專利名稱：抗血小板膜糖蛋白vi單克隆抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及人血小板膜糖蛋白VI(以下可簡稱GPVI)的抗體和產(chǎn)生該抗體的細(xì)胞。
背景技術(shù)：
血小板在血液凝固、機(jī)體防御中擔(dān)負(fù)著極其重要的作用，由其生理學(xué)作用可以闡明多種病態(tài)相關(guān)。特別是在血小板形成止血栓的功能中引人注目，例如，血管內(nèi)皮細(xì)胞受到損傷，則血管內(nèi)皮下的主要基質(zhì)蛋白——膠原暴露出來，血小板與其粘附。接著，通過來自膠原的信號，血小板被活化，最終，血小板經(jīng)由血纖蛋白原凝聚。根據(jù)情況，這成為血栓栓塞性疾病等病狀的原因，作為治療的目標(biāo)而引人注目。
以往，為了由于血小板凝聚而導(dǎo)致的血栓形成的治療、預(yù)防，人們使用了阿司匹林、噻氯匹定、GPIIb/IIIa拮抗劑等抗血小板藥物，但在有效性和出血等副作用方面人們也指出了很多的問題，人們希望有不具上述問題、具有充分的安全性和確切且適合的作用的優(yōu)異的抗血小板藥面世。
已經(jīng)明確存在于血小板膜上的GPVI是血小板的膠原受體，由膠原刺激導(dǎo)致血小板活化中起主要的作用(非專利文獻(xiàn)1高山博史，日本學(xué)血栓止血學(xué)會志，2003年，第14卷，第2號，參照75-81頁)。即，Sugiyama等人在自身免疫性血小板減少患者的血小板中發(fā)現(xiàn)了62kDa膜蛋白特異性缺失，未見膠原導(dǎo)致的血小板凝聚(參照非專利文獻(xiàn)2Tateo Sugiyama等6人，Blood，(美國)，1987年，第69卷，第6號，1712-1720頁)，還有報告指出，該患者的血小板中，缺失的蛋白是GPVI，由患者的血清純化得到的抗體Fab片段抑制膠原引發(fā)的血小板凝聚(參照非專利文獻(xiàn)2和非專利文獻(xiàn)3Masaaki Moroi等4人，Journalof Clinical Investigation，(美國)，1989年，第84卷，第5號，1440-1445頁)。
目前，Sugiyama等人(參照非專利文獻(xiàn)2)和Takahashi等人(參照非專利文獻(xiàn)4)報道了來自自身免疫疾病患者的抗人GPVI自身抗體。但是，Sugiyama等人的報告中，由患者的血漿純化得到的抗人GPVI自身抗體具有引發(fā)血小板凝聚的作用，不可直接用于藥物。非專利文獻(xiàn)4(Hoyu Takahashi等2人，American Journal of Hematology，美國，2001年，第67卷，第4號，262-267頁)中記載有推測為GPVI的約62kDa的蛋白的自身抗體存在，以及該抗體引發(fā)血小板凝聚。另外，為了將來自這些患者的抗GPVI抗體作為藥物應(yīng)用于臨床，必須以穩(wěn)定的品質(zhì)、大量生產(chǎn)安全性高的抗體，但工業(yè)生產(chǎn)的方法尚未確立。
目前制備的抗GPVI抗體有抗小鼠GPVI單克隆大鼠抗體(參照專利文獻(xiàn)1EP1228768)、以及抗人GPVI單克隆小鼠抗體(參照專利文獻(xiàn)2WO01/00810和專利文獻(xiàn)3WO02/080968，Thromb Haemost.2003年7月號；89(6)996-1003)。它們是來自非人動物的抗體，施用于人時，具有高度的免疫原性(也可以稱作“抗原性”)，因此有副作用的危險性，將該抗體直接施用于人是不適當(dāng)?shù)?，人們希望施用于人的抗體是純粹的來自人的人抗體。
另外，采用噬菌體顯示法等制備識別人GPVI的人單鏈抗體(scFv)(參照專利文獻(xiàn)2、專利文獻(xiàn)3和非專利文獻(xiàn)5Peter A Smethurst)共16人、Blood，(美國)，2002年，第100卷，第11號，474a頁)。這些單鏈抗體是通過肽接頭使人抗體的VH與VL連接而成的，是具有來自人的可變區(qū)的抗體，但與細(xì)胞產(chǎn)生的通常的免疫球蛋白相比，通常與抗原的親和性低，在機(jī)體內(nèi)的半衰期也短。
通過CDR(互補(bǔ)決定區(qū))移植等制備人源抗體的方法已是公知的，但CDR的氨基酸序列、以及大多情況下的支架區(qū)(FR)的一部分來自非人動物抗體，抗體的氨基酸序列的全部不是來自人，因此有人認(rèn)為有可能在機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生對所施用的抗體的抗體，從免疫原性方面來看，作為藥物，并不是有效且安全的。關(guān)于人抗體的制備已有很多報道，這些報道的方法都存在各種問題，目前的現(xiàn)狀是尚未認(rèn)識到可適合所有抗原的常規(guī)化方法，通常難以獲得高滴度的人抗體。
發(fā)明內(nèi)容
由此，在人們需求安全性高、有效性優(yōu)異且易于使用的藥物作為抗血小板藥的狀況下，迫切需要的是可以施用于人的純粹地來自人的抗GPVI抗體。
本發(fā)明的目的在于提供與存在于人血小板膜上的糖蛋白——GPVI特異性結(jié)合的新型抗體，優(yōu)選單克隆抗體。特別提供可施用于人、有效且副作用方面沒有問題的純粹來自人的抗GPVI人抗體。還提供與人GPVI特異性結(jié)合、含有新的CDR序列的抗體。
進(jìn)一步提供產(chǎn)生這些抗體的細(xì)胞，具體提供特定的雜交瘤。
本發(fā)明人為解決上述課題，以產(chǎn)生GPVI的自身抗體的人淋巴細(xì)胞為出發(fā)材料，著力獲得有效抑制經(jīng)由GPVI的血小板凝聚的人抗體?；谠撓敕?，進(jìn)行了深入地研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在通過特定條件的體外免疫法活化末梢血淋巴細(xì)胞，制備與小鼠骨髓瘤細(xì)胞的雜交瘤時，從多個雜交瘤中成功地獲得了產(chǎn)生具有與GPVI的結(jié)合能力，具有抑制膠原導(dǎo)致的血小板凝聚的活性的抗體的雜交瘤。分離該克隆，進(jìn)一步研究，結(jié)果成功地獲得了編碼該抗體的基因，明確了該抗體的CDR的氨基酸序列是新的序列。并通過基因重組技術(shù)制備了重組抗體，從而完成了本發(fā)明。
本說明書中，將雜交瘤(例如克隆#2-6)產(chǎn)生的抗體記為#2-6抗體，將由該雜交瘤的抗體基因進(jìn)行基因工程重組的抗體記為R#2-6抗體。
本發(fā)明的第1方案是與人GPVI特異性結(jié)合的人抗體，優(yōu)選單克隆抗體(以下分別記為抗人GPVI抗體和人GPVI單克隆抗體)或其活性片段，優(yōu)選單獨(dú)不會引發(fā)人血小板凝聚的抗體或其活性片段。具體為(1)與人GPVI特異性結(jié)合，通過體內(nèi)施用，抑制膠原導(dǎo)致的人血小板凝聚的人抗體或其活性片段，優(yōu)選將該抗體或活性片段體內(nèi)施用后，對于由血液中分離出的血小板，由膠原引發(fā)的凝聚能比通常的血小板低或未觀察到；(2)具有以下任何一個或以上的作用的人抗體或其活性片段與人GPVI特異性結(jié)合，特異性抑制血小板上的GPVI與膠原的結(jié)合，使血小板上的功能性GPVI消失，或者通過預(yù)先與人血小板接觸，抑制膠原導(dǎo)致的血小板凝聚，即，使人血小板因應(yīng)答膠原而凝聚的能力降低或缺失；(3)上述(1)-(2)的抗體或其活性片段，該抗體或其活性片段將血小板上的人GPVI攝入該血小板的細(xì)胞內(nèi)(內(nèi)化)，或者通過切斷來抑制膠原導(dǎo)致的人血小板凝聚。
上述(1)-(3)的抗體優(yōu)選為單獨(dú)不引發(fā)人血小板凝聚和/或體內(nèi)施用時不會引起血小板減少的抗體。優(yōu)選的例子有克隆#2-6或#2-4的雜交瘤所產(chǎn)生的抗體或?qū)⑵渑c人IgG、更優(yōu)選人IgG4重組的抗體。另外，本發(fā)明的抗體是人GPVI與抗體的解離常數(shù)(Kd值)優(yōu)選為100nM或以下，更優(yōu)選為50nM或以下的抗體。本發(fā)明的抗體的活性片段只要具有與GPVI的結(jié)合能力即可，例如是Fab(抗原結(jié)合片段)、Fab’、F(ab’)2、單鏈抗體(scFv)、二硫鍵穩(wěn)定化抗體(dsFv)、含有CDR的肽等。
具體來說，是(4)與人GPVI特異性結(jié)合，特異性抑制膠原導(dǎo)致的人血小板凝聚、但不抑制凝血酶導(dǎo)致的凝聚，單獨(dú)不會引發(fā)人血小板凝聚的人抗體或其活性片段。在與抑制由膠原導(dǎo)致的血小板凝聚的濃度或用量同等、優(yōu)選10倍、更優(yōu)選100倍、進(jìn)一步優(yōu)選1000倍的情況下單獨(dú)不會顯著引發(fā)人血小板凝聚的抗體或其活性片段。
這里，上述(1)-(4)的抗體中，抑制人GPVI與膠原的結(jié)合的抗體優(yōu)選以10nM或以下、更優(yōu)選以1nM或以下、進(jìn)一步優(yōu)選0.1nM或以下的解離常數(shù)(Kd值)抑制人GPVI與膠原的結(jié)合。
本發(fā)明的抗體并不限定為特定的克隆，具有與本發(fā)明的優(yōu)選的例子(#2-6、#2-4、R#2-6或#2-4抗體等)同樣作用的抗體都包含在本發(fā)明的范圍。本發(fā)明的抗體的作用的有無可以通過實(shí)施例所示的方法或公知的方法確認(rèn)。
與本發(fā)明優(yōu)選的抗體在GPVI上的結(jié)合部位或表位相同或至少部分相同的抗體、例如在與GPVI的結(jié)合中存在互相競爭的關(guān)系的抗體也包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。與本發(fā)明的抗體的結(jié)合部位是否有共通性，可以按照實(shí)施例記載的方法或公知的方法確認(rèn)。
本發(fā)明的第2方案是含有新型的CDR氨基酸序列或可變區(qū)氨基酸序列的抗人GPVI抗體，優(yōu)選為單克隆抗體。具體來說，是(5)抗人GPVI抗體或其活性片段，其中，至少抗體的H鏈或L鏈一方中的3組CDR、優(yōu)選抗體的H鏈和L鏈雙方的6組CDR含有表4記載的克隆、優(yōu)選選自克隆#2-6和#2-4的任意雜交瘤產(chǎn)生的抗體的CDR氨基酸序列，以此作為分別對應(yīng)的CDR的氨基酸序列；(6)VH CDR1中含有SEQ ID NO.47的氨基酸序列、VH CDR2中含有SEQ ID NO.48的氨基酸序列、VH CDR3中含有SEQ ID NO.49的氨基酸序列、VLCDR1中含有SEQ ID NO.98的氨基酸序列、VLCDR2中含有SEQ ID NO.99的氨基酸序列、VLCDR3中含有SEQID NO.100的氨基酸序列的抗體或其活性片段，或者VH CDR1中含有SEQ ID NO.7的氨基酸序列、VH CDR2中含有SEQ ID NO.8的氨基酸序列、VH CDR3中含有SEQ ID NO.9的氨基酸序列、VLCDR1中含有SEQ ID NO.10的氨基酸序列、VLCDR2中含有SEQ ID NO.11的氨基酸序列、VLCDR3中含有SEQ ID NO.12的氨基酸序列的抗體或其活性片段；(7)抗人GPVI抗體或其活性片段，其中，至少抗體的H鏈或L鏈的可變區(qū)、優(yōu)選抗體的H鏈和L鏈雙方的可變區(qū)含有表4記載的克隆、優(yōu)選選自克隆#2-6和#2-4的任意雜交瘤產(chǎn)生的抗體所具有的可變區(qū)的氨基酸序列，以此作為分別對應(yīng)的可變區(qū)的氨基酸序列；(8)H鏈的可變區(qū)含有SEQ ID NO.143的氨基酸序列、L鏈的可變區(qū)含有SEQ ID NO.144的氨基酸序列的抗體或其活性片段，或者H鏈的可變區(qū)含有SEQ ID NO.15的氨基酸序列、L鏈的可變區(qū)含有SEQ IDNO.16的氨基酸序列的抗體或其活性片段；(9)#2-6細(xì)胞或#2-4細(xì)胞產(chǎn)生的單克隆抗體或其活性片段。
本發(fā)明的第3方案是產(chǎn)生第1或第2方案的抗體的細(xì)胞。具體來說，是(10)產(chǎn)生上述(1)-(9)記載的任何抗體的轉(zhuǎn)化細(xì)胞、(11)上述(10)的細(xì)胞，該細(xì)胞為#2-6細(xì)胞或#2-4細(xì)胞。
