專利名稱：自體造血干細(xì)胞體外凈化的方法及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及自體造血干細(xì)胞移植過程中，對(duì)造血干細(xì)胞中混有的腫瘤細(xì)胞的體外凈化方法、相應(yīng)的試劑盒以及腫瘤的治療方法。
背景技術(shù)：
高劑量化放療聯(lián)合造血干細(xì)胞移植是治療惡性腫瘤的一項(xiàng)重要技術(shù)，根據(jù)造血干細(xì)胞的來源，造血干細(xì)胞移植可分為自體造血干細(xì)胞移植和異體造血干細(xì)胞移植。自體造血干細(xì)胞移植較異體移植有著不受供體限制、移植相關(guān)死亡率低、安全性高、花費(fèi)低等優(yōu)點(diǎn)。目前自體造血干細(xì)胞移植已廣泛用于惡性腫瘤的治療研究，其對(duì)多發(fā)性骨髓瘤、惡性淋巴瘤患者有著肯定的療效(KumarA，et al.，Lancet Oncol.2003；4293-304；Schouten HC，et al.，J.Clin Oncol.2003；21(21)3918-27)。近10多年來，隨著外周血造血干細(xì)胞移植技術(shù)的日趨完善，該項(xiàng)技術(shù)更被用于難治性乳腺癌、睪丸癌、卵巢癌、小細(xì)胞肺癌、鼻咽癌、兒童纖維母細(xì)胞瘤、軟組織肉瘤等實(shí)體瘤的治療研究，不少資料已顯示出較好的初步療效。
盡管自體造血干細(xì)胞移植有許多優(yōu)點(diǎn)，但自體造血干細(xì)胞移植可能帶來的腫瘤細(xì)胞回輸，常常是腫瘤復(fù)發(fā)的根源(Brenner MK，et al.，Lancet.1993；34185-68)，特別是對(duì)于多發(fā)性骨髓瘤等血液系腫瘤，以及中高度惡性淋巴瘤、乳腺癌、兒童神經(jīng)母細(xì)胞瘤、小細(xì)胞肺癌等骨髓高侵犯率腫瘤(Armitage JO，Antman K.High-Dose Cancer TherapyPharmacology，Hematopoietins，Stem cells(Third edition).2000 by LIPPINCOTT WILLIAMS&WILKINS，pp301-331)。
90年代初期，有人根據(jù)造血干細(xì)胞與惡性腫瘤細(xì)胞表面CD34抗原的差異，研發(fā)出了CD34陽性細(xì)胞免疫磁珠篩選純化技術(shù)(MACS)，曾給自體造血干細(xì)胞體外凈化帶來了極大的希望，但經(jīng)過10多年的臨床評(píng)價(jià)，人們發(fā)現(xiàn)盡管該技術(shù)可降低2～6個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)的瘤細(xì)胞，但殘存的腫瘤細(xì)胞仍可導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)。
隨后有人根據(jù)造血干細(xì)胞與惡性腫瘤細(xì)胞表面腺病毒受體的天然差異，提出了應(yīng)用攜帶抑癌基因或自殺基因的復(fù)制缺陷型腺病毒凈化造血干細(xì)胞的方法。但這種方法由于所用的復(fù)制缺陷型腺病毒只是一種載體，它本身不能殺死腫瘤細(xì)胞，其對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷主要依賴攜帶的外源基因，而外源基因的抗腫瘤效應(yīng)則依賴于腫瘤細(xì)胞是否存在對(duì)應(yīng)的基因突變；而當(dāng)采用攜帶自殺基因的復(fù)制型缺陷腺病毒時(shí)，抗腫瘤效應(yīng)不僅依賴于自殺基因在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，而且還依賴于腫瘤細(xì)胞對(duì)由抗腫瘤前藥轉(zhuǎn)化出的抗腫瘤藥物的敏感性。因此這類方法的應(yīng)用是有局限性的。
因此，尋求更理想的造血干細(xì)胞體外凈化方法仍是業(yè)內(nèi)學(xué)者的主要攻關(guān)方向之一。本發(fā)明正是針對(duì)這一需求而完成的。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的狀況并依據(jù)造血干細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞表面腺病毒受體的天然差異，發(fā)明人進(jìn)行了大量深入的研究工作，使得本發(fā)明終于得以完成。
