式)按上述配方配制10L發(fā)酵液于發(fā)酵罐中，經(jīng)滅菌后接種子培養(yǎng)液，菌種的接種量為培養(yǎng)基溶液的15％，即1.5L，光密度(OD值)為3；用氫氧化鈉來調(diào)節(jié)pH6.0，開始培養(yǎng)；在開始培養(yǎng)6h后把葡萄糖350g(首先配制成30％的溶液消毒)慢速加入發(fā)酵罐，用時(shí)20h；發(fā)酵過程中長菌及誘導(dǎo)溫度30℃，發(fā)酵為時(shí)間66h；發(fā)酵過程中采用氫氧化鈉和鹽酸調(diào)節(jié)pH，使發(fā)酵過程中的pH值維持在6.0～6.6之間。
菌泥收集和干燥過程同實(shí)施例1，凍干制品中活菌數(shù)所得菌粉活菌數(shù)可達(dá)9.3*1010個(gè)/g。菌體轉(zhuǎn)化亞油酸生成共軛亞油酸的轉(zhuǎn)化率可達(dá)32.7％。
權(quán)利要求
1.一種能有效轉(zhuǎn)化亞油酸為共扼亞油酸的微生物菌株，是植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum HSC 235)CCTCC No.M204051，利用該菌株制備高活性乳酸菌制品的方法，包括(1)配制發(fā)酵培養(yǎng)基，各組分的含量均為重量體積百分比，即g/L酵母提取物5.0-15.0，蛋白胨10.0-30.0，氯化鈉8.5，葡萄糖20.0-30.0，亞油酸8-30，無水醋酸鈉5，MgSO4·7H2O0.2，MnSO4·H2O0.05，檸檬酸二銨2，CoCl20.002，吐溫801ml/L-5ml/L，其余為水，pH值為6.0～6.6；(2)將菌株CCTCC No.M204051，HSC235進(jìn)行常規(guī)斜面活化、種子培養(yǎng)，種子液接入上述發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)、發(fā)酵，發(fā)酵工藝a.種子液接種量為發(fā)酵培養(yǎng)基溶液的5％～15％，種子液的光密度OD值為1～3；b.發(fā)酵過程中培養(yǎng)條件長菌溫度為28℃～30℃，發(fā)酵時(shí)間為60h～72h；c.采取慢速補(bǔ)加糖方式，加糖量為每10升發(fā)酵液100g-350g，且在接種后6h開始，48h內(nèi)加完；d.采用緩慢加亞油酸的方式；e.發(fā)酵過程中采用添加氫氧化鈉和鹽酸自動(dòng)平衡調(diào)節(jié)pH值，使pH值維持在6.0～6.6之間；(3)發(fā)酵結(jié)束，發(fā)酵液經(jīng)離心脫水，收集細(xì)胞，加保護(hù)劑，真空冷凍干燥，得活菌粉。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征是發(fā)酵培養(yǎng)基中的亞油酸溶解或包埋在環(huán)糊精、單甘脂、牛血清蛋白-卵磷脂、淀粉、牛血清蛋白、卵磷脂、甘油物質(zhì)中的一種中，再行添加。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的制備方法，其特征是溶解或包埋后的亞油酸添加方式為發(fā)酵液中亞油酸初始濃度誘導(dǎo)濃度控制在0.4g/L以內(nèi)，接種培養(yǎng)12h后再間歇補(bǔ)加，48h內(nèi)加完。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征是發(fā)酵結(jié)束，發(fā)酵液通過高速冷凍離心機(jī)用去離子無菌水洗滌三次(7000轉(zhuǎn)/分，20min，4℃)，離心收集細(xì)胞，加保護(hù)劑，真空冷凍干燥，即得活菌粉。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征是所述的保護(hù)劑為甘油、脫脂奶粉、海藻糖、甘露醇中的一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及新型高活性乳酸菌制品的制備方法，該方法利用發(fā)明人篩選并保藏的具有轉(zhuǎn)化亞油酸生成共軛亞油酸能力的乳酸菌(Lactobacillus plantarum)HSC235 CCTCC No.M204051，在優(yōu)化條件下發(fā)酵培養(yǎng)該新菌株，包括發(fā)酵培養(yǎng)基配方篩選、酶誘導(dǎo)物的提供方式，發(fā)酵工藝條件選定等制得高活性乳酸菌制品，凍干制品活菌粉中活菌數(shù)可達(dá)10
文檔編號(hào)C12R1/25GK1793330SQ200510061449
公開日2006年6月28日 申請(qǐng)日期2005年11月7日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月7日
發(fā)明者梁新樂 申請(qǐng)人:浙江工商大學(xué)