專利名稱：一種乳酸菌活菌總數(shù)快速計數(shù)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
乳酸菌活菌總數(shù)快速計數(shù)法主要應(yīng)用于各類乳酸菌在菌種擴培、發(fā)酵及其菌劑制備過程中所進行的大量乳酸菌活菌總數(shù)在線計數(shù)工作。
背景技術(shù)：
乳酸菌具有良好的保健功能和生產(chǎn)特性，已被廣泛用于牛奶發(fā)酵、蔬菜發(fā)酵、乳酸菌劑制備、藥物制劑、詞料等現(xiàn)代工業(yè)生產(chǎn)中。乳酸菌活菌數(shù)是研究和生產(chǎn)中經(jīng)常需要跟蹤測定的指標，目前，乳酸菌活菌數(shù)測定方法常用平板稀釋法，也有釆用高層瓊脂法、GB法、血球計數(shù)板計數(shù)法、特殊染色計數(shù)法、比濁計數(shù)法等進行乳酸菌菌數(shù)測定。這些方法各有優(yōu)缺點平板稀釋計數(shù)法和GB法是經(jīng)典的乳酸菌活菌計數(shù)法，但操作過程繁瑣，培養(yǎng)時間長，不能及時反映菌體生長情況，無法實現(xiàn)在線檢測；高層瓊脂法除了搡作過程繁瑣，培養(yǎng)時間長外，搡作要求較高，培養(yǎng)出來的菌落小而密，不易計數(shù)；血球計數(shù)板計數(shù)法在染色時不清晰，使計數(shù)困難、檢測結(jié)果明顯偏低，而且在使用后計數(shù)板不易清洗，易有殘留物，影響觀察和計數(shù)結(jié)果；甲苯胺藍特殊染色計數(shù)法不能區(qū)分細胞死活，檢測結(jié)果明顯偏高；比濁計數(shù)法雖然比較簡便，可以連續(xù)測定，但誤差很大，其計數(shù)結(jié)果受培養(yǎng)基成分、代謝產(chǎn)物的影響很大。發(fā)明的內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提出一種乳酸菌活菌總數(shù)快速計數(shù)方法，解決各類乳酸菌在菌種擴培、發(fā)酵及其菌劑制備過程中所進行的大量乳酸菌活菌總數(shù)在線計數(shù)問題。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的。
1、 制備染液。次甲基藍0.1-lg,碳酸鈉0.5-2g,蒸餾水100ml。混勻，靜置0.5-2h后，過濾，靜置2h后備用；
2、 菌懸液制備與梯度稀釋。稱取l克菌粉或移取lml乳酸菌培養(yǎng)液，用無菌水進行10-100倍稀釋，震蕩混合均句制成菌懸液；移取菌懸液，用無菌水對菌懸液進行IO倍梯度稀釋，震蕩混合均勻，總稀釋倍數(shù)以顯微鏡視野中菌體數(shù)為20-200個為宜；
3、 染色制片。用微量定量移管吸取5;^/菌懸液置干凈載玻片上，加5///的上述染液，蓋上蓋玻片；
4、 計數(shù)。將菌液浸片置顯微鏡下鏡檢，選擇浸片4個角和中央的10~20個視野計算乳酸菌活菌總數(shù)，并求取每個視野中乳酸活菌數(shù)平均值；
5、 每克菌粉/每亳升菌液中含有的乳酸活菌數(shù)計算公式為
^x^xlMx總稀釋倍數(shù)5 5
其中，C為蓋玻片的面積，B為一個視野的面積，A為每個視野中乳酸活菌數(shù)平均值。本發(fā)明具有以下優(yōu)點和效果
本發(fā)明能直接對乳酸菌進行在線活菌檢測，能在顯微鏡下直接數(shù)出活菌數(shù)，是一種快速，直觀、簡便，實際應(yīng)用價值較高的乳酸菌活菌計數(shù)方法。檢測結(jié)果與平板稀
釋法、高層瓊脂法等方法比較接近，特別與GB法基本一致，且步驟簡化，操作誤差
小，結(jié)果重現(xiàn)性好，省去漫長的培養(yǎng)時間，是一種快速、簡便的乳酸菌活菌總數(shù)計數(shù)
方法，可實現(xiàn)乳酸菌活菌數(shù)在線檢測。
具體實施例方式
本發(fā)明將通過以下實施例作進一步說明。
以下實施例所用顯微鏡取目鏡16x ,接物鏡40x, —個視野的直徑d為0.27mm,一個視野的面積B=7t r 2=7i(d/2)2=3.14 x (0.27/2wm)2=0.0572265 mm2,蓋玻片的面積C=(18mw)2=324 mm2。
實施例1。
1、 取次甲基藍0.1g,碳酸鈉0.5g，蒸餾水lOOml。混勻，靜置lh后，過濾，靜置2h后備用；
