專利名稱：：一種用于去除轉(zhuǎn)基因植物中選擇標記基因的方法
技術領域：
：本發(fā)明屬于植物基因工程領域，是一種用瞬時表達位點特異性重組酶的植物病毒表達載體去除轉(zhuǎn)基因植物中選擇標記基因的方法。具體的講，涉及可在植物細胞中表達Cre重組酶的一種病毒表達載體p35S-m30Bcre，通過農(nóng)桿菌侵染法在植物細胞中瞬時、高效表達Cre重組酶，以消除轉(zhuǎn)基因植物中的選擇標記基因的一種新方法。
背景技術：
：隨著植物基因工程技術的發(fā)展，許多種類的植物可以被遺傳轉(zhuǎn)化以改良其性狀或作為生物反應器生產(chǎn)有用的蛋白，如重要的醫(yī)用蛋白。在植物的轉(zhuǎn)化操作中，通常只有很少數(shù)的植物細胞被轉(zhuǎn)化。為了將轉(zhuǎn)化和未轉(zhuǎn)化的細胞快速簡便的區(qū)分開，選擇標記基因成為轉(zhuǎn)化載體的必要組成成分。目前使用較多的選擇標記基因有抗生素抗性基因和除草劑抗性基因，如卡那霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、除草劑basta抗性基因等。然而，一旦獲得遺傳穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因植物，選擇標記基因便失去了在轉(zhuǎn)化體中繼續(xù)存在的必要性，并且下面這些不利因素決定了有必要從轉(zhuǎn)化體中去除選擇標記基因1.目前所能用的選擇標記基因數(shù)量有限，若同一個體常需多次轉(zhuǎn)化，每次篩選均用不同標記，比較困難。2.可能引起轉(zhuǎn)基因植物中目的基因發(fā)生基因沉默。3.環(huán)境安全性問題，主要是選擇標記基因在不同生物間的水平轉(zhuǎn)移，可能引起對生態(tài)平衡的破壞。4.公眾對轉(zhuǎn)基因食品和產(chǎn)品的接受性，很多轉(zhuǎn)基因生物制品最終會投放到市場，如口服疫苗、改良品質(zhì)的作物等，目的基因以外的其它基因的存在尤其是抗性基因的存在會引起公眾對健康的擔心。目前，利用共轉(zhuǎn)化系統(tǒng)、轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)、位點特異性重組系統(tǒng)等均可實現(xiàn)去除轉(zhuǎn)基因植物中的選擇標記基因的目的。位點特異性重組系統(tǒng)主要由2個組分組成位點特異性重組酶和重組位點。由于位點特異性重組系統(tǒng)的確定性和精確性，它們在基因重組的操作上具有很大的應用價值。在去除轉(zhuǎn)基因植物選擇標記基因的研究中，可利用的位點特異性重組系統(tǒng)有來源于噬菌體P1(bacteriophageP1)的Cre/lox系統(tǒng)、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)2μ質(zhì)粒的FLP/FRT系統(tǒng)、接合酵母(Zygosaccharomycesrouxii)pSRl質(zhì)粒的R/RS系統(tǒng)，但以Cre/lox重組系統(tǒng)的應用最為廣泛12。Cre重組酶是一個分子量為38kDa的位點特異性重組酶，它可介導在兩個lox位點(一段長度為34bp的DNA序列)間的DNA發(fā)生切除、整合或倒位的反應3。用Cre/lox體系消除轉(zhuǎn)基因植物中的標記基因就是利用Cre重組酶可介導兩個同向lox位點間的DNA片段切除的特性，一般步驟是將選擇標記基因克隆到兩個同向lox位點之間，首先通過抗性篩選得到轉(zhuǎn)化體，然后將Cre重組酶在獲得的轉(zhuǎn)基因植物中表達，在Cre重組酶的作用下將lox位點間的選擇標記基因消除。早在1991年，Dale和Ow首次利用來自噬菌體P1的Cre/lox系統(tǒng)消除選擇標記基因，他們采用雜交或再次轉(zhuǎn)化的方法表達Cre重組酶，成功消除了轉(zhuǎn)基因煙草中的標記基因。但是因為雜交和二次轉(zhuǎn)化引入Cre重組酶時，必須需要另一個選擇標記基因，所以只有通過后代分離才能獲得只表達目的蛋白而無任何選擇標記的轉(zhuǎn)基因植物，這種操作需要較長的周期4。