專利名稱：一種低毒性葡激酶突變體，其制備方法及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種葡激酶突變體其制備方法及用途，具體的說，本發(fā)明涉及一種低毒性葡激酶突變體，其制備方法及其在制備溶栓藥物上的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
研制溶栓藥物使血管再通是治療心肌梗塞和腦梗塞的有效途徑。溶栓劑通過激活纖維蛋白酶原使之變?yōu)橛谢钚缘睦w維蛋白溶酶活化纖溶系統(tǒng)，從而降解纖維蛋白(血栓)。目前，已經(jīng)應(yīng)用于臨床的溶栓藥物有組織型纖溶酶原激活劑(t-PA)、尿激酶，鏈激酶(SK)等，但這些藥物在溶栓效力、血栓選擇性等方面存在一定缺陷，需要研制新一代溶栓藥物。
相對(duì)早期溶栓藥物，理想的溶栓藥物應(yīng)該具有溶栓效力強(qiáng)，血栓選擇性高、再梗塞率低、半衰期長、價(jià)格便宜等優(yōu)點(diǎn)。葡激酶(staphylokinase，SAK)是一種由金黃色葡萄球菌分泌的含有136個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)。它作為新一代溶栓藥物，具有上述優(yōu)點(diǎn)，作為血栓特異性溶栓藥物，溶栓效力與當(dāng)前最理想的溶栓藥t-PA及其衍生物相當(dāng)。在一項(xiàng)多中心隨機(jī)開放實(shí)驗(yàn)中，100個(gè)急性心肌梗死(AMI)病人用劑量相當(dāng)?shù)腟AK和alteplase(t-PA的一種衍生物)比較治療發(fā)現(xiàn)，給藥90分鐘后，用alteplase的病人組58％獲得完全再通，而用SAK的病人組再通率達(dá)62％。說明SAK與alteplase治療對(duì)早期冠狀動(dòng)脈再通至少同樣有效。此外，葡激酶可以通過原核基因工程制備，價(jià)格卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于t-PA及其衍生物(王曉文，楊子義，新型葡激酶的研究進(jìn)展，解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào)，第19卷第3期)。目前葡激酶在我國已經(jīng)在完成III期臨床試驗(yàn)后獲得新藥證書上市，國外則正在進(jìn)行II/III臨床研究。
但遺憾的是在葡激酶的臨床試驗(yàn)中，葡激酶暴露了兩大臨床缺陷，一是其免疫原性，二是較為嚴(yán)重的出血毒性。臨床實(shí)驗(yàn)表明AMI大部分病人(＞80％)注射SAK后第14～35d后出現(xiàn)中和性抗體，高滴度的抗體可持續(xù)2周到1年半。中和抗體的產(chǎn)生嚴(yán)重影響了它的重復(fù)應(yīng)用，若以后再堵導(dǎo)致應(yīng)用同樣藥物無效，不得不改用其它溶栓藥物，減弱了它的應(yīng)用效果，甚至?xí)T發(fā)急性過敏反應(yīng)(王曉文，楊子義，新型葡激酶的研究進(jìn)展，解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào)，第19卷第3期)；更為嚴(yán)重的是，盡管從理論上講葡激酶對(duì)血栓的選擇性較強(qiáng)，但在臨床試驗(yàn)中觀察到了其較為嚴(yán)重的出血副作用，以皮膚粘膜為主(陸化，盛瑞蘭，徐衛(wèi)等，凍干重組葡激酶對(duì)正常人凝血、纖溶系統(tǒng)影響的研究，中國藥理學(xué)通報(bào)，2000；17(1)47～50)，國外和國內(nèi)報(bào)告葡激酶導(dǎo)致的出血發(fā)生率(如牙齦出血)高達(dá)20％左右(楊勝榮，周麗娟，叢洪良等，國產(chǎn)重組葡激酶耐受性和安全性的臨床試驗(yàn)，河北醫(yī)藥2001年第23卷第5期)。國外臨床試驗(yàn)還觀察到葡激酶導(dǎo)致嚴(yán)重的臟器出血和顱內(nèi)出血，甚至危及生命(Armstrong PW，Burton JR，Palisaitis D，Collaborativeangiographic patency trial of recombinant staphylokinase(CAPTORS)，Am Heart J.2000；139(5)820-3.)。