本發(fā)明的第4方案是多核苷酸或核酸，該多核苷酸或核酸含有編碼第1或第2方案的抗體或其活性片段的至少H鏈或L鏈一方中的3組CDR、優(yōu)選可變區(qū)的堿基序列。具體來說，是編碼第1或第2方案的抗體或其活性片段的多核苷酸，(12)多核苷酸，該多核苷酸含有在表4記載的克隆、優(yōu)選選自克隆#2-6和2-4的任意的雜交瘤的抗體的基因中編碼分別對應(yīng)的CDR的堿基序列，以此作為編碼至少抗體的H鏈或L鏈一方中的3組CDR、優(yōu)選抗體的H鏈或L鏈兩方的6組CDR的堿基序列；(13)分別含有編碼VH CDR1的SEQ ID NO.147的堿基序列、編碼VH CDR2的SEQ ID NO.148的堿基序列、編碼VH CDR3的SEQ IDNO.149的堿基序列、編碼VL CDR1的SEQ ID NO.150的堿基序列、編碼VL CDR2的SEQ ID NO.151的堿基序列、編碼VL CDR3的SEQID NO.152的堿基序列的多核苷酸，或者分別含有編碼VH CDR1的SEQ ID NO.23的堿基序列、編碼VH CDR2的SEQ ID NO.24的堿基序列、編碼VH CDR3的SEQ ID NO.25的堿基序列、編碼VL CDR1的SEQ ID NO.26的堿基序列、編碼VL CDR2的SEQ ID NO.27的堿基序列、編碼VL CDR3的SEQ ID NO.28的堿基序列的多核苷酸；(14)多核苷酸，該多核苷酸含有在表4記載的克隆、優(yōu)選選自克隆#2-6和#2-4的任意的雜交瘤的抗體基因中編碼分別對應(yīng)的可變區(qū)的堿基序列，以此作為至少抗體的H鏈或L鏈的可變區(qū)、優(yōu)選抗體的H鏈和L鏈兩方的可變區(qū)；(15)含有編碼H鏈的可變區(qū)的SEQ ID NO.145的堿基序列和編碼L鏈的可變區(qū)的SEQ ID NO.146的堿基序列的多核苷酸，或者含有編碼H鏈的可變區(qū)的SEQ ID NO.31的堿基序列和編碼L鏈的可變區(qū)的SEQ ID NO.32的堿基序列的多核苷酸。
本發(fā)明的第5方案是制備第1或第2方案的抗體的方法。具體來說，制備第1或第2方案的抗體的方法包括，(16)包含培養(yǎng)上述(10)的細(xì)胞的步驟、以及收集該細(xì)胞產(chǎn)生的單克隆抗體的步驟的制備方法；(17)包含培養(yǎng)上述(10)的細(xì)胞的步驟、以及收集該細(xì)胞產(chǎn)生的單克隆抗體的步驟的制備方法；(18)包含使用第4方案的多核苷酸、含有該多核苷酸的表達(dá)載體、含有該多核苷酸或該表達(dá)載體的細(xì)胞的任意的步驟的制備方法。
本發(fā)明的第6方案涉及含有本發(fā)明第1或第2方案的抗體為有效成分的藥物組合物，優(yōu)選為用于血栓性、栓塞性或動脈硬化性疾病的預(yù)防和/或治療的藥物組合物。
本發(fā)明的第7方案是使用本發(fā)明第1或第2方案的抗體對試樣中GPVI進(jìn)行檢測或定量，由此來進(jìn)行疾病的診斷的方法，優(yōu)選對血液凝固異常相關(guān)疾病進(jìn)行診斷的方法。
本發(fā)明的第8方案是由重組人抗體、特別是重組人-人嵌合抗體、具體說就是通過基因工程的方法重組人抗體(例如IgM抗體)來制備其它類的人抗體(例如IgG抗體、特別是人IgG4抗體)或編碼它們的多核苷酸的方法，該方法包含例如通過基因工程方法重組編碼雜交瘤產(chǎn)生的抗體(例如人IgM)的多核苷酸、和公知的人抗體(例如IgG4抗體)的多核苷酸的步驟。該方法有以雜交瘤的mRNA和/或基因組DNA為模板的PCR法，具體有實(shí)施例9、優(yōu)選實(shí)施例10記載的方法。實(shí)施例10中，以基因組DNA為模板，通過PVR擴(kuò)增多個外顯子，將這些多種(IgG有4種)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物混合，同時實(shí)施PCR，可以簡便地制備編碼目標(biāo)抗體的多核苷酸。
附圖簡述
圖1是表示構(gòu)建GPVI-Fc表達(dá)質(zhì)粒pCAGGS-GPVI-Fc的流程圖。
圖2是表示構(gòu)建用于制備重組病毒的轉(zhuǎn)移載體的克隆——pYNG-GPVI-Fc的流程圖。
圖3是表示通過與GPVI-Fc的反應(yīng)性，由ELISA法測定18種抗GPVI單克隆人抗體的結(jié)合活性的結(jié)果圖。圖4是表示重組抗GPVI人抗體(R#2-4和R#2-6)與由人末梢血制備的血小板結(jié)合的圖。
圖5是表示各種人IgG化GPVI抗體與GPVI-hFc的結(jié)合性的圖。
本發(fā)明的抗體是單克隆抗體。該單克隆抗體的制備方法不限于特定的方法，例如可以是雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體、摻入抗體的基因的重組細(xì)胞所產(chǎn)生的單克隆抗體、或者由EB病毒轉(zhuǎn)化的細(xì)胞所產(chǎn)生的單克隆抗體等任何抗體。
人抗體是指可變區(qū)全體和恒定區(qū)全體都含有來自人的氨基酸序列的抗體。本發(fā)明的人抗體的制備方法不限于特定的方法，例如可以是人-人雜交瘤所產(chǎn)生的人抗體、轉(zhuǎn)基因動物所產(chǎn)生的人抗體、摻入人抗體的基因的重組細(xì)胞所產(chǎn)生的人抗體、由EB病毒轉(zhuǎn)化的人細(xì)胞所產(chǎn)生的抗體、或者用產(chǎn)生自身抗體的人的淋巴細(xì)胞制備的雜交瘤所產(chǎn)生的人抗體的任何抗體。
本發(fā)明的抗體是與人GPVI特異性結(jié)合的抗體。優(yōu)選本發(fā)明的抗體中，人GPVI與抗體的解離常數(shù)(Kd值)為100nM或以下，更優(yōu)選為50nM或以下。測定人GPVI與抗體的解離常數(shù)的方法不限于特定的方法，可通過常規(guī)方法進(jìn)行。例如可使用固定于芯片上的GPVI-Fc，通過如BIACORE3000這樣的蛋白質(zhì)相互作用分析裝置來測定。具體如本發(fā)明的抗體具有抑制由膠原導(dǎo)致的人血小板凝聚的作用。這里，血小板凝聚可通過公知的方法測定，例如可用血小板凝聚能測定裝置等，以透光率為指標(biāo)，通過計算凝聚率來測定，通常，以透光率為最大的點(diǎn)的凝聚率(以下可稱為最大凝聚率)表示。在后述的實(shí)施例6所記載的方法中，本發(fā)明的抗體在優(yōu)選10μg/mL或以下、更優(yōu)選1μg/mL或以下、進(jìn)一步優(yōu)選0.1μg/mL或以下的濃度下，使最大凝聚率減少至優(yōu)選對照的50％或以下、更優(yōu)選對照的30％或以下、進(jìn)一步優(yōu)選對照的20％或以下、最優(yōu)選對照的10％或以下。測定抑制膠原導(dǎo)致的人血小板凝聚的方法不限于上述方法，可通過常規(guī)方法進(jìn)行。還優(yōu)選在實(shí)施例6所記載的方法中具有抑制膠原引發(fā)人血小板凝聚的作用、即不管是否有直接的作用，通過使人血小板應(yīng)答膠原而凝聚的能力降低或缺失，間接地抑制膠原引發(fā)人血小板凝聚的作用的抗體。例如在實(shí)施例15記載的方法中，本發(fā)明的抗體在例如30μg/mL或以下、優(yōu)選10μg/mL或以下、更優(yōu)選1μg/mL或以下的濃度下，優(yōu)選使最大凝聚率減少至對照的30％或以下、優(yōu)選對照的10％或以下、進(jìn)一步優(yōu)選對照的5％或以下。
本發(fā)明的抗體優(yōu)選不抑制膠原以外的引發(fā)血小板凝聚的物質(zhì)例如凝血酶導(dǎo)致的凝聚，在后述的實(shí)施例6記載的方法中，本發(fā)明的抗體在優(yōu)選0.1μg/mL或以上、更優(yōu)選1μg/mL或以上、進(jìn)一步優(yōu)選10μg/mL或以上、特別優(yōu)選100μg/mL或以上的抗體濃度下，最大凝聚率優(yōu)選為對照的80％或以上、更優(yōu)選為對照的85％或以上、進(jìn)一步優(yōu)選為對照的90％或以上、特別優(yōu)選為對照的95％或以上。測定對由膠原以外的引發(fā)血小板凝聚的物質(zhì)導(dǎo)致的人血小板凝聚的抑制的方法不限于上述方法，可通過其它常規(guī)方法進(jìn)行。
即在引發(fā)血小板凝聚的物質(zhì)不存在下，本發(fā)明的抗體單獨(dú)不會促進(jìn)或引發(fā)人血小板凝聚，在后述的實(shí)施例6記載的方法中，優(yōu)選在0.1μg/mL或以上、更優(yōu)選1μg/mL或以上、進(jìn)一步優(yōu)選10μg/mL或以上、特別優(yōu)選100μg/mL或以上的抗體濃度下，最大凝聚率優(yōu)選為20％或以下、更優(yōu)選為10％或以下。在單獨(dú)的抗體下測定血小板凝聚的方法不受限定，可通過常規(guī)方法進(jìn)行。另外，例如使用全血、優(yōu)選經(jīng)抗凝血劑(阿加曲班等)處理的全血，可以間接評價對血小板的影響。實(shí)施例14中給出了一例。
目前所報告的幾乎所有的人GPVI的抗體，包括上述人自身抗體在內(nèi)，單獨(dú)的抗體在體外具有活化血小板的作用、和/或引發(fā)或促進(jìn)血小板凝聚的作用，因此在施用于機(jī)體時，有可能引起血小板減少。有報道稱以Fab片段等的形式不會引發(fā)血小板凝聚，但在機(jī)體內(nèi)，由于某些原因，不能完全否定Fab發(fā)生交聯(lián)或凝聚，顯示與IgG等同樣的問題的可能性。因而，優(yōu)選不僅抗體的活性片段，即使是完整的抗體分子、例如IgG的形式也不顯示上述作用或上述作用低的抗GPVI抗體。
另外，自然形態(tài)的抗體分子例如IgG等在機(jī)體內(nèi)的動態(tài)和穩(wěn)定性優(yōu)異。通常，與Fab等片段相比，IgG在血液中的半衰期長很多，特別是血栓形成等慢性疾病或需要長時間施用抗體的病態(tài)中，希望是血液中半衰期長的分子形態(tài)，特別優(yōu)選IgG。
本發(fā)明的抗體可以特異性抑制血小板上的GPVI和膠原的結(jié)合，在后述的實(shí)施例7記載的方法中，本發(fā)明的抗體為優(yōu)選以100μg/mL或以下、更優(yōu)選100μg/mL或以下、進(jìn)一步優(yōu)選1μg/mL或以下、特別優(yōu)選0.1μg/mL或以下的濃度50％抑制GPVI與膠原的結(jié)合的抗體。測定膠原與GPVI的結(jié)合的方法不限于特別的方法，可按照常規(guī)方法進(jìn)行。
通過體內(nèi)施用，本發(fā)明的抗體抑制膠原導(dǎo)致的血小板凝聚。可以認(rèn)為本發(fā)明的抗體抑制膠原導(dǎo)致的血小板凝聚的機(jī)理是(i)本發(fā)明的抗體抑制因血管內(nèi)皮細(xì)胞傷害而暴露的膠原與存在于血小板上的GPVI的結(jié)合；(ii)預(yù)先使本發(fā)明的抗體與存在于血小板表面上的GPVI結(jié)合，形成不能與膠原結(jié)合的狀態(tài)；(iii)通過本發(fā)明的抗體與血小板和/或巨核細(xì)胞表面上的GPVI結(jié)合而將GPVI攝入內(nèi)部(內(nèi)化)，結(jié)果使GPVI從血小板表面消失；或者(iv)通過本發(fā)明的抗體所具有的活性，切斷存在于血小板和/或巨核細(xì)胞表面的GPVI，結(jié)果使GPVI從血小板表面消失等。本發(fā)明的人抗體對于膠原導(dǎo)致的血小板凝聚的抑制的機(jī)理可以是任何一種，也可以兼具多種機(jī)理。
本發(fā)明的第2方案有含有新型CDR氨基酸序列或可變區(qū)氨基酸序列的抗人GPVI單克隆抗體。
抗體的重鏈和輕鏈的N末端一側(cè)存在可變區(qū)，分別稱為重鏈可變區(qū)(VH)、輕鏈可變區(qū)(VL)?？勺儏^(qū)內(nèi)存在互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)，該部分擔(dān)負(fù)著抗原識別的特異性。可變區(qū)除CDR以外的部分具有保持CDR結(jié)構(gòu)的作用，稱為支架區(qū)(FR)。重鏈和輕鏈的C末端存在恒定區(qū)，分別稱為重鏈恒定區(qū)(CH)、輕鏈恒定區(qū)(CL)。
重鏈可變區(qū)中存在第一互補(bǔ)決定區(qū)(CDR1)、第二互補(bǔ)決定區(qū)(CDR2)和第三互補(bǔ)決定區(qū)(CDR3)三個互補(bǔ)決定區(qū)。將重鏈可變區(qū)中的三個互補(bǔ)決定區(qū)總括起來稱為重鏈互補(bǔ)決定區(qū)。輕鏈可變區(qū)中也同樣，存在第一互補(bǔ)決定區(qū)(CDR1)、第二互補(bǔ)決定區(qū)(CDR2)和第三互補(bǔ)決定區(qū)(CDR3)三個互補(bǔ)決定區(qū)。將輕鏈可變區(qū)中的三個互補(bǔ)決定區(qū)總括起來稱為輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)。
本發(fā)明的抗體的CDR序列并沒有限定，優(yōu)選抗體含有作為VHCDR1的SEQ ID NO.47的氨基酸序列、作為VH CDR2的SEQ IDNO.48的氨基酸序列、作為VH CDR3的SEQ ID NO.49的氨基酸序列、作為VL CDR1的SEQ ID NO.98的氨基酸序列、作為VL CDR2的SEQID NO.99的氨基酸序列或作為VL CDR3的SEQ ID NO.100的氨基酸序列中的任何一個或以上，優(yōu)選含有H鏈的三個、更優(yōu)選含有全部的氨基酸序列。
本發(fā)明的抗體的VH和VL的氨基酸序列不受限定，優(yōu)選的抗體有含有作為VH的SEQ ID NO.143的氨基酸序列或作為VL的SEQ IDNO.144的氨基酸序列的任意一個或以上的抗體，或者含有作為VH的SEQ ID NO.15的氨基酸序列或作為VL的SEQ ID NO.16的氨基酸序列的任意一個或以上的抗體。
本發(fā)明的抗體不必限定于特定的氨基酸序列，在對其活性和/或抗原性不產(chǎn)生實(shí)質(zhì)影響的范圍內(nèi)，允許在本發(fā)明的抗體的氨基酸序列中，例如在可變區(qū)、特別是FR部分進(jìn)行1至多個氨基酸殘基的附加、缺失、置換和/或插入。
