專利名稱:骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的制備及其與控釋神經(jīng)營養(yǎng)因子的聯(lián)合應(yīng)用的制作方法
專利說明骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的制備及其與控釋神經(jīng)營養(yǎng)因子的聯(lián)合應(yīng)用 本發(fā)明涉及一種治療神經(jīng)系統(tǒng)損傷的干細(xì)胞制劑與控釋神經(jīng)營養(yǎng)因子聯(lián)合應(yīng)用的方法,具體地說,涉及骨髓間質(zhì)干細(xì)胞制劑的制備及最佳體外神經(jīng)誘導(dǎo)時間,及其與控釋神經(jīng)營養(yǎng)因子最佳混合比例,用于治療腦及脊髓中樞神經(jīng)系統(tǒng)和其它疾病的新技術(shù)。對于由神經(jīng)系統(tǒng)損傷導(dǎo)致的癱瘓和其他神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙臨床上常常無有效治療方法,有人采用神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞移植來促進神經(jīng)損傷的功能恢復(fù),但供者神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞主要來源于胎腦或其它意外死亡者,來源不足有免疫排斥問題且在臨床應(yīng)用上存在倫理學(xué)障礙。因此,選擇新的干細(xì)胞源移植治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病變得越來越重要和緊迫。干細(xì)胞具有自我復(fù)制和多向分化的功能,是形成生命機體各種組織器官的起源細(xì)胞。在正常生殖生理過程中,干細(xì)胞由受精卵分化而來。干細(xì)胞移植治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷取得了一定的研究成果,但對損傷神經(jīng)系統(tǒng)的功能重建仍未達(dá)到理想的效果。這是因為損傷后神經(jīng)區(qū)域神經(jīng)營養(yǎng)因子水平下降,限制了中樞神經(jīng)的修復(fù)。鑒于神經(jīng)營養(yǎng)因子類物質(zhì)在體內(nèi)極易降解、半衰期短的特點,必須建立起一種持續(xù)供給的體系。在轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究領(lǐng)域使用最多的仍是病毒載體,但病毒轉(zhuǎn)載基因的過程包裹非常復(fù)雜的“插入”程序,此外,病毒類載體的存在有引起免疫反應(yīng)和重組病毒的危險,因此,在研究新型載體的同時研究新的應(yīng)用方法很有必要。越來越多的新型材料應(yīng)用于組織工程中來,藥物控釋已成為可降解生物材料的重要應(yīng)用。
成人骨髓中的間質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell,MSC)屬于成體干細(xì)胞,具有增殖能力強、來源豐富、采集方便等優(yōu)點,成為另一個可供細(xì)胞移植的細(xì)胞源。然而,MSC誘導(dǎo)分化后的神經(jīng)元其活性如何,移植到中樞神經(jīng)系統(tǒng)是否可以繼續(xù)存活,能否促進神經(jīng)功能的恢復(fù),尚有疑問。而且移植細(xì)胞與控釋神經(jīng)營養(yǎng)因子使用配比問題也有待解決。因此,建立一種可以廣泛應(yīng)用于臨床治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的具有活性的干細(xì)胞誘導(dǎo)技術(shù),并建立相關(guān)的細(xì)胞與控釋神經(jīng)營養(yǎng)因子混合配比的技術(shù)具有重要的意義。本發(fā)明的目的在于提供一種既可以保持移植細(xì)胞活性又可以保證誘導(dǎo)的有效性的方法,并提供確定細(xì)胞與控釋神經(jīng)營養(yǎng)因子移植混合物分配比例的方法。