為降低葡激酶的副作用，使之更加適合臨床使用，國內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行了SAK結(jié)構(gòu)改造研究，目前研究集中在降低免疫原性方面，主要是利用基因工程、蛋白質(zhì)工程等途徑設(shè)計(jì)、改造野生型葡激酶蛋白，力求得到免疫原性小、溶栓活性高的SAK。Collen發(fā)現(xiàn)，構(gòu)建了重組SAK的兩個(gè)變異體M 38和M 89，它們分別是Lys 35、Glu 38、Lys 74、Glu 75、Arg 77用Ala替代和Lys 74、Glu 75、Arg 777、Glu 80、Asp 82用Ala替代獲得的變異體。與野生型相比，在倉鼠、兔、狒狒和人體中誘導(dǎo)產(chǎn)生的中和性抗體都明顯減少，但它們活性也降低了50％。為解決活性下降問題，Collen將M38、M89突變體回復(fù)，在此基礎(chǔ)上建立了14個(gè)新的突變體，篩選后發(fā)現(xiàn)，Lys 74是重要的抗原表位。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)表明，兩個(gè)變異體SAK(K74A)和SAK(K74A，E75A，R77A)在人體具有完整的溶栓活性，同時(shí)也有較低的免疫原性。Laroche用順序加成突變構(gòu)建了大量sak突變體。即首先將1個(gè)或2個(gè)氨基酸突變?yōu)锳la，突變的范圍包括除了Gly、Ala、Pro之外的所有氨基酸，比較各突變體的特異活性和抗體吸收(對(duì)野生型SAK誘導(dǎo)的抗體的吸收)情況，選擇出13個(gè)突變體。然后做順序加成，再次比較各突變體纖溶特性和抗體吸收指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)顯示，突變體誘導(dǎo)的中和抗體比例(47％)低于野生型(81％)；野生型SAK產(chǎn)生的抗體可以全部被野生型SAK吸收，但只能被變異體不完全吸收，說明突變體中缺少了野生型的某些表位；變異體誘導(dǎo)出的抗體可完全被野生型吸收，說明氨基酸替換沒有產(chǎn)生新表位(Laroche Y，Heymans S，Capaert S，Recombinant staphylokinase variants with reducedantigenicity due to elimination of B-lymphocyte epitopes，Blood，2000，961425)。獲得的SAK突變體SY161經(jīng)進(jìn)一步PEG修飾，已經(jīng)進(jìn)入臨床研究，它保留了溶栓活性同時(shí)，SY161-P5抗原性有所降低(王曉文，楊子義，新型葡激酶的研究進(jìn)展，解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào)，第19卷第3期)。從上述結(jié)果來看，除了已經(jīng)證明的Lys 74是重要免疫表位，對(duì)SAK免疫原性的貢獻(xiàn)較大以外，并未發(fā)現(xiàn)其它顯著影響SAK的免疫原性的位點(diǎn)。
另外，盡管SAK的出血副作用是其臨床應(yīng)用的另一障礙，但現(xiàn)有技術(shù)沒有通過點(diǎn)突變降低SAK的出血副作用的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
為克服野生型葡激酶的上述臨床缺陷，降低其毒副作用，本發(fā)明公開了一種新型低毒性葡激酶突變體。
本發(fā)明還公開了該葡激酶突變體的制備方法。
本發(fā)明還公開了該葡激酶突變體在制備溶栓藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的新型低毒性葡激酶突變體，與野生型葡激酶相比，36位氨基酸為甘氨酸，130位氨基酸為蘇氨酸，135位氨基酸為精氨酸。與野生型葡激酶相比，溶栓活性相當(dāng)，但毒性明顯降低，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，上述葡激酶突變體不具野生型葡激酶通常表現(xiàn)的出血毒性，且免疫原性更低。
本發(fā)明的葡激酶突變體分子具有序列表中序列1所示氨基酸序列。
本發(fā)明還公開了一種編碼上述葡激酶突變體的基因，該基因具有序列表中序列2所示的核苷酸序列。
本發(fā)明所述葡激酶突變體的制備方法包括如下步驟(1)制備葡激酶突變體編碼基因；(2)突變基因與表達(dá)載體進(jìn)行連接；(3)在大腸桿菌中進(jìn)行高效表達(dá)；(4)葡激酶突變體的分離純化。