本發(fā)明的抗體為恒定區(qū)含有優(yōu)選來自人抗體、更優(yōu)選來自人IgG、進(jìn)一步優(yōu)選來自人IgG4的氨基酸序列的抗體。
本發(fā)明的抗體并不限定于特定的分子種類?？贵w、即免疫球蛋白的結(jié)構(gòu)含有重鏈(H鏈)和輕鏈(L鏈)，根據(jù)重鏈的類型(γ、α、μ、δ、ε)而分為5種同型(IgG、IgA、IgM、IgD、IgE)。其中，IgG和IgA由于重鏈不同(例如人有γ1、γ2、γ3、γ4、α1、α2)而分有亞類(例如人有IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2)。輕鏈被分類為κ或λ的其中之一型。本發(fā)明的抗體并不限于類、亞型或同型，可以是任何類型。優(yōu)選同型為IgG的抗體，從沒有補(bǔ)體結(jié)合性的觀點(diǎn)看，進(jìn)一步優(yōu)選亞類為IgG4的抗體。
對于本發(fā)明的抗體的活性，例如只要具有與GPVI的結(jié)合能力即可，可以是抗體的片段或一部分。例如可以是Fab(抗原結(jié)合片段)、Fab’、(Fab’)2、單鏈抗體(scFv)、二硫鍵穩(wěn)定化抗體(dsFv)、含有CDR的肽等。
本發(fā)明的第3方案提供產(chǎn)生本發(fā)明的抗體的細(xì)胞。所述細(xì)胞的例子有雜交瘤、轉(zhuǎn)化物、或者導(dǎo)入了本發(fā)明的抗體的基因的基因重組細(xì)胞等。產(chǎn)生抗體的雜交瘤具體有使用從產(chǎn)生GPVI的自身抗體的人末梢血采集的淋巴細(xì)胞制備的雜交瘤——#2-6細(xì)胞或#2-4細(xì)胞。本發(fā)明還提供上述發(fā)明的細(xì)胞所產(chǎn)生的抗體?？贵w生成細(xì)胞不限于特定的細(xì)胞，優(yōu)選使用從產(chǎn)生GPVI的自身抗體的人末梢血采集的淋巴細(xì)胞制備的雜交瘤所產(chǎn)生的抗體，進(jìn)一步優(yōu)選#2-6細(xì)胞或#2-4細(xì)胞所產(chǎn)生的抗體、以及通過基因重組技術(shù)由該抗體制備的重組抗體。
本發(fā)明的第4方案提供編碼本發(fā)明第1或第2方案的抗體的多核苷酸或核酸。該多核苷酸只要是編碼本發(fā)明的抗體的氨基酸序列的即可，不受限定，多核苷酸包含DNA和RNA。
編碼本發(fā)明的抗體的CDR序列的多核苷酸不受限定，優(yōu)選為含有編碼作為VH CDR1的氨基酸序列的SEQ ID NO.147堿基序列、編碼作為VH CDR2的氨基酸序列的SEQ ID NO.148堿基序列、編碼作為VH CDR3的氨基酸序列的SEQ ID NO.149堿基序列、編碼作為VLCDR1的氨基酸序列的SEQ ID NO.150堿基序列、編碼作為VL CDR2的氨基酸序列的SEQ ID NO.151堿基序列或編碼作為VL CDR3的氨基酸序列的SEQ ID NO.152堿基序列中的任何一個或以上、更優(yōu)選含有H鏈的三個、進(jìn)一步優(yōu)選含有全部的堿基序列的多核苷酸，還優(yōu)選為含有編碼作為VH CDR1的氨基酸序列的SEQ ID NO.23堿基序列、編碼作為VH CDR2的氨基酸序列的SEQ ID NO.24堿基序列、編碼作為VH CDR3的氨基酸序列的SEQ ID NO.25堿基序列、編碼作為VLCDR1的氨基酸序列的SEQ ID NO.26堿基序列、編碼作為VL CDR2的氨基酸序列的SEQ ID NO.27堿基序列或編碼作為VL CDR3的氨基酸序列的SEQ ID NO.28堿基序列中的任何一個或以上、更優(yōu)選含有H鏈的三個、進(jìn)一步優(yōu)選含有所全部的堿基序列的多核苷酸。
編碼本發(fā)明的抗體的VH和VL的氨基酸序列的多核苷酸不受限定，優(yōu)選含有編碼作為VH的氨基酸序列的SEQ ID NO.145堿基序列、或編碼作為VL的氨基酸序列的SEQ ID NO.146堿基序列中的任意一個，更優(yōu)選含有兩種堿基序列的多核苷酸，還優(yōu)選含有編碼作為VH的氨基酸序列的SEQ ID NO.31堿基序列、或編碼作為VL的氨基酸序列的SEQ ID NO.32堿基序列中的任意一個，更優(yōu)選含有兩種堿基序列的多核苷酸。
編碼本發(fā)明抗體的恒定區(qū)的多核苷酸含有優(yōu)選來自人抗體、更優(yōu)選來自人IgG、進(jìn)一步優(yōu)選來自人IgG4的堿基序列。
通過將含有本發(fā)明的抗體的核苷酸序列的基因移入細(xì)胞中，可以制備產(chǎn)生本發(fā)明的抗體的細(xì)胞。移入的基因為含有編碼作為VH CDR1的氨基酸序列的SEQ ID NO.147堿基序列、編碼作為VH CDR2的氨基酸序列的SEQ ID NO.148堿基序列、編碼作為VH CDR3的氨基酸序列的SEQ ID NO.149堿基序列、編碼作為VL CDR1的氨基酸序列的SEQ ID NO.150堿基序列、編碼作為VL CDR2的氨基酸序列的SEQ IDNO.151堿基序列或編碼作為VL CDR3的氨基酸序列的SEQ IDNO.152堿基序列中的任何一個或以上的基因，還優(yōu)選含有編碼作為VH CDR1的氨基酸序列的SEQ ID NO.23堿基序列、編碼作為VHCDR2的氨基酸序列的SEQ ID NO.24堿基序列、編碼作為VH CDR3的氨基酸序列的SEQ ID NO.25堿基序列、編碼作為VL CDR1的氨基酸序列的SEQ ID NO.26堿基序列、編碼作為VL CDR2的氨基酸序列的SEQ ID NO.27堿基序列或編碼作為VL CDR3的氨基酸序列的SEQID NO.28堿基序列中的任何一個或以上的基因。移入的基因優(yōu)選含有編碼作為VH的氨基酸序列的SEQ ID NO.145堿基序列或編碼作為VL的氨基酸序列的SEQ ID NO.146堿基序列中的任意一個或以上的基因，或者優(yōu)選含有編碼作為VH的氨基酸序列的SEQ ID NO.31堿基序列、或編碼作為VL的氨基酸序列的SEQ ID NO.32堿基序列中的任意一個或以上的基因。引入的基因還優(yōu)選具有編碼作為VH的氨基酸序列的SEQ ID NO.145堿基序列和編碼作為VL的氨基酸序列的SEQ IDNO.146堿基序列的基因，或者具有編碼作為VH的氨基酸序列的SEQID NO.31堿基序列和編碼作為VL的氨基酸序列的SEQ ID NO.32堿基序列的基因；進(jìn)一步優(yōu)選含有編碼恒定區(qū)來自人抗體的氨基酸序列的堿基序列的基因。
(制備方法)本發(fā)明的第5方案提供抗體的生產(chǎn)方法。制作本發(fā)明的抗體的方法沒有限定，可以用以下記載的方法制備。即，從對GPVI產(chǎn)生自身抗體的患者末梢血中采集淋巴細(xì)胞，制備通過體外免疫法活化的淋巴細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞的雜交瘤。得到制備的雜交瘤所產(chǎn)生的抗體，選擇具有與GPVI的結(jié)合能力、具有抑制膠原導(dǎo)致的血小板凝聚的活性的抗體，得到產(chǎn)生該抗體的細(xì)胞。通過培養(yǎng)該細(xì)胞，可得到本發(fā)明的抗體。
本發(fā)明的抗體也可以制成采用公知的方法(自Nature，312643，1984、Nature，321522，1986以來開發(fā)了很多方法)制備的重組人抗體的形式。首先，由產(chǎn)生本發(fā)明的抗體的細(xì)胞例如淋巴細(xì)胞、優(yōu)選由生產(chǎn)抗GPVI單克隆抗體的雜交瘤獲得編碼VH或VL的核酸例如cDNA，確定堿基序列和氨基酸序列。接著，將獲得的編碼VH和VL的cDNA分別插入動物細(xì)胞用表達(dá)載體中，構(gòu)建人抗體載體，通過導(dǎo)入動物細(xì)胞使其表達(dá)來制備，其中，動物細(xì)胞用表達(dá)載體含有編碼由相同細(xì)胞或不同的人細(xì)胞制備的人抗體CH和/或人抗體CL的基因。導(dǎo)入動物細(xì)胞的基因的制備方法沒有限定，可以由來自雜交瘤的基因組DNA或cDNA獲得，也可以通過PCR由雜交瘤的mRNA獲得，還可以通過化學(xué)合成獲得。
摻入有編碼本發(fā)明的抗體VH或VL的核酸的載體沒有限定，優(yōu)選常用于蛋白質(zhì)基因等表達(dá)、特別是適合抗體基因的表達(dá)的載體或高表達(dá)用載體。優(yōu)選的例子有含有EF啟動子和/或CMV增強(qiáng)子的載體，例如pEF-BOS或?qū)嵤├惺褂玫妮d體。另外，通常還可以分別制備摻入編碼VH或VL的核酸的表達(dá)載體，共轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，也可以摻入到單一的表達(dá)載體中。
要導(dǎo)入表達(dá)載體的宿主細(xì)胞沒有限定，優(yōu)選常用于蛋白質(zhì)基因等的表達(dá)，特別是適合抗體基因的表達(dá)的細(xì)胞。例如有細(xì)菌(大腸桿菌等)、放線菌、酵母、昆蟲細(xì)胞(SF9等)、哺乳類細(xì)胞(COS-1、CHO、骨髓瘤細(xì)胞等)。
對于重組人抗體的制備中所使用的人抗體的恒定區(qū)，例如人抗體重鏈恒定區(qū)可以使用Cγ1或Cγ4，人抗體輕鏈恒定區(qū)可以使用Ck等任意的人抗體恒定區(qū)。
含有人的CDR序列的抗體除在人體內(nèi)天然存在的抗體之外，也包含由人抗體噬菌體文庫和人抗體生成轉(zhuǎn)基因動物獲得的抗體等。人抗體噬菌體表達(dá)文庫是通過將由人B細(xì)胞制備的抗體基因插入到噬菌體基因中，使Fab、單鏈抗體等抗體的活性片段在噬菌體的表面表達(dá)的文庫。可由該文庫回收表達(dá)具有所希望的抗原結(jié)合活性的抗體的活性片段的噬菌體，其中所述抗原結(jié)合活性是以對固定有抗原的基質(zhì)的結(jié)合活性為指標(biāo)。該抗體的活性片段還可以進(jìn)一步通過基因工程方法，變換成含有2條完全的H鏈和2條完全的L鏈的人抗體分子。
本發(fā)明除含有2條重鏈和2條輕鏈的抗體之外，也包含本發(fā)明的抗體的活性片段等。抗體的活性片段例如有Fab(抗原結(jié)合片段)、Fab’、F(ab’)2，用接頭等將抗體的活性片段結(jié)合的例子有單鏈抗體(scFv)、二硫鍵穩(wěn)定化抗體(dsFv)，含有抗體的活性片段的肽例如有含有CDR的肽。這些可以通過用適當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)分解酶處理本發(fā)明的抗體的方法或基因重組技術(shù)等公知的方法來制備。
本發(fā)明的Fab可以如下獲得當(dāng)本發(fā)明的抗GPVI采用IgM時，用蛋白質(zhì)分解酶——胰蛋白酶來處理，采用IgG時，用蛋白質(zhì)分解酶——木瓜酶來處理。或者將編碼該抗體的Fab的DNA插入原核生物用表達(dá)載體或真核生物用表達(dá)載體，通過將該載體導(dǎo)入原核生物或真核生物來使其表達(dá)，制備Fab。
本發(fā)明的F(ab’)2可通過用蛋白質(zhì)分解酶——胰蛋白酶處理本發(fā)明的抗GPVI抗體來獲得?；蛘呤瓜率鯢ab’進(jìn)行硫醚鍵合或二硫鍵合來制備。
本發(fā)明的Fab’可以將與GPVI特異性反應(yīng)的F(ab’)2進(jìn)行還原劑二硫蘇糖醇處理來獲得。
本發(fā)明的scFv中含有的VH和VL可以使用本發(fā)明的雜交瘤所產(chǎn)生的抗體或人抗體的任何一種。本發(fā)明的scFv可如下制備獲得編碼本發(fā)明的抗GPVI抗體的VH和VL的cDNA，構(gòu)建編碼scFv的DNA，將該DNA插入原核生物用表達(dá)載體或真核生物用表達(dá)載體，將該表達(dá)載體導(dǎo)入原核生物或真核生物，使其表達(dá)，可以制備scFv。
dsFv是指將VH和VL中的各1個氨基酸殘基置換成半胱氨酸殘基，經(jīng)由該半胱氨酸殘基間的二硫鍵，使上述置換后的多肽結(jié)合而得到抗體。要置換為半胱氨酸殘基的氨基酸殘基可以按照Reiter等人公開的方法[Protein Engineering，7，697(1994)]，基于抗體的立體結(jié)構(gòu)預(yù)測來選擇。本發(fā)明的dsFv中所含的VH和VL也可以使用來自本發(fā)明的第1方案或第2方案的抗體的任何一種。
本發(fā)明的dsFv可如下制備獲得編碼本發(fā)明的抗GPVI抗體的VH和VL的cDNA，構(gòu)建編碼dsFv的DNA，將該DNA插入原核生物用表達(dá)載體或真核生物用表達(dá)載體，將該表達(dá)載體導(dǎo)入原核生物或真核生物，使其表達(dá)，可以制備dsFv。
含有CDR的肽含有H鏈或L鏈CDR的至少一個區(qū)而構(gòu)成。多個CDR可以直接或經(jīng)由適當(dāng)?shù)碾慕宇^結(jié)合。本發(fā)明的含有CDR的肽可如下制備獲得編碼本發(fā)明的抗GPVI抗體的VH和VL的cDNA，構(gòu)建編碼CDR的DNA，將該DNA插入原核生物用表達(dá)載體或真核生物用表達(dá)載體，將該表達(dá)載體導(dǎo)入原核生物或真核生物，使其表達(dá)，可以制備含有CDR的肽。含有CDR的肽也可以通過Fmoc法(芴甲氧羰基法)，tBoc法(t-叔丁氧羰基法)等化學(xué)合成方法來制備。