首先，本發(fā)明人通過攜帶綠色熒光蛋白基因的復(fù)制型缺陷型腺病毒(Ad-GFP)轉(zhuǎn)染造血干細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞，再通過熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀檢測，證實(shí)了腺病毒對(duì)多數(shù)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)染率較高，而對(duì)造血干細(xì)胞很難轉(zhuǎn)染。本發(fā)明人在這一發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上，具體完成了如下

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一在于提供一種自體造血干細(xì)胞體外凈化的新方法。在本發(fā)明的方法中，包括將含有腫瘤細(xì)胞的造血干細(xì)胞與基因工程改造后的增殖性溶瘤病毒接觸和使增殖性溶瘤病毒進(jìn)入腫瘤細(xì)胞的步驟。其中所述的腫瘤細(xì)胞包括血液系腫瘤細(xì)胞例如多發(fā)性骨髓瘤、急性白血病、慢性白血病、惡性淋巴瘤等，還包括非血液系腫瘤細(xì)胞例如惡性淋巴瘤、乳腺癌、睪丸癌、卵巢癌、小細(xì)胞肺癌、鼻咽癌、兒童纖維母細(xì)胞瘤、軟組織肉瘤等實(shí)體瘤細(xì)胞。所述的增殖性溶瘤病毒包括能選擇性在腫瘤細(xì)胞中增殖復(fù)制的腺病毒、單純皰疹病毒、新城疫病毒、水泡性口炎病毒和呼腸孤病毒。本發(fā)明優(yōu)選的增殖性溶瘤病毒是增殖性腺病毒，特別是能被腫瘤細(xì)胞表面的腺病毒受體識(shí)別的缺失了E1B基因的腺病毒。所述的增殖性腺病毒包括缺失了E1B基因的所有5型增殖腺病毒。
本申請(qǐng)人于1998年保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)的一種腺病毒就是一種缺失了E1B基因的所有5型增殖腺病毒，其保藏號(hào)為CCTCC98003。下文中有時(shí)將CCTCC98003簡稱為H101。
在本發(fā)明的凈化方法中，若以腫瘤細(xì)胞為感染目標(biāo)細(xì)胞，優(yōu)選的是將增殖性腺病毒與造血干細(xì)胞移植物中混有的腫瘤細(xì)胞按照10～10000MOI(腺病毒/腫瘤細(xì)胞)范圍進(jìn)行接觸，較優(yōu)選的MOI范圍為10-5000，更優(yōu)選的MOI范圍是50-1000。當(dāng)MOI低于10時(shí)，由于腺病毒的密度較低可能會(huì)使個(gè)別的腫瘤細(xì)胞沒能和腺病毒充分接觸并結(jié)合上，因而存在腫瘤細(xì)胞殘存的可能性；這時(shí)可借助其他一些造血干細(xì)胞的純化方法如MACS技術(shù)或再次進(jìn)行與增殖性腺病毒接觸結(jié)合，以達(dá)到100％的凈化效果。當(dāng)MOI高于10000時(shí)，可能對(duì)造血干細(xì)胞回輸后的血液重建產(chǎn)生一些不利的影響；這時(shí)可能需要對(duì)患者施用一些有利于血液重建的藥物或其他醫(yī)療手段，因而，可能給患者增加醫(yī)療負(fù)擔(dān)。
在本發(fā)明的凈化方法中，優(yōu)選的是將造血干細(xì)胞移植物與增殖性腺病毒接觸30分鐘至8小時(shí)的時(shí)間，優(yōu)選的是接觸1-4小時(shí)，更優(yōu)選接觸2-4小時(shí)。當(dāng)接觸時(shí)間低于30分鐘時(shí)，可能會(huì)由于腫瘤細(xì)胞與腺病毒結(jié)合不充分，而導(dǎo)致結(jié)合的病毒數(shù)量不夠，從而影響凈化效果。當(dāng)接觸時(shí)間長于8小時(shí)時(shí)，對(duì)于凈化效果的提高不但沒有幫助，反而由于造血干細(xì)胞在離體條件下存在的時(shí)間較長，可能導(dǎo)致造血干細(xì)胞的存活力下降。
在本發(fā)明的凈化方法中，對(duì)于將造血干細(xì)胞移植物和增殖性腺病毒的接觸方式?jīng)]有特別的限制，可以將造血干細(xì)胞移植物加入到腺病毒保存液中，也可反過來。優(yōu)選將腺病毒保存液加入到造血干細(xì)胞移植物中。
在本發(fā)明的凈化方法中，還包括在將造血干細(xì)胞移植物和增殖性腺病毒接觸之前，對(duì)從患者體內(nèi)采集的造血干細(xì)胞移植物進(jìn)行離心和洗滌的步驟。離心的目的在于除去血清和血小板，減少血清和血小板存在對(duì)病毒感染腫瘤細(xì)胞的影響，洗滌步驟在于將殘存的血清和血小板成分除去。在本發(fā)明方法中所用的離心、洗滌和去除血清和血小板的方法、儀器和試劑均是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。在和增殖性腺病毒接觸之前，優(yōu)選用細(xì)胞培養(yǎng)液將造血干細(xì)胞濃度調(diào)整為106-109個(gè)細(xì)胞/毫升，優(yōu)選107-108個(gè)細(xì)胞/毫升。
在本發(fā)明的凈化方法中，對(duì)于造血干細(xì)胞和腺病毒的混合體積沒有十分特別的限制。但是，從提高混勻的效率和腺病毒與腫瘤細(xì)胞結(jié)合的效率這一角度考慮，優(yōu)選進(jìn)行較小體積的混合，例如在MOI為100-1000時(shí)，使混合后的總體積為0.1-100毫升，優(yōu)選的是混合后的總體積為0.5-10毫升。當(dāng)混合后的總體積太小例如小于0.1毫升或太大例如超過100毫升時(shí)，都可能影響腺病毒和腫瘤細(xì)胞的結(jié)合效率。
本發(fā)明的另一目的在于提供一種用于自體造血干細(xì)胞體外凈化的試劑盒。本發(fā)明的用于造血干細(xì)胞體外凈化的試劑盒，包含含有增殖性溶瘤病毒的試劑和描述增殖性溶瘤病毒使用方法的說明書。所述的增殖性溶瘤病毒包括能選擇性在腫瘤細(xì)胞中增殖復(fù)制的單純皰疹病毒、腺病毒、新城疫病毒、水泡性口炎病毒和呼腸孤病毒。優(yōu)選的增殖性溶瘤病毒是增殖性腺病毒，特別是能被腫瘤細(xì)胞表面的腺病毒受體識(shí)別的缺失了E1B基因的腺病毒。這樣的增殖性腺病毒包括缺失了E1B基因的所有5型增殖腺病毒，例如CCTCC98003。
本發(fā)明的試劑盒優(yōu)選還進(jìn)一步包括用于洗滌造血干細(xì)胞移植物的試劑。所述的洗滌試劑一般為能保持造血干細(xì)胞活力的任何適當(dāng)?shù)募?xì)胞培養(yǎng)液如RPM1640或和細(xì)胞等滲的溶液如生理鹽水等。
本發(fā)明的試劑盒優(yōu)選還進(jìn)一步包括用于抗凝的試劑。該抗凝的試劑包括肝素、枸櫞酸鈉。
本發(fā)明的試劑盒還任選地包含混合容器如試管等和/或混合裝置如攪拌棒或震蕩器等。
本發(fā)明的另一目的在于提供一種用于治療腫瘤的方法，包括如下步驟1)從腫瘤患者獲取造血干細(xì)胞移植物；2)將步驟1)獲得的造血干細(xì)胞移植物和增殖性腺病毒接觸以除去移植物中的腫瘤細(xì)胞；3)將步驟2)獲得的造血干細(xì)胞移植物回輸給腫瘤患者本人。
在本發(fā)明的治療腫瘤患者的方法中，優(yōu)選在實(shí)施步驟1)之前對(duì)腫瘤患者進(jìn)行大劑量的放、化療，以殺死患者體內(nèi)大部分的腫瘤細(xì)胞。
在本發(fā)明的治療腫瘤患者的方法中，優(yōu)選在實(shí)施步驟2)之前對(duì)造血干細(xì)胞移植物進(jìn)行離心和洗滌以除去其中的血清和血小板。而且，在將凈化后的造血干細(xì)胞回輸給腫瘤患者之前，優(yōu)選對(duì)其進(jìn)行洗滌以除去未結(jié)合的腺病毒的步驟，所用的洗滌液可以是細(xì)胞培養(yǎng)液如RPM1640，也可以是生理鹽水等。
在上述步驟2)中，所述的腫瘤細(xì)胞包括血液系腫瘤細(xì)胞例如多發(fā)性骨髓瘤、急性白血病、慢性白血病、惡性淋巴瘤等，還包括非血液系腫瘤細(xì)胞例如惡性淋巴瘤、乳腺癌、睪丸癌、卵巢癌、小細(xì)胞肺癌、鼻咽癌、兒童纖維母細(xì)胞瘤、軟組織肉瘤等實(shí)體瘤細(xì)胞。所述的增殖性溶瘤病毒包括能選擇性在腫瘤細(xì)胞中增殖復(fù)制的單純皰疹病毒、腺病毒、新城疫病毒、水泡性口炎病毒和呼腸孤病毒。優(yōu)選的增殖性溶瘤病毒是增殖性腺病毒，特別是能被腫瘤細(xì)胞表面的腺病毒受體識(shí)別的缺失了E1B基因的腺病毒。這樣的增殖性腺病毒包括缺失了E1B基因的所有5型增殖腺病毒，例如CCTCC98003。
本發(fā)明人在體外實(shí)驗(yàn)中，通過四氮唑蘭(MTT)法、腫瘤集落形成法、粒單核細(xì)胞集落形成法(CFU-GM)，證實(shí)了增殖性腺病毒CCTCC98003若以腫瘤細(xì)胞為轉(zhuǎn)染目標(biāo)細(xì)胞，則至少在100-1000MOI范圍內(nèi)，可完全清除造血干細(xì)胞中混有的腫瘤細(xì)胞，而對(duì)造血干細(xì)胞的增殖能力沒有影響。
在非肥胖型糖尿病-嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷(NOD-SCID)鼠體內(nèi)，通過組織連續(xù)病理切片、上皮細(xì)胞角蛋白(CK 19)的RT-PCR檢測，完成了對(duì)增殖性腺病毒CCTCC98003對(duì)腫瘤細(xì)胞凈化清除的評(píng)價(jià)；還通過對(duì)小鼠外周血和骨髓中人源性血細(xì)胞和造血干細(xì)胞的流式細(xì)胞檢測，完成了CCTCC98003是否影響造血干細(xì)胞造血重建能力的評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示CCTCC98003在一定劑量、混合培養(yǎng)體積、混合培養(yǎng)時(shí)間條件下，可完全清除造血干細(xì)胞中混有的腫瘤細(xì)胞，而對(duì)造血干細(xì)胞的重建造血能力沒有影響。
除非另有說明，本說明書中所用的術(shù)語和縮略語具有本領(lǐng)域中所用的一般常規(guī)含義。
附圖簡述

圖1顯示的是攜帶熒光蛋白基因的復(fù)制缺陷型腺病毒(Ad-GFP)100MOI對(duì)不同類型細(xì)胞的熒光顯微鏡觀察結(jié)果。每種細(xì)胞均進(jìn)行同視野可見光、熒光顯微鏡計(jì)數(shù)，求出熒光細(xì)胞比率即為腺病毒轉(zhuǎn)染率。具體見圖1中，圖AK、圖AY、圖BK、圖BY、圖CK、圖CY、圖DK、圖DY。結(jié)果可見在Ad-GFP 100MOI感染滴度，乳腺癌細(xì)胞MCF-7、MDA-MB-231、多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞SKO-007均可獲完全轉(zhuǎn)染，而外周血造血干細(xì)胞(PBSC)即使高達(dá)800MOI也未見轉(zhuǎn)染。
圖2顯示的是Ad-GFP 100MOI對(duì)不同類型細(xì)胞轉(zhuǎn)染的流式細(xì)胞檢測結(jié)果。流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，Ad-GFP在100MOI感染滴度時(shí)，對(duì)MCF-7、MDA-MB-231、SKO-007分別為93.1％、95.1％、86.9％，而PBSC的轉(zhuǎn)染率即使高達(dá)800MOI轉(zhuǎn)染率也僅為1.75％。
圖3顯示的是96小時(shí)MTT法檢測CCTCC98003對(duì)不同類型細(xì)胞的殺傷效應(yīng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)CCTCC9800396小時(shí)對(duì)MCF-7、MDA-MB-231、SKO-007三種細(xì)胞的半數(shù)抑瘤藥物劑量(IC50)分別為25、46.6、2.1MOI病毒感染滴度，而對(duì)照藥物Ad-GFP對(duì)上述三種細(xì)胞沒有明顯殺傷效應(yīng)。
圖4顯示的是14天集落形成法檢測CCTCC98003對(duì)不同類型細(xì)胞的殺傷效應(yīng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)CCTCC98003對(duì)MCF-7、MDA-MB-231、SKO-007三種細(xì)胞的半數(shù)抑瘤藥物劑量(IC50)分別為2.1、3.4、0.3MOI病毒感染滴度，其中100MOI病毒滴度均可獲得完全腫瘤生長抑制。而對(duì)照藥物Ad-GFP對(duì)上述三種細(xì)胞沒有明顯殺傷效應(yīng)圖5顯示的是CCTCC98003對(duì)造血干細(xì)胞CFU-GM形成影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)CCTCC98003在800MOI以下時(shí)，對(duì)造血干細(xì)胞CFU-GM形成無明顯影響，與Ad-GFP結(jié)果一致。
圖6顯示的是CCTCC98003劑量依賴性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。在混合培養(yǎng)體積為1ml、混合培養(yǎng)時(shí)間2小時(shí)條件下，可見CCTCC98003在≥50MOI滴度，已經(jīng)可以完全抑制MCF-7細(xì)胞生長。
圖7顯示的CCTCC98003體積依賴性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。在CCTCC98003感染滴度為100MOI、混合培養(yǎng)2小時(shí)情況下，0.5～10.0ml范圍均可完全抑制MCF-7細(xì)胞生長。對(duì)照為不加CCTCC98003，混合培養(yǎng)體積為0.5ml。
圖8顯示的是CCTCC98003時(shí)間依賴性實(shí)驗(yàn)。在CCTCC98003感染滴度為100MOI、混合培養(yǎng)體積為0.5ml情況下，0.5～8小時(shí)范圍混合培養(yǎng)時(shí)間均可完全抑制MCF-7細(xì)胞生長。對(duì)照為不加CCTCC98003，混合培養(yǎng)時(shí)間為2小時(shí)。
圖9顯示的是CCTCC98003模擬凈化體外實(shí)驗(yàn)。把105MCF-7細(xì)胞與107PBSC細(xì)胞混合，CCTCC98003以10、100、250、500MOI進(jìn)行凈化，可見CCTCC98003對(duì)腫瘤細(xì)胞在≥100MOI感染滴度時(shí)，可完全抑制腫瘤細(xì)胞生長。對(duì)照藥物Ad-GFP對(duì)MCF-7無凈化效果。
圖10顯示的是CCTCC98003模擬凈化造血重建評(píng)價(jià)。通過造血干細(xì)胞的CFU-GM形成實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，CCTCC98003凈化MCF-7細(xì)胞的同時(shí)，對(duì)造血干細(xì)胞的CFU-GM形成能力沒有影響。與對(duì)照藥物Ad-GFP結(jié)果一致。
圖11是顯示NOD-SCID鼠連續(xù)病理切片評(píng)價(jià)CCTCC98003(H101)體外凈化效果的照片。連續(xù)病理切片可見，RPM1640培養(yǎng)液空白對(duì)照組、Ad-GFP對(duì)照組小鼠肺內(nèi)多發(fā)乳腺癌瘤結(jié)節(jié)，而H101凈化組未見肺內(nèi)瘤結(jié)節(jié)。
圖12顯示的是NOD-SCID鼠肺組織CK19RT-PCR檢測電泳結(jié)果的照片?？梢娫贑CTCC98003凈化組380bp處未見CK 19的條帶，CK19為人源上皮腫瘤細(xì)胞的特異性基因標(biāo)記，而RPM1640培養(yǎng)液空白對(duì)照組、Ad-GFP對(duì)照組均可見CK 19擴(kuò)增條帶，Tubulin為內(nèi)參對(duì)照。
圖13顯示的是CCTCC98003凈化對(duì)人源性造血干細(xì)胞在NOD-SCID鼠體內(nèi)重建造血的影響。圖13A為NOD-SCID鼠外周血人源性血細(xì)胞流式檢測結(jié)果，圖13B為NOD-SCID鼠骨髓人源性血細(xì)胞流式檢測結(jié)果，其中CD45+細(xì)胞為人源性白細(xì)胞標(biāo)記，CD45+CD34+細(xì)胞為人源性造血干細(xì)胞標(biāo)記，CD45+CD19+細(xì)胞為人源性B淋巴細(xì)胞標(biāo)記。結(jié)果顯示CCTCC98003對(duì)于人類造血干細(xì)胞在NOD-SCID鼠體內(nèi)造血重建沒有顯著影響。
為了更加清楚地描述本發(fā)明的內(nèi)容，以下以實(shí)施例的方式對(duì)本發(fā)明作示例性的說明。這些實(shí)施例不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的任何限制。
實(shí)施例I Ad-GFP對(duì)造血干細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞、多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率測定記數(shù)造血干細(xì)胞PBSC、乳腺癌細(xì)胞MCF-7以及MDA-MB-231、多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞SKO-007細(xì)胞，以105個(gè)/皿接種于35mm皿中，每皿加入500μl無血清1640培養(yǎng)液(購自美國GIBCO公司)。以0、25MOI、50MOI、100MOI、200MOI、400MOI、800MOI滴度，加Ad-GFP于上述細(xì)胞培養(yǎng)皿中，37℃混勻晃動(dòng)2小時(shí)，加入含20％胎牛血清的1640培養(yǎng)液500μl，置入37℃CO2孵箱，48小時(shí)后在熒光顯微鏡下記數(shù)Ad-GFP感染率，并經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測。結(jié)果可見，在熒光顯微鏡下，Ad-GFP 100MOI滴度，MCF-7、MDA-MB-231、SKO-007可獲得100％轉(zhuǎn)染，而對(duì)于PBSC，即使Ad-GFP感染滴度高達(dá)800MOI，也未見細(xì)胞轉(zhuǎn)染。結(jié)果見圖1所示。同時(shí)流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)MCF-7、MDA-MB-231、SKO-007的感染率分別為93.1％、95.1％、86.9％，而對(duì)于PBSC，即使Ad-GFP感染滴度高達(dá)800MOI，轉(zhuǎn)染率僅有1.75％。結(jié)果見圖2所示。
實(shí)施例II CCTCC98003對(duì)乳腺癌細(xì)胞、多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞殺傷效應(yīng)評(píng)價(jià)以每孔8×103細(xì)胞，接種MCF-7、MDA-MB-231、SKO-007細(xì)胞于96孔板中。每孔加入100μl無血清1640培養(yǎng)液，分別以0、25MOI、50MOI、100MOI、200MOI滴度轉(zhuǎn)染Ad-GFP、CCTCC98003，Ad-GFP作為對(duì)照。37℃培養(yǎng)箱晃動(dòng)混勻培養(yǎng)2小時(shí)，加入含20％胎牛血清的1640培養(yǎng)液100μl，置入37℃CO2孵箱培養(yǎng)，96小時(shí)后進(jìn)行MTT法檢測。MTT檢測按照常規(guī)方法，最后計(jì)算不同感染滴度細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率公式見下。繪制劑量-細(xì)胞存活率曲線，用最小二乘法進(jìn)行曲線擬合，根據(jù)所得的公式求得抑制50％細(xì)胞存活的IC50。細(xì)胞存活率(％)＝(加藥細(xì)胞OD值-空白細(xì)胞OD值)/(對(duì)照細(xì)胞OD值-空白細(xì)胞OD值)×100％混合培養(yǎng)96小時(shí)后，CCTCC98003對(duì)MCF-7、MDA-MB-231、SKO-007的IC50分別為25、46.6、2.1MOI，對(duì)照Ad-GFP對(duì)MCF-7、MDA-MB-231、SKO-007的生長影響不明顯。結(jié)果見圖3；腫瘤集落形成法體外培養(yǎng)14天結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CCTCC98003對(duì)MCF-7、MDA-MB-231、SKO-007的IC50分別為2.1、3.4、0.3MOI，對(duì)照Ad-GFP對(duì)MCF-7、MDA-MB-231生長影響不明顯。結(jié)果見圖4。
實(shí)施例III CCTCC98003對(duì)造血干細(xì)胞CFU-GM形成能力的影響新鮮分離的PBSC細(xì)胞，以每孔2000個(gè)CD34+細(xì)胞接種于24孔板，加入200d1640，分別接受0、100MOI、200MOI、400MOI、600MOI、800MOI、1500MOI轉(zhuǎn)染CCTCC98003、Ad-GFP。37℃混勻晃動(dòng)培養(yǎng)2小時(shí)，加入半固體CFU-GM培養(yǎng)液(購自美國STEM CELL公司)400μl，混勻后放入37℃CO2孵箱培養(yǎng)，14天后，當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見集落時(shí)，終止培養(yǎng)，顯微鏡下記數(shù)CFU-GM集落數(shù)。按下面公式計(jì)算集落形成率。集落形成率＝集落數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100％結(jié)果顯示在CCTCC98003小于800MOI時(shí)，對(duì)造血干細(xì)胞CFU-GM形成能力沒有顯著影響。結(jié)果見圖5。
實(shí)施例IV CCTCC98003對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞體外凈化參數(shù)的確定(1)劑量依賴性研究。取對(duì)數(shù)生長期的MCF-7細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化記數(shù)，于60mm皿中接種1000個(gè)細(xì)胞。37℃CO2孵箱培養(yǎng)，24小時(shí)后，吸盡含血清1640培養(yǎng)液，PBS緩沖液洗兩遍，每皿加入200μl無血清1640培養(yǎng)液，分別以0、0.001MOI、0.01MOI、0.1MOI、1MOI、10MOI、50MOI、100MOI、200MOI滴度轉(zhuǎn)染H101。37℃培養(yǎng)箱晃動(dòng)混勻培養(yǎng)2小時(shí)，吸去培養(yǎng)液，加入含10％胎牛血清的1640培養(yǎng)液4ml，置入37℃CO2孵箱培養(yǎng)，7～14天后，當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見集落時(shí)，終止培養(yǎng)，棄去培養(yǎng)液，用PBS緩沖液洗兩次，進(jìn)行0.2％結(jié)晶紫染色15分鐘，清水緩慢沖洗染色液，室溫干燥，顯微鏡下記數(shù)大于50個(gè)細(xì)胞的集落數(shù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)CCTCC98003為10MOI時(shí)，對(duì)MCF-7細(xì)胞生長有顯著抑制，當(dāng)劑量為≥50MOI時(shí)，可完全抑制MCF-7細(xì)胞的生長。結(jié)果見圖6。
(2)體積依賴性研究。應(yīng)用腫瘤集落形成法進(jìn)行評(píng)價(jià)。CCTCC98003以100MOI為病毒感染滴度，2小時(shí)為病毒混合培養(yǎng)時(shí)間，在不同病毒-細(xì)胞混合培養(yǎng)體積條件下，觀察腫瘤集落形成差異。混合培養(yǎng)體積選擇500、1000、2000、5000、10000μl 5個(gè)不同體積單位。CCTCC98003對(duì)MCF-7細(xì)胞的體積依賴性研究發(fā)現(xiàn)，在100MOI病毒感染滴度、2小時(shí)混合培養(yǎng)時(shí)間情況下，混合培養(yǎng)體積在500-10000μl范圍，可完全清除腫瘤細(xì)胞。結(jié)果見圖7。
(3)時(shí)間依賴性研究。應(yīng)用腫瘤集落形成法進(jìn)行評(píng)價(jià)。CCTCC98003以100MOI為病毒感染滴度，500μl為病毒混合轉(zhuǎn)染體積，在不同病毒-細(xì)胞混合培養(yǎng)時(shí)間條件下，觀察腫瘤集落形成的差異?；旌吓囵B(yǎng)時(shí)間選擇0.5、1、2、4、8小時(shí)，5個(gè)不同時(shí)間段。結(jié)果可見，在混合培養(yǎng)0.5小時(shí)CCTCC98003可顯著抑制MCF-7細(xì)胞生長，在混合培養(yǎng)時(shí)間≥1小時(shí)時(shí)，可完全清除造血干細(xì)胞中混有的腫瘤細(xì)胞。結(jié)果見圖8。
實(shí)施例V CCTCC98003體外模擬凈化乳腺癌MCF-7細(xì)胞與造血干細(xì)胞混合物把MCF-7細(xì)胞與PBSC細(xì)胞以1/100比例混合(1×104個(gè)MCF-7混入1×106個(gè)PBSC細(xì)胞)，以MCF-7細(xì)胞為轉(zhuǎn)染目標(biāo)細(xì)胞，分別給予0、10MOI、100MOI、250MOI、500MOI滴度，轉(zhuǎn)染混合培養(yǎng)細(xì)胞。病毒-細(xì)胞混合培養(yǎng)體積為500μl，混合培養(yǎng)時(shí)間為2小時(shí)。最后同時(shí)把凈化處理后的混合細(xì)胞，分別進(jìn)行腫瘤集落形成評(píng)價(jià)和造血干細(xì)胞CFU-GM形成評(píng)價(jià)。腫瘤細(xì)胞集落評(píng)價(jià)在7～14天，CFU-GM評(píng)價(jià)在14～21天。結(jié)果可見，當(dāng)MCF-7以1/100比例與PBSC混合時(shí)，CCTCC98003在感染滴度≥100MOI、混合培養(yǎng)體積0.5ml、混合培養(yǎng)時(shí)間為2小時(shí)，可獲得完全的瘤細(xì)胞凈化。結(jié)果見圖9。并且在上述條件下CCTCC98003對(duì)造血干細(xì)胞的CFU-GM形成能力沒有影響。結(jié)果見圖10。
實(shí)施例VI CCTCC98003體外凈化乳腺癌MCF-7細(xì)胞的NOD-SCID鼠體內(nèi)評(píng)價(jià)選擇6～8周齡、體重20-30克的NOD-SCID鼠共24只，隨機(jī)分成三組，每組8只，分別為1640培養(yǎng)液空白對(duì)照組、Ad-GFP對(duì)照組、CCTCC98003凈化組。把經(jīng)造血干細(xì)胞刺激因子動(dòng)員后，從健康自愿者體內(nèi)采集的PBSC，與MCF-7細(xì)胞混合。混合情況為2×105個(gè)MCF-7細(xì)胞、2×106PBSC細(xì)胞，混合總體積為500μl。然后按體外實(shí)驗(yàn)的凈化結(jié)果，應(yīng)用CCTCC98003對(duì)上述混合物進(jìn)行凈化處理。CCTCC98003凈化條件為感染滴度100MOI、混合體積500μl、培養(yǎng)時(shí)間為2小時(shí)。凈化后的500μl混合物，從小鼠尾靜脈注入。輸注凈化后的混合細(xì)胞前，常規(guī)對(duì)NOD-SCID鼠進(jìn)行Co60全身照射，劑量為220cGY，以進(jìn)一步抑制NOD-SCID鼠的免疫功能。45天處死小鼠，取靜脈血細(xì)胞、骨髓細(xì)胞，進(jìn)行人CD45+、CD45+CD34+、CD45+CD19+流式細(xì)胞檢測，從而評(píng)價(jià)人造血干細(xì)胞重建NOD-SCID鼠造血的能力。處死小鼠后取肺組織進(jìn)行連續(xù)病理組織切片檢測，同時(shí)再進(jìn)行CK19RT-PCR檢測，以評(píng)價(jià)CCTCC98003對(duì)乳腺癌細(xì)胞的凈化效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在1640培養(yǎng)液空白對(duì)照組、Ad-GFP對(duì)照組中，NOD-SCID鼠的肺組織連續(xù)病理切片顯示肺內(nèi)多發(fā)乳腺癌瘤結(jié)節(jié)，而CCTCC98003凈化組未見肺內(nèi)瘤結(jié)節(jié)，結(jié)果見圖11。NOD-SCID鼠肺組織CK19RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)1640培養(yǎng)液空白對(duì)照組、Ad-GFP對(duì)照組均可見380bp大小的CK19擴(kuò)增條帶，而CCTCC98003凈化組未見同樣大小的擴(kuò)增條帶，顯示了CCTCC98003顯著的凈化效果。結(jié)果見圖12。
通過對(duì)NOD-SCID鼠靜脈血、骨髓中人類CD45+細(xì)胞、CD45+CD34+、CD45+CD19+細(xì)胞檢測發(fā)現(xiàn)，1640培養(yǎng)液空白對(duì)照組、Ad-GFP對(duì)照組、CCTCC98003凈化組三組間，人類CD45+細(xì)胞、CD45+CD34+、CD45+CD19+細(xì)胞水平無顯著差異，CCTCC98003對(duì)人類造血干細(xì)胞在NOD-SCID鼠體內(nèi)重建造血沒有明顯影響。結(jié)果見圖13A、13B。
權(quán)利要求
1.一種自體造血干細(xì)胞體外凈化的方法，包括將含有腫瘤細(xì)胞的造血干細(xì)胞與增殖性腺病毒接觸并使所述的增殖性腺病毒進(jìn)入腫瘤細(xì)胞的步驟。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的增殖性腺病毒是缺失了ElB基因的5型增殖腺病毒。
3.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的腫瘤細(xì)胞選自惡性淋巴瘤細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞、睪丸癌細(xì)胞、卵巢癌細(xì)胞、小細(xì)胞肺癌細(xì)胞、鼻咽癌細(xì)胞、兒童纖維母細(xì)胞瘤細(xì)胞、軟組織肉瘤細(xì)胞、多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞、急性白血病和慢性白血病瘤細(xì)胞。
4.權(quán)利要求1所述的方法，其中將增殖性腺病毒與造血干細(xì)胞移植物中混有的腫瘤細(xì)胞按照腺病毒/腫瘤細(xì)胞為10～10000的感染復(fù)數(shù)進(jìn)行混合。
5.權(quán)利要求3所述的方法，其中感染復(fù)數(shù)為10～5000。
6.權(quán)利要求4所述的方法，其中感染復(fù)數(shù)為50～1000。
7.權(quán)利要求1所述的方法，其中將造血干細(xì)胞移植物與增殖性腺病毒接觸30分鐘至8小時(shí)的時(shí)間。
8.權(quán)利要求7所述的方法，其中將造血干細(xì)胞移植物與增殖性腺病毒接觸1-4小時(shí)。
9.權(quán)利要求8所述的方法，將造血干細(xì)胞移植物與增殖性腺病毒接觸2-4小時(shí)。
10.權(quán)利要求1所述的方法，其中還包括在將造血干細(xì)胞移植物和增殖性腺病毒接觸之前，對(duì)從患者體內(nèi)采集的造血干細(xì)胞移植物進(jìn)行離心和洗滌的步驟。
11.權(quán)利要求10所述的方法，其中還包括在洗滌步驟之后，用生理鹽水或細(xì)胞培養(yǎng)液將造血干細(xì)胞的濃度調(diào)整為106-109個(gè)細(xì)胞/毫升的步驟。
12.權(quán)利要求11所述的方法，其中造血干細(xì)胞的濃度為107-108個(gè)細(xì)胞/毫升。
13.一種用于自體造血干細(xì)胞體外凈化的試劑盒，其特征在于包含含有增殖性腺病毒的試劑，描述增殖性腺病毒使用方法的說明書，以及任選的混合容器和混合裝置。
14.權(quán)利要求13所述的試劑盒，其中所述的腺病毒是缺失了ElB基因的5型增殖腺病毒。
15.權(quán)利要求14所述的試劑盒，還進(jìn)一步包括用于洗滌造血干細(xì)胞的試劑。
16.權(quán)利要求15所述的試劑盒，其中所述的洗滌試劑為細(xì)胞培養(yǎng)液。
17.權(quán)利要求16所述的試劑盒，其中還進(jìn)一步包括用于抗凝的試劑。
18.權(quán)利要求17所述的試劑盒，其中所述的抗凝試劑為肝素或枸櫞酸鹽。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種自體造血干細(xì)胞體外凈化的方法，其特征在于包括將含有腫瘤細(xì)胞的造血干細(xì)胞與增殖性腺病毒接觸并使所述的增殖性腺病毒進(jìn)入腫瘤細(xì)胞的步驟。本發(fā)明還提供了用于該自體造血干細(xì)胞體外凈化的方法的試劑盒。
文檔編號(hào)C12N5/10GK1712522SQ20041004974
公開日2005年12月28日 申請(qǐng)日期2004年6月25日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月25日
發(fā)明者吳世凱, 林晨, 宋三泰 申請(qǐng)人:上海三維生物技術(shù)有限公司