專利名稱：一種硝基苯硝基還原酶及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物生物技術(shù)和基因工程技術(shù)領(lǐng)域中一種硝基苯硝基還原酶及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
我國已成為世界上最大的解熱鎮(zhèn)痛藥生產(chǎn)國，阿司匹林、撲熱息痛、安乃近等品種的產(chǎn)量均超10000噸，非那西丁、氨基比林、安替比林等品種的產(chǎn)量超過1000噸。目前我國解熱鎮(zhèn)痛藥的產(chǎn)量增長很快，預(yù)計(jì)今后還將以每年8％左右的速度增長。隨著解熱鎮(zhèn)痛藥的增長，其中間體也獲得了長足的發(fā)展。2003年國內(nèi)撲熱息痛消費(fèi)量快速增加，出口也呈迅猛增長勢頭，出口量為28163噸，全年出口量同上一年相比增幅達(dá)1倍左右。到2004年其出口增速雖然放慢，但依然有所增長，2004年1至5月?lián)錈嵯⑼吹某隹诹繛?2501噸，略高于去年同期。對氨基酚是合成撲熱息痛的重要中間體，近年來也增長迅速。同時，鄰氨基酚是染料、醫(yī)藥、香料中間體，主要用于制造色酚AS-PH、廣泛應(yīng)用于染料行業(yè)，也用于醫(yī)藥工藝和香料行業(yè)，如鄰位香蘭素等。因此，隨著印染業(yè)、香料業(yè)和醫(yī)學(xué)界的發(fā)展，市場對合成這些產(chǎn)品的中間體的需求也會不斷加大。
目前，對氨基酚和鄰氨基酚等芳香族化合物的生產(chǎn)是采用加純氫的化學(xué)工藝，不僅成本高(需要純氫)，而且容易給環(huán)境造成污染。利用酶促反應(yīng)的生物加工和轉(zhuǎn)化是近年來新興的生物工程技術(shù)，可以在常溫常壓條件下以非常經(jīng)濟(jì)、高效的方法轉(zhuǎn)化加工獲得高純度的高品質(zhì)產(chǎn)品，目前已經(jīng)在生物制藥領(lǐng)域、生物化工領(lǐng)域得到應(yīng)用，如手性藥物的生產(chǎn)和丙烯酰胺的生產(chǎn)。硝基苯硝基還原酶或具有類似的硝基還原催化功能的酶蛋白的發(fā)現(xiàn)使硝基苯類的生物轉(zhuǎn)化成為可能。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種硝基苯硝基還原酶及其編碼基因。
本發(fā)明所提供的硝基苯硝基還原酶，來源于睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonastestosteroni)CNB1 CGMCC No.1028菌株，是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)1)序列表中的SEQ ID №1；2)將序列表中SEQ ID №1的氨基酸殘基序列經(jīng)過一至十個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有硝基苯硝基還原酶功能的蛋白質(zhì)。
其中，序列表中的序列1由227個氨基酸殘基組成。
上述硝基苯硝基還原酶的編碼基因也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。它可具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №2的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID №1蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID№2 限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
所述高嚴(yán)謹(jǐn)條件可為在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下雜交并洗膜。
其中，序列表中的SEQ ID №2由684個堿基組成，其編碼序列為自5’端第1到第684位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID №1的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。
含有本發(fā)明基因的表達(dá)載體、細(xì)胞系及宿主菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
本發(fā)明的硝基苯硝基還原酶可按如下方法表達(dá)將含有上述硝基苯硝基還原酶編碼基因的重組表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞得到轉(zhuǎn)化子，培養(yǎng)該轉(zhuǎn)化子，表達(dá)得到硝基苯硝基還原酶。
