專利名稱：基因工程法制備抗乙肝病毒特異性轉(zhuǎn)移因子的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種制備抗乙肝病毒特異性轉(zhuǎn)移因子的方法。
背景技術(shù)：
抗乙肝病毒特異性轉(zhuǎn)移因子是一種用于制造治療乙肝的藥物的生物制品，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)母體感染有乙肝病毒時(shí)，其胎盤中含有抗乙肝病毒特異性轉(zhuǎn)移因子，可從其胎盤中提取抗乙肝病毒特異性轉(zhuǎn)移因子，提取時(shí)，將胎盤破碎，離心分離，取上清，經(jīng)滅菌后制成制品。其不足之處在于由于該方法制備的抗乙肝病毒特異性轉(zhuǎn)移因子的產(chǎn)量低下，成本高，原料來(lái)源有限，難以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化大量生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種可以適用于工業(yè)化生產(chǎn)抗乙肝病毒特異性轉(zhuǎn)移因子的方法。
本發(fā)明的目的是通過(guò)基因工程法來(lái)實(shí)現(xiàn)的，其制備方法包括如下步驟一、mRNA差異顯示法克隆小鼠抗乙肝病毒特異性轉(zhuǎn)移因子基因取健康成年雌性BALBc小鼠，人工感染乙肝病毒，感染成功后，取出其脾臟組織，用DEPC處理的生理鹽水沖洗后迅速投入液氮中，待冷凍完全即可用于提取脾臟組織mRNA；脾臟組織總RNA的提取采用Promega RNAgents總RNA提取系統(tǒng)，取脾臟組織于變性劑中使組織勻漿化，用酸平衡的苯酚∶氯仿∶異戊醇＝125∶24∶1進(jìn)行抽提，使RNA脫離DNA及蛋白，從混合液中層析到水相，再用異丙醇將RNA沉淀濃縮；所得RNA用1-2個(gè)單位的無(wú)RNA酶污染的DNA酶處理，然后60-70℃加熱8-12分鐘，使DNA酶失活，mRNA溶解于雙蒸水中，零下65-75℃保存；采用PromegaPolyATtract-mRNA提取系統(tǒng)進(jìn)行mRNA的抽提，在分離用磁架的作用下，雜交復(fù)合物被抗生鏈霉素蛋白包裹磁珠捕捉，隨后洗去非結(jié)合的RNA，使mRNA和核糖體RNA分離；再利用AMV反轉(zhuǎn)錄酶將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA第1條鏈，反轉(zhuǎn)錄以3’端的單堿基錨定引物引導(dǎo)下進(jìn)行；然后以聚丙烯酰胺凝膠電泳法分離擴(kuò)增條帶，銀染法顯示差異表達(dá)mRNA，在PCR過(guò)程中3’端錨定引物和5’端隨機(jī)引物與反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物共同在低溫下退火，所得產(chǎn)物經(jīng)6％變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，篩選特異性mRNA目的條帶；將特異性mRNA條帶進(jìn)一步擴(kuò)增、鑒定、雜交后克隆、測(cè)序、篩選；二、重組基因工程酵母菌的構(gòu)建對(duì)篩選所得的小鼠抗乙肝病毒特異性轉(zhuǎn)移因子基因進(jìn)行質(zhì)粒構(gòu)建通過(guò)PCR方法使小鼠抗乙肝病毒特異性轉(zhuǎn)移因子基因中帶有Xho I和Xba I酶切位點(diǎn)序列，再克隆到表達(dá)載體pPICZ中；將重組表達(dá)載體克隆進(jìn)入啤酒酵母菌中，培養(yǎng)重組酵母菌30-40小時(shí)后，0.5％甲醇誘導(dǎo)40-45小時(shí)大規(guī)模表達(dá)抗乙肝病毒特異性轉(zhuǎn)移因子；三、基因工程表達(dá)產(chǎn)物的分離與純化提取抗乙肝病毒特異性轉(zhuǎn)移因子的細(xì)胞；將細(xì)胞破碎，分離，去除固體物質(zhì)，留上清，再純化即可獲得抗乙肝病毒特異性轉(zhuǎn)移因子。