本發(fā)明的抗體也包含例如雜交瘤所產(chǎn)生的人抗體、用EB病毒轉(zhuǎn)化的細(xì)胞所產(chǎn)生的人抗體、由cDNA表達(dá)的重組人抗體、或者將放射性同位素、蛋白質(zhì)、肽或低分子化合物等與這些抗體的活性片段結(jié)合得到的抗體?？梢酝ㄟ^化學(xué)方法[抗體工學(xué)入門(金光修著1994年(株)地人書館)]，將放射性同位素、蛋白質(zhì)、肽或低分子化合物等與本發(fā)明的抗GPVI抗體或抗體的活性片段的H鏈或L鏈的N末端一側(cè)或C末端一側(cè)、抗體或抗體的活性片段中的適當(dāng)?shù)娜〈蛑ф?、以及抗體或抗體的活性片段中的糖鏈結(jié)合來制備。雜交瘤是指使淋巴細(xì)胞與來自人、小鼠、大鼠等的骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合而得到的、產(chǎn)生具有所需的抗原特異性的單克隆抗體的細(xì)胞。
制備單克隆抗體時，優(yōu)選考慮到與細(xì)胞融合所使用的骨髓瘤細(xì)胞的配合性來進(jìn)行選擇。骨髓瘤細(xì)胞可以使用公知的各種細(xì)胞。其中包含來自人的SKO-007、人小鼠雜交骨髓瘤SHM-D33、來自小鼠的P3、P3U1、SP2/O、NS-1、來自大鼠的YB2/0和Y3-Ag1，2，3等骨髓瘤細(xì)胞。
雜交瘤制備所使用的細(xì)胞不受限制，優(yōu)選雜交瘤制備所使用的多種細(xì)胞中的至少一種為來自人的細(xì)胞。來自人的細(xì)胞可以使用末梢血、淋巴結(jié)或脾臟等的人的淋巴細(xì)胞，特別優(yōu)選可以確認(rèn)有自身抗體產(chǎn)生的人的淋巴細(xì)胞。
淋巴細(xì)胞的活化可通過公知的方法進(jìn)行。例如優(yōu)選由人的末梢血或脾臟采集B細(xì)胞，通過體外免疫法刺激抗原，用來自人B細(xì)胞的骨髓瘤細(xì)胞或來自小鼠的骨髓瘤細(xì)胞制備雜交瘤的方法；用EB病毒轉(zhuǎn)染，使其與小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合的方法；用PWM等促分裂原刺激，將B細(xì)胞活化為多克隆并融合的方法(免疫實(shí)驗操作法I·II、右田俊介等人編輯、南江堂)等。
用于刺激細(xì)胞的抗原不受限定。抗原蛋白質(zhì)的來源動物可以根據(jù)抗體的使用目的適當(dāng)選擇，可以是來自天然產(chǎn)物的、通過基因工程制備的、化學(xué)合成的、與其它蛋白質(zhì)或肽得到的融合蛋白質(zhì)等的任何形式。例如可以使用血小板、血小板的膜、純化GPVI、重組GPVI、GPVI-Fc，優(yōu)選GPVI-Fc。
活化淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的融合可以采用Milstein等的方法(Methods in Enzymol.，73卷3頁)等公知的方法進(jìn)行。例如有使用聚乙二醇(PEG)作為融合劑的方法(單克隆抗體實(shí)驗操作法入門、安東民衛(wèi)·千葉丈/著、講談社)或電融合法等。免疫細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的混合比只要是它們可融合的比例即可，沒有限定，優(yōu)選相對于活化淋巴細(xì)胞，使用1/10量至等量的骨髓瘤細(xì)胞。使用PEG(平均分子量為1,000-4,000)進(jìn)行細(xì)胞融合的方法中，PEG濃度不受限定，優(yōu)選以50％進(jìn)行?？梢蕴砑佣谆鶃嗧?DMSO)等輔助劑作為融合效率促進(jìn)劑。融合是通過將加溫至37℃的PEG溶液添加到混合的細(xì)胞中而起始，反應(yīng)1-5分鐘后通過添加培養(yǎng)基而終止。
將由該融合形成的雜交瘤在含有次黃嘌呤、胸苷和氨基蝶啶的培養(yǎng)基(HAT)等選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)1天-10天，與未融合細(xì)胞分離。再通過所產(chǎn)生的抗體進(jìn)一步選擇所得的雜交瘤。按照公知的有限稀釋法，將所選擇的雜交瘤進(jìn)行單一克隆，建立單一克隆性抗體生成雜交瘤。
檢測雜交瘤所產(chǎn)生的抗體的活性的方法可以使用公知的方法。這里，抗體的活性的檢測如下進(jìn)行第一步是檢測與GPVI抗原的結(jié)合能力，第二步檢測抑制GPVI與膠原結(jié)合的活性。第一步的活性的檢測方法例如有ELISA法、蛋白質(zhì)印跡法、放射免疫法。第二步的活性的檢測法例如有ELISA法(結(jié)合抑制型)、蛋白質(zhì)相互作用分析法(BIOCORE等)、血小板凝聚抑制測定法。
可通過公知的方法培養(yǎng)確立的雜交瘤，由其培養(yǎng)上清獲得單克隆抗體。
抗體的純化可以使用鹽析法、凝膠過濾法、離子交換色譜法或親和柱層析法等公知的純化方法進(jìn)行。
抗體的濃度可通過公知的蛋白質(zhì)定量方法、例如280nm下的吸光度測定來測定。
確認(rèn)本發(fā)明的抗GPVI抗體的抗原結(jié)合性的方法、或者使用本發(fā)明的抗GPVI抗體檢測生物試樣中的GPVI的方法可以采用熒光抗體法、免疫酶聯(lián)抗體法(ELISA)、放射性物質(zhì)標(biāo)記免疫抗體法(RIA)、免疫組織染色法、免疫細(xì)胞染色法等免疫組織化學(xué)染色法(ABC法、CSA法等)、蛋白質(zhì)印跡法、免疫沉降法、以上闡述的酶聯(lián)免疫測定法、夾心ELISA法[單克隆抗體試驗手冊(講談社Scientific、1987年)、續(xù)生化學(xué)實(shí)驗講座5免疫生化學(xué)研究法(東京化學(xué)同人、1986年)]等。
本發(fā)明的抗體對于由例如膠原等引發(fā)血小板凝聚的物質(zhì)導(dǎo)致的血小板凝聚的影響的測定方法不受限定，可通過常規(guī)方法進(jìn)行。具體是向人血小板懸浮液中添加本發(fā)明的抗體，然后添加膠原，用血小板凝聚能測定裝置等測定凝聚率。
在單獨(dú)的抗體下測定血小板凝聚的方法不受限定，可通過常規(guī)方法進(jìn)行。具體是向人血小板懸浮液中添加本發(fā)明的抗體，用血小板凝聚能測定裝置等測定凝聚率。
(用途)本發(fā)明的抗體是與人GPVI特異性結(jié)合的抗體，含有本發(fā)明的抗體、抗體的活性片段、與化學(xué)物質(zhì)結(jié)合的抗體的修飾物、或者上述的混合液的組合物等有各種用途，其中包括人的疾病預(yù)防、診斷和治療用途，或受試樣品、細(xì)胞和組織等中的人GPVI的檢測用途等的。
特別是本發(fā)明的抗體的一個方案是抗體單獨(dú)不會引起人血小板凝聚，因此，不僅是抗體的活性片段，抗體本身也抑制人血小板凝聚，不僅制成活性片段，即使施用抗體本身，也可以用于人的疾病預(yù)防、診斷和治療等。
用途藥物本發(fā)明的抗體與GPVI的結(jié)合的特異性高，且來自人，優(yōu)選單獨(dú)不具有促進(jìn)或引發(fā)人血小板凝聚的作用，因此對人的疾病、例如因血小板的活化或凝聚、或者血管內(nèi)皮障礙或動脈硬化性的反應(yīng)而引起的疾病的預(yù)防和/或治療特別有效，還可用于對血栓或栓塞起因的疾病例如血栓形成和栓塞形成等的預(yù)防和/或治療。這些疾病不僅包含動脈性血栓形成，也包含靜脈性血栓形成，還包含起因于心房顫動的腦梗塞。
可由本發(fā)明的抗體預(yù)防和/或治療的人的疾病或病態(tài)具體有心肌梗塞，在溶栓療法、施行經(jīng)皮冠狀竇瓣內(nèi)腔擴(kuò)張術(shù)、施行支架、施行旁路手術(shù)或施行人工血管時的或者之后的血管內(nèi)皮肥厚、血管再狹窄、心絞痛或心肌梗塞，心房顫動或心房撲動以及起因于這些的血栓形成、栓塞形成或腦梗塞、閉塞性血栓性脈管炎、急性動脈硬化閉塞、閉塞性動脈硬化或深部靜脈血栓等；還有腦梗塞(動脈粥樣變性形血栓性梗塞、腔梗、心源性梗塞)、瞬時性腦缺血發(fā)作、蛛網(wǎng)膜下腔出血后的腦血管痙攣、肺血栓、肺栓塞、血管性紫癜、特發(fā)性血小板減少性紫癜、血栓性血小板減少性紫癜、彌散行血管內(nèi)凝血、體外循環(huán)使防止血液凝固、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多發(fā)性動脈炎、抗磷脂抗體綜合征、紫癜性腎炎、伴隨糖尿病的內(nèi)皮細(xì)胞傷害、糖尿病性腎炎、糖尿病性視網(wǎng)膜病、腎栓塞、伴隨移植治療的并發(fā)癥(肝靜脈閉塞病、移植物抗宿主病)等。
本發(fā)明的抗體還可以對于之前所述的預(yù)防和/或治療對象的疾病單獨(dú)施用，也可以與其它藥理活性成分聯(lián)合使用，所述藥理活性成分例如有公知的溶栓劑(例如包括組織型纖溶酶原激活劑(t-PA)及其衍生物(包括變異體或所謂的第二代)、尿激酶、鏈激酶)、或者公知的抗血小板藥物(例如阿司匹林、噻氯匹定、氯吡格雷、血栓烷拮抗劑、血栓烷合成抑制劑、GPIIb/IIIa拮抗劑)、公知的抗凝固藥(例如華法林、肝素、低分子肝素、戊多糖、凝血酶抑制劑、Fxa抑制劑、FVIIa抑制劑)等。這里，關(guān)于聯(lián)合使用，除了施用同時含有本發(fā)明的抗體和該藥理活性成分的合劑之外，也包括將本發(fā)明的抗體和相應(yīng)的藥理活性成分分別制成制劑，在相同時期或不同時間施用的情況，只要在患者的血液中同時存在即可，不限定施用形式。
含有本發(fā)明的抗體以及制劑學(xué)上可接受的組合物作為有效成分的藥物可以使用通常使用的制劑用載體或賦型劑、其它添加劑例如片劑、注射劑、散劑、栓劑等制備，施用于人類等動物。
應(yīng)用于人時，其施用途徑有口服給藥、靜脈內(nèi)給藥(大丸劑給藥、連續(xù)輸液、間歇輸液)、皮下給藥、肌內(nèi)給藥、關(guān)節(jié)內(nèi)給藥、經(jīng)皮給藥、經(jīng)鼻給藥等，通常為口服給藥或靜脈內(nèi)給藥。本發(fā)明的抗體對人的臨床給藥量可考慮所使用的患者的癥狀、體重、年齡、性別等適當(dāng)確定，通常成人每天靜脈內(nèi)給藥為1-10000mg、優(yōu)選10-1000mg，將其一次或分?jǐn)?shù)次給藥。給藥量依據(jù)各種條件而變動，也有用比上述給藥量的范圍少的量即足夠的情況。
這里，雖然本發(fā)明的抗體在識別GPVI這點(diǎn)上是共通的，但本發(fā)明包含具有不同機(jī)理的各種抗體。例如，直接抑制GPVI與膠原的結(jié)合、或者通過切斷GPVI來抑制血小板的活化和/或凝聚的抗體有望即時獲得效果，因此有可能至少在疾病的急性期(例如在心肌梗塞時或?qū)嵤㏄TCA時或者它們發(fā)生之前一點(diǎn)或剛發(fā)生之后)有用。這種情況下，優(yōu)選使本發(fā)明的抗體與血液中血小板表面的GPVI的大部分結(jié)合，因此可以施用較大量的抗體，例如可以單次或者分次進(jìn)行靜脈注射或輸液。另外，將GPVI攝入到內(nèi)部的抗體或許不能得到即時的效果，但考慮到人血小板在血液中的壽命(9-10天左右)以及人抗體在血液中的半衰期(IgG為數(shù)周)，則有望得到持續(xù)性的效果，因此例如可能在疾病的慢性期(例如心肌梗塞發(fā)病后或?qū)嵤㏄TCA后數(shù)天-數(shù)個月)中有用。這種情況下，可以以較大的間隔例如以幾天或數(shù)周作為1個療程，以部分、優(yōu)選完全抑制血液中的血小板與膠原的反應(yīng)性的程度施用以使血小板表面的GPVI消失所需要的量的抗體，例如可以采取一次或分次進(jìn)行靜脈注射或輸液的方式。優(yōu)選的方案中，本發(fā)明的抗體可以同時具有這些效果。還可以將多種預(yù)期分別具有上述效果的抗GPVI抗體組合實(shí)施治療。
用于腸道外給藥的組合物通常含有溶解于可接受的載體、優(yōu)選水性載體中的免疫球蛋白的溶液或其混合液?？墒褂酶鞣N水性載體例如水、緩沖水、磷酸鹽緩沖生理鹽水(PBS)、0.4％生理鹽水、0.3％甘氨酸、人白蛋白溶液等。這些溶液是無菌的，并且通常不存在微粒物質(zhì)。這些組合物可通過常用的、熟知的滅菌方法滅菌。為了使組合物接近生理學(xué)條件，可根據(jù)要求含有藥學(xué)上可接受的輔助物質(zhì)、例如pH調(diào)節(jié)和緩沖劑、毒性調(diào)節(jié)劑等，例如乙酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣和乳酸鈉。這些制劑中的抗體的濃度可以在廣范圍、即低于約0.005％重量(通常至少約為1％重量)至15-20％重量這樣大量的范圍內(nèi)變化，主要根據(jù)所選擇的給藥的特定方式，基于液容量、粘性等選擇。
制備腸道外給藥組合物的現(xiàn)實(shí)的方法對于本技術(shù)領(lǐng)域熟練人員來講是公知或清楚的，例如在Remington’s Pharmaceutical Sciences(第15版、Mack Publishing Campany、Easton、Pennsylvania、1980)(該引用例也為本說明書的一部分)中有更詳細(xì)的記載。適合用于清洗(灌洗)或其它途徑的組合物可根據(jù)所需的特定應(yīng)用進(jìn)行選擇。幾種藥學(xué)組合物可含有抗GPVI抗體及其疾病中常用的其它治療藥。任何情況下都適用于大丸劑給藥和持續(xù)給藥。另外，預(yù)防或治療的有效量可以根據(jù)對象疾病、病態(tài)和患者的狀態(tài)等適當(dāng)確定。