最近，Cre/lox系統(tǒng)還被用來消除質(zhì)體基因組中的選擇標記基因，但同樣需用二次轉(zhuǎn)化法或雜交來穩(wěn)定表達Cre重組酶，最后利用后代分離獲得無標記基因的、質(zhì)體被轉(zhuǎn)化的植物56。為克服以上述的需經(jīng)后代分離才能獲得無選擇標記基因的轉(zhuǎn)基因植物而帶來的實驗周期長的缺點，并且為了避免因穩(wěn)定表達Cre重組酶而產(chǎn)生的植物表型畸變現(xiàn)象7，科研工作者嘗試用農(nóng)桿菌介導的瞬時提供Cre重組酶的方式來消除標記基因。在1999年，Gleave等就利用Cre酶的瞬時表達來消除標記基因，因無需雜交而大大縮短了周期，但是負選擇標記基因一胞嘧啶脫氨酶基因(codA)的同時使用是必須的，否則效率極低8；在2001年，ZuoJ等利用雌激素誘導型啟動子控制Cre重組酶的表達實現(xiàn)選擇標記基因和Cre基因的共消除，獲得了無選擇標記基因的轉(zhuǎn)基因擬南芥9，但其所用的雌激素誘導劑對環(huán)境安全并不友好。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于針對以上存在的問題，為了克服當前在本
技術領域：
去除轉(zhuǎn)基因植物中選擇標記基因的方法所存在的缺陷，提供一種能在植物細胞中瞬時表達Cre重組酶的病毒表達載體，一種對環(huán)境安全，又可消除轉(zhuǎn)基因植物中選擇標記基因的新方法。具體地講，該方法步驟包括構建含有兩個同向重組位點的植物轉(zhuǎn)化載體，把選擇標記基因克隆在兩個重組位點之間；用含此種植物轉(zhuǎn)化載體的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物，獲得含選擇標記基因的轉(zhuǎn)基因植物；構建一種由植物組成型啟動子驅(qū)動的表達位點特異性重組酶的植物病毒表達載體；將植物病毒表達載體導入轉(zhuǎn)基因植物的細胞，來瞬時表達位點特異性重組酶，去除兩個同向重組位點間的選擇標記基因，在不含任何抗生素的培養(yǎng)基上經(jīng)過組織培養(yǎng)，獲得無選擇標記基因的轉(zhuǎn)基因植物的方法。所述的植物轉(zhuǎn)化載體中的兩個同向重組位點包括Cre重組酶識別的lox位點、FLP重組酶識別的FRT位點或R重組酶識別的RS位點等。所述的選擇標記基因包括卡那霉素抗性基因(nptII)、潮霉素抗性基因(hpt)或除草劑basta抗性基因(bar)等。所述的植物轉(zhuǎn)化載體之一是pGNG，其中選擇標記基因一卡那霉素抗性基因(nptII)被克隆在兩個同向重組位點-lox位點之間。所述的轉(zhuǎn)基因植物是用植物轉(zhuǎn)化載體pGNG轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404，借助農(nóng)桿菌介導的葉盤轉(zhuǎn)化法獲得含選擇標記基因nptII的轉(zhuǎn)基因SRl煙草(Nicotianatabacumcv.SR1)。所述的病毒表達載體可以采用煙草花葉病毒(TMV)表達載體、黃瓜花葉病毒(CMV)表達載體、馬鈴薯X病毒(PVX)表達載體或煙草脆裂病毒(TRV)表達載體等。所述的組成型啟動子可以采用花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動子、農(nóng)桿菌的Nos啟動子或聚泛素基因啟動子等。所述的位點特異性重組酶可以是識別lox位點的Cre重組酶、識別FRT位點的FLP重組酶或識別RS位點的R重組酶。所述的病毒表達載體，其中之一是將煙草花葉病毒(TMV)載體30B經(jīng)過改造而構建的病毒表達載體p35S-m30Bcre，其中含有組成型啟動子一花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動子，并且含有位點特異性重組酶-Cre重組酶基因。所述的將病毒表達載體導入植物細胞中的方法包括農(nóng)桿菌侵染法、基因槍接種法、摩擦接種法等。