本發(fā)明提供了工業(yè)化生產(chǎn)抗乙肝病毒特異性轉(zhuǎn)移因子的方法，為確認(rèn)其存在，在制備時(shí)，可同時(shí)采用兩對(duì)照組，即取日齡相同、體重接近的健康成年雌性BALBc小鼠作對(duì)照組，其中一組感染人皰疹病毒，另一組作為正常對(duì)照，在篩選的mRNA目的條時(shí)，感染皰疹病毒小鼠及正常小鼠脾臟組織應(yīng)未表達(dá)或表達(dá)極低。以獲得產(chǎn)物進(jìn)行生物學(xué)試驗(yàn)，具有良好抗乙肝病毒的效果；經(jīng)游離氨基酸測(cè)定及肽譜分析以及游離堿基分析，可確認(rèn)抗乙肝病毒特異性轉(zhuǎn)移因子的存在。本發(fā)明可進(jìn)行大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)，其生產(chǎn)成本低，產(chǎn)量大，可制成抗乙肝病毒的藥品和保健品等。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1按如下步驟制備制備抗乙肝病毒特異性轉(zhuǎn)移因子一、mRNA差異顯示法克隆小鼠抗乙肝病毒特異性轉(zhuǎn)移因子基因1、人工感染取三只日齡相同、體重接近的健康成年雌性BALBc小鼠，其中一只人工感染乙肝病毒(皮下注射)，一只感染人皰疹病毒，另一只作為正常對(duì)照。
利用市售乙肝病毒表面抗原檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)試劑盒以及皰疹病毒檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)試劑盒分別檢測(cè)小鼠血清中相應(yīng)抗體的產(chǎn)生，確定陽(yáng)性即人工感染成功。
2、小鼠脾臟組織mRNA提取將三只小鼠分別脫頸椎致死，取出脾臟組織，用DEPC處理的生理鹽水沖洗后迅速投入液氮中，待冷凍完全即可用于提取脾臟組織mRNA。
脾臟組織總RNA的提取采用Promega RNAgents總RNA提取系統(tǒng)。取5mg脾臟組織于變性劑中使組織勻漿化，其中檸檬酸鈉溶液中含有亞硫氰胍、β巰基乙醇和n-月桂肌氨酸，可使內(nèi)源的RNA酶失活，將核蛋白復(fù)合物變性，釋放RNA。用酸平衡的苯酚∶氯仿∶異戊醇(125∶24∶1)(pH4.3-4.7)抽提后，RNA脫離DNA及蛋白，從混合液中層析到水相。再用異丙醇將RNA沉淀濃縮。所得RNA用1-2個(gè)單位的無(wú)RNA酶污染的DNA酶處理，然后65℃加熱10分鐘，使DNA酶失活。mRNA溶解于雙蒸水中，-70℃保存。總RNA得率約為6-8mgRNA/g小鼠脾組織。瓊脂糖凝膠電泳分析樣品，并用EB染色觀察。核糖體RNA應(yīng)完整無(wú)彌散，28S核糖體RNA的強(qiáng)度應(yīng)為18S核糖體RNA強(qiáng)度的2倍。分光光度計(jì)分析顯示A260/A280的比值為1.7-2.0。
mRNA的抽提采用Promega PolyATtract-mRNA提取系統(tǒng)。該系統(tǒng)用抗生鏈霉素蛋白包裹磁珠代替oligo-dT纖維素柱。在溶液中，生物素化(長(zhǎng)度25mer，并接有生物素共價(jià)相連的18碳臂)的Oligo-dT退火到總RNA中的poly(A)+RNA上。在分離用磁架的作用下，雜交復(fù)合物被抗生鏈霉素蛋白包裹磁珠捕捉，隨后洗去非結(jié)合的RNA，使mRNA和核糖體RNA分離。
3、利用AMV反轉(zhuǎn)錄酶將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA第1條鏈。反轉(zhuǎn)錄以3’端的單堿基錨定引物(T11M)引導(dǎo)下進(jìn)行。
4、聚丙烯酰胺凝膠電泳法分離擴(kuò)增條帶，銀染法顯示差異表達(dá)mRNA。在PCR過(guò)程中3’端錨定引物和5’端隨機(jī)引物與反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物共同在低溫下退火(40℃)，所得產(chǎn)物經(jīng)6％變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，篩選的mRNA目的條帶應(yīng)為感染乙肝病毒來(lái)源脾組織所特有，感染皰疹病毒及正常脾臟組織未表達(dá)或表達(dá)極低的條帶。特異性mRNA條帶進(jìn)一步擴(kuò)增、鑒定、雜交后克隆、測(cè)序、篩選。