用于構(gòu)建含有上述硝基苯硝基還原酶編碼基因的重組表達(dá)載體的出發(fā)載體可為基因工程領(lǐng)域中的質(zhì)粒表達(dá)載體、病毒表達(dá)載體、酵母表達(dá)載體等載體，如pGEX系列載體、pET系列載體、Cosmid載體、pPIC9K。宿主選擇與上述表達(dá)載體相適應(yīng)的宿主。所述轉(zhuǎn)化子的培養(yǎng)條件與其出發(fā)宿主的培養(yǎng)條件相同，需誘導(dǎo)表達(dá)外源基因的轉(zhuǎn)化子，采用相應(yīng)的誘導(dǎo)物誘導(dǎo)表達(dá)本發(fā)明的硝基苯硝基還原酶。當(dāng)以細(xì)菌為宿主時，可將上述硝基苯硝基還原酶編碼基因連接到載體SuperCos 1后，以GigapackIII XL包裝蛋白包裝，或?qū)⒃摶蜻B接到其他表達(dá)載體，然后將包裝好的載體或連接載體轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌或其他細(xì)菌(如假單胞菌)，經(jīng)LB培養(yǎng)基或其他培養(yǎng)基培養(yǎng)，含有連接基因片段的菌落就為轉(zhuǎn)化子，以SuperCos 1為載體的轉(zhuǎn)化子不需要誘導(dǎo)就可以表達(dá)酶活性，而以其他的表達(dá)載體為載體的轉(zhuǎn)化子則需要載體相應(yīng)的誘導(dǎo)物誘導(dǎo)表達(dá)酶活性。這些轉(zhuǎn)化子可以用于生產(chǎn)本發(fā)明的硝基苯硝基還原酶或直接用于對氨基酚和鄰氨基酚類芳香族化合物及其相關(guān)衍生化合物的生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)。
本發(fā)明的硝基苯硝基還原酶在大腸桿菌中的表達(dá)量可達(dá)1000-1500mg/L。該酶可以催化硝基苯類化合物進(jìn)行硝基還原反應(yīng)，首先形成羥氨基苯類化合物，進(jìn)而形成對氨基酚或鄰氨基酚類化合物。其以硝基苯為底物的比活性可達(dá)121.3U·mg-1·min-1。酶促實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明的硝基苯硝基還原酶不僅能催化硝基苯硝基的還原反應(yīng)，而且能以鄰氯硝基苯、間氯硝基苯、對氯硝基苯和2，4-二硝基氯代苯為底物進(jìn)行硝基還原反應(yīng)，此酶的底物范圍很廣，能催化絕大多數(shù)含硝基的芳香族化合物。
本發(fā)明為生物生產(chǎn)對氨基酚和鄰氨基酚類化合物及其相關(guān)衍生化合物提供了一種新的硝基苯硝基還原酶，該酶可以催化硝基苯類化合物進(jìn)行硝基還原反應(yīng)，形成羥氨苯，進(jìn)而形成對氨基酚或在羥氨苯歧位酶作用下形成鄰氨基酚類化合物。本發(fā)明的硝基苯硝基還原酶及其編碼基因?qū)⒃趯Π被雍袜彴被宇惙枷阕寤衔锛捌湎嚓P(guān)衍生化合物的生產(chǎn)中發(fā)揮重要作用。
具體實(shí)施例方式
以下實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法如無特別說明均為常規(guī)方法。
實(shí)施例1、本發(fā)明的硝基苯硝基還原酶基因的獲得將睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonas testosteroni)CNB1 CGMCC No.1028菌株在LB平板上的單菌落挑到LB培養(yǎng)液中，30℃振蕩培養(yǎng)，收集菌體，提取基因組DNA，用MboI部分酶切至30kb左右的片斷。用SuperCos 1作為載體(購自StratageneCompany，USA)，載體先用XbaI酶切后，去磷酸化，再用BamHI酶切成6.8kb和1.1kb的兩個片段。將基因組部分酶切的片段和處理后的載體在16℃用T4DNA連接酶連接。連接好的片段用Gigapack III XL包裝蛋白(購自Stratagene Company，USA)包裝。轉(zhuǎn)染至大腸桿菌XL 1-blue MR(購自Stratagene Company，USA)中，建立Cosmid基因文庫。用2-氨基苯酚作為底物篩選文庫，在2-氨基苯酚水溶液中30℃培養(yǎng)兩天，溶液為無色的克隆為陽性克隆，從基因文庫中篩選到3個陽性克隆。將其中一個克隆的質(zhì)粒提取出來測序。對測序結(jié)果進(jìn)行ORF分析，在NCBI上進(jìn)行blastx比對，從序列中分析出編碼硝基苯硝基還原酶的基因序列，其編碼的氨基酸序列與來源于[Pseudomonas putida HS12]的nitrobenzene nitroreductase(登錄號為AAK26512)的序列相似性為92％；與來源于[Pseudomonas pseudoalcaligenes JS45]的nitrobenzene nitroreductase(登錄號為AAT71308)的序列相似性為88％。該基因的核苷酸序列和其編碼的氨基酸序列分別如序列表中序列2和序列1所示。