為了貯藏，本發(fā)明的抗體可以冷凍或冷凍干燥，可在要使用之前在適當(dāng)?shù)妮d體中復(fù)原。已知該技術(shù)對于通常的免疫球蛋白有效，可以采用公知的冷凍干燥和復(fù)原技術(shù)。冷凍干燥和復(fù)原可能導(dǎo)致不同程度的抗體的活性損失(例如通常的免疫球蛋白、IgM抗體有比IgG抗體產(chǎn)生較大的活性損失的傾向)，以及為了彌補(bǔ)其損失而必須調(diào)節(jié)使用水平，這點(diǎn)使本領(lǐng)域人員應(yīng)可認(rèn)識到。
用途GPVI檢測使用本發(fā)明的抗體或抗體活性片段檢測受檢樣品中的GPVI的方法可包含以下步驟使受試樣品與本發(fā)明的抗體或抗體的活性片段接觸的步驟，檢測與本發(fā)明的抗體或抗體活性片段結(jié)合的受檢樣品中的GPVI的步驟。還可以包含對受檢樣品中的GPVI進(jìn)行定量的步驟。通過檢測受試樣品中GPVI的方法，可以進(jìn)行疾病的診斷。特別是可用于人的疾病、例如血栓性、栓塞性或動脈硬化性疾病的診斷。
使用本發(fā)明的抗體檢測受檢樣品中的GPVI的方法有夾心ELISA系統(tǒng)、抑制ELISA類、熒光抗體法、免疫組織化學(xué)染色法、放射性物質(zhì)標(biāo)記免疫抗體法、蛋白質(zhì)印跡法、免疫沉降法等，但不限于這些。作為對象的受檢樣品不受限定，可以使用生物樣品，有動物特別是人的體液或組織、細(xì)胞和菌體以及它們的提取液、培養(yǎng)上清、涂片和切片，優(yōu)選為血小板。
使用本發(fā)明的抗體或抗體活性片段抑制GPVI或血小板上的GPVI與膠原的結(jié)合的方法可包含至少一步以下的方法使GPVI或血小板表面上的GPVI與本發(fā)明的抗體或抗體活性片段接觸的步驟，使GPVI或血小板表面上的GPVI與膠原接觸的步驟，本發(fā)明的抗體或抗體活性片段抑制GPVI或血小板表面上的GPVI與膠原結(jié)合的步驟。
檢測本發(fā)明的抗體或抗體活性片段對GPVI或血小板表面上的GPVI的血小板凝聚的抑制作用的步驟除采用上述的體外測定系統(tǒng)外，還可以采用體內(nèi)測定系統(tǒng)。這里所述的體內(nèi)測定系統(tǒng)是指對機(jī)體施用本發(fā)明的抗體或抗體活性片段，檢測該抗體或抗體活性片段對機(jī)體功能或狀態(tài)的影響的評價系統(tǒng)。例如有對施用膠原的模型動物施用本發(fā)明的抗體或抗體活性片段，評價對病態(tài)的嚴(yán)重程度指標(biāo)的影響的系統(tǒng)。
實(shí)施例以下通過實(shí)施例進(jìn)一步具體說明本發(fā)明，這些只是舉例，本發(fā)明并不受這些實(shí)施例的任何限制。另外，以下記載中使用的簡略符號基于本領(lǐng)域中的常用簡略符號。
實(shí)施例1人可溶型GPVI-Fc的制備制備人GPVI的胞外結(jié)構(gòu)域與人IgG的Fc片段的融合蛋白(GPVI-Fc)，以此作為體外免疫用抗原和篩選用抗原。DNA操作沒有特別限定，按照分子克隆第二版(Molecular Cloning A Laboratory Manual3rd.，Joseph S.，等人.，Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001))進(jìn)行。
GPVI-Fc表達(dá)質(zhì)粒按照以下順序進(jìn)行基因工程制備。首先，以摻入了江角等人克隆的人GPVI cDNA的質(zhì)粒pBK-CMV-GPVI-1(Biochem Biophys.Res.Commun.20008月號14；277(1)27-36)為模板，使用有義引物-1(SEQ ID NO.33，5’末端一側(cè)含有限制酶Xba I識別序列)和反義引物-1(SEQ ID NO.34，5’末端一側(cè)含有限制酶BamH I識別序列)進(jìn)行PCR，得到編碼人GPVI胞外結(jié)構(gòu)域(269個氨基酸)的cDNA。另一方面，以含有人IgG1Fc結(jié)構(gòu)域的cDNA的質(zhì)粒pM1304(記載于WO 97/42319)為模板進(jìn)行PCR，預(yù)先得到編碼可與GPVI胞外結(jié)構(gòu)域框內(nèi)連接的人IgG1Fc結(jié)構(gòu)域(506個氨基酸)的cDNA。用于該P(yáng)CR的有義引物-2(SEQ ID NO.35)設(shè)計為含有編碼人IgG1Fc結(jié)構(gòu)域N末端一側(cè)的cDNA序列、并在其5’末端一側(cè)配置限制酶BamH I識別序列，反義引物-2(SEQ ID NO.36)設(shè)計為在人IgG1Fc結(jié)構(gòu)域的C末端一側(cè)配置限制酶Kpn I識別序列。用限制酶處理由PCR得到的兩個cDNA片段，然后插入到以哺乳動物細(xì)胞為宿主的表達(dá)質(zhì)粒pCAGGS(專利第2824434號公報)的克隆位點(diǎn)。即，編碼人GPVI胞外結(jié)構(gòu)域的cDNA片段用限制酶Xba I和BamH I切斷，編碼人IgG1Fc結(jié)構(gòu)域的cDNA片段用限制酶BamH I和切斷KpnI切斷。在PCAGGS的克隆位點(diǎn)插入接頭，附加適當(dāng)?shù)南拗泼盖形稽c(diǎn)(Xba I、KpnI)，然后，框內(nèi)連接編碼人GPVI胞外結(jié)構(gòu)域的cDNA和編碼人IgG1Fc結(jié)構(gòu)域的cDNA并插入。其步驟如圖1所示。
以所得表達(dá)質(zhì)粒(pCAGGS-GPVI-Fc)為基礎(chǔ)，制備桿狀病毒的轉(zhuǎn)移載體和重組病毒，在蠶蛹中進(jìn)行表達(dá)。即，用限制酶Xba I和Hind III切斷pCAGGS-GPVI-Fc，切取編碼GPVI-Fc的DNA片段，用BluntingKit(TAKARA)使其末端為平末端。將該DNA片段插入桿狀病毒的轉(zhuǎn)移載體pYNG的Sma I位點(diǎn)，選擇沿多角體蛋白啟動子正方向插入的克隆(pYNG-GPVI-Fc)。該步驟如圖2所示。以該克隆為基礎(chǔ)制備重組病毒，通過蛋白質(zhì)印跡確認(rèn)GPVI-Fc蛋白質(zhì)在病毒感染細(xì)胞中的表達(dá)。將最終制備的病毒溶液接種于蠶蛹上，進(jìn)行GPVI-Fc的表達(dá)。
結(jié)果，蠶蛹磨碎液中可見足夠量的GPVI-Fc的表達(dá)，將其磨碎液用蛋白A柱(Prosep-A、MILLIPORE)進(jìn)行GPVI-Fc的純化。
實(shí)施例2使用具有抗GPVI自身抗體的人末梢血淋巴細(xì)胞制備抗GPVI單克隆人抗體抗GPVI單克隆人抗體是將已確認(rèn)具有GPVI的自身抗體的供血者的淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，如下制備。首先，將6ml從征得書面同意的供血者身體無菌采血得到的添加肝素的血液鋪于加入有3mlFicoll-Plus(Amersham Pharmacia Biotech AB)的Leucosep離心分離管(Greiner)中，1000g離心，回收淋巴細(xì)胞組分。將所得淋巴細(xì)胞組分在Dulbecco’s PBS(以下可稱為D-PBS)中以800g離心清洗2次，然后懸浮于含有10％FCS(胎牛血清)的Hybridoma-SFM(Invitrogen)，得到7.4×107個細(xì)胞。
分別向上述淋巴細(xì)胞組分中添加2.5μg/ml PHA-L(Sigma)、20μg/ml LPS(DIFCO)、10μg/ml實(shí)施例1記載的純化GPVI-Fc，制備成細(xì)胞濃度為1×106個/ml，培養(yǎng)3天，進(jìn)行淋巴細(xì)胞的活化。培養(yǎng)時，再添加400U/mL IL-4(PeproTech)，微調(diào)節(jié)成適當(dāng)?shù)臈l件，例如使培養(yǎng)時間為8天等，嘗試使淋巴細(xì)胞活化。細(xì)胞融合按照安藤等人(單克隆抗體實(shí)驗操作法入門、安東民衛(wèi)·千葉丈/著、講談社)，將活化的人淋巴細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞(SP2/O-Ag14、ATCC CRL 1581)以4∶1混合，通過50％聚乙二醇(Sigma)進(jìn)行細(xì)胞融合。融合后，懸浮于含有10％FCS、1×HAT(Invitrogen)的Hybridoma-SFM中，培養(yǎng)10天，然后對增殖的雜交瘤的培養(yǎng)上清取樣，通過ELISA法篩選產(chǎn)生目標(biāo)抗體的雜交瘤。
即，向每孔添加并固定了0.25μg純化GPVI-Fc的免疫板(Maxisorb、NUNC)上添加50μl雜交瘤的培養(yǎng)上清，在37℃反應(yīng)1小時。作為對照，將人純化Fc(Athens Research And Technology，Inc.)同樣地制成固相化微孔，添加培養(yǎng)上清使其反應(yīng)。反應(yīng)終止后，清洗各孔，向各孔中添加過氧化物酶標(biāo)記抗人κ抗體(DAKO、P129)或過氧化物酶標(biāo)記抗人λ抗體(DAKO、P130)。在37℃反應(yīng)1小時，然后同樣地清洗，向各孔中添加TMB顯色液(BioFix)，反應(yīng)10分鐘后，添加0.5M硫酸溶液，中止反應(yīng)。接著通過讀板儀測定450nm的吸光度，在純化人Fc中，吸光度未上升，只在固定有GPVI-Fc的孔中吸光度上升，即，選擇出了存在產(chǎn)生抗GPVI抗體的雜交瘤的孔。
進(jìn)一步通過有限稀釋法進(jìn)行培養(yǎng)，得到單一克隆。即，與上述同樣地對培養(yǎng)10天后的培養(yǎng)液進(jìn)行篩選，得到產(chǎn)生抗GPVI單克隆人抗體的雜交瘤。
將選擇的雜交瘤在含有10％FCS的Hybridoma-SFM中培養(yǎng)，使培養(yǎng)基無血清化以產(chǎn)生抗體。按照說明書，通過Prosep-Thiosorb M柱(MILLIPORE)純化IgM抗體，IgG抗體使用Prosep-A柱(MILLIPORE)純化。純化抗體用0.076M磷酸緩沖液(PBS)(pH 6.4)透析，由280nm的吸光度計算濃度。
實(shí)施例3制備的抗GPVI單克隆人抗體的分型實(shí)施例2得到的抗體的分型通過Human IgG Subclass ProfileELISA Kit(Zymed Laboratories)和蛋白質(zhì)印跡進(jìn)行。ELISA是按照試劑盒使用說明進(jìn)行，以抗體的稀釋液作為樣品使用。對于不能用試劑盒檢測出的抗體則通過4-20％的SDS-PAGE分別分離出約1μg樣品，然后轉(zhuǎn)印PVDF膜(MILLIPORE)，進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡。即，封閉PVDF膜后，與過氧化物酶標(biāo)記兔抗人IgM抗體(P0322、DAKO)反應(yīng)。清洗后，使其與ECL試劑(Amersham Pharmacia Biotech AB)反應(yīng)，通過光捕獲儀(ATTO)檢測反應(yīng)的條帶。所得的抗GPVI抗體的分型結(jié)果如表1所示。
表1分型結(jié)果
實(shí)施例4抗GPVI單克隆人抗體的GPVI結(jié)合活性的測定(ELISA法)通過實(shí)施例2記載的ELISA法測定實(shí)施例2得到的純化抗體的GPVI結(jié)合活性。實(shí)施例2中，添加20ng實(shí)施例2中制備的純化抗GPVI單克隆人抗體代替雜交瘤的培養(yǎng)上清，使用純化人IgM(Cappel)作為對照。
結(jié)果如圖3所示，作為對照使用的人IgM中，吸光度未上升，而所選擇的雜交瘤產(chǎn)生的純化抗GPVI單克隆人抗體中，吸光度都顯著上升，可見制備的抗體特異性識別GPVI。
實(shí)施例5關(guān)于抗GPVI單克隆人抗體抑制GPVI-Fc與膠原結(jié)合的研究為了驗證實(shí)施例2中得到的抗體特異性抑制GPVI與膠原的結(jié)合，采用蛋白質(zhì)相互作用分析裝置(BIACORE3000)進(jìn)行分析。首先，按照BIACO公司的使用手冊，將6303RU(共振單元)人膠原TypeI(生化學(xué)工業(yè)制造)固定于CM5芯片上(BIACORE制造)上。這里，RU是BIACORE裝置中使用的表示響應(yīng)的單位，1000RU表示有約1.2ng的物質(zhì)結(jié)合。將GPVI-Fc和純化人IgM或純化抗GPVI抗體分別以50μg/ml混合，注入固定有膠原的芯片。