二、重組基因工程酵母菌的構(gòu)建對(duì)篩選所得的小鼠抗乙肝病毒特異性轉(zhuǎn)移因子基因進(jìn)行質(zhì)粒構(gòu)建通過(guò)PCR方法使小鼠抗乙肝病毒特異性轉(zhuǎn)移因子基因中帶有Xho I和Xba I酶切位點(diǎn)序列，再克隆到表達(dá)載體pPICZ中。
將重組表達(dá)載體克隆進(jìn)入啤酒酵母菌中，培養(yǎng)重組酵母菌30小時(shí)后，0.5％甲醇誘導(dǎo)42小時(shí)大規(guī)模表達(dá)抗乙肝病毒特異性轉(zhuǎn)移因子。
三、基因工程表達(dá)產(chǎn)物的分離與純化利用mRNA差異顯示技術(shù)克隆小鼠抗乙肝病毒特異性轉(zhuǎn)移因子基因，經(jīng)人工生物反應(yīng)器培養(yǎng)進(jìn)行生產(chǎn)，提取抗乙肝病毒特異性轉(zhuǎn)移因子。
1、抗乙肝病毒特異性轉(zhuǎn)移因子工藝細(xì)胞破碎(提取細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)物)，離心(去除固體物質(zhì)組織細(xì)胞等)，再純化(過(guò)柱、超濾、冷凍干燥)，加工成口服液劑型(10ml/支，含20mg抗乙肝病毒特異性轉(zhuǎn)移因子)，含片劑型(0.5g/片，每片含5mg抗乙肝病毒特異性轉(zhuǎn)移因子)。
在提取純化時(shí)的工藝流程發(fā)酵罐培養(yǎng)物→膠體磨成勻漿→固液分離，留濾液→濃縮→粗濾→超濾→低溫高真空冷凍干燥，經(jīng)凍結(jié)、升華，再干燥成固體。
2、抗乙肝病毒特異性轉(zhuǎn)移因子質(zhì)控(1)、外觀凍干制劑為白色或微黃色疏松體，溶液為澄清白色或微黃色液體。
(2)、蛋白質(zhì)用20％磺基水楊酸，不得出現(xiàn)輕微渾濁或沉淀。
(3)、水分卡爾-弗修氏法測(cè)定水分應(yīng)≤3％(g/g)。
(4)、pH值電位法測(cè)定應(yīng)為6.5～7.5。
(5)、HBSAg.HCV.HIV標(biāo)準(zhǔn)試劑盒小于2ng/ml(經(jīng)濃縮十倍)，檢測(cè)結(jié)果應(yīng)為陰性。
(6)、紫外吸收值LOD值測(cè)定紫外吸收最大值在250-260nm之間，紫外吸光E＝7-8，A260/A280≥1.8，多肽含量＞2mg/ml，核糖含量80μg/ml。
(7)、層析分析用葡聚糖G25(Sephadex)，可見(jiàn)明顯兩個(gè)高峰。260nm/280nm有最大吸收值分子量小于5000。
(8)、原子吸收光譜測(cè)定產(chǎn)品金屬元素、微量元素。
(9)、生物學(xué)性質(zhì)無(wú)菌試驗(yàn)，按照生物制品規(guī)程檢測(cè)應(yīng)無(wú)菌；生長(zhǎng)熱源試驗(yàn)，家兔試驗(yàn)，豚鼠皮下注射法，無(wú)化膿、壞死，動(dòng)物健在。
(10)、活性測(cè)定用E玫瑰花環(huán)試驗(yàn)，結(jié)花率高于對(duì)照30％。
(11)、測(cè)游離氨基酸及肽譜分析，游離堿基的分析。功能主治有關(guān)的主要藥效學(xué)試驗(yàn)，動(dòng)物急性毒性試驗(yàn)資料，動(dòng)物長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)，資料JA1100微量元素分析，藥品穩(wěn)定性試驗(yàn)資料。
實(shí)施例2一、mRNA差異顯示法克隆小鼠抗乙肝病毒特異性轉(zhuǎn)移因子基因取健康成年雌性BALBc小鼠，人工感染乙肝病毒，感染成功后，取出其脾臟組織，用DEPC處理的生理鹽水沖洗后迅速投入液氮中，待冷凍完全即可用于提取脾臟組織mRNA；脾臟組織總RNA的提取采用Promega RNAgents總RNA提取系統(tǒng)(市售)，取脾臟組織于變性劑中使組織勻漿化，用酸平衡的苯酚∶氯仿∶異戊醇＝125∶24∶1進(jìn)行抽提，使RNA脫離DNA及蛋白，從混合液中層析到水相，再用異丙醇將RNA沉淀濃縮；所得RNA用1-2個(gè)單位的無(wú)RNA酶污染的DNA酶處理，然后60℃加熱12分鐘，使DNA酶失活，mRNA溶解于雙蒸水中，零下65℃保存；采用Promega