實(shí)施例2、本發(fā)明的硝基苯硝基還原酶的表達(dá)及其功能鑒定1、本發(fā)明的硝基苯硝基還原酶的表達(dá)提取睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonas testosteroni)CNB1 CGMCC No.1028菌株的基因組DNA，以其為模板，在引物15’-GACGTTTCATATGCCGACCAGCCCGTTC-3’(帶下劃線的堿基為NdeI識別位點(diǎn)，粗體為起始密碼子)和引物25’-TGGGATCCTAATTCGTGGACGAAGGTGG-3’(帶下劃線的堿基為BamHI識別點(diǎn)，粗體為終止密碼子)的引導(dǎo)下，PCR擴(kuò)增本發(fā)明的硝基苯硝基還原酶基因。其中，50μl PCR反應(yīng)體系為模板(60ng/μl)0.5μl；dNTP(每種10mM)1μl；引物(各25μM)1μl；10×緩沖液5μl；ddH2O 42.1μl；Taq(5U/μl)0.4μl。其中，10×緩沖液來自于TaKaRa Taq試劑盒(TaKaRa公司，Code No.DR100A)。PCR溫度條件為先94℃2min；然后94℃ 30sec，40℃ 45sec，72℃ 45sec，共30個循環(huán)；再72℃ 5min。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果表明擴(kuò)增到一條700bp左右的條帶，大小與預(yù)測結(jié)果一致。回收大小約700bp的片段，克隆至pGEM-T載體，進(jìn)行基因序列分析，結(jié)果表明擴(kuò)增得到的硝基苯硝基還原酶基因具有序列表中SEQ ID NO2的核苷酸序列。利用限制性內(nèi)切酶NdeI和BamHI將該P(yáng)CR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆入pET-21a(+)(購自Novagen公司，USA)中的相應(yīng)位點(diǎn)，得到重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌BL21(DE3)中，然后在抗性LB培養(yǎng)基(氨芐青霉素100μg/ml)上進(jìn)行篩選陽性克隆；在引物1和引物2的引導(dǎo)下，用菌落PCR的方法驗(yàn)證篩選到的陽性克隆(轉(zhuǎn)化子)；將轉(zhuǎn)化子置于LB液體培養(yǎng)基中37℃、150rpm振蕩培養(yǎng)，至菌密度OD600為0.8左右時，加入1mM的IPTG誘導(dǎo)1.5小時，表達(dá)硝基苯硝基還原酶。表達(dá)得到的酶蛋白在12％的SDS-PAGE上有一明顯的誘導(dǎo)條帶，大小為27kDa，與硝基苯硝基還原酶的理論大小相同。硝基苯硝基還原酶通過His·Tag柱子純化(His·Bind Resin Chromatography，Novagen公司，USA)，具體操作步驟按照產(chǎn)品手冊進(jìn)行，其表達(dá)量為1200mg/L。
2、本發(fā)明的硝基苯硝基還原酶活性的測定硝基苯硝基還原酶在催化硝基苯或其他底物還原時需要以NAD(P)H為輔酶，而NAD(P)H在340nm處有最大吸收峰，紫外分光光度計(jì)測定單位時間內(nèi)340nm處的光吸收值的減少量，可測得硝基苯硝基還原酶的比活。反應(yīng)體系包括0.3μmol硝基苯，50mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH8.0)1mL，含有0.3-0.9mg硝基苯硝基還原酶的純蛋白溶液，0.6μmol NAD(P)H，酶促反應(yīng)總體積為3mL，室溫下反應(yīng)5min。NADPH摩爾消光系數(shù)ε＝6.22L mmol-1cm-1。1個單位的酶活力定義為每分鐘還原1μmol硝基所需的酶量。結(jié)果表明該硝基苯硝基還原酶比活性為121.3U·mg-1·min-1。
3、硝基苯硝基還原酶的功能鑒定以步驟1得到的硝基苯硝基還原酶做酶催化反應(yīng)實(shí)驗(yàn)，分別以硝基苯、鄰氯硝基苯、間氯硝基苯、對氯硝基苯和2，4-硝基氯代苯為底物。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示，表明此酶對這五種硝基芳烴化合物都具有硝基還原的催化活性，硝基還原的催化速率的大小分別為硝基苯＞對氯硝基苯＞間氯硝基苯＞鄰氯硝基苯＞2，4-二硝基氯代苯。反應(yīng)條件如下0.3μmol底物，50mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH8.0)1mL，含有0.3～0.9mg硝基苯硝基還原酶的純蛋白溶液，0.6μmol NAD(P)H。酶促反應(yīng)總體積為3mL，室溫下反應(yīng)5min，于340nm處檢驗(yàn)光吸收值的變化速率。
表1本發(fā)明的硝基苯硝基還原酶的底物范圍

