專利名稱：用于檢測b族鏈球菌特有序列的引物、短柄圓環(huán)探針、試劑盒及方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種用于檢測細菌的裝置和方法，尤其涉及一種用于檢測B族鏈球菌特有序列的引物、短柄圓環(huán)探針、以及試劑盒及方法。
背景技術：
B族鏈球菌(GBS)學名為無乳鏈球菌(S.agalactiae)，是一種有莢膜的細菌，能夠引起牛乳房炎，危害畜牧業(yè)非常嚴重，所以早為畜醫(yī)界注目。后來發(fā)現(xiàn)該細菌能夠感染人類，尤其是新生兒。該細菌所引起的敗血病、腦膜炎、肺炎等疾病的死亡率極高，并且通常伴有神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥，由此又被醫(yī)學界所重視。鑒于該細菌引起的感染不只限于乳房炎，其細菌壁中多糖物質(zhì)又屬于抗原構造分類中的B族，故目前一般采用B族鏈球菌來代替學名無乳鏈球菌。
B族鏈球菌通常寄居于陰道和直腸，帶菌率可高達30％左右。在健康人的鼻咽部也可分離到B族鏈球菌。新生兒感染與母體帶菌有著密切關系，當分娩時胎兒經(jīng)過帶菌產(chǎn)道時可能受感染，也可能由醫(yī)護人員呼吸道所攜帶病菌而引起感染。
B族鏈球菌感染也稱作乙型鏈球菌感染，是新生兒敗血癥和腦膜炎、以及母親感染的重要原因。健康婦女中15-35％帶有生殖道和消化道B族鏈球菌菌落。一般健康良好的并不致病，但孕婦可感染，表現(xiàn)為菌血癥、泌尿系感染、胎膜感染、宮內(nèi)膜感染、以及創(chuàng)傷感染。大約25％妊娠婦女可檢測出B族鏈球菌，其中約有一半會帶給新生兒，有1-2％新生兒會發(fā)病。在美國統(tǒng)計發(fā)病率是1-4‰，澳大利亞、英國、和芬蘭也有相似的數(shù)據(jù)報道。這種母嬰傳播發(fā)生在臨產(chǎn)，由于新生兒暴露于有B族鏈球菌產(chǎn)道，可吞進和吸入細菌，也可能宮內(nèi)感染，其結果不僅可發(fā)病和致死，也可遺留長期病理狀態(tài)如耳聾、視力受損、發(fā)育障礙、以及腦癱瘓等后遺癥。
新生兒B族鏈球菌感染表現(xiàn)為菌血癥、腦膜炎、和皮膚感染，新生兒B族鏈球菌感染有兩種類型①早期發(fā)病的爆發(fā)性敗血癥常見于1周內(nèi)的嬰兒，并且第一周內(nèi)發(fā)病者的80％發(fā)生在第一天。具有敗血癥的一般表現(xiàn)，伴有呼吸窘迫，約1/3患兒有腦膜炎，也稱新生兒呼吸窘迫癥或新生兒休克綜合癥。病情兇險，1-2天死亡，死亡率高達50％-70％。此類感染主要來自帶菌的產(chǎn)婦，B族鏈球菌血清型可以分為I、II、或III型。②晚期發(fā)病的化膿性腦膜炎發(fā)病的年齡在1周-3月之間，平均為4周，呼吸道癥狀不多見，多伴隨有敗血癥。病死率約15％，存活者可有癡呆、腦積水等后遺癥。此類感染一般是醫(yī)院內(nèi)感染，B族鏈球菌血清型主要是III型。
1990年以來，美國由于分娩前采取預防性篩查，使早發(fā)的B族鏈球菌感染降低了70％。根據(jù)分娩前得到篩查結果，患者可在住院后立即得到靜脈注射抗生素治療。目前，通常采用標準細菌培養(yǎng)方法來檢測B族鏈球菌的存在，該方法從陰道和肛門取材，由于需要進行細菌培養(yǎng)，需要在35-37周孕期取材，大約需要18-48小時得到檢測結果。如果檢測結果為陽性，需要給孕婦使用抗生素以預防她將細菌傳染給嬰兒。
B族鏈球菌感染是導致新生兒疾病和死亡的主要病因，通常采用標準的細菌培養(yǎng)的檢測方法進行檢測，要得到結果需要18-48小時。因而采用這種方法比較費時，不能夠有效、快速地檢測出B族鏈球菌的存在。

發(fā)明內(nèi)容
因此，針對現(xiàn)有技術存在的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種用于檢測B族鏈球菌特有序列的引物、短柄圓環(huán)探針、以及試劑盒及方法，以供實驗室、臨床研究使用，并能夠應用于普查和預防工作，尋找可能的動物來源及從動物到人的轉(zhuǎn)移與進化。
為了實現(xiàn)上述目的，針對B族鏈球菌的特點，首先選擇相應的靶序列，然后針對所選擇的特定靶序列設計特異性的引物，特異性地擴增出目的DNA片段。因此，根據(jù)待測基因兩端的DNA順序的引物設定也是本發(fā)明的要點。
本發(fā)明提供了一種為進行PCR擴增B族鏈球菌選定的靶序列而設計的引物，其中該引物序列為5’CGG TTA ATG AGG CTA TTACTA 3’和5’CAA TCA CAT CTG TTA AGG C 3’，且該靶序列選定在537-656之間。
本發(fā)明還提供了一種為了檢測該特定靶序列而設計的探針。首先選定用于識別和檢測B族鏈球菌的靶序列，將該靶基因片段選定在573-597之間。將該短柄圓環(huán)探序列設計成5’CAG GGT TGGCAC GCA ATG AAG TCT 3’，其中短柄是由該序列兩端互補的六對堿基構成的寡核苷酸，該圓環(huán)序列與選定的靶基因片段互補。
此外，本發(fā)明還提供了一種用于確定在生物樣品中B族鏈球菌是否存在的方法，包括以下步驟a)采集生物樣品，并且進行預處理；b)制備DNA模板；c)將步驟b)得到的DNA模板進行PCR擴增處理，其中所用的一對引物序列為5’CGG TTA ATG AGG CTATTA CTA 3’和5’CAA TCA CAT CTG TTA AGG C 3’；以及d)將步驟c)得到的擴增靶序列進行檢測。
另外，本發(fā)明還提供了一種用于檢測B族鏈球菌的試劑盒，該試劑盒每人份包括0.5-1ml拭子洗脫液，含有Tris和EDTA緩沖液，pH值在6-8之間；裂解液管，內(nèi)裝0.05-0.1ml玻璃珠；核酸擴增和雜交反應管，內(nèi)裝0.02-0.04ml的核酸擴增混和液、一對序列為5’CGG TTA ATG AGG CTA TTA CTA 3’和5’CAA TCA CAT CTGTTA AGG C 3’的引物、dNTP、B族鏈球菌探針、以及內(nèi)參照引物和探針；0.05-0.1ml溶解液；以及0.02-0.05ml自備試劑。
本發(fā)明用于識別B族鏈球菌的基因檢測方法與現(xiàn)有培養(yǎng)技術相比，具有以下特點和優(yōu)點1.根據(jù)本發(fā)明的方法，可以方便、安全地采集生物樣本，適于批量處理，樣品檢測最快可以在2-3小時內(nèi)完成，具有檢測速度快、檢測成本低的特點；2.根據(jù)本發(fā)明用于檢測B族鏈球菌的試劑盒，具有靈敏性和特異性高、以及穩(wěn)定性好的優(yōu)點，有著廣闊的市場應用前景；以及3.根據(jù)本發(fā)明用于檢測B族鏈球菌的方法及試劑盒，可以供實驗室和臨床研究使用，并應用于普查和預防工作。


圖1是根據(jù)本發(fā)明的B族鏈球菌檢測的設計流程圖；圖2是短柄圓環(huán)探針進行靶序列檢測的作用原理圖；以及圖3示意性說明了本發(fā)明的短柄圓環(huán)探針構象。
具體實施例方式
如圖1所示，本發(fā)明用于檢測生物樣本中B族鏈球菌的方法包括以下步驟1.本發(fā)明根據(jù)國際上報道的B族鏈球菌序列來選擇靶點；2.針對選定靶點設計引物和探針序列；3.提取患者的DNA樣本；以及4.進行核酸擴增和雜交檢測DNA樣本中是否存在B族鏈球菌。
通過以下對上述各個步驟的詳細描述，本領域技術人員可以進一步了解本發(fā)明的目的和優(yōu)點。
步驟1選擇靶點以下為國際上報道的B族鏈球菌序列，結合于此作為參考，該序列是本發(fā)明選擇靶點的依據(jù)。
CTTTCAACTCAAGAAATTGGCATGCTCTAATAGATCTTCCCCCTCGTTGACAAACAAGATAATATTCCTTATTTTTATCTAACTGTTCAAACTTATGACTGAGTTGACTCAAAGGAAGATTTATCGCACCTGAAATATGCCCCCCACGATACTCATGCTCTTCACGAACGTCTATCAAATGGATATTATGCTGGGCAATCAATGTTTCTAATGCTACAACAGTTATCTTTTTAGTCATAATCTTTATTTCCTTTGATACTTGGCAAATTTAGTCAAATGACTAATCACTTTATTATTTAAAATGGTGACATCGTTCTACTATTATGACTATTATCGTAAACCTTTTAATCATAAAAACCATGGTAGTACAAAATCACGAAGTCGACAGCATCACACGAAAAATACAAATATTATTTTAATGCTGTTTGAAGTGCTGCTTGTAATGTTACAATCTCTTGATCAACTTGTTGTACCGTAACATTTGGATTCAACTGAACTCCAACAGCATGTGTGATTGCTTTATTTAAAGTATTGTAAACTTTAAATTCTTTGACGTTAAGTACTTTTTTATCTCTAGTAAAGCGTGTATTCCAGATTTCCTTATCAAGTTTTGATTTTGTATAGATTGTAGCTCTATCAGTTGGTTTTAAATCAGGATAAGTTAAAACCTTTTGTTCTAATGCCTTTACATCGTTAACTTGAGCTTTAATTGAATCAACTGAAGCAAATGGATCTAAAATGCGAATAACCAGCTTAGTTATCCCAAATCCCATATCAATATTTGCTTGACTAACCTTATTTGCTAAATGTTGAGTTGAAAAAGTGATTGCTTCAATCACATCTGTTAAGGCTTCTACACGACTACCAATAGAATTCAAATCATAAACTGTCTCAGGGTTGGCACGCAATGAAGTCTTTAATTTTTCAACACTAGTAATAGCCTCATTAACCGTTTTTTCATAATCTGTTCCCTGAACATTATCTTTGATATTTCTCAACTGAATGCTATCTTGATCAAGCTTTTGAGCCATTTGCTGGGCTTGATTATTACTGTTTACATGATTTACCACTTGTGGAGTTGTCACTTGATCAGCATGTACTTCTAATACAGCTGGTGAAAATAACAATGCACCAGCCACTAGAGTTCCAGATAGATACATCATATGTTTAACGTTCATAATGAATTTCCTCCTTTAAACTAAAATCACTTTTACTGCAGTATTTTTAATTTACAGGGCCCATGTTTGTATCTTACTACTTGTCCAAAAGGTCGTCAAGCGCTTTCTTTTCCCCTATATTTTACATTATTACAAATAAACTGCATTTTTTTCATAAAACTAATATTATCATTTTGCTATAATATACTTGCGCCTATCCTTTTGTTAATTTCTGATAATTTAATTTATATTTTCATGTAAAAAACCATAACGATAATTTACCACCTTATATAAATCTAAATATTTTAGAAAATTTCTACTTATCACTATTTTTATCAAATAGATTAGCCTAATGTTTTTCTTAAAAAATAAATTTAATAAGAAGCGTACTATTTTAGATAAAATCGTTCCATTATGCCCAAAAACCATACTAAAACTCATTATTTTTACTTTCTGTTTAGAAATTCATACTAGACCAAGTATTTTAGACACTTAAAAAGCCTTAAACATAATAAGTTCAAGACTTTTTATTACTTAGTATTTTAAACTGTGAGTTTGTTTGGCAGTTCCCTCCGATGATTTTTACCCCAATTTTTTGAACCAAAAGTTAACAATATCGTCAGCCATAGTATTGATATCTAGATTACATTTACTGGTAACTATGTTACCATGTGTATGGATAACTTATATCAAAAATATATTAATCTAAAAAAGTGAATAACCCT TATAAAATAAGTAAATCCTAAGTACAGCATTAACTTCAAGTAAACAATTTAACGGAGGTAGTATATGAAAATAGCAATAATCGGATATAGTGGGTCGGGTAAGTCCACTTTAGCAAGAAAATTGGGAAATTACTATAATTGCAATGTATTACATCTTGATAGTATTCACTTCGCCCCAAATTGGGAAGAGAGAAAATATGATGACATGATTGACG靶點選擇是本發(fā)明的引物設計的基礎，要求所選的靶點穩(wěn)定，沒有突變區(qū)，長度在120-180bp之間。由于臨床采樣中細菌數(shù)量少，需要針對選定的靶序列進行擴增(即擴增靶序列的拷貝數(shù)量)，從而提高檢測方法的靈敏度。
根據(jù)本發(fā)明所選擇的靶點與迄今收集到的國際報道已知序列比較，其穩(wěn)定、無突變、且適合應用于基因檢測。
步驟2針對選定靶點設計引物和探針序列一般而言，基因檢測要求靶分子數(shù)量足夠高，而多數(shù)臨床樣本中靶分子量遠低于此限，其采樣量不能很大。因此，單獨應用基因檢測技術存在靈敏度低的問題。
目前聚合酶鏈式反應(以下簡稱“PCR”)技術的建立使基因診斷進入了一個嶄新的階段，其是一種基因擴增技術，在現(xiàn)代分子生物學研究中是很有價值的工具，可應用于不同領域。PCR技術于1983年由美國Centus公司人類遺傳室的科學家Kary Mullis發(fā)明。以PCR技術為主的體外核酸擴增技術的發(fā)展，使低拷貝臨床樣本的檢測成為可能。PCR能使樣品中靶序列的拷貝數(shù)特異性地快速擴增，將檢測閾值降至1-10拷貝數(shù)，大大提高了雜交檢測的靈敏度。
然而，評價PCR擴增是否成功，關鍵在于針對靶序列的引物設計，并且靶序列的選擇更是PCR擴增成功的關鍵。本發(fā)明通過精確地計算和設計以及實驗和篩選，確定了理想的靶序列及引物，以獲得理想的靶序列擴增結果，從而為應用各種分子檢測技術進行靶序列檢測提供了基礎。
雜交方法是一種分子生物學的標準技術，用于檢測DNA或RNA分子的特定序列(靶序列)。雜交方法有很多種，最常見的可以采用DNA或RNA先轉(zhuǎn)移并固定到硝酸纖維素或尼龍膜上，與其互補的單鏈DNA或RNA探針可用放射性或非放射性標記。如圖2所示，在膜上雜交時，探針通過氫鍵與其互補的靶序列結合，洗去未結合的游離探針后，經(jīng)放射自顯影或顯色反應檢測特異結合的探針。
最近發(fā)展起來的短柄圓環(huán)探針技術，也稱分子信標技術，也是一種雜交檢測的方法，其具有快速靈敏的特點。在探針5’和3’端之間可形成一個具有20個堿基左右的圓環(huán)結構，當溶液中有模板序列時，探針的圓環(huán)序列與模板雜交，探針的發(fā)夾結構被破壞而線性展開；此時，熒光分子與淬滅分子分開并發(fā)出熒光，通過熒光的強度就可檢測靶序列?，F(xiàn)有技術已有將其應用于結核桿菌的耐藥基因檢測等。
對于應用核酸雜交檢測，核酸雜交是提高基因診斷特異性的關鍵。短柄圓環(huán)探針體系特別值得推薦，這是因為其具有高特異性結合的特點。當采用DNA結合染料(如SYBR Green)進行的熒光即時檢測系統(tǒng)時，需要知道SYBR Green與所有雙鏈DNA結合的情況才能夠進行檢測。然而，短柄圓環(huán)探針的特殊性就在于僅與互補靶基因片段結合，只報告互補的靶序列或擴增產(chǎn)物。短柄圓環(huán)探針系統(tǒng)與其它線形探針比較，還具有可檢測出單堿基對錯配的功能。短柄圓環(huán)探針遇到有錯配的單堿基對時，會很不穩(wěn)定且不牢固，在這點上與一般線形探針有所不同，可應用于發(fā)現(xiàn)位點突變。與線形溶解探針比較，標記在短柄圓環(huán)探針上的熒光素與淬滅劑相鄰，直接能量轉(zhuǎn)換易于淬滅。因此，淬滅劑和熒光素的選擇比較容易。
應用短柄圓環(huán)探針體系檢測B族鏈球菌，關鍵在于確定合適的靶序列，需要其具有特異性和穩(wěn)定性。進一步地，所選靶序列應當符合探針序列的設計要求，要考慮能夠保持圓環(huán)結構而不發(fā)生自身序列的雜交，以及特異性雜交產(chǎn)生的力能夠克服短柄序列之間的結合力等等，這些都是解決檢測問題的要點。
目前，通常采用PCR產(chǎn)物電泳的方法檢測PCR擴增是否成功，而采用這種方法會增加額外時間，增加實驗室設備和試劑的污染危險。在檢測操作中，必須將所有試管打開進行取樣。另外，同樣的引物-模板系統(tǒng)重復進行檢測，前一次實驗的擴增產(chǎn)物可作為隨后實驗導致污染的模板，從而產(chǎn)生假陽性。而應用短柄圓環(huán)探針可以減少電泳步驟，因而減少污染機會，反應和結果分析在密封的一個試管中進行，從而提高了檢測的準確性。
本發(fā)明采用了核酸擴增技術，而擴增能否成功的關鍵是針對選定靶點的引物設計，該引物的設計是本發(fā)明所解決關鍵技術。選擇每個引物的長度在18-25bp之間，同時設計引物要求避免其自身雜交，因而還要進一步考慮其TM值等設計參數(shù)。
本發(fā)明是根據(jù)世界上各研究機構公開發(fā)表的B族鏈球菌序列基礎上，分析確定B族鏈球菌的特異性、穩(wěn)定的序列。為利用PCR技術，經(jīng)過計算、設計、及篩選，提供了一對優(yōu)選的針對B族鏈球菌設計的特異性引物。
此外，本發(fā)明還設計了短柄圓環(huán)探針，能夠檢測實驗室及臨床的生物樣本，通過以下對實施例的詳細描述，本領域技術人員可以進一步了解本發(fā)明的目的和優(yōu)點。
本發(fā)明提供了一種為進行PCR擴增B族鏈球菌選定的靶序列而設計的引物，其中該引物序列為5’CGG TTA ATG AGG CTA TTACTA 3’和5’CAA TCA CAT CTG TTA AGG C 3’，且該靶序列選定在537-656之間。
本發(fā)明還提供了一種用于檢測B族鏈球菌的短柄圓環(huán)探針，將該短柄圓環(huán)探序列設計成5’CAG GGT TGG CAC GCA ATG AAGTCT 3’，其中短柄是由該序列兩端互補的六對堿基構成的寡核苷酸，圓環(huán)序列與選定的靶基因片段互補。短柄圓環(huán)探針的5’端標記熒光素，3’端標記DABCYL淬滅劑，可以應用熒光檢測技術檢測雜交，報告靶基因序列。
優(yōu)選地，將PCR技術與短柄圓環(huán)探針體系結合，用于檢測B族鏈球菌的存在。
步驟3提取DNA樣本提取DNA樣本，即制備DNA模板，包括以下步驟(1)將拭子樣本放置在TE液中，靜置5-20分鐘，震蕩15-40秒；(2)將40-80μl拭子上清液加入裂解液管，高速震蕩5-10分鐘；(3)瞬時離心2-5秒；(4)在95℃下孵育2-10分鐘，立即冰??；以及(5)瞬時離心2-5秒。
步驟4核酸擴增和雜交檢測DNA樣本根據(jù)本發(fā)明的用于確定在生物樣品中B族鏈球菌是否存在的方法，包括以下步驟a)采集生物樣品，并且進行預處理；b)制備DNA模板；c)將步驟b)得到的DNA模板進行PCR擴增處理，其中所用的一對引物序列為5’CGG TTA ATG AGG CTA TTA CTA3’和5’CAA TCA CAT CTG TTA AGG C 3’；以及d)將步驟c)得到的擴增靶序列進行檢測。
根據(jù)本發(fā)明的基因診斷方法，優(yōu)選地，對擴增的靶序列檢測采用短柄圓環(huán)探針熒光檢測，本領域技術人員也可以采用其它雜交技術來檢測該擴增靶序列。
此外，根據(jù)本發(fā)明的用于檢測B族鏈球菌的基因診斷試劑盒，該試劑盒每人份包括0.5-1ml拭子洗脫液，含有Tris和EDTA緩沖液，pH值在6-8之間；裂解液管，內(nèi)裝0.05-0.1ml玻璃珠；核酸擴增和雜交反應管，內(nèi)裝0.02-0.04ml的核酸擴增混和液、一對序列為5’CGG TTA ATG AGG CTA TTA CTA 3’和5’CAA TCA CATCTG TTA AGG C 3’的引物、dNTP、B族鏈球菌探針、以及內(nèi)參照探針；0.05-0.1ml溶解液，優(yōu)選地，該溶解液為經(jīng)處理的高純水、Tris-HCl、Triton X-100、或NaCl；以及0.02-0.05ml自備試劑，優(yōu)選地，該自備試劑為石蠟油。
根據(jù)本發(fā)明提供的試劑盒及基因診斷方法，通過包括對患者的病變部位的分泌物和組織、血樣、以及尿樣的檢查作為B族鏈球菌早期診斷參考依據(jù)，同時也可以實現(xiàn)更大范圍采樣檢測，以檢測和發(fā)現(xiàn)B族鏈球菌。目前，已從臨床送檢病變部位的分泌物和組織、以及血樣中，檢測出B族鏈球菌的特有基因序列。
下面結合實施例，對本發(fā)明進行進一步闡述，并且不會因此限制本發(fā)明的保護范圍。
實施例1用于PCR引物的制備根據(jù)本發(fā)明的一對引物序列為5’CGG TTA ATG AGG CTATTA CTA 3’和5’CAA TCA CAT CTG TTA AGG C 3’，該序列可以有效地避免自身雜交，退火溫度在50-60℃之間。儀器規(guī)格為ABI 391DNA合成儀，產(chǎn)地美國，該合成儀可從美國應用生物系中國公司購買，原料為ABI合成柱A、T、C、和G，ABI合成堿基A、T、C、和G。
短柄圓環(huán)探針的制備如圖3所示，根據(jù)本發(fā)明的短柄圓環(huán)探針序列為5’CAG GGTTGG CAC GCA ATG AAG TCT 3’，其中短柄是該序列兩端互補的六對堿基構成的寡核苷酸。采用ABI 391DNA合成儀，產(chǎn)地美國，該合成儀可從美國應用生物系中國公司購買，原料為ABI合成柱A、T、C、和G，ABI合成堿基A、T、C、和G，其中5’端標記FAM的熒光素，而3’端標記DABCYL淬滅劑。
短柄圓環(huán)探針熒光檢測B族鏈球菌短柄圓環(huán)探針體系與核酸擴增在同一試管中進行，無需開蓋，可以有效地避免污染，從而提高檢測準確率。
每人份(25μl)核酸擴增體系設計如下體系組成 終濃度緩沖液 1xMgCl22.0mMdNTP 0.08mMTaq，酶2.5單位短柄圓環(huán)探針 0.5mM引物 0.5mMDNA模板5μlH2O 補充至25μl
即時PCR程序設置95℃2分鐘1個循環(huán)94℃15秒55℃50秒 }40個循環(huán)72℃10秒實施例2根據(jù)本發(fā)明的用于確定在生物樣品中B族鏈球菌是否存在的方法，包括以下步驟1.樣本采集對于被檢測者陰道和直腸的樣本需用滌綸拭子，首先擦去被檢測者陰道內(nèi)過多的分泌物，將拭子小心地插入被檢測者的陰道，采取陰道低位1/3處粘膜分泌物樣本，再將拭子小心地插入被檢測者的肛門，在肛門括約肌以上約2-5厘米處輕輕旋轉(zhuǎn)取得樣本，按照醫(yī)院樣本輸送程序送至實驗室，注意防止運送中的過熱溫度(一般不超過30℃)；2.樣本檢測將步驟1采集到的樣本在室溫下保存，24小時內(nèi)檢測，原則上樣本在5-25℃可保存6天。如果不能在24小時內(nèi)處理，應該置于冰箱(4℃)保存，熒光PCR法檢測目的是找到特有序列，檢測結果應該在分娩前4小時報告，此檢測結果對于決定選用抗生素治療，進行分娩前預防，是及時而有必要的；3.制備DNA模板，包括以下步驟(1)將拭子樣本放置在1xTE液中，靜置10分鐘，震蕩25秒；(2)將拭子上清液60μl加入裂解液管，高速震蕩10分鐘；(3)瞬時離心5秒；(4)在95℃下孵育5分鐘，立即冰??；以及(5)瞬時離心4秒；
4.進行核酸擴增處理，包括以下步驟(1)取DNA模板液2μl；(2)加入混合反應液23μl；(3)循環(huán)時間與溫度設置95℃ 2分鐘1次循環(huán)；94℃15秒55℃50秒}40次循環(huán)；以及72℃10秒5.檢驗結果報告即時熒光法檢測目的是找到特有序列，檢測結果在分娩前4小時報告，此檢測結果對于決定選用抗生素治療，進行分娩前預防，是及時而有必要的。
實施例3B族鏈球菌檢測試劑盒及其使用方法每人份用于檢測B族鏈球菌的試劑盒包括0.8ml拭子洗脫液，包括1x Tris、EDTA緩沖液，pH值為7.2；裂解液管，內(nèi)裝0.08ml玻璃珠；核酸擴增和雜交反應管，內(nèi)裝0.025ml的0.001％核酸擴增混和液、0.002％一對特異引物、0.05％dNTP、0.001％B族鏈球菌探針、0.001％內(nèi)參照引物和探針，其中特異引物序列為5’CGG TTA ATGAGG CTA TTA CTA 3’和5’CAA TCA CAT CTG TTAAGG C 3’；0.07ml溶解液，為經(jīng)處理的高純水；0.03ml石蠟油；以及0.01ml陽性對照液，為B族鏈球菌特有序列。
采用根據(jù)本發(fā)明的試劑盒檢測B族鏈球菌的方法，包括以下步驟1)吸取1ml拭子洗脫液放置于1.5ml離心管中；2)將拭子放置于裝有洗脫液的離心管中，使拭子浸濕，然后稍微向上提起，剪斷高于離心管的拭子柄部分，蓋好蓋子，室溫靜置5分鐘，高速震蕩5分鐘，稍離心以便甩去離心管蓋子上的液體；3)從洗脫液中吸取50μl液體放置在裂解液管中，高速震蕩5-15分鐘，其中震蕩時間根據(jù)所用儀器的震蕩強度而定；4)在95℃孵育2分鐘，取出并立即置于冰浴中；5)向反應管中加入23μl溶解液，用吸頭輕吹打溶解并將試劑混合均勻；以及6)再向反應管中加入10μl的石蠟油，取1.5μl裂解液管中的模板加到反應管中石蠟油的液面下，在石蠟油液面下，用吸頭輕吹打4次，將試劑與模板混合均勻，按下列程序設置進行核酸擴增和雜交(即時核酸擴增)95℃2分鐘1個循環(huán)94℃15秒55℃50秒 }40個循環(huán)72℃10秒比較例美國FDA通過的IDI-Strep BTM檢測B族鏈球菌的方法，與本發(fā)明的方法不同之處在于引物、探針序列選擇、以及內(nèi)參照的制定，其中IDI-Strep BTM為加拿大人研制在美國首次上市的用于檢測B族鏈球菌的試劑盒，價格為每人份30美元。
分別采用根據(jù)本發(fā)明的B族鏈球菌方法(稱之為“乙鏈即時檢測法”)與現(xiàn)有技術的IDI-Strep BTM檢測方法進行對比試驗，將對比試驗的結果列于表1，而將臨床診斷檢測結果列于表2。
表1對比試驗結果




表2臨床診斷檢測結果

從表2數(shù)據(jù)可以得出靈敏性＝(PCR方法的陽性樣本數(shù)/培養(yǎng)方法的陽性樣本數(shù))×100％＝(38/39)×100％＝97.4％
特異性＝(PCR方法的陰性樣本數(shù)/培養(yǎng)方法的陰性樣本數(shù))×100％＝(72/73)×100％＝98.6％符合率＝[(PCR方法的陽性樣本數(shù)+PCR方法的陰性樣本數(shù))/總樣本數(shù)]×100％＝[(38+72)/112]×100％＝98.2％陽性預測值＝(PCR方法的陽性樣本數(shù)/耐藥培養(yǎng)的陽性樣本總數(shù))×100％＝[38/(38+1)]×100％＝97.4％陰性預測值＝(PCR方法的陰性樣本數(shù)/耐藥培養(yǎng)的陰性樣本總數(shù))×100％＝[72/(1+72)]×100％＝98.6％如果以培養(yǎng)結果為參考，其中一例GBS陰性樣本*雖與IDI結果不同(IDI為陽性)，但與培養(yǎng)結果相同(陰性)，一例GBS陽性樣本**，IDI結果為陰性，培養(yǎng)結果也是陰性。
其中陽性預測值表示某一檢測方法其陽性結果被證明為陽性的概率，陰性預測值表示某一檢測方法其陰性結果被證明為陰性的概率。
由此可以看出，與現(xiàn)有技術的IDI-StrepTM檢測方法相比，本發(fā)明的乙鏈即時檢測法在靈敏性、特異性、陽性預測值、和陰性預測值方面至少等同或優(yōu)于IDI-StrepTM檢測方法(如果以培養(yǎng)結果為參照標準)。IDI-StrepTM試劑盒價格是本發(fā)明試劑盒的5倍。
此外，本發(fā)明用于快速檢測B族鏈球菌的試劑盒可批量生產(chǎn)、操作簡單、簡便快捷、特異性好、靈敏性高、并且符合率高，具有良好的市場應用前景。
以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對于本領域的技術人員來說，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
權利要求
1.一種為進行PCR擴增B族鏈球菌選定的靶序列而設計的引物，所述引物為以下的一對序列5’CGG TTA ATG AGG CTA TTA CTA 3’；以及5’CAA TCA CAT CTG TTA AGG C 3’。
2.一種用于檢測B族鏈球菌的短柄圓環(huán)探針，所述短柄圓環(huán)探針序列為5’CAG GGT TGG CAC GCA ATG AAG TCT 3’，所述短柄是所述短柄圓環(huán)探針序列兩端互補的六對堿基構成的寡核苷酸。
3.根據(jù)權利要求2所述的短柄圓環(huán)探針，其特征在于，所述5’端標記FAM的熒光素，而3’端標記DABCYL淬滅劑。
4.一種用于檢測生物樣品中B族鏈球菌的方法，包括以下步驟a)采集所述生物樣品，并且進行預處理；b)制備DNA模板；c)將步驟b)得到的DNA模板進行PCR擴增處理，其中所用的一對引物序列為5’CGG TTA ATG AGG CTA TTACTA 3’和5’CAA TCA CAT CTG TTA AGG C 3’；以及d)將步驟c)得到的擴增靶序列進行檢測。
5.根據(jù)權利要求4所述的方法，其特征在于，步驟d)是采用短柄圓環(huán)探針熒光檢測。
6.根據(jù)權利要求5所述的方法，其特征在于，所述短柄圓環(huán)探針包括短柄部分和圓環(huán)部分，其中圓環(huán)序列與所述靶序列是完全互補的序列。
7.根據(jù)權利要求6所述的方法，其特征在于，所述圓環(huán)序列是5’CAG GGT TGG CAC GCA ATG AAG TCT 3’。
8.根據(jù)權利要求4所述的方法，其特征在于，所述生物樣品選自人類、動物、脫離人體、或動物體的組織、體液、和分泌物。
9.根據(jù)權利要求8所述的方法，其特征在于，所述生物樣品包括病變部位的分泌物和組織、血樣、以及尿樣。
10.一種用于檢測B族鏈球菌的試劑盒，包括0.5-1ml拭子洗脫液，包括Tris和EDTA緩沖液，pH值在6-8之間；裂解液管，內(nèi)裝0.05-0.1ml玻璃珠；核酸擴增和雜交反應管，內(nèi)裝0.02-0.04ml的核酸擴增混和液、一對序列為5’CGG TTA ATG AGG CTA TTA CTA 3’和5’CAA TCA CAT CTG TTA AGG C 3’的引物、dNTP、B族鏈球菌探針、以及內(nèi)參照引物和探針；0.05-0.1ml溶解液；以及0.02-0.05ml自備試劑。
11.根據(jù)權利要求10所述的試劑盒，其特征在于，所述B族鏈球菌探針是序列為5’CAG GGT TGG CAC GCA ATG AAGTCT 3’的短柄圓環(huán)探針。
12.根據(jù)權利要求10所述的試劑盒，其特征在于，進一步包括陽性對照液。
13.根據(jù)權利要求10所述的試劑盒，其特征在于，所述溶解液為經(jīng)處理的高純水、Tris-HCl、Triton X-100、或NaCl。
14.根據(jù)權利要求10所述的試劑盒，其特征在于，所述自備試劑為石蠟油。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于檢測細菌的方法，尤其涉及一種為檢測B族鏈球菌特有序列而設計的引物、短柄圓環(huán)探針、試劑盒及方法。本發(fā)明的目的在于提供一種有效、快速檢測B族鏈球菌的方法，以供實驗室、臨床研究使用，并能夠應用于普查和預防工作，尋找B族鏈球菌可能的動物來源及從動物到人的轉(zhuǎn)移與進化。本發(fā)明用于檢測B族鏈球菌的基因診斷試劑盒具有使用簡便、快捷、靈敏性和特異性高、以及穩(wěn)定性好的優(yōu)點，有著廣闊的市場應用前景。
文檔編號C12Q1/68GK1712546SQ20041004973
公開日2005年12月28日 申請日期2004年6月25日 優(yōu)先權日2004年6月25日
發(fā)明者吳秉銓, 高建平 申請人:吳秉銓