制備葡激酶突變體編碼基因可以按照實(shí)驗(yàn)室常規(guī)方法進(jìn)行，優(yōu)選PCR法。與野生型葡激酶基因相比，編碼本發(fā)明的葡激酶突變體的基因，其編碼基因的第108位的堿基A替換成堿基G，使得第36位精氨酸殘基替換為甘氨酸殘基；第391位堿基A替換成堿基G，使得第130位賴氨酸殘基替換為蘇氨酸殘基；第406位堿基A替換成堿基G，使得第130位賴氨酸殘基替換為精氨酸殘基。
上述制備方法中所述表達(dá)載體可以是常規(guī)的原核系統(tǒng)表達(dá)載體，如商業(yè)PET系列載體和國內(nèi)廣泛使用的PBV220載體，優(yōu)選PBV220載體。大腸桿菌可以是適合原核系統(tǒng)表達(dá)的配套大腸桿菌，當(dāng)使用PET類載體，宿主菌優(yōu)選E.coli BL21(DE3)系列；當(dāng)使用PBV220載體時(shí)宿主菌可選擇多種商業(yè)上提供的大腸桿菌，優(yōu)選E.coli DH5α。
本發(fā)明構(gòu)建的SAK突變體基因與pBV220相連接，在大腸桿菌DH5α中實(shí)現(xiàn)了高效表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物主要以可溶性狀態(tài)存在。經(jīng)分離純化，獲得了電泳純的SAK突變體。純化蛋白用BCA方法進(jìn)行蛋白定量(汪家政，范明.蛋白質(zhì)技術(shù)手冊(cè)[M].北京科學(xué)出版社，2000，51-54.)。以相同方法制備的野生型SAK為對(duì)照，采用溶圈法進(jìn)行溶栓活性鑒定，并通過豚鼠試驗(yàn)觀測(cè)其出血活性和免疫原性。經(jīng)纖維蛋白溶圈法測(cè)定，該突變體與野生型葡激酶相比，溶栓活性相當(dāng)。但毒性明顯降低，野生型葡激酶腹腔注射豚鼠，幾乎全部表現(xiàn)出皮膚出血，而該突變體無此現(xiàn)象。肺部病理切片顯示，葡激酶突變體導(dǎo)致的出血也顯著低于野生型葡激酶。另外與野生型葡激酶相比，突變體的免疫原性顯著更低。
本發(fā)明還公開了該葡激酶突變體在制備溶栓藥物中的應(yīng)用，本發(fā)明的葡激酶突變體可用于急性心肌梗塞、外周動(dòng)脈血栓和深部靜脈血栓等血栓性疾病的搶救和治療。


圖1為葡激酶突變體的PCR擴(kuò)增圖譜(箭頭所示為目的片段)圖2為重組表達(dá)質(zhì)粒pBV220-mSAK的酶切圖譜(箭頭所示為目的片段)圖3為葡激酶突變體表達(dá)蛋白的SDS-PAGE分析(箭頭所示為目的產(chǎn)物)圖4為葡激酶突變體表達(dá)蛋白經(jīng)過一步層析后的SDS-PAGE分析(箭頭所示為目的產(chǎn)物)圖5為葡激酶突變體表達(dá)蛋白經(jīng)過兩步層析后的SDS-PAGE分析(箭頭所示為目的產(chǎn)物)圖6為mSAK突變體蛋白與wt-sak的抗體反應(yīng)性比較圖7為不同時(shí)間葡激酶及突變體刺激的抗體效價(jià)圖8為葡激酶及突變體誘導(dǎo)的皮膚出血情況比較圖9為葡激酶及突變體誘導(dǎo)的肺出血情況比較。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例一 葡激酶突變基因構(gòu)建、表達(dá)質(zhì)粒的鑒定及表達(dá)1.材料和方法
1.1材料大腸桿菌DH5α，表達(dá)載體pBV220、重組葡激酶(rSAK)質(zhì)粒和菌株由本室制備(發(fā)明名稱利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)葡激酶的方法，中國發(fā)明專利號(hào)98102132)，抗SAK多克隆抗體均由本室按照常規(guī)方法制備并保存，葡激酶標(biāo)準(zhǔn)品、溶栓活性測(cè)定試劑均購自中國生物制品檢定所，Taq DNA聚合酶購自大連寶生物公司、T4 DNA連接酶、質(zhì)粒提取試劑盒、限制性內(nèi)切酶EcoRI、BamH I均購自Promega公司，DNA純化試劑盒購自鼎國生物技術(shù)公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。蛋白定量試劑盒BCA為PIERCE公司產(chǎn)品。
1.2方法1.2.1葡激酶突變體構(gòu)建以金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株FRI S-6(購于美國ATCC)DNA為模板，通過PCR法引入突變位點(diǎn)，反應(yīng)條件為96℃ 10min預(yù)變性，然后94℃ 60s，50℃ 60s，72℃ 60s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。上游引物P15，-CAC GAA TTC ATG TCA AGT TCA TTC GAC AAA-3，(含加入的酶切位點(diǎn)EcoR I)；下游引物P105′-GGC GGA TCC TTA TTT CCTTTC TAT AAC AAC CGT TGT AAT TAA G-3，(含引入的BamH I酶切位點(diǎn)及突變位點(diǎn)K135R，K130T)。通過擴(kuò)增獲得突變SAK基因片段。
1.2.2表達(dá)載體的構(gòu)建DNA片段的回收、質(zhì)粒的提取與純化、均按試劑盒說明書進(jìn)行；SAK突變體基因經(jīng)EcoRI、BamH I酶切回收后與相同酶切回收pBV220載體連接，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pBV220-mSAK，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，同時(shí)培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，酶切鑒定是否含有mSAK基因序列，陽性克隆送上海博亞公司測(cè)序。
1.2.3 mSAK蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與鑒定挑取單菌落，在5ml LB培養(yǎng)基(含100mg/l的氨芐西林)中37℃培養(yǎng)過夜，按1％比例接種到200ml含氨芐西林的LB培養(yǎng)基中，30℃振蕩培養(yǎng)至OD600約為0.8時(shí)，升溫至42℃誘導(dǎo)培養(yǎng)4hr；完畢后離心收集菌體并超聲破碎，離心分別收集上清和沉淀進(jìn)行蛋白SDS-PAGE分析。
1.2.4表達(dá)產(chǎn)物的純化采用離子交換層析與凝膠過濾兩步純化。
Q-Sepharose FF離子交換層析Tris-HCl(pH8.0)平衡后，超聲破碎收集的上清，用10mmol/L Tris-HCl緩沖液稀釋至1～2mg/ml后上層析柱。上樣結(jié)束后，用3倍柱床體積的上述緩沖液洗脫未結(jié)合蛋白，洗脫峰恢復(fù)至基線后，用0.5mol/L NaCl 10mmol/L Tris-HCl洗脫，收集洗脫峰各組分并測(cè)定各組分SAK活性及蛋白濃度，SDS-PAGE分析各組分中蛋白含量。
凝膠過濾分子篩凝膠柱Sephacryl-s-200用0.02mol/L磷酸鹽緩沖液平衡備用。將離子交換柱收集的活性組分合并，進(jìn)一步濃縮后，上凝膠柱，流速1ml/min，檢測(cè)蛋白峰，用纖維蛋白溶解法測(cè)定各組分中mSAK活性，收集活性主峰，用SDS-PAGE初步測(cè)定mSAK純度。
2.結(jié)果2.1葡激酶突變體基因獲得進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳結(jié)果顯示，在相應(yīng)位置出現(xiàn)條帶(圖1)。
2.2表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定PCR篩選陽性轉(zhuǎn)化子，提取重組質(zhì)粒，用EcoR I、BamH I酶切，可見載體片段與約400bp的插入片段，它與DNA Marker相應(yīng)片段的大小基本一致(圖2)。測(cè)序結(jié)果表明(見序列表2)，與野生型葡激酶基因相比，編碼本發(fā)明的葡激酶突變體的基因，其編碼基因的第108位的堿基A替換成堿基G，使得第36位精氨酸殘基替換為甘氨酸殘基；第391位堿基A替換成堿基G，使得第130位賴氨酸殘基替換為蘇氨酸殘基；第406位堿基A替換成堿基G，使得第130位賴氨酸殘基替換為精氨酸殘基。除相應(yīng)130、135位氨基酸已經(jīng)突變，且在36位氨基酸增加了一處突變，為模板內(nèi)含的突變。
2.3 mSAK工程菌的誘導(dǎo)表達(dá)和表達(dá)產(chǎn)物存在形態(tài)鑒定熱激誘導(dǎo)含有重組質(zhì)粒的E.coli DH5α，重組蛋白獲得高效表達(dá)，其分子量與提純的重組野生型SAK相同，約15kDa；色譜掃描儀檢測(cè)顯示，重組蛋白占菌體總蛋白的40-50％(圖3)，離心收集菌體，PBS洗滌，超聲處理后進(jìn)行SDS-PAGE分析，表達(dá)蛋白主要以可溶性產(chǎn)物為主。
2.4 mSAK突變體蛋白的純化誘導(dǎo)后離心收集菌體，10mmol/L Tris-HCl緩沖液重懸后超聲破碎后離心收集上清，SDS-PAGE分析估計(jì)蛋白濃度，稀釋至1～2mg/ml后上Q-Sepharose FF離子交換層析柱，線性梯度洗脫，SDS-PAGE分析顯示，離子交換層析可以去除大部分雜蛋白(圖4)，收集樣品峰進(jìn)一步濃縮透析后上凝膠柱Sephacryl-s-200純化，蛋白電泳結(jié)果mSAK呈現(xiàn)單一條帶(圖5)。以上結(jié)果表明，通過以上兩步的組合，可以對(duì)構(gòu)建的葡激酶的突變體進(jìn)行有效的純化。用BCA試劑盒法測(cè)定純化突變體蛋白的含量。
實(shí)施例二 葡激酶突變體的活性分析1.材料方法1.1材料野生型葡激酶的制備與純化，與實(shí)施例一中葡激酶突變體的制備方法相同，其它材料見實(shí)施例一。
1.2方法1.2.1葡激酶突變體的溶栓活性測(cè)定以野生型葡激酶為對(duì)照，采用纖維蛋白溶圈法，參照中國生物制品檢定規(guī)程2001版，即在含有纖維蛋白原、人纖溶酶和凝血酶的凝膠板上打孔，將mSAK蛋白稀釋后加入各孔，每孔加樣10μl，置于潮濕平皿中37℃孵箱中過夜，測(cè)量溶圈直徑，同時(shí)采用系列稀釋的葡激酶標(biāo)準(zhǔn)品做一標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程從而推算mSAK的溶栓活性。
表1 mSAK活性測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線


經(jīng)直線回歸，r＝0.997，A＝1.299，B＝0.2581.2.2抗體反應(yīng)性比較以野生型葡激酶為對(duì)照，用不同量的突變體蛋白與相同稀釋度的兔抗SAK抗血清溫育，用溶圈法測(cè)定剩余抗原的溶栓活性。
1.2.3豚鼠免疫原性檢測(cè)及出血傾向觀察以野生型葡激酶為對(duì)照，選用健康雄性豚鼠，體重280±20g，購自本院動(dòng)物中心，每只豚鼠腹腔注射0.5ml，每周一次，第一次125μg/只，第二次與第三次各250μg/只，每次注射后一周耳靜脈取血，ELISA檢測(cè)血清中抗體水平，同時(shí)觀察豚鼠的活動(dòng)狀態(tài)，局部如眼瞼、鼻周圍皮膚等出血情況，并做重要臟器病理切片。
2.結(jié)果2.1 SAK突變體蛋白溶栓活性測(cè)定測(cè)量突變體蛋白的溶圈直徑，代入回歸方程中計(jì)算各突變體蛋白的總?cè)芩ɑ钚裕肂CA試劑盒法測(cè)定各突變體蛋白的含量，用溶栓活性除以蛋白含量計(jì)算出樣品中mSAK的比活性，同時(shí)設(shè)wt-SAK作為參考，結(jié)果所獲突變體蛋白的比活性與野生型葡激酶相當(dāng)。
表2 mSAK與wt-SAK活性測(cè)定結(jié)果比較表

2.2SAK突變體蛋白與wt-sak的抗體反應(yīng)性比較以野生型SAK為對(duì)照，測(cè)定經(jīng)wt-SAK抗血清溫育后的wt-SAK、mSAK的殘余纖溶活性。wt-SAK的活性明顯受到抗wt-SAK血清的抑制，低濃度時(shí)幾乎完全被抑制，而mSak突變體所受影響很小，在低濃度和高濃度時(shí)變化不大(圖6)。
2.3豚鼠免疫原性檢測(cè)每次免疫后一周耳靜脈取血，以wt-SAK、mSAK為抗原ELISA檢測(cè)血清中的抗體水平，前兩次免疫二者的抗體滴度上升的不快，相差也不明顯，第三次免疫后，wt-SAK抗體滴度迅速接近105，而mSAK僅達(dá)到103左右(圖7)。
2.4動(dòng)物出血傾向觀察在豚鼠試驗(yàn)意外的觀察到，野生型葡激酶幾乎在所有豚鼠中均導(dǎo)致嚴(yán)重的局部皮膚出血(表3)，而類似的現(xiàn)象在葡激酶突變體沒有觀察到(圖8)。同時(shí)肺部病理切片結(jié)果表明，肺部出血葡激酶野生型也較突變體嚴(yán)重的多(圖9)。說明獲得的葡激酶突變體可以有效的降低野生型葡激酶的出血傾向。
表3 動(dòng)物出血數(shù)比較

一種低毒性葡激酶突變體，其制備方法及用途序列表<110>中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所<120>一種低毒性葡激酶突變體，其制備方法及用途<130>
<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>136<212>PRT<213>
<400>1Ser Ser Ser Phe Asp Lys Gly Lys Tyr Lys Lys Gly Asp Asp Ala Ser1 5 10 15Tyr Phe Glu Pro Thr Gly Pro Tyr Leu Met Val Asn Val Thr Gly Val20 25 30Asp Gly Lys Gly Asn Glu Leu Leu Ser Pro Arg Tyr Val Glu Phe Pro35 40 45Ile Lys Pro Gly Thr Thr Leu Thr Lys Glu Lys Ile Glu Tyr Tyr Val50 55 60Glu Trp Ala Leu Asp Ala Thr Ala Tyr Lys Glu Phe Arg Val Val Glu65 70 75 80Leu Asp Pro Ser Ala Lys Ile Glu Val Thr Tyr Tyr Asp Lys Asn Lys85 90 95Lys Lys Glu Glu Thr Lys Ser Phe Pro Ile Thr Glu Lys Gly Phe Val100 105 110Val Pro Asp Leu Ser Glu His Ile Lys Asn Pro Gly Phe Asn Leu Ile115 120 125Thr Thr Val Val lle Glu Arg Lys130 135<210>2<211>408<212>DNA<213>
<400>2tcaagttcat tcgacaaagg aaaatataaa aaaggcgatg acgcgagtta ttttgaacca 60acaggcccgt atttgatggt aaatgtgact ggagttgatg gtaaaggaaa tgaattgcta120tcccctcgtt atgtcgagtt tcctattaaa cctgggacta cacttacaaa agaaaaaatt180gaatactatg tcgaatgggc attagatgcg acagcatata aagagtttag agtagttgaa240ttagatccaa gcgcaaagat cgaagtcact tattatgata agaataagaa aaaagaagaa300acgaagtctt tccctataac agaaaaaggt tttgttgtcc cagatttatc agagcatatt360aaaaaccctg gattcaactt aattacaacg gttgttatag aaaggaaa 408
權(quán)利要求
1.一種葡激酶突變體，其特征在于與野生型葡激酶相比，36位氨基酸為甘氨酸，130位氨基酸為蘇氨酸，135位氨基酸為精氨酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的葡激酶突變體，其特征在于具有序列表中序列1所示的氨基酸序列。
3.編碼權(quán)利要求1的葡激酶突變體的基因，其特征在于具有序列表中序列2所示的核苷酸序列。
4.權(quán)利要求1或2所述的葡激酶突變體的制備方法，其特征在于包括如下步驟(1)對(duì)野生型葡激酶基因進(jìn)行定點(diǎn)突變；(2)突變基因與表達(dá)載體進(jìn)行連接；(3)在大腸桿菌中進(jìn)行高效表達(dá)；(4)葡激酶突變體的分離純化。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的制備方法，其特征在于所述表達(dá)載體是PBV220。
6.根據(jù)權(quán)利要求4的制備方法，其特征在于所述大腸桿菌是E.coli DH5α。
7.權(quán)利要求1或2所述的葡激酶突變體在制備溶栓藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種新型低毒性葡激酶突變體，還公開了其制備方法及用途。本發(fā)明的葡激酶突變體與野生型葡激酶相比，36位氨基酸為甘氨酸，130位氨基酸為蘇氨酸，135位氨基酸為精氨酸。制備該突變體的方法包括葡激酶基因定點(diǎn)突變、與表達(dá)載體連接、在大腸桿菌中高效表達(dá)、分離純化等步驟。本發(fā)明的葡激酶突變體可以作為一種溶栓藥物使用。與野生型葡激酶相比，溶栓活性相當(dāng)，但毒性明顯降低，不具野生型葡激酶的出血毒性，且免疫原性更低。
文檔編號(hào)C12N9/12GK1763185SQ20041008630
公開日2006年4月26日 申請(qǐng)日期2004年10月22日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月22日
發(fā)明者姜永強(qiáng), 鄭玉玲, 寧保安, 馬茹 申請(qǐng)人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所