4、硝基苯硝基還原酶催化產(chǎn)物的鑒定(1)羥氨苯歧位酶的制備提取睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonas testosteroni)CNB1 CGMCC No.1028菌株的基因組DNA，以其為模板，在引物35’-GTCCGAATTCAAGGAGACCCCTTCATGCC-3’(帶下劃線的堿基為EcoRI識別位點(diǎn)，粗體為起始密碼子)和引物45’-GTCAAAGCTTTGCGGGAAGTCTGATGGT-3’(帶下劃線的堿基為HindIII酶切位點(diǎn)，粗體為終止密碼子)的引導(dǎo)下，PCR擴(kuò)增羥氨苯歧位酶基因。其中，50μl PCR反應(yīng)體系為模板(60ng/μl)0.5μl；dNTP(每種10mM)1μl；引物(各25μM)1μl；10×緩沖液5μl；ddH2O 42.1μl；Taq(5U/μl)0.4μl。其中，10×緩沖液來自于TaKaRa Taq試劑盒(TaKaRa公司，Code No.DR100A)。PCR溫度條件為先94℃ 2min；然后94℃ 30sec，58℃ 45sec，72℃ 45sec，共30個循環(huán)；再72℃ 5min。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果表明擴(kuò)增到一條450bp左右的條帶，大小與預(yù)測結(jié)果一致。回收大小約450bp的片段，克隆至pGEM-T載體，進(jìn)行基因序列分析，結(jié)果表明擴(kuò)增得到的羥氨苯歧位酶基因具有序列表中SEQ ID NO3的核苷酸序列，編碼具有序列表中序列4的氨基酸殘基序列的羥氨苯歧位酶。利用限制性內(nèi)切酶EcoRI和HindIII將該P(yáng)CR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆入pET-21a(+)(購自Novagen公司，USA)中的相應(yīng)位點(diǎn)，得到重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌BL21(DE3)中，然后在抗性LB培養(yǎng)基(氨芐青霉素100μg/ml)上進(jìn)行篩選；在引物3和引物4的引導(dǎo)下，用菌落PCR的方法驗(yàn)證篩選到的陽性克隆(轉(zhuǎn)化子)；將轉(zhuǎn)化子置于LB液體培養(yǎng)基中37℃、150rpm振蕩培養(yǎng)，至菌密度OD600為0.8左右時，加入1mM的IPTG誘導(dǎo)1.5小時，表達(dá)羥氨苯歧位酶。羥氨苯歧位酶通過His·Tag柱子純化(His·Bind Resin Chromatography，Novagen公司，USA)，具體操作步驟按照產(chǎn)品手冊進(jìn)行。
(2)硝基苯硝基還原酶催化產(chǎn)物的鑒定酶促反應(yīng)總體積為3mL，含有0.3μmol硝基苯，50mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH8.0)1mL，0.5mg硝基苯硝基還原酶純蛋白，0.6μmol NAD(P)H。室溫下反應(yīng)5min后，再加入0.3mg步驟(1)的羥氨苯歧位酶反應(yīng)5min后，加入等體積的乙酸乙酯，振蕩萃取10min，5000rpm離心，取上層有機(jī)相，用氮?dú)庑⌒膶⒁宜嵋阴ゴ蹈?，將殘留物用水溶解，進(jìn)行HPLC分析，分析條件如下HP1050型液相色譜儀；C-18反相柱(4.6mm，250mm，Agilent，USA)；流動相為甲醇∶水＝60∶40(v/v)；流動相流速為1ml/min；檢測波長為210nm。分析結(jié)果表明產(chǎn)物中有鄰氨基酚(保留時間為2.766min)，說明硝基苯經(jīng)過硝基苯硝基還原酶的催化后，生成的產(chǎn)物為羥氨苯(羥氨基苯在羥氨苯歧位酶的作用下可形成鄰氨基酚)。
序列表<160>4<210>1<211>227<212>PRT<213>睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonas testosteroni)<400>1Met Pro Thr Ser Pro Phe Ile Asp Asp Leu Ile Arg Asp Arg Arg Thr1 5 10 15Lys Arg Gly Phe Leu Asp Gln Pro Val Pro Ile Glu Met Val Lys Asp20 25 30Ile Leu Ser Val Ala Lys Tyr Thr Pro Ser Ser Ser Asn Thr Gln Pro35 40 45Trp Arg Cys Tyr Val Leu Thr Gly Glu Ala Arg Glu Arg Val Thr Thr50 55 60Ala Ala Val Glu Ala Tyr Arg Gly Ala Pro Glu Gly Leu Lys Pro