實(shí)施例6抗體對人血小板凝聚能的影響按照常規(guī)方法(Takayama H等人.，Biochemical and BiophysicalResearch Communication，174，922-927頁(1991))，從征得書面同意的健康人采集血液，從其中制備血小板，按照終濃度約2×108-3×108個/mL使用。血小板凝聚能的測定按照Ezumi Y等人.(Blood，99，3250-3255頁(2002))如下實(shí)施。添加作為受檢物質(zhì)的實(shí)施例2中得到的抗體或其溶劑，然后在37℃溫育5分鐘。再添加CaCl2溶液，使終濃度為1mM，在37℃邊攪拌邊溫育3分鐘。加入膠原(NYCOMED PHARMA GMBH)的溶液，使終濃度為3-4μg/mL，用血小板凝聚能測定裝置(興和株式會社制造PA-200)隨時測定透光率，由此測定抗體對膠原引發(fā)的血小板凝聚的抑制作用。其結(jié)果如表2所示。血小板凝聚的測定結(jié)果用透光率最大時的透光率(最大凝聚率)表示。
接著，添加人凝血酶(Sigma)代替膠原作為血小板凝聚引發(fā)物質(zhì)，其濃度為0.3單位/mL，同樣地測定抗體對血小板凝聚的影響。結(jié)果，#2-4抗體在10μg/mL的抗體濃度下的最大凝聚率為96％。
再在上述測定中不添加膠原等引發(fā)血小板凝聚的物質(zhì)，測定受檢物質(zhì)(抗體)單獨(dú)的引發(fā)血小板凝聚的作用，結(jié)果，#2-4抗體在10μg/mL的抗體濃度下的最大凝聚率為3％。
由以上的結(jié)果可以觀察到#2-4抗體單獨(dú)不具有引發(fā)血小板凝聚的作用，只特異性抑制膠原導(dǎo)致的血小板凝聚。
表2(A)#2-4抗體
實(shí)施例7抗GPVI單克隆人抗體的解離常數(shù)的測定使用蛋白質(zhì)相互作用分析裝置(BIACORE3000)測定實(shí)施例6中確認(rèn)具有血小板凝聚抑制活性的抗體的解離常數(shù)。按照BIACORE公司的使用手冊，將實(shí)施例1中記載的純化GPVI-Fc固定于CM5芯片上。對于#2-4抗體用BIACORE3000的Wizard Program測定，使用BIACORE公司的BIAevaluation軟件進(jìn)行分析，計算出#2-4抗體的解離常數(shù)(Kd)為4.13×10-8M。
實(shí)施例8抗GPVI抗體的CDR氨基酸序列的確定按照實(shí)施例2培養(yǎng)通過實(shí)施例2的ELISA法的篩選選擇的雜交瘤。在細(xì)胞濃度為2×105個/ml的階段回收培養(yǎng)液，使用TRIzol(Invitrogen)，由回收的細(xì)胞提取mRNA。接著，按照SuperscriptFirst-strand synthesis System II(Invitrogen)的使用手冊，通過寡聚dT引物，由mRNA合成單鏈cDNA。參考論文(J.Immunol.Methods 19952月號27；179(2)203-14)和J.Mol.Biol.1991 12月5222(3)581-97)的信息，合成擴(kuò)增重鏈和輕鏈可變區(qū)的PCR引物(序列記載于表3)，以之前制備的來自雜交瘤的單鏈cDNA為模板進(jìn)行PCR。用2％的瓊脂糖確認(rèn)擴(kuò)增的DNA條帶，然后用自旋柱(Sigma)純化PCR產(chǎn)物。將純化的PCR產(chǎn)物與pT7BlueT載體(Novagen)混合，使用連接試劑盒verII(TAKARA)，在16℃進(jìn)行30分鐘的連接反應(yīng)。用該反應(yīng)液轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞大腸桿菌(JM109、TAKARA)，接種于含X-Gal、IPTG的LB板上，培養(yǎng)過夜。挑取出現(xiàn)的白色集落，用EX Taq聚合酶(TAKARA)、U-19mer引物(序列記載于表3)、T7啟動子引物(序列記載于表3、
<p>表4
表5和表6分別表示#2-4和#2-6的克隆的H鏈和L鏈可變區(qū)的氨基酸序列和核苷酸序列，表7表示#2-4和#2-6的克隆的CDR的核苷酸序列。
表5
表6
表7
實(shí)施例9通過基因重組生產(chǎn)人抗體(1)重組人IgG表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建參考數(shù)據(jù)庫信息，制備含有人IgG重鏈基因的翻譯起始密碼子的ATG的有義引物和含有翻譯終止密碼子的反義引物，以人脾臟5’-Stretch cDNA文庫(Clonetech公司制造)為模板進(jìn)行PCR。將含有人IgG基因的擴(kuò)增的DNA片段摻入pT7Blue(Novagen)，確認(rèn)堿基序列。通過不切斷人IgG基因的內(nèi)部的限制酶將人IgG基因從pT7Blue中切出，然后插入到表達(dá)質(zhì)粒pCAGGS的克隆位點(diǎn)，進(jìn)行人IgG重鏈表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建。人IgG輕鏈表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建也以與重鏈的情況同樣的方法進(jìn)行。
(2)抗體基因的克隆培養(yǎng)雜交瘤#2-6，制備細(xì)胞。將所得細(xì)胞用D-PBS(Sigma)清洗，然后使用TRIzol Reagent(Invitrogen)分離純化總RNA。接著使用寡聚-dT引物和SuperScriptII system(Invitrogen)合成單鏈cDNA。合成擴(kuò)增重鏈和輕鏈可變區(qū)的PCR引物，以來自雜交瘤的單鏈cDNA為模板進(jìn)行PCR。將擴(kuò)增的DNA片段摻入pT7Blue(Novagen)，進(jìn)行堿基序列的確認(rèn)。
(3)人-人嵌合抗體表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建使用可切取人IgG基因的重鏈可變區(qū)的適當(dāng)?shù)南拗泼?，切取重鏈可變區(qū)，與來自雜交瘤的重鏈可變區(qū)置換。此時，來自雜交瘤的重鏈可變區(qū)的DNA片段通過含有與插入的限制酶切位點(diǎn)相同的序列的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。具有來自雜交瘤的輕鏈可變區(qū)的重組人IgG表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建也以與重鏈的情況相同的方法進(jìn)行。
(4)人-人嵌合抗體生成克隆的選擇導(dǎo)入到CHO(CCL-61)或SP2/0-ag14(ATCC CRL 1581)并經(jīng)培養(yǎng)后在上清種表達(dá)的目標(biāo)抗體通過與GPVI的結(jié)合活性進(jìn)行選擇。具體來說，首先，將各4μg(共12μg)嵌合抗體重鏈表達(dá)質(zhì)粒、輕鏈表達(dá)質(zhì)粒、pSV2-neo與60μg轉(zhuǎn)染試劑FuGENE6(Roche Diagnostics)混合，靜置一段時間。接著，在培養(yǎng)面積為150cm2的培養(yǎng)燒瓶中培養(yǎng)至半?yún)R合的狀態(tài)，向該細(xì)胞的培養(yǎng)液中添加質(zhì)粒和FuGENE的混合液。培養(yǎng)2、3天后，將細(xì)胞接種于96孔板上，濃度為0.7個/孔，再用含有0.2mg/mlG-418的培養(yǎng)基進(jìn)行2、3周的培養(yǎng)。從形成有集落的孔中回收培養(yǎng)上清，通過EIA研究與GPVI的結(jié)合活性，得到具有結(jié)合活性的克隆。
(5)人-人嵌合抗體的生成將人-人嵌合抗體生成克隆在含有血清的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，在匯合階段更換為無血清培養(yǎng)基(Hybridoma-SFM、Invitrotec)，然后再進(jìn)行2天的培養(yǎng)。將所得培養(yǎng)上清用蛋白A柱(ProseP-A、MILLOPRE)純化，得到純化嵌合抗體。
實(shí)施例10IgG4化和Fab化來自雜交瘤的抗GPVI抗體的制備(1)材料和裝置所使用的材料和裝置如下所示。
·引物(由SIGMA Genosys Japan合成)HV3-11-a 5’GGAGTTTCCATTCGGTGATCAG 3’(SEQ ID NO.153)IGLV2-14-a5’GTGCTGGGGTCTCAGGAGGCAG 3’(SEQ ID NO.154)IgL-a 5’CTATGAACATTCTGTAGGGGC 3’ (SEQ ID NO.155)IgL-b 5’TGCAGCTCTAGTCTCCCGTGG 3’ (SEQ ID NO.156)IgM-1 5’GGGAAGGAAGTCCTGTGCGA 3’ (SEQ ID NO.157)IGLV1-51-a5’CAGCTGTGAGCGCAGAAGGCAG 3’(SEQ ID NO.158)IGLV1-51-b5’TCGGGACAATCTTCATCATG 3’ (SEQ ID NO.159)IgG4-a5’CGGTCACATGGCACCACCTCT 3’ (SEQ ID NO.160)IgG4-c5’TGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTC 3’(SEQ ID NO.161)IgG4-d5’GACCATATTTGGACTCAACTCTCTTGTCCA 3’(SEQ ID NO.162)IgG4-f5’GCCCATCATGCCCAGCACCTGAGTTCCTGG 3’(SEQ ID NO.163)IgG4-g5’CCAGGAACTCAGGTGCTGGGCATGATGGGC 3’(SEQ ID NO.164)IgG4-h5’TCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGC 3’(SEQ ID NO.165)IgG4-i5’GCTCTCGGGGCTGCCCTTTGGCTTTGGAGA 3’(SEQ ID NO.166)IgG4-j5’CCCTGGCACTCATTTACCCAG 3’(SEQ ID NO.167)IgG4-k5’GACGGGGTACGTGCCAAGCATCCT 3’(SEQ ID NO.168)IgG4-m5’AGCGCTAGCACCAAGGGCCCATCCGTCTTC 3’(SEQ ID NO.169)IgG4-n5’AGATCTTCATGGGGGACCATATTTGGACTC 3’(SEQ ID NO.170)IgG4-t5’TTAATGATGATGATGATGATGTGGGGGACC 3’(SEQ ID NO.171)M45’GTTTTCCCAGTCACGACG 3’(SEQ ID NO.172)HchainREV-ScaI5’GGGCGGAGTACTGGAGACGGTGACC 3’(SEQ ID NO.173)HchainEco47NheI 5’CCCCCGCTAGCGCTGGAGACGGTGACC 3’(SEQ ID NO.174)mIgG2c-a 5’GGATCCAAAACAACAGCCCCATCGGTCTAT 3’(SEQ ID NO.175)mIgG2c-b 5’TGGACAAGAAAATTGAGCCCAGAGTGCCCA 3’(SEQ ID NO.176)mIgG2c-c 5’TGGGCACTCTGGGCTCAATTTTCTTGTCCA 3’(SEQ ID NO.177)mIgG2c-d 5’GTCCCCCATGCGCAGCTCCAGACCTCTTGG 3’(SEQ ID NO.178)mIgG2c-e 5’CCAAGAGGTCTGGAGCTGCGCATGGGGGAC 3’(SEQ ID NO.179)
mIgG2c-f 5’TCTCAAAACCCAGAGGGCCAGTAAGAGCTC 3’(SEQ ID NO.180)mIgG2c-g 5’GAGCTCTTACTGGCCCTCTGGGTTTTGAGA 3’(SEQ ID NO.181)mIgG2c-h 5’AGATCTTCATTTACCCAGAGACCGGGAGAT 3’(SEQ ID NO.182)·PCR反應(yīng)用酶Ex Taq(TAKARA BIO INC.)10X反應(yīng)緩沖液和dNTP mixture使用所附產(chǎn)品·基因組DNAHeLa基因組lotN34707-1(BD Biosciences Clontech)小鼠基因組DNA(由B6小鼠尾部提取)·PCR裝置DNA Engine(MJ RESEARCH，INC.)·瓊脂糖凝膠電泳SeaKem GTG Agarose(TAKARA BIO INC.)潛水型電泳裝置(ADVANCE)50X TAE(2mol/L Tris-乙酸，0.05mol/L EDTA)(NIPPONGENE)分子量標(biāo)志(Sty I消化的λDNA片段)·由凝膠提取DNA片段的試劑盒QIAEX II(QIAGEN K.K.)·哺乳動物細(xì)胞用表達(dá)載體pEF2cew(pEF-BOS的EF啟動子上游附加有CMV增強(qiáng)子的改良型表達(dá)載體)·TA克隆載體和連接試劑pT7BlueT(NOVAGEN)TaKaRa連接試劑盒ver.2(TAKARA BIO INC.)·大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞JM109(TAKARA BIO INC.)·質(zhì)粒純化試劑盒(QIAGEN K.K.)·測序儀用試劑盒和分析裝置DYEnamic ET Terminator Cycle Sequencing Premix Kitlot.1767(Amersham Biosciences)ABI3100遺傳分析儀(Applied Biosystems)·培養(yǎng)液