2、 稱取lg菌粉，并將其加入到99m/無菌水中，震蕩混合均勻；將菌懸液移取lm/加入裝有9m/無菌水的試管中，震蕩混勻后取出lm/加入下一支裝有9m/無菌水的試管中，對菌懸液作兩次10倍梯度稀釋，即總稀釋倍數(shù)為10000;
3、 用微量定量移管吸取5w/菌懸液置干凈載玻片上，加5^/的上述染液，蓋上蓋玻片，注意不可有氣泡，也不可將菌液溢出蓋玻片以外；
4、 計數(shù)。將菌液浸片置顯微鏡下鏡檢，選擇浸片4個角和中央的IO個視野計算活菌體總數(shù)，并求出其乳酸活菌平均值A(chǔ)為43.3;
5、 將C、 B、 A、總稀釋倍數(shù)的值代入下式，每克乳酸菌粉中含有的乳酸活菌數(shù)
為
2x」xiMx總稀釋倍數(shù)^.903 x 10ii;S 5
實施例2。
1、 取次甲基藍0.1g，碳酸鈉2g，蒸餾水100mL混勻，靜置2h后，過濾，靜置2h后備用；
2、 移取lm/乳酸菌培養(yǎng)液，并將其加入到99m/無菌水中，震蕩混合均勻，即總稀釋倍數(shù)為100;
3、 用微量定量移管吸取5///菌懸液置千凈載玻片上，加5w/的上述染液，蓋上蓋玻片，注意不可有氣泡，也不可將菌液溢出蓋玻片以外；
4、 計數(shù)。將菌液浸片置顯微鏡下鏡檢，選擇浸片4個角和中央的20個視野計算活菌體總數(shù)，并求出其乳酸活菌平均值A(chǔ)為85.5;
5、 將C、 B、 A、總稀釋倍數(shù)的值代入下式，每毫升菌液中含有的乳酸活菌數(shù)為匕x jx^^x總稀釋倍數(shù)二9.681 x 109;5 5
實施例3。
1、 取次甲基藍0.5g,碳酸鈉0.5g,蒸餾水100ml?；靹颍o置0.5h后，過濾，靜置2h后備用；
2、 移取lm/乳酸菌培養(yǎng)液，并將其加入到99m/無菌水中，震蕩混合均勻，即總稀釋倍數(shù)為100;
3、 用微量定量移管吸取5w/菌懸液置干凈載玻片上，加5w/的上述染液，蓋上蓋玻片，注意不可有氣泡，也不可將菌液溢出蓋坡片以外；
4、 計數(shù)。將菌液浸片置顯微鏡下鏡檢，選擇浸片4個角和中央的15個視野計算活菌體總數(shù)，并求出其乳酸活菌平均值A(chǔ)為135.6;
5、 將C、 B、 A、總稀釋倍數(shù)的值代入下式，每毫升菌液中含有的乳酸活菌數(shù)為
￡x jxlMx總稀釋倍數(shù)^.535 x 10i、5 權(quán)利要求
1、一種乳酸菌活菌總數(shù)快速計數(shù)方法，其特征是(1)取次甲基藍0.1-1g，碳酸鈉0.5-2g，蒸餾水100ml，混勻，靜置0.5-2h后，過濾，靜置2h；(2)稱取1克菌粉或移取1ml乳酸菌培養(yǎng)液，用無菌水進行10-100倍稀釋，震蕩混合均勻制成菌懸液；移取菌懸液，用無菌水對菌懸液進行10倍梯度稀釋，震蕩混合均勻，總稀釋倍數(shù)以顯微鏡視野中菌體數(shù)為20-200個為宜；(3)用微量定量移管吸取5μl菌懸液置干凈載玻片上，加5μl的上述染液，蓋上蓋玻片；(4)將菌液浸片置顯微鏡下鏡檢，選擇浸片4個角和中央的10～20個視野計算乳酸菌活菌總數(shù)，并求取每個視野中乳酸活菌數(shù)平均值；(5)計算每克菌粉/每毫升菌液中含有的乳酸活菌數(shù)為其中，C為蓋玻片的面積，B為一個視野的面積，A為每個視野中乳酸活菌數(shù)平均值。
全文摘要
一種乳酸菌活菌總數(shù)快速計數(shù)方法，取次甲基藍0.1-1g，碳酸鈉0.5-2g，蒸餾水100ml，混勻，靜置0.5-2h后，過濾，靜置2h；稱取1克菌粉或移取1ml乳酸菌培養(yǎng)液，用無菌水進行10-100倍稀釋，制成菌懸液；移取菌懸液，用無菌水進行10倍梯度稀釋；吸取5μl菌懸液置于載玻片上，加5μl上述染液，蓋上蓋玻片；選擇10～20個視野計算乳酸菌活菌總數(shù)，并乳酸活菌數(shù)平均值；計算每克菌粉/每毫升菌液中含有的乳酸活菌數(shù)為上述公式，其中，C為蓋玻片的面積，B為一個視野的面積，A為每個視野中乳酸活菌數(shù)平均值。本發(fā)明步驟簡化，誤差小，重現(xiàn)性好，省去漫長的培養(yǎng)時間，是一種快速、簡便的乳酸菌活菌總數(shù)計數(shù)方法，可實現(xiàn)乳酸菌活菌數(shù)在線檢測。
文檔編號C12Q1/06GK101659982SQ200910186079
公開日2010年3月3日 申請日期2009年9月22日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月22日
發(fā)明者曾哲靈, 濤 熊, 韻 王, 黃錦卿 申請人:南昌大學