所述的將病毒表達載體導入植物細胞中的方法之一是用病毒表達載體p35S-m30Bcre轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105，獲得的重組農(nóng)桿菌agro35S-m30Bcre，借助農(nóng)桿菌侵染法將TMV載體導入pGNG轉(zhuǎn)化的SRl煙草細胞中，表達Cre重組酶。本專利申請人于2004年6月10日已將病毒表達載體根癌土壤桿菌Agrobacterriumtumefaciensagro35S-m30Bcre保藏在北京中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。保藏登記號為CGMCCNO.1176。所述的無選擇標記基因的轉(zhuǎn)基因植物是重組農(nóng)桿菌CGMCCNO.1176與pGNG轉(zhuǎn)化的SR1煙草的葉片共培養(yǎng)，瞬時表達Cre重組酶，在不含任何抗生素的培養(yǎng)基上獲得的去除選擇標記基因的轉(zhuǎn)基因煙草。本發(fā)明的最后一個目的是按照本發(fā)明所述的方法，用植物病毒載體瞬時表達位點特異性的重組酶，在去除轉(zhuǎn)基因植物中選擇標記基因和基因表達調(diào)控中的應用。目前可利用Cre/lox系統(tǒng)、FLP/FRT系統(tǒng)和R/RS系統(tǒng)等位點特異性重組系統(tǒng)來去除轉(zhuǎn)基因植物中的選擇標記基因，主要是利用位點特異性重組酶(Cre、FLP和R)可介導兩個同向重組位點(Cre識別的lox、FLP識別的FRT和R識別的RS)間的DNA序列發(fā)生切除重組，重組過程不需任何額外的能量和輔助因子12。如上所述的用于植物轉(zhuǎn)化的載體是含有兩個同向重組位點的載體，其中之一是含有兩個同向的lox位點的pGNG，并且選擇標記基因nptII克隆在兩個lox位點之間，實施例1詳細描述了該載體的構建，其具體結(jié)構如圖1-B所示；用pGNG轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404獲得含pGNG的重組農(nóng)桿菌；借助農(nóng)桿菌介導的葉盤轉(zhuǎn)化法用含pGNG的重組農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化SR1煙草葉片10；用Southernblot和Westernblot分析轉(zhuǎn)基因煙草，證實獲得了pGNG的轉(zhuǎn)基因煙草。如上所述的一種表達位點特異性重組酶的病毒載體，其中之一是采用35S啟動子驅(qū)動TMV載體m30B瞬時表達Cre重組酶，實施例3詳細地敘述了該病毒表達載體p35S-m30Bcre的構建，其具體結(jié)構如圖1-D所示。如上所述的將表達位點特異性重組酶的病毒載體導入轉(zhuǎn)基因植物以獲得無選擇標基因的植物，是用病毒表達載體p35S-m30Bcre轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105，獲得重組農(nóng)桿菌agro35S-m30Bcre，用重組農(nóng)桿菌agro35S-m30Bcre與pGNG轉(zhuǎn)基因煙草的葉片共培養(yǎng)，在不含任何抗生素的培養(yǎng)基上獲得再生苗，用Southernblotting、RT-PCR分析證實獲得了無選擇標記基因再生植株。最后，用PCR方法、Kan抗性實驗、GFP熒光觀察和GUS染色分析獲得的無選擇標記基因再生苗的T1后代植株，證實無選擇標記基因的性狀可以穩(wěn)定遺傳。本發(fā)明提供了一種消除轉(zhuǎn)基因植物中的選擇標記基因的新方法的一個示例，即利用TMV表達載體m30B瞬時、高效、系統(tǒng)擴散地表達Cre重組酶，消除了轉(zhuǎn)基因SR1煙草中兩個同向lox位點間的選擇標記基因nptII，證實了這種策略的可行性。與已報道的穩(wěn)定表達Cre重組酶去除轉(zhuǎn)化體中的選擇標記基因的方法相比4，用m30B瞬時表達Cre重組酶保證了不需雜交和后代分離就可獲得無標記基因轉(zhuǎn)化體，這樣縮短了周期；而且我們的實驗還證明表達Cre重組酶的病毒載體cDNA未整合到無選擇標記基因轉(zhuǎn)化體的染色體中，這避免了因Cre的穩(wěn)定表達而引起的植物表型畸變現(xiàn)象7。