Dulbecco’s MEM培養(yǎng)基(Sigma)·轉(zhuǎn)染用試劑FuGENE6(ロシユダイアグノステイツクス)(2)實(shí)驗方法所使用的主要的實(shí)驗方法如下所示。
·PCR反應(yīng)酶按照所附使用說明書進(jìn)行。以下表示反應(yīng)液的組成例。
反應(yīng)液TaKaRa Ex Taq(5units/μL)0.25μL10X Ex Taq緩沖液 5μLdNTP混合物(各2.5mM) 4μL人的腎臟第一鏈cDNA 1μL有義引物(10pmol/μL) 1μL反義引物(10pmol/μL) 1μL水 37.75μL(a)瓊脂糖凝膠電泳首先制備0.8％濃度的瓊脂糖凝膠。將其放入裝滿1x TAE的電泳槽?？字屑尤?μL樣品，然后在135V下進(jìn)行15分鐘的電泳。泳動結(jié)束后，將凝膠用溴化乙啶染色，再通過UV照射檢測條帶。同時電泳分子量標(biāo)志。
(b)由凝膠提取DNA片段用剃刀切取目標(biāo)條帶，使用QIAEX II試劑盒從凝膠片中提取DNA。方法按照所附說明書進(jìn)行。提取的DNA片段溶解于20μL的無菌水中。
(c)連接反應(yīng)將1μL完成提取的DNA片段、1μL克隆用載體pT7BlueT和2μL連接試劑盒ver.2的I液混合，在室溫下靜置15分鐘，進(jìn)行連接反應(yīng)。
(d)轉(zhuǎn)化大腸桿菌將50μL感受態(tài)大腸桿菌在冰上融解，加入4μL連接反應(yīng)產(chǎn)物，直接在冰上靜置30分鐘。在42℃熱休克45秒，涂布在含有終濃度為50μg/mL的氨芐青霉素的LB板上，在37℃培養(yǎng)過夜。
(e)質(zhì)粒的純化和測序反應(yīng)分別按照試劑盒的使用說明書進(jìn)行。
(f)轉(zhuǎn)染按照FuGENE6使用說明書進(jìn)行。采用6孔板時，轉(zhuǎn)染前一天以1.5×105個細(xì)胞/ml的密度將2mL COS-1細(xì)胞鋪于各孔中。第二天，在97μL的Dulbecco’s MEM培養(yǎng)基上混合3μL的FuGENE6和1μg的表達(dá)質(zhì)粒，靜置15分鐘或以上，然后滴加到2mL無血清Dulbecco’sMEM培養(yǎng)基上，通過與該培養(yǎng)液交換，進(jìn)行轉(zhuǎn)染。
(3)編碼重鏈可變區(qū)和輕鏈的基因的克隆1)通過用寡聚dT引物對由各雜交瘤提取的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成單鏈cDNA。接著通過如下所示的各反應(yīng)，分別擴(kuò)增編碼各重鏈可變區(qū)和輕鏈的基因片段。
a)#2-4以單鏈cDNA為模板，使用引物(HV3-11-a和IgM-1)，通過PCR反應(yīng)特異性擴(kuò)增重鏈可變區(qū)的cDNA。另一方面，使用引物(IGLV1-51-a和IgL-b)進(jìn)行第一次PCR反應(yīng)，接著，以該反應(yīng)產(chǎn)物為模板，使用引物(IGLV1-51-b和IgL-a)進(jìn)行第2次的PCR反應(yīng)(嵌套式PCR)，擴(kuò)增輕鏈cDNA。
b)#2-6以單鏈cDNA為模板，使用引物(HV3-11-a和IgM-1)，通過PCR反應(yīng)特異性擴(kuò)增重鏈可變區(qū)的cDNA。同樣，使用引物(IGLV2-14-a和IgL-b)進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增輕鏈cDNA。
2)將各擴(kuò)增片段克隆到pT7-BlueT載體中，確認(rèn)序列。具有#2-4的重鏈可變區(qū)的質(zhì)粒為pT7-#2-4H，具有輕鏈的為pT7-#2-4λ，#2-6也同樣，分別為pT7-#2-6H、pT7-#2-6λ。
(4)編碼重鏈恒定區(qū)(Cγ4)的基因的克隆以HeLa基因組DNA為模板，用以下的引物對進(jìn)行PCR反應(yīng)。結(jié)果，擴(kuò)增了編碼以下結(jié)構(gòu)域的基因區(qū)IgG4-a和IgG4-d中的CH1結(jié)構(gòu)域、IgG4-c和IgG4-g中的鉸鏈部分、IgG4-f和IgG4-i中的CH2結(jié)構(gòu)域、IgG4-h和IgG4-k中的CH3結(jié)構(gòu)域。接著，將這4種擴(kuò)增產(chǎn)物混合，使用引物IgG4-m和IgG4-j進(jìn)行PCR反應(yīng)，由此得到各結(jié)構(gòu)域相聯(lián)接的擴(kuò)增產(chǎn)物。將該擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到pT7-BlueT載體中，確認(rèn)為編碼重鏈恒定區(qū)(Cγ4)的序列，從而制成了pTK-2232。
(5)抗體表達(dá)用的重鏈表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建使用引物(M4和HchainREV-ScaI)對編碼pT7-#2-4H和pT7-#2-6H的重鏈可變區(qū)的基因區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后將該擴(kuò)增產(chǎn)物用限制酶EcoR I和Sca I切斷，制備片段A。
另一方面，將pTK-2232用限制酶Eco 47III和Bam HI切斷，制備編碼重鏈恒定區(qū)(Cγ4)的基因片段B。
將這些片段用EcoR I和Bam HI切斷，與制備的表達(dá)載體pEF2cew的EF啟動子下游連接成片段A+片段B，構(gòu)建各重鏈表達(dá)質(zhì)粒。確認(rèn)序列后，作為pTK-#2-4γ和pTK-#2-6γ。
(6)Fab表達(dá)用重鏈表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建①只表達(dá)Fab重鏈的質(zhì)粒的構(gòu)建使用引物(M4和HchainEco47NheI)對編碼pT7-#2-4H和pT7-#2-6H的重鏈可變區(qū)的基因區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后將該擴(kuò)增產(chǎn)物用限制酶EcoR I和Nhe I切斷，制備片段C。
另一方面，以pTK-2232為模板，使用引物(IgG4-m和IgG4-n)進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增緊接CH1結(jié)構(gòu)域其后具有終止密碼子的CH1基因片段。將該CH1擴(kuò)增片段克隆到pT7-BlueT載體上，構(gòu)建pT7-IgG4-mn。將該pT7-IgG4-mn用Nhe I和Bgl II切斷，得到片段D。
將這些片段用EcoR I和Bam HI切斷，與制備的表達(dá)載體pEF2cew的EF啟動子下游連接成片段C+片段D，構(gòu)建只表達(dá)各Fab重鏈的質(zhì)粒。確認(rèn)序列后，作為pTK-#2-4Fab和pTK-#2-6Fab。
②表達(dá)C末端具有組氨酸標(biāo)志(His-tag)的Fab重鏈(Fab-His)的質(zhì)粒的構(gòu)建以pTK-2232為模板，使用引物(IgG4-m和IgG4-t)進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增緊接CH1結(jié)構(gòu)域其后具有His-tag的CH1基因片段。將該CH1擴(kuò)增片段克隆到pT7-BlueT載體上，構(gòu)建pT7-IgG4mt。將該pT7-IgG4mt用限制酶Nhe I和Bam HI切斷，得到片段E。
將這些片段用EcoR I和Bam HI切斷，與制備的表達(dá)載體pEF2cew的EF啟動子下游連接成片段C+片段E，構(gòu)建表達(dá)C末端具有His-tag的Fab重鏈的質(zhì)粒。確認(rèn)序列后，作為pTK-#2-4Fab-His和pTK-#2-6Fab-His。
(7)輕鏈表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建用不會切斷輕鏈部分的適當(dāng)?shù)南拗泼?例如Eco RI和Xba I等)切取具有各輕鏈基因的質(zhì)粒(pT7-#2-4λ和pT7-#2-6λ)，制備片段F。
將該片段F用相同的酶切斷，連接到制備的表達(dá)載體pEF2cew的EF啟動子下游，構(gòu)建各輕鏈表達(dá)質(zhì)粒。確認(rèn)序列后，作為pTK-#2-4λ和pTK-#2-6λ。
(8)重組抗體和Fab的表達(dá)1)COS-1細(xì)胞在含有10％胎牛血清的Dulbecco’s MEM培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染前一天以1.5×105個細(xì)胞/ml的密度將其鋪于培養(yǎng)容器中。第二天，將重鏈(或Fab)表達(dá)質(zhì)粒和輕鏈表達(dá)質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染試劑(FuGENE6、Roche Diagnostics)進(jìn)行適量混合，然后滴加到無血清的Dulbecco’s MEM培養(yǎng)基上，將其與培養(yǎng)液交換，進(jìn)行轉(zhuǎn)染。
結(jié)果，轉(zhuǎn)染pTK-#2-4γ和pTK-#2-4λ時，可以使重組IgG4抗體——R#2-4抗體在培養(yǎng)液中分泌表達(dá)。同樣，通過使用pTK-#2-6γ和pTK-#2-6λ，可以在培養(yǎng)液中分泌表達(dá)R#2-6抗體；使用pTK-#2-4Fab和pTK-#2-4λ、或者pTK-#2-6Fab和pTK-#2-6λ，可以在培養(yǎng)液中分泌表達(dá)重組Fab(pTK-#2-4Fab和pTK-#2-6Fab)；使用pTK-#2-4Fab-His和pTK-#2-4λ、或者pTK-#2-6Fab-His和pTK-#2-6λ，可以在培養(yǎng)液中分泌表達(dá)具有His-tag的重組Fab(R#2-4Fab-His和(R#2-6Fab-His)。
2)在50％CO2存在下，在37℃培養(yǎng)2-3天，回收培養(yǎng)液。
(9)重組抗體的純化[重組IgG抗體的純化]從培養(yǎng)液中純化重組IgG4抗體(R#2-4抗體和R#2-6抗體)，可以使用Prosep-A柱(MILLIPORE)進(jìn)行，用PBS(pH 7.4)透析，然后由280nm的吸光度計算濃度。
1)從培養(yǎng)液中純化重組Fab分子(R#2-4Fab和R#2-6Fab)，可以使用抗人λ輕鏈抗體柱(自己制作)進(jìn)行。
2)從培養(yǎng)液中純化具有His-Tag的重組Fab分子(R#2-4Fab-His和R#2-6Fab-His)，可以首先使用Hi-Trap Chelating HP(Amersham)進(jìn)行初次純化，然后使用抗人λ輕鏈抗體柱進(jìn)行二次純化，從而實(shí)現(xiàn)。
3)全部Fab在純化后用PBS(pH 7.4)透析，由280nm吸光度計算濃度。另外，血小板凝聚抑制實(shí)驗中要使用的Fab用生理鹽水透析。
實(shí)施例11人GPVI-小鼠Fc融合蛋白的制備(1)GPVI-mFc融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建1)以小鼠基因組DNA為模板，用以下的引物對進(jìn)行PCR反應(yīng)。結(jié)果，如mIgG2c-a和mIgG2c-c中的CH1結(jié)構(gòu)域、mIgG2c-b和mIgG2c-e中的鉸鏈部分、mIgG2c-d和mIgG2c-g中的CH2結(jié)構(gòu)域、mIgG2c-f和mIgG2c-h中的CH3結(jié)構(gòu)域，編碼小鼠免疫球蛋白(mIgG2c)重鏈恒定區(qū)的各結(jié)構(gòu)域的基因區(qū)得到擴(kuò)增。接著，將這4種擴(kuò)增產(chǎn)物混合，使用引物mIgG2c-a和mIgG2c-h進(jìn)行PCR反應(yīng)，由此得到各結(jié)構(gòu)域相連接的擴(kuò)增產(chǎn)物。將該擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到pT7-BlueT載體中，確認(rèn)為編碼重鏈恒定區(qū)(Cγ2c)的序列，從而制成了pT7-mIgG2c。