PolyATtract-mRNA提取系統(tǒng)(市售)進(jìn)行mRNA的抽提，在分離用磁架的作用下，雜交復(fù)合物被抗生鏈霉素蛋白包裹磁珠捕捉，隨后洗去非結(jié)合的RNA，使mRNA和核糖體RNA分離；再利用AMV反轉(zhuǎn)錄酶將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA第1條鏈，反轉(zhuǎn)錄以3’端的單堿基錨定引物引導(dǎo)下進(jìn)行；然后以聚丙烯酰胺凝膠電泳法分離擴(kuò)增條帶，銀染法顯示差異表達(dá)mRNA，在PCR過(guò)程中3’端錨定引物和5’端隨機(jī)引物與反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物共同在低溫下退火，所得產(chǎn)物經(jīng)6％變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，篩選特異性mRNA目的條帶；將特異性mRNA條帶進(jìn)一步擴(kuò)增、鑒定、雜交后克隆、測(cè)序、篩選。
二、重組基因工程酵母菌的構(gòu)建對(duì)篩選所得的小鼠抗乙肝病毒特異性轉(zhuǎn)移因子基因進(jìn)行質(zhì)粒構(gòu)建通過(guò)PCR方法使小鼠抗乙肝病毒特異性轉(zhuǎn)移因子基因中帶有Xho I和Xba I酶切位點(diǎn)序列，再克隆到表達(dá)載體pPICZ中；將重組表達(dá)載體克隆進(jìn)入啤酒酵母菌中，培養(yǎng)重組酵母菌30小時(shí)后，0.5％甲醇誘導(dǎo)40小時(shí)大規(guī)模表達(dá)抗乙肝病毒特異性轉(zhuǎn)移因子。
三、基因工程表達(dá)產(chǎn)物的分離與純化提取抗乙肝病毒特異性轉(zhuǎn)移因子的細(xì)胞，將細(xì)胞破碎，分離，以去除固體物質(zhì)組織細(xì)胞等，再純化即可獲得乙肝病毒特異性轉(zhuǎn)移因子。
實(shí)施例3一、mRNA差異顯示法克隆小鼠抗乙肝病毒特異性轉(zhuǎn)移因子基因取健康成年雌性BALBc小鼠若干，人工感染乙肝病毒，感染成功后，取出其脾臟組織，用DEPC處理的生理鹽水沖洗后迅速投入液氮中，待冷凍完全即可用于提取脾臟組織mRNA；脾臟組織總RNA的提取采用PromegaRNAgents總RNA提取系統(tǒng)，取脾臟組織于變性劑中使組織勻漿化，用酸平衡的苯酚∶氯仿∶異戊醇＝125∶24∶1進(jìn)行抽提，使RNA脫離DNA及蛋白，從混合液中層析到水相，再用異丙醇將RNA沉淀濃縮；所得RNA用1-2個(gè)單位的無(wú)RNA酶污染的DNA酶處理，然后70℃加熱8分鐘，使DNA酶失活，mRNA溶解于雙蒸水中，零下75℃保存；采用Promega PolyATtract-mRNA提取系統(tǒng)進(jìn)行mRNA的抽提，在分離用磁架的作用下，雜交復(fù)合物被抗生鏈霉素蛋白包裹磁珠捕捉，隨后洗去非結(jié)合的RNA，使mRNA和核糖體RNA分離；再利用AMV反轉(zhuǎn)錄酶將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA第1條鏈，反轉(zhuǎn)錄以3’端的單堿基錨定引物引導(dǎo)下進(jìn)行；然后以聚丙烯酰胺凝膠電泳法分離擴(kuò)增條帶，銀染法顯示差異表達(dá)mRNA，在PCR過(guò)程中3’端錨定引物和5’端隨機(jī)引物與反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物共同在低溫下退火，所得產(chǎn)物經(jīng)6％變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，篩選特異性mRNA目的條帶；將特異性mRNA條帶進(jìn)一步擴(kuò)增、鑒定、雜交后克隆、測(cè)序、篩選；二、重組基因工程酵母菌的構(gòu)建對(duì)篩選所得的小鼠抗乙肝病毒特異性轉(zhuǎn)移因子基因進(jìn)行質(zhì)粒構(gòu)建通過(guò)PCR方法使小鼠抗乙肝病毒特異性轉(zhuǎn)移因子基因中帶有Xho I和Xba I酶切位點(diǎn)序列，再克隆到表達(dá)載體pPICZ中；將重組表達(dá)載體克隆進(jìn)入啤酒酵母菌中，培養(yǎng)重組酵母菌35小時(shí)后，0.5％甲醇誘導(dǎo)45小時(shí)大規(guī)模表達(dá)抗乙肝病毒特異性轉(zhuǎn)移因子。