因為TMV載體可以在pGNG轉(zhuǎn)化的煙草中高效、系統(tǒng)擴散地表達Cre重組酶，保證了不需任何篩選就可獲得高達9.4％消除率，與用5-氟胞嘧啶篩選無標記基因轉(zhuǎn)化體的策略8、用雌激素誘導劑控制Cre重組酶的表達來去除選擇標記基因的方法相比較9，用病毒載體瞬時表達Cre重組酶去除選擇標記基因的策略不需要任何額外的化學試劑就可獲得理想效果，這樣簡化了實驗操作，避免了有害化合物的使用，又節(jié)省了開支。我們的實驗還表明，無選擇標記基因的轉(zhuǎn)化體后代不帶病毒。總之，用TMV載體m30B瞬時表達Cre重組酶去除pGNG轉(zhuǎn)化的SR1煙草中兩個同向lox位點間的選擇標記基因nptII為實例，證實了病毒載體瞬時表達位點特異性重組酶可以快速、簡便地去除轉(zhuǎn)基因植物中的兩個同向重組位點間的選擇標記基因，獲得無選擇標記基因轉(zhuǎn)化體，這樣既避免了因選擇標記基因存在引起的環(huán)境安全性問題，又利于轉(zhuǎn)基因作物的推廣和公眾對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的接受。應當指出的是，通過本發(fā)明所述的方法去除轉(zhuǎn)基因植物中選擇標記基因是本
技術領域：
的一般技術人員，完全可以理解的。同時，本方法還可用于(1)無需二次轉(zhuǎn)化而經(jīng)過瞬時表達Cre重組酶的病毒載體侵染轉(zhuǎn)基因植物直接獲得無選擇標記基因的種子；(2)除普通煙外其他TMV可侵染的轉(zhuǎn)基因作物中選擇標記基因的消除；(3)使用其他的病毒載體瞬時表達Cre重組酶，來消除該類病毒載體能侵染的轉(zhuǎn)基因作物中選擇標記基因的消除。所以本發(fā)明還包括Cre基因克隆入除p35S-m30B外，構建的能瞬時表達Cre重組酶的其他的病毒載體。為了更好地理解本
發(fā)明內(nèi)容，下面結(jié)合附圖作進一步描述圖1.植物轉(zhuǎn)化載體結(jié)構和選擇標記基因消除示意圖(A)lox-MCS-lox示意圖；(B)植物轉(zhuǎn)化載體pGNG示意圖；(C)pGNG重組后結(jié)構示意圖；(D)病毒表達載體p35S-m30Bcre示意圖HHindIII，EFcoRI，示lox位點的方向，示外殼蛋白(CP)的亞基因組啟動子圖2.轉(zhuǎn)pGNG煙草的分子水平分析(A)Westernblot分析，一抗為兔抗GFP血清，二抗是堿性磷酸酶(AP)標記的羊抗兔IgG(B)Southern雜交分析，HindIII酶切處理50微克(μg)煙草總DNA，用32P標記的GUS編碼區(qū)作雜交探針G1-G6pGNG轉(zhuǎn)化的煙草株系，PpBI121，N野生型煙草，HHindIII圖3.農(nóng)桿菌接種SR1煙草兩周后觀察GFP熒光的觀測(A)用agro35S-m30BGFP接種后，在長波長UV照射下，觀察病毒的擴散(B)用agro35S-30BGFP接種后，在長波長UV照射下，觀察病毒的擴散箭頭示注射接種部位圖4.agro35S-m30Bcre接種pGNG轉(zhuǎn)化體兩周后GUS染色箭頭示注射接種的部位圖5.無選擇標記基因再生苗的Southern雜交分析(A)Southern雜交分析選擇標記基因的消除agro35S-m30Bcre侵染G1、G4的T1代無菌苗，獲得再生植株，NindIII+EcoRI酶切處理30μg煙草總DNA，用32P標記的GUS編碼區(qū)作雜交探針。G1G1的T1代苗，G4G4的T1代苗，G1R1G1的T1代苗的再生苗，G1R3G1的T1代苗的再生苗，G4R4G4的T1代苗的再生苗，N野生型煙草，HHindIII，EEcoRI(B)Southern雜交分析病毒基因組cDNAagro35S-m30Bcre侵染G1、G4的T1代無菌苗，獲得再生植株，EcoRI酶切處理30μg煙草總DNA，用32P標記的Cre編碼區(qū)作雜交探針。Pp35S-m30Bcre，N野生型煙草，G1R1G1的T1代苗的再生苗，G1R3G1的T1代苗的再生苗，G4R4G4的T1代苗的再生苗，EEcoRI圖6.