2)用限制酶Bam HI和Kpn I從該pT7-mIgG2c切取編碼小鼠Fc區(qū)的基因片段，制備片段H。另一方面，用限制酶Xba I和Bgl II從pCAGGS-GPVI-Fc質(zhì)粒中切取編碼人GPVI胞外結(jié)構(gòu)域的基因片段，制備片段I。將這些片段用Xba I和Kpn I切斷，與制備的表達(dá)載體pEF2cew的EF啟動子下游連接成片段H+片段I，構(gòu)建表達(dá)人GPVI和小鼠Fc的融合蛋白(GPVI-Fc)的質(zhì)粒。確認(rèn)序列后，作為pTK-2249。(2)GPVI-mFc融合蛋白的表達(dá)和純化1)COS-1細(xì)胞在含有10％胎牛血清的Dulbecco’s MEM培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染前一天以1.5×105個細(xì)胞/ml的密度將其鋪于培養(yǎng)容器中。第二天，將pTK-2249與轉(zhuǎn)染試劑(FuGENE6、Roche Diagnostics)進(jìn)行適量混合，然后滴加到無血清的Dulbecco’s MEM培養(yǎng)基上，將其與培養(yǎng)液交換，進(jìn)行轉(zhuǎn)染。
2)在50％CO2存在下，在37℃培養(yǎng)2-3天，回收培養(yǎng)液。
3)從培養(yǎng)液中純化GPVI-mFc融合蛋白，使用Prosep-A柱(MILLIPORE)進(jìn)行，用PBS(pH 7.4)透析，然后由280nm的吸光度計算濃度。
實(shí)施例12各種抗GPVI抗體與GPVI結(jié)合活性的測定(細(xì)胞計量術(shù))從健康人采集血液，通過離心制備血小板組分。將5×106個血小板懸浮于50μL含有5％人血漿、0.5％熱滅活胎牛血清(FBS)的PBS中，添加2μg施例10中制備的各種重組抗GPVI人抗體(IgG4)，然后在室溫下溫育1小時。用1mL含有0.5％熱滅活FBS的PBS清洗2次，然后再懸浮于50μL含有0.5％熱滅活胎牛血清(FBS)的PBS中，加入1μg抗人IgG抗體FITC標(biāo)記抗體，然后溫育1小時。用1mL含有0.5％熱滅活FBS的PBS清洗2次，然后用Cytometric FC500(BeckmanCoulter)測定FITC陽性血小板數(shù)。
結(jié)果，與R#2-6抗體反應(yīng)的血小板為90％或以上，R#2-4抗體中，68％為FITC陽性細(xì)胞。
圖4是表示重組GPVI人抗體(R#2-4和R#2-6)與由人末梢血制備的血小板結(jié)合的圖。圖4中，白色直方圖表示與作為陰性對照的人全部IgG反應(yīng)時的熒光強(qiáng)度分布。灰色表示的直方圖表示與R#2-4或R#2-6抗體反應(yīng)時的熒光強(qiáng)度分布。
實(shí)施例13各種抗GPVI抗體與GPVI結(jié)合活性的測定(ELISA法)用PBS制備成3μg/mL的GPVI-hFc嵌合蛋白或GPVI-mFc嵌合蛋白，分別以50μL/孔添加到ELISA用96孔板中，在37℃溫育2小時，使其形成固相。用400μL/孔PBS清洗5次，然后用2％穩(wěn)定劑/PBS在室溫下進(jìn)行1小時封閉處理。以10μg/mL的濃度將實(shí)施例10中制備的各種重組抗GPVI人抗體(IgG4)添加到GPVI-Fc固相化免疫板中，在室溫下反應(yīng)2小時。用含0.05％吐溫20的PBS清洗3次，用PBS清洗2次，然后分別用PBS將二次抗體(抗人κ-輕鏈抗體HRP標(biāo)記或抗人λ-輕鏈抗體HRP標(biāo)記)稀釋1000倍、稀釋2000倍，添加到各孔中，在室溫下溫育2小時。用含0.05％吐溫20的PBS清洗3次，用PBS清洗2次，然后添加TMB溶液，室溫下顯色20分鐘，加入1M硫酸，中止顯色，測定450nm的吸光度。
結(jié)果，作為陰性對照的人全部IgG幾乎未與GPVI-hFc結(jié)合，但R#2-4和R#2-6抗體以10μg/mL顯示與GPVI-hFc的明顯的結(jié)合活性(圖5)。R#2-6和R#2-4抗體也與GPVI-mFc顯示了親和性。
實(shí)施例14單獨(dú)的抗GPVI抗體對全血和血小板的影響(1)抗GPVI抗體對使用全血形成血凝塊時的影響使用抗凝血酶劑從健康人采血，向2mL采集的血液中添加各種GPVI抗體，使終濃度為30μg/mL，在37℃溫育2小時。然后目視確認(rèn)血凝塊的形成。已知的抗GPVI抗體例如來自自身免疫性血小板減少患者血液中的IgG可單獨(dú)引發(fā)血小板凝聚(非專利文獻(xiàn)2)，因此可以推斷該系統(tǒng)中，凝固系統(tǒng)過度活化，引起血凝塊形成，但與添加對照IgG的情形相同，添加了R#2-4和R#2-6抗體的樣品中，完全未見血凝塊的形成。
(2)抗GPVI抗體對血小板的影響按照實(shí)施例6，使用PRP測定抗體單獨(dú)引發(fā)血小板凝聚的作用。結(jié)果，即使在100μg/mL的濃度下，R#2-4和R#2-6抗體單獨(dú)沒有引發(fā)人血小板凝聚。
實(shí)施例15人IgG化抗GPVI抗體對于血小板的膠原應(yīng)答性的效果使用抗凝血酶，由健康人采血，向2mL所采集的血液中添加各種GPVI抗體，在37℃溫育3小時。然后分離血小板，制備成3×108個血小板/mL，添加CaCl2溶液，使終濃度為1mM，邊在37℃攪拌邊溫育3分鐘。加入膠原溶液，使終濃度為1-2μg/mL，用血小板凝聚能測定裝置(A C Medical株式會社、MCM hematoracer801)測定濁度。
結(jié)果顯示用30μg/mL的R#2-4或R#2-6抗體處理的血小板中，血小板對膠原的凝聚能顯著降低。
表8
產(chǎn)業(yè)實(shí)用性本發(fā)明的抗體通過與人血小板上的GPVI特異性結(jié)合，使血小板凝聚能降低，因此，例如可以用作抗血小板藥等藥物。本發(fā)明的人抗體作為藥物施用于人，沒有異種抗體、嵌合抗體、人源抗體所具有的免疫原性，因此有用。本發(fā)明的抗體單獨(dú)不會引發(fā)人血小板凝聚，這例如可以無需經(jīng)過制成Fab等的處理即可直接作為藥物施用。本發(fā)明的抗體比已有抗體可以以低用量抑制膠原導(dǎo)致的血小板凝聚，可以以更少的用量有效地作為藥物應(yīng)用。
序列表<110>Mochida Pharmaceutical，Co.，Ltd.
<120>抗血小板膜糖蛋白VI單克隆抗體<130>G05-0095<150>JP 2003-199192<151>2003-07-18<160>182<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>5<212>PRT<213>智人<400>1Asp Tyr Tyr Met Ser1 5<210>2<211>17<212>PRT<213>智人<400>2Tyr Ile Thr Ser Ser Ser Ser Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys1 5 10 15Gly<210>3<211>15<212>PRT<213>智人<400>3Asp Arg Ala Val Arg Gly Val Ile Ile Ile Arg Pro Pro Asp Tyr1 5 10 15
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<400>113Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser1 5<210>114<211>11<212>PRT<213>智人<400>114Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu Ser Ala Gly Val1 5 10<210>115<211>11<212>PRT<213>智人<400>115Ser Gly Asp Lys Leu Gly Asp Lys Tyr Ala Cys1 5 10<210>116<211>7<212>PRT<213>智人<400>116Gln Asp Ser Lys Arg Pro Ser1 5<210>117<211>9<212>PRT<213>智人<400>117Gln Ala Trp Asp Ser Ser Thr Tyr Val1 5
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Cys Ser Tyr Ala Gly Ser Tyr Thr Phe Leu1 5 10<210>127<211>11<212>PRT<213>智人<400>127Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp Leu Ala1 5 10<210>128<211>7<212>PRT<213>智人<400>128Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser1 5<210>129<211>9<212>PRT<213>智人<400>129Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Tyr Thr1 5<210>130<211>14<212>PRT<213>智人<400>130Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser1 5 10<210>131
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<223>引物<400>155ctatgaacat tctgtagggg c21<210>156<211>21<212>DNA<213>人工的<220>
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<223>引物<400>164ccaggaactc aggtgctggg catgatgggc 30<210>165<211>30<212>DNA<213>人工的<220>
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<223>引物<400>180tctcaaaacc cagagggcca gtaagagctc 30<210>181<211>30<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>181gagctcttac tggccctctg ggttttgaga 30
<210>182<211>30<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>182agatcttcat ttacccagag accgggagat 30
權(quán)利要求
1.人抗體或其活性片段，其與人血小板膜糖蛋白VI特異性結(jié)合，并且其單獨(dú)不會引發(fā)人血小板凝聚。
2.人抗體或其活性片段，其與人血小板膜糖蛋白VI特異性結(jié)合，通過體內(nèi)施用來抑制膠原導(dǎo)致的人血小板凝聚。
3.人抗體或其活性片段，其具有以下的任意一種或多種作用與人GPVI特異性結(jié)合，特異性抑制血小板上的GPVI與膠原的結(jié)合，使血小板上的功能性的GPVI消失，或者通過預(yù)先與血小板接觸，使人血小板應(yīng)答膠原而凝聚的能力降低或缺失。
4.人抗體或其活性片段，其與人血小板膜糖蛋白VI特異性結(jié)合，抑制膠原導(dǎo)致的人血小板凝聚，但其單獨(dú)不會引發(fā)人血小板凝聚。
5.抗體或其活性片段，其在VH CDR1中具有SEQ ID NO.47的氨基酸序列、VH CDR2中具有SEQ ID NO.48的氨基酸序列、VH CDR3中具有SEQ ID NO.49的氨基酸序列、VLCDR1中具有SEQ ID NO.98的氨基酸序列、VLCDR2中具有SEQ ID NO.99的氨基酸序列、VLCDR3中具有SEQ ID NO.100的氨基酸序列；或者在VH CDR1中具有SEQ ID NO.7的氨基酸序列、VH CDR2中具有SEQ ID NO.8的氨基酸序列、VH CDR3中具有SEQ ID NO.9的氨基酸序列、VLCDR1中具有SEQ ID NO.10的氨基酸序列、VLCDR2中具有SEQ ID NO.11的氨基酸序列、VLCDR3中具有SEQ ID NO.12的氨基酸序列。
6.產(chǎn)生權(quán)利要求1-5中任一項的抗體或其活性片段的細(xì)胞。
7.多核苷酸，其含有編碼權(quán)利要求1-5中任一項的抗體或其活性片段的H鏈和/或L鏈的堿基序列。
8.藥物組合物，該藥物組合物含有權(quán)利要求1-4的抗體或其活性片段作為有效成分。
9.重組人-人嵌合抗體的制備方法。
全文摘要
本發(fā)明提供與人血小板膜糖蛋白VI特異性結(jié)合，但單獨(dú)不會引發(fā)人血小板凝聚的人抗體或其活性片段；產(chǎn)生上述抗體或其活性片段的細(xì)胞；含有上述抗體或其活性片段作為有效成分的藥物組合物。上述細(xì)胞例如可如下獲得通過體外免疫法活化對GPVI產(chǎn)生自身抗體的人的末梢血淋巴細(xì)胞，制備與小鼠骨髓瘤細(xì)胞的雜交瘤，選擇分泌具有與GPVI的結(jié)合能力，具有抑制膠原導(dǎo)致的人血小板凝聚的活性的單克隆抗體的雜交瘤。
文檔編號C12P21/08GK1852981SQ20048002705
公開日2006年10月25日 申請日期2004年7月20日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月18日
發(fā)明者高山博史, 白川嘉門, 山川徹, 川原哲史 申請人:持田制藥株式會社