本發(fā)明的目的是通過以下方式而實現(xiàn)的骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的制備方法,包括骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng);骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的體外誘導(dǎo);移植誘導(dǎo)骨髓間質(zhì)干細(xì)胞與控釋神經(jīng)營養(yǎng)因子GDNF的聯(lián)合應(yīng)用。
骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)包括抽取健康猴骨髓,分離單個核細(xì)胞;接種于含15%胎牛血清(Fetal bovine serum,F(xiàn)BS)的L-DMEM培養(yǎng)液中,培養(yǎng)液中添加堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblastic growth factor,bFGF)3ng/ml,培養(yǎng)瓶中貼壁培養(yǎng);取5-8代骨髓間質(zhì)干細(xì)胞進行鑒定,體外誘導(dǎo)觀察其成骨、成脂肪多向分化潛能;移植前48小時5-溴脫氧尿嘧啶核苷酸(5-Bromo-2-deoxyuridine,BrdU)按10umol/L濃度標(biāo)記,計數(shù)備用。其中骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的體外誘導(dǎo)時間為1.5小時;3.0×106骨髓間質(zhì)干細(xì)胞與GDNF含量為0.5ug的控釋膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(glial cell line-derived neurotrophic fanctor,GDNF)為最佳配比。
本發(fā)明還包括以前述方法制備的骨髓間質(zhì)干細(xì)胞在制備修復(fù)中樞神經(jīng)損傷藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明具有的重要用途如下1.猴MSC的原代培養(yǎng)要比大鼠MSC的培養(yǎng)困難,而這種難度和成人MSC的培養(yǎng)難度相當(dāng),本發(fā)明建立起一種改良的培養(yǎng)方法從而使MSC的培養(yǎng)變得容易。
2.本發(fā)明確定了體外誘導(dǎo)最佳時間的方法,既可以保證誘導(dǎo)的有效性,又可以保證移植細(xì)胞的活性。
3.本發(fā)明解決了細(xì)胞與控釋神經(jīng)營養(yǎng)因子的移植比例的問題,從而達(dá)到兩組的優(yōu)化組合。
4.本發(fā)明采用自體MSC移植,因而具有很大的應(yīng)用優(yōu)勢。
5.本發(fā)明采用猴為對象,其遺傳背景與人較大鼠等低等動物更為接近,脊髓損傷后的病理改變過程與人類更為接近。
6.采用標(biāo)準(zhǔn)化的猴脊髓挫傷模型,損傷程度相當(dāng)于人類的截癱,其與臨床上發(fā)生的大多數(shù)脊髓損傷類型接近,因而具有良好的模擬性。
7.本發(fā)明觀察指標(biāo)全面,誘發(fā)電位檢測為臨床常用的評價脊髓功能的方法。病理分析全面,實驗結(jié)果可靠,具有重大的參考價值。本發(fā)明對實驗動物的觀察期長達(dá)4~5個月,其中一只長達(dá)1年,實驗結(jié)果更加有意義。
8.所使用控釋載體對機體無毒無害,可以完全降解,可以產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn),應(yīng)用方便。
9.所使用的MSC經(jīng)過流式分析、多向分化潛能的鑒定,使用可靠。
10.MSC移植前,經(jīng)中藥提取物誘導(dǎo),既可以保證移植細(xì)胞在體內(nèi)繼續(xù)向神經(jīng)方向分化,有避免了MSC體內(nèi)成瘤的潛在危險。