Glu65 70 75 80Tyr Ser Tyr Phe Pro Glu Pro Leu His Glu Pro Tyr Ala Thr Arg Phe85 90 95Asn Ser Phe Arg Gly Gln Leu Gly Asp Ala Glu Gly Cys Cys Arg Ser100 105 110Asp Ile Thr Gly Arg Arg Arg Tyr Val Glu Arg Gln Phe Arg Phe Phe115 120 125Asp Ala Pro Val Gly Leu Ile Phe Thr Met Asp Arg Arg Leu Glu Trp130 135 140Ala Ser Phe Ile Cys Tyr Gly Cys Phe Leu Gln Asn Ile Met Leu Ala145 150 155 160Ala Lys Gly Arg Gly Leu Asp Thr Cys Pro Gln Gly Leu Trp Ser Leu165 170 175
Gln His Pro Val Leu Arg Thr Glu Leu Asn Leu Pro Asp Asp Gln Met180 185 190Val Val Ala Gly Met Ser Leu Gly Trp Ala Asp Asn Ser Met Ala Val195 200 205Asn Gln Met Ser Met Ser Arg Val Glu Leu Glu Glu Phe Thr Thr Phe210 215 220Val His Glu225<210>2<211>684<212>DNA<213>睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonas testosteroni)<400>2atgccgacca gcccgttcat tgatgatctg atacgcgacc gtcgcacgaa gcgtggtttt 60ctggatcagc cagtgccgat agaaatggtg aaggacatcc tttcagtggc aaagtatacg120cctagttcga gtaacaccca gccgtggcgc tgttatgttt taaccggtga ggcgcgcgag180cgcgttacta cggccgcggt ggaggcgtac cgcggagcac ccgaaggcct gaagccggag240tattcatact ttcctgaacc actgcatgaa ccctatgcga cccgtttcaa ttcgtttcgc300ggacaactgg gcgacgctga aggatgctgc cgaagtgata taaccgggcg gcgtcgatac360gtcgagcgcc agttccgttt tttcgacgcg ccggtaggcc tcattttcac gatggatcgc420cgtctggaat gggccagttt catttgctat ggctgctttc tccagaacat catgctggca480gccaagggtc gtggtctcga tacttgccct caaggactat ggtccctgca gcacccggtg540ctgcgcactg aactcaacct tcctgatgat caaatggtgg tagcggggat gtcgctgggc600tgggccgaca atagcatggc agtgaaccag atgagtatgt ccagggtgga actggaagag660ttcaccacct tcgtccacga atga 684<210>3<211>453<212>DNA<213>睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonas testosteroni)
<400>3atgcctgccc agccgaatgt cgcttatttc acccatcgcc ttctacaggc agggttcgtg 60cttttccttc ttgggctcct gacgggtatt gtcattccag ccgcccaact tccgcgcatg120gcactgtcca gccatctcca gggcgtcatg aatggctcct tcctcatcgc tctcggactt180tgctggaagc atctcgttct tccgtcctgg gccgagagga tggcgttcct ttcggccatt240acggggacat atgcgaactg ggcggcgacg ctgctttcag ctttcaccgg tgctgccccg300atgatgccca ttgccggtgg cggaagcgtt ggtactccct ttcacgaaat gctggtgtcc360ggcctcctgc tcttcctgat cctggccatg atcctcacct gcgtgcttgt gctgtggggg420cttcaccgtc ggtcgggtgt cccagcacca tga 