三、基因工程表達(dá)產(chǎn)物的分離與純化提取抗乙肝病毒特異性轉(zhuǎn)移因子的細(xì)胞，將細(xì)胞破碎，分離，以去除固體物質(zhì)組織細(xì)胞等，再純化即可獲得乙肝病毒特異性轉(zhuǎn)移因子。
權(quán)利要求
1.基因工程法制備抗乙肝病毒特異性轉(zhuǎn)移因子的方法，其特征在于包括以下步驟一、mRNA差異顯示法克隆小鼠抗乙肝病毒特異性轉(zhuǎn)移因子基因取健康成年雌性BALBc小鼠，人工感染乙肝病毒，感染成功后，取出其脾臟組織，用DEPC處理的生理鹽水沖洗后迅速投入液氮中，待冷凍完全即可用于提取脾臟組織mRNA；脾臟組織總RNA的提取采用Promega RNAgents總RNA提取系統(tǒng)，取脾臟組織于變性劑中使組織勻漿化，用酸平衡的苯酚∶氯仿∶異戊醇＝125∶24∶1進(jìn)行抽提，使RNA脫離DNA及蛋白，從混合液中層析到水相，再用異丙醇將RNA沉淀濃縮；所得RNA用1-2個(gè)單位的無(wú)RNA酶污染的DNA酶處理，然后60-70℃加熱8-12分鐘，使DNA酶失活，mRNA溶解于雙蒸水中，零下65-75℃保存；采用PromegaPolyATtract-mRNA提取系統(tǒng)進(jìn)行mRNA的抽提，在分離用磁架的作用下，雜交復(fù)合物被抗生鏈霉素蛋白包裹磁珠捕捉，隨后洗去非結(jié)合的RNA，使mRNA和核糖體RNA分離；再利用AMV反轉(zhuǎn)錄酶將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA第1條鏈，反轉(zhuǎn)錄以3’端的單堿基錨定引物引導(dǎo)下進(jìn)行；然后以聚丙烯酰胺凝膠電泳法分離擴(kuò)增條帶，銀染法顯示差異表達(dá)mRNA，在PCR過(guò)程中3’端錨定引物和5’端隨機(jī)引物與反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物共同在低溫下退火，所得產(chǎn)物經(jīng)6％變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，篩選特異性mRNA目的條帶；將特異性mRNA條帶進(jìn)一步擴(kuò)增、鑒定、雜交后克隆、測(cè)序、篩選；二、重組基因工程酵母菌的構(gòu)建對(duì)篩選所得的小鼠抗乙肝病毒特異性轉(zhuǎn)移因子基因進(jìn)行質(zhì)粒構(gòu)建通過(guò)PCR方法使小鼠抗乙肝病毒特異性轉(zhuǎn)移因子基因中帶有Xho I和Xba I酶切位點(diǎn)序列，再克隆到表達(dá)載體pPICZ中；將重組表達(dá)載體克隆進(jìn)入啤酒酵母菌中，培養(yǎng)重組酵母菌30-40小時(shí)后，0.5％甲醇誘導(dǎo)40-45小時(shí)大規(guī)模表達(dá)抗乙肝病毒特異性轉(zhuǎn)移因子；三、基因工程表達(dá)產(chǎn)物的分離與純化提取抗乙肝病毒特異性轉(zhuǎn)移因子的細(xì)胞；將細(xì)胞破碎，分離，去除固體物質(zhì)，留上清，再純化即可獲得抗乙肝病毒特異性轉(zhuǎn)移因子。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種以基因工程法制備抗乙肝病毒特異性轉(zhuǎn)移因子的方法，首先以mRNA差異顯示法克隆小鼠抗乙肝病毒特異性轉(zhuǎn)移因子基因；然后構(gòu)建表達(dá)抗乙肝病毒特異性轉(zhuǎn)移因子的重組酵母菌，并培養(yǎng)，大規(guī)模表達(dá)抗乙肝病毒特異性轉(zhuǎn)移因子，經(jīng)破碎、分離和純化即可獲得抗乙肝病毒特異性轉(zhuǎn)移因子。本發(fā)明可進(jìn)行大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)，其生產(chǎn)成本低，產(chǎn)量大，可制成抗乙肝病毒的藥品和保健品等。
文檔編號(hào)C12N15/09GK1683413SQ20051003808
公開(kāi)日2005年10月19日 申請(qǐng)日期2005年3月11日 優(yōu)先權(quán)日2005年3月11日
發(fā)明者葉滿紅, 郭金鋼 申請(qǐng)人:揚(yáng)州同人生物工程有限公司