胚胎干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞存在著獲取困能、倫理問題等,因而在應(yīng)用上存在著很大限制;造血干細(xì)胞在治療神經(jīng)損傷性方面很有局限性;而骨髓間質(zhì)干細(xì)胞由于獲取容易,體外擴增容易,因而很容易獲取所需數(shù)量的細(xì)胞,在操作上具有簡單性、可行性,更為重要的是MSC可從自體獲取,根本不用考慮免疫排斥反應(yīng),因而在應(yīng)用后不需要使用免疫抑止劑,而當(dāng)前免疫移植劑的價格是很昂貴的,而且應(yīng)用后還存在著很大副作用,因此MSC的推廣應(yīng)用不但可以為患者節(jié)省一大筆開支,而且較少不必要的副作用。所以,MSC較其他細(xì)胞在治療神經(jīng)損傷性疾病方面具有最強的競爭力。經(jīng)神經(jīng)誘導(dǎo)的MSC可以在脊髓內(nèi)更好向神經(jīng)元細(xì)胞分化,而且避免了其成瘤的可能性。
總之,本發(fā)明確定了最佳神經(jīng)誘導(dǎo)時間,最佳MSC與控釋GDNF比例,通過聯(lián)合局部移植的方法使損傷猴脊髓的功能康復(fù)及結(jié)構(gòu)修復(fù)。為細(xì)胞與生物工程材料的聯(lián)合應(yīng)用提供了指導(dǎo)方法。因此,此項發(fā)明是治療脊髓損傷和相關(guān)疾病的有效策略,具有廣闊的臨床開發(fā)前景。
圖1是GDNF控釋生物材料掃描電鏡像。顯示GDNF包裹于單甲氧基聚乙二醇聚乳酸嵌共聚體(Poly(lactic acid)-Poly(eyhylene glycol),mPEG-b-PLA)形成的微球體中,隨著材料的降解,GDNF可以釋放出來發(fā)揮生物學(xué)活性。
圖2顯示正常皮層體感誘發(fā)電位(cortical somatosensory evoked potential,CSEP)呈正(P)、負(fù)(N)雙向波型。
圖3顯示經(jīng)顱磁刺激運動誘導(dǎo)電位(motor evoked potential,MEP)波型呈多極性波。
圖4顯示脊髓損傷部位神經(jīng)元[尼氏染色(×400)]。
A.實驗組脊髓損傷部位前角神經(jīng)元數(shù)量多,運動神經(jīng)元胞體清晰,細(xì)胞可見數(shù)量眾多的尼氏小體。
B.對照組脊髓損傷部位前角神經(jīng)元數(shù)量減少,胞體內(nèi)尼氏小體消失,細(xì)胞水腫。
圖5顯示脊髓損傷部位皮質(zhì)脊髓側(cè)束[甘氨銀浸鍍法染色(×400)]A.實驗組脊髓損傷部位皮質(zhì)脊髓側(cè)束橫切面組織結(jié)構(gòu)正常,軸突密度高,著色深。
B.對照組脊髓損傷部位皮質(zhì)脊髓側(cè)束橫切面結(jié)構(gòu)疏松、紊亂,軸突密度低。
C.實驗組脊髓損傷部位皮質(zhì)脊髓側(cè)束縱切面軸索排列整齊,結(jié)構(gòu)完整,連續(xù)性好。
D.對照組脊髓損傷部位皮質(zhì)脊髓束縱切面軸索斷裂,結(jié)構(gòu)破壞。
圖6免疫雙標(biāo)組化反應(yīng)(×400),顯示實驗組脊髓前角免疫雙標(biāo)陽性細(xì)胞(核藍(lán)紫色,胞漿棕褐色),在前角運動神經(jīng)元周圍可觀察到BrdU和NSE雙標(biāo)陽性細(xì)胞。實施例1、改良骨髓間質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)的制備技術(shù)實例。抽取健康猴髂骨骨髓,分離單個核細(xì)胞,接種于含15%FBS的L-DMEM培養(yǎng)液中(其中添加bFGF,3ng/ml),塑料培養(yǎng)瓶中貼壁培養(yǎng)。取5-8代骨髓MSCs進行鑒定,方法包括流式細(xì)胞儀檢測其表面抗原標(biāo)志,體外誘導(dǎo)觀察其成骨、成脂肪多向分化潛能。移植前48小時Brdu按10umol/L濃度標(biāo)記,計數(shù)備用。