453<210>4<211>150<212>PRT<213>睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonas testosteroni)<400>4Met Pro Ala Gln Pro Asn Val Ala Tyr Phe Thr His Arg Leu Leu Gln1 5 10 15Ala Gly Phe Val Leu Phe Leu Leu Gly Leu Leu Thr Gly Ile Val Ile20 25 30Pro Ala Ala Gln Leu Pro Arg Met Ala Leu Ser Ser His Leu Gln Gly35 40 45Val Met Asn Gly Ser Phe Leu Ile Ala Leu Gly Leu Cys Trp Lys His50 55 60Leu Val Leu Pro Ser Trp Ala Glu Arg Met Ala Phe Leu Ser Ala Ile65 70 75 80Thr Gly Thr Tyr Ala Asn Trp Ala Ala Thr Leu Leu Ser Ala Phe Thr85 90 95Gly Ala Ala Pro Met Met Pro Ile Ala Gly Gly Gly Ser Val Gly Thr100 105 110Pro Phe His Glu Met Leu Val Ser Gly Leu Leu Leu Phe Leu Ile Leu
115 120 125Ala Met Ile Leu Thr Cys Val Leu Val Leu Trp Gly Leu His Arg Arg130 135 140Ser Gly Val Pro Ala Pro145 150
權(quán)利要求
1.硝基苯硝基還原酶，是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)1)序列表中的SEQ ID №1；2)將序列表中SEQ ID №1的氨基酸殘基序列經(jīng)過一至十個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有硝基苯硝基還原酶功能的蛋白質(zhì)。
2.權(quán)利要求1所述的硝基苯硝基還原酶的編碼基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于所述硝基苯硝基還原酶編碼基因具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №2的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID №1蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID №2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
4.含有權(quán)利要求2或3所述的硝基苯硝基還原酶編碼基因的表達(dá)載體。
5.含有權(quán)利要求2或3所述的硝基苯硝基還原酶編碼基因的細(xì)胞系。
6.含有權(quán)利要求2或3所述的硝基苯硝基還原酶編碼基因的宿主菌。
7.權(quán)利要求1所述的硝基苯硝基還原酶在對氨基酚和鄰氨基酚類芳香族化合物及其相關(guān)衍生化合物生產(chǎn)中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求2或3所述的硝基苯硝基還原酶編碼基因在對氨基酚和鄰氨基酚類芳香族化合物及其相關(guān)衍生化合物生產(chǎn)中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種硝基苯硝基還原酶及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明的硝基苯硝基還原酶，是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)1)序列表中的SEQ ID №1；2)將序列表中SEQ ID №1的氨基酸殘基序列經(jīng)過一至十個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有硝基苯硝基還原酶功能的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的硝基苯硝基還原酶及其編碼基因?qū)⒃趯Π被雍袜彴被宇惙枷阕寤衔锛捌湎嚓P(guān)衍生化合物的生產(chǎn)中發(fā)揮重要作用。
文檔編號C12N15/53GK1796548SQ20041010283
公開日2006年7月5日 申請日期2004年12月28日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月28日
發(fā)明者劉雙江, 吳建峰, 劉志培 申請人:中國科學(xué)院微生物研究所