無選擇標記基因轉(zhuǎn)基因苗的RT-PCR分析agro35S-m30Bcre侵染G1、G4的T1代無菌苗，獲得再生植株，用引物CR1/CR2檢測病毒載體的cp，用引物C3/C2檢測插入TMV表達載體的Cre基因G1R1G1的T1代苗的再生苗，G1R3G1的T1代苗的再生苗，G4R4G4的T1代苗的再生苗，MDNAladder(從上到下1.2，0.9，0.7，0.5，0.3，0.1kb)，N野生型煙草圖7.無選擇標記基因轉(zhuǎn)化體后代的PCR分析和PCR產(chǎn)物的測序(A)萌發(fā)無選擇標記基因的轉(zhuǎn)化體的T1代苗，選取GUS染色為陽性的植株，用引物P1/P2進行PCR分析G1R1G1的T1代苗的再生苗，G1R3G1的T1代苗的再生苗，G4R4G4的T1代苗的再生苗，R1S1、R1S2G1R1的T1代苗，R3S3、R3S4G1R3的T1代苗，R4S5、R4S6G4R4的T1代苗，MDNAladder(從上到下1.2，0.9，0.7，0.5，0.3，0.1kb)，N野生型煙草(B)測序分析PCR產(chǎn)物圖8.無選擇標記基因的轉(zhuǎn)化體后代的GFP熒光觀察(A)和GUS組織化學染色(B)萌發(fā)轉(zhuǎn)化體的T1代苗，長波長UV下觀測綠色熒光或用X-Gluc進行GUS染色1，3G1的T1代苗，2，4G1R1的T1代苗具體實施方式為了對本發(fā)明的構思和技術要點予以更好地理解，現(xiàn)通過以下實施例進一步進行描述，但是決不是對本發(fā)明技術的限定。實施例1植物轉(zhuǎn)化載體pGNG的構建、農(nóng)桿菌介導的葉盤轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)基因煙草的分子檢測1.植物轉(zhuǎn)化載體pGNG的構建植物表達載體pGNG在pBI121(購自Clontech公司)基礎上改建11，pGNG的構建過程簡述如下人工合成131bp的含有兩個同向lox位點和多個酶切位點的lox-MCS-lox(圖1A)，用一對引物M1(5′-TTCAAGCTTCGGTCTAGATAACTTCGT一3′)和M2(5′-ACGGAATTCGGTACCCGCG-3′)進行PCR擴增，lox-MCS-lox兩端分別含HindIII和EcoRI切點(下劃線示出)。PCR擴增的程序為94℃預變性3分鐘(min)，按以下程序進行擴增94℃1min；55℃1min；72℃45秒(s)；35個循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后72℃延伸10min。用lox-MCS-lox置換掉pBI121的RB和LB間SacII-EcoRI片段(含NosP-nptII-NosT-35SP-gus-NosT)，生成pBI121lox-MCS-lox(lox-MCS-lox兩側(cè)的HindIII和EcoRI切點仍保留)，測序表明引入的lox-MCS-loxDNA片段完全正確。另將lox-MCS-lox片段用HindIII和EcoRI酶切后，克隆到同樣酶切的pBI221(購自Clontech公司)中，構建來自pBI221lox-MCS-lox。將來自pBI221的CaMV35S啟動子和來自pBI121的GUS-NosT片段克隆到lox-MCS-lox前后，構建pBI221-35S-lox-MCS-lox-GUS。HindIII+EcoRI酶切pBI221-35S-lox-MCS-lox-GUS回收35S-lox-MCS-lox-GUS片段，克隆到同樣酶切的pBI121lox-MCS-lox中，構建pBI121-35S-lox-MCS-lox-GUS。然后用引物GF1(5′-TGGATCCAACAATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTC-3′)和引物GF2(5′-CGAGCTCTTATTTGTATAGTTCATCCATGCC-3′)進行PCR擴增，從pBIN35S-mgfp5-ER(JimHASELOFF博士惠贈)12擴增出gfP，擴增的gfP用BamHI+SacI酶切回收，克隆到同樣酶切的pBI221lox-MCS-lox中，構建成pBI221lox-GFP-lox。