實施例2、用于移植的MSCs體外最佳誘導(dǎo)時間的確定。將MSCs誘導(dǎo)細(xì)胞分為0小時組(對照)、1小時組、1.5小時組、2小時組和3小時組,每組分為6個樣本,分別進行巢蛋白(NESTIN)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)免疫組化染色,并利用流式細(xì)胞儀進行細(xì)胞凋亡檢測。
(平均) NESTIN陽性率(%) NSE陽性率(%) 細(xì)胞凋亡百分比(%)0小時組 0 02.71小時組 1015 2.81.5小時組 2530 3.22小時組 1035 5.73小時組 3 55 7.2從結(jié)果中可以看出,誘導(dǎo)1.5小時既可以保證誘導(dǎo)的效果又可以保證細(xì)胞的活性,是最佳誘導(dǎo)時間。而目前關(guān)于誘導(dǎo)細(xì)胞的移植并沒有關(guān)注移植細(xì)胞活性的問題,若移植細(xì)胞誘導(dǎo)后活性喪失必然影響到移植的效果。
實施例3、移植誘導(dǎo)MSCs與控釋神經(jīng)營養(yǎng)因子的最佳配比的確定。將GDNF含量不同的控釋GDNF分別在培養(yǎng)液中放置1周,然后將此培養(yǎng)液配成神經(jīng)誘導(dǎo)液分別對3.0×106猴MSCs進行誘導(dǎo),每組6個樣本,并檢測3小時的細(xì)胞凋亡百分比。
GDNF含量ug 細(xì)胞凋亡百分比(平均)0 7.20.256.40.375 5.80.5 3.80.625 3.80.753.6從結(jié)果中可以看出,GDNF含量在0.5時可以明顯降低誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡百分比,而且再增加含量效果無明顯增加,因此,3.0×106細(xì)胞與GDNF含量為0.5ug的控釋GDNF為最佳配比,因在本實驗中移植細(xì)胞總量為1.2×107,因子所需GDNF總量為2ug。而在目前,移植細(xì)胞與控釋因子在移植過程中的比例仍無有效的確定方法。
實施例4、實驗移植骨髓MSCs源性神經(jīng)前體細(xì)胞與GDNF控釋生物材料治療脊髓人為損傷所致的猴神經(jīng)功能障礙實例。按實例1、實例2所述方法分別分離培養(yǎng)MSCs及制備GDNF控釋生物材料。制備動物模型,取8只健康雄性恒河猴,體重4kg,隨機分組。采用肌肉鹽酸氯胺酮注射液與地西泮注射液復(fù)合麻醉,手術(shù)按改良Allen’s法制作胸段脊髓損傷模型。
實驗設(shè)計如下移植組損傷后第10天,消化計數(shù)誘導(dǎo)的猴MSCs,將3.0×106cells/kg與含2ugGDNF的控釋生物材料制成200uL的PBS懸液,分五點注射到實驗組(n=4)脊髓損傷部位(損傷脊髓階段頭尾端左右前角部位各一點,損傷中端后中間溝一點)PBS組給予同等劑量的PBS。
采用美國Nicolet公司生產(chǎn)的VikingIV型誘發(fā)電生理儀分別于術(shù)前、脊髓休克期過后、治療后4-5月進行皮層體感誘發(fā)電位(CSEP)、經(jīng)顱磁刺激運動誘發(fā)電位(MEP)檢測,客觀評價脊髓感覺與運動功能;按照改良Tarlov評分法分標(biāo)準(zhǔn)進行運動功能評價;為了解治療對脊髓結(jié)構(gòu)的保護作用,應(yīng)用尼氏染色觀察前角運動神經(jīng)元,應(yīng)用甘氨銀法觀察軸索,并進行圖形分析。為了解移植細(xì)胞在猴脊髓內(nèi)的存活與分化情況,本發(fā)明對脊髓石蠟切片進行免疫雙標(biāo)組化法檢測Brdu標(biāo)記細(xì)胞的存活、遷移與神經(jīng)分化情況。
CSEP檢測結(jié)果(表1)。
表1 CSEP測潛伏期與波幅的均值(x±s) n=8組別潛伏期(ms)潛伏期(ms)波幅(μV)波幅降低度(μV)實驗組 治療前 16.04±0.82 20.46±0.80 10.56±1.303.78±1.32a治療后 16.75±0.58b20.60±1.18c6.65±0.90對照組 治療前 16.42±1.20 19.82±1.52 9.95±0.849.95±0.84未治療0與對照組比較at=-11.194,P<0.01;與實驗組正常比較,bt=-2.013,P=0.07;與實驗組正常比較,ct=-0.274,P=0.8損傷前所有獼猴脛后神經(jīng)均可引出正常的CSEP信號(圖2)。損傷后所有動物CSEP信號消失,4~5月后,治療組與損傷前相比潛時期無明顯延長,但波幅降低(6.65±0.90)μV,波幅降低度(3.78±1.32)μV,與對照組波幅降低度(9.95±0.84)μV之間具有顯著性差異,p<0.01;對照組CSEP信號仍然無法引出。表明移植組的感覺功能獲得了一定程度的恢復(fù),而PBS組無變化。
MEP檢測結(jié)果(表2)。
表2實驗不同階段MEP的潛伏期和波幅(x±s)潛伏期(ms)波幅(mv)正常 4-5月后正常4-5月后 波幅降低度實驗組 20.15±0.9429.92±1.440.88±0.030 0.43±0.084 0.45±0.032對照組 20.92±0.82 0.92±0.052 0 0.92±0.052實驗組波幅降低度與對照組比較P<0.01MEP由多極性波組成(圖3),損傷后第10天,所有實驗動物MEP缺失,治療后4~5月,實驗組MEP波型有一定恢復(fù),但潛時期延長(p<0.01),波幅降低(P<0.01),對照組MEP仍然缺失。波幅降低度是指與正常波幅之間的差值,間接反映了脊髓損傷后波幅恢復(fù)的程度,波幅降低度越小,與正常值之間的差值就越小,波幅恢復(fù)程度就越高,治療效果就越好。實驗組的波幅降低度明顯低于對照組,p<0.01。表明移植組的運動功能獲得了一定程度的恢復(fù),而PBS組未觀察到這種變化。
Tarlov評分結(jié)果。由于皮質(zhì)脊髓束損傷(上運動神經(jīng)元癱),脊髓休克期(損傷后一周左右),過后,獼猴主要保持一種遲緩性癱瘓狀態(tài)下肢屈曲、內(nèi)收,髖及膝關(guān)鍵屈曲,各趾跖屈。對照組這種狀態(tài)保持到實驗終期,評分等級0級;治療后3周期始,實驗組可觀察到股部肌肉和膝關(guān)節(jié)的輕微運動,8周時這種運動變得較為明顯,膝關(guān)節(jié)活動度增加,并可以觀察到趾及踝關(guān)節(jié)的運動,3月中,膝關(guān)節(jié)活動度明顯加大,但仍不能完全伸展,下肢仍無法支撐自身體重,站立不能,繼續(xù)觀察4周以上,治療效果不再有明顯改觀,處死動物,評分等級1-2級。表明移植組的運動功能有一定恢復(fù),而PBS組運動功能始終不能恢復(fù)。
尼氏染色結(jié)果(表3)。
表3前角運動神經(jīng)元數(shù)量(個)(x±s)實驗組 對照組神經(jīng)元計數(shù) 18.3±0.90 5.6±0.68P<0.01實驗組脊髓前角大、中型運動神經(jīng)元數(shù)量較多,尼氏小體染色正常(圖4A);對照組神經(jīng)元數(shù)量顯著減少(p<0.01),尼氏小體消失(圖4B)。
軸突染色結(jié)果(表4,5)。
表4脊髓皮質(zhì)脊髓側(cè)束橫切面軸突數(shù)量和橫切面積(x±s)項 目軸突數(shù)(個)/平均視野面積(um2)/平均視野左側(cè)① 右側(cè)② 左右平均③ 左側(cè)④ 右側(cè)⑤左右平均⑥實驗組 1423±2611404±189 1412±220 13213.89±2954.23 10238.61±1200.0211771.25±1131.05對照組 734±175 707±229 720±168 6024.71±1542.924992.22±1949.455538.45±2000.28①P<0.01,②P<0.01,③P<0.01,④P<0.01,⑤P<0.01,⑥P<0.01表5脊髓皮質(zhì)脊髓側(cè)束縱切面縱切面積;光密度值(x±s)項 目面積(um2)/平均視野平均光密度 平均積分光密度實驗組(左) 25319.27±2108.01 0.4340±0.0279 11388.82±1307.20(右) 26118.50±2597.80 0.4197±0.0386 12009.36±1512.68(左右平均) 25718.88±2302.82 0.4268±0.0293 11499.09±1390.00對照組(左) 15205.86±1468.36 0.3192±0.0675 5235.30±1179.30(右) 13662.06±3668.50 0.3212±0.03024664.26±1618.21(左右平均) 14413.96±2323.76 0.3202±0.04774949.78±1479.82左側(cè)面積/平均視野比較P<0.01;左側(cè)平均光密度值比較P<0.05;左側(cè)平均積分光密度值比較P<0.01;右側(cè)面積/平均視野比較P<0.01;右側(cè)平均光密度值比較P<0.01;右側(cè)平均積分光密度值比較P<0.01;實驗組組織結(jié)構(gòu)完整,軸突密度高;對照組側(cè)索框架結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重,皮質(zhì)脊髓側(cè)束軸突密度低,軸索破壞(圖5)。光密度反映物體對光的吸收率,可反映軸突染色的深淺度。軸突染色越深,其對光線的吸收越多,故光密度越高。積分光密度是平均光密度與面積的乘積,顏色越深,面積越大,積分光密度越高。結(jié)果顯示治療組后索軸索平均光密度、積分光密度高于對照組,有顯著性差異,p<0.01。表明移植組組織結(jié)構(gòu)恢復(fù)程度較好。
免疫組化染色結(jié)果表明,移植后4~5個月,實驗組脊髓損傷區(qū)仍然有BrdU標(biāo)記的猴骨髓間質(zhì)干細(xì)胞源性細(xì)胞存活,并且可以表達(dá)神經(jīng)元標(biāo)志物NSE(圖6),說明使用本方法可以使移植到脊髓中的誘導(dǎo)的猴骨髓間質(zhì)干細(xì)胞存活,而且有機的與脊髓神經(jīng)組織整合在一起,并進一步具備分化為神經(jīng)組織細(xì)胞的能力。這種雙標(biāo)陽性的細(xì)胞在每張脊髓切片(厚4um)中的數(shù)量為6-8個,散在分布,脊髓內(nèi)各處都可以出現(xiàn)。我們推測移植細(xì)胞替代損傷組織細(xì)胞的方式可能是其修復(fù)脊髓損傷的一個重要機制。
神經(jīng)營養(yǎng)因子已經(jīng)顯示出對中樞神經(jīng)損傷的修復(fù)作用,如何有效的應(yīng)用神經(jīng)營養(yǎng)因子修復(fù)神經(jīng)損傷是目前研究的一個重點。鑒于神經(jīng)營養(yǎng)因子類物質(zhì)在體內(nèi)極易降解、半衰期短的特點,必須建立起一種持續(xù)供給的體系。在轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究領(lǐng)域使用最多的仍是病毒載體,但病毒轉(zhuǎn)載基因的過程包裹非常復(fù)雜的“插入”程序,此外,病毒類載體的存在有引起免疫反應(yīng)和重組病毒的危險,因此,在研究新型載體的同時研究新的應(yīng)用方法很有必要。
藥物控釋已成為可降解生物材料的重要應(yīng)用。單甲氧基聚乙二醇聚乳酸嵌共聚體(mPEG-b-PLA)是一種良好的生物材料,然而這種生物材料是否可以用來進行脊髓局部移植治療還不清楚。
當(dāng)mPEG-b-PLA植入脊髓后,首先發(fā)生的是材料吸水,滲入材料的水很快在材料表面和內(nèi)部之間形成一個梯度。但是這種梯度會在幾天內(nèi)消失,因為像水這樣的小分子的擴散速度比酯鍵的斷裂速度快得多。因而,可以認(rèn)為酯鍵的水解開始時是均勻的。降解會使能加速酯鍵水解的羧基端基的數(shù)目增加,只有能溶于周圍水性介質(zhì)的低聚物才能從材料上脫離下來。隨著時間的延長,那些位于材料表面的可溶性齊聚物可以在完全降解之前被分離出來,而那些在材料內(nèi)部的齊聚物仍然受到束縛,導(dǎo)致內(nèi)部的酸性大于表層,從而產(chǎn)生羧基濃度的內(nèi)外差異。隨著降解的進行,材料內(nèi)部會有越來越多的羧基加速內(nèi)部材料的降解,并進一步增大內(nèi)外差異。當(dāng)內(nèi)部材料完全轉(zhuǎn)變成可降解性齊聚物并溶解在水性介質(zhì)中時,就會形成表面由沒有完全降解的高聚物組成的中空結(jié)構(gòu),其表面厚度由很多因素決定。酶解作用在材料的降解過程中尤其在后期也發(fā)揮了一定作用。
權(quán)利要求
1.骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的制備方法,包括骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng);骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的體外誘導(dǎo);移植誘導(dǎo)骨髓間質(zhì)干細(xì)胞與控釋膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子GDNF的聯(lián)合應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述制備方法,其特征在于骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)包括抽取健康猴骨髓,分離單個核細(xì)胞;接種于含15%胎牛血清FBS的L-DMEM培養(yǎng)液中,培養(yǎng)液中添加堿性成纖維細(xì)胞生長因子bFGF,3ng/ml,培養(yǎng)瓶中貼壁培養(yǎng);取5-8代骨髓間質(zhì)干細(xì)胞進行鑒定,體外誘導(dǎo)觀察其成骨、成脂肪多向分化潛能;移植前48小時5-溴脫氧尿嘧啶核苷酸Brdu按10umol/L濃度標(biāo)記,計數(shù)備用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述制備方法,其特征在于骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的體外誘導(dǎo)時間為1.5小時。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述制備方法,其特征在于3.0×106骨髓間質(zhì)干細(xì)胞與GDNF含量為0.5ug的控釋GDNF為最佳配比。
5.以前述方法制備的骨髓間質(zhì)干細(xì)胞在制備修復(fù)中樞神經(jīng)損傷藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及骨髓間質(zhì)干細(xì)胞制劑的制備及最佳體外神經(jīng)誘導(dǎo)時間,及其與控釋神經(jīng)營養(yǎng)因子最佳混合比例,用于治療腦及脊髓中樞神經(jīng)系統(tǒng)和其它疾病的新技術(shù)。骨髓間質(zhì)干細(xì)胞MSC的制備方法,包括骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng);骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的體外誘導(dǎo);移植誘導(dǎo)骨髓間質(zhì)干細(xì)胞與控釋膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子GDNF的聯(lián)合應(yīng)用。本發(fā)明還包括以前述方法制備的骨髓間質(zhì)干細(xì)胞在制備修復(fù)中樞神經(jīng)損傷藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明確定了最佳神經(jīng)誘導(dǎo)時間,最佳MSC與控釋GDNF比例,通過聯(lián)合局部移植的方法使損傷猴脊髓的功能康復(fù)及結(jié)構(gòu)修復(fù),為細(xì)胞與生物工程材料的聯(lián)合應(yīng)用提供了指導(dǎo)方法。因此,本發(fā)明是治療脊髓損傷和相關(guān)疾病的有效策略,具有廣闊的臨床開發(fā)前景。
文檔編號C12N5/08GK1710068SQ200510035460
公開日2005年12月21日 申請日期2005年6月23日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月23日
發(fā)明者鄧宇斌 申請人:中山大學(xué)