用SacI+SalI酶切pX6-GFP(JianruZUO博士惠贈)13回收含NosP-nptII-NosT的片段，插入同樣酶處理的pBI221lox-GFP-lox中，獲得pBI221lox-GFP-nptII-lox。最后，XbaI+SalI酶切pBI221lox-GFP-nptII-lox，回收含GFP-NosP-nptII-NosT的片段，克隆到同樣酶切的pBI121-35S-lox-MCS-lox-GUS中，生成植物轉(zhuǎn)化載體pGNG(圖1B)。將pGNG轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404(購自GibcoBRL公司)，在含利福霉素(Rif，30mg/L)、鏈霉素(50mg/L)、Kan(50mg/L)的LB培養(yǎng)基上得到轉(zhuǎn)化子，并進一步經(jīng)PCR鑒定gfp，選出含有pGNG的菌株。2.葉盤轉(zhuǎn)化法獲得轉(zhuǎn)基因煙草接種含pGNG的農(nóng)桿菌到3.5毫升(ml)的LB液體培養(yǎng)基中，在28C、300rpm的搖床上培養(yǎng)過夜后用于植物轉(zhuǎn)化，農(nóng)桿菌培養(yǎng)液用1/2MS培養(yǎng)液稀釋10倍，至每毫升約1×106至1×107個細菌。選取長有4-5片真葉的SR1煙草無菌苗為試驗材料，剪取葉片，去掉主葉脈，切成約1cm見方的小塊，然后將葉片小塊置于稀釋的根癌農(nóng)桿菌菌液中浸泡20min。用無菌濾紙吸干葉表面菌液，把葉片置于MS共培養(yǎng)培養(yǎng)基(MS無機鹽+B5維生素+1.2mg/L6-BA+0.1mg/LIAA+30g/L蔗糖+0.8g/Lphytogel)上共培養(yǎng)，使切口處與培養(yǎng)基充分接觸，28℃暗培養(yǎng)2天。然后，將煙草葉盤轉(zhuǎn)入MS分化培養(yǎng)基(MS無機鹽+B5維生素+1.2mg/L6-BA+0.1mg/LIAA+500mg/L羧芐青霉素+300mg/LKan+30g/L蔗糖+0.8g/Lphytogel)上培養(yǎng)，兩周繼代一次。培養(yǎng)大約4周后，可觀察到葉片邊緣長出愈傷組織小塊，并開始分化長出小綠點，逐步長成分化芽。當分化芽長至1厘米左右時，將生長狀態(tài)良好的小芽轉(zhuǎn)移到MS生根培養(yǎng)基(MS無機鹽+B5維生素+0.2mg/LIBA+30g/L蔗糖+0.8g/Lphytogel+500mg/L羧芐青霉素+200mg/LKan)上進行生根培養(yǎng)，分化芽在MS生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)3周后，能夠長出正常根，形成完整的植株后，移栽到溫室里繼續(xù)培養(yǎng)。3.轉(zhuǎn)基因煙草表達GFP的Westernblot檢測稱取轉(zhuǎn)基因煙草的新鮮葉片100mg，液氮冷凍研磨。將粉末轉(zhuǎn)入200微升(μl)加樣緩沖液(125mMTris-HClpH8.0；20％甘油；4％SDS；0.05％溴酚蘭；2％巰基乙醇)中，100℃煮10min，離心后，然后取植物總蛋白樣品約100μg進行SDS-PAGE(15％的分離膠和4％的濃縮膠)。電泳結(jié)束后，用Bio-Rad半干電泳轉(zhuǎn)移儀將蛋白轉(zhuǎn)移至甲醇預處理的PVDF膜上。恒壓9伏，轉(zhuǎn)移30min。將膜置于封閉緩沖液(20mMTris-HClpH7.4；30mMNaCl；1mMEDTA；0.1％Tween-20；3％BSA)中，室溫輕搖過夜。將膜置于兔抗GFP血清中(13000；20mMTris-HClpH7.4；30mMNaCl；1mMEDTA；0.1％Tween-20；1％BSA稀釋)室溫輕搖1小時(h)；用洗滌緩沖液(20mMTris-HClpH7.4；30mMNaCl；1mMEDTA；0.1％Tween-20)洗膜三次，每次10min。將膜置于堿性磷酸酶(AP)標記的羊抗兔IgG中(15000；20mMTris-HClpH7.4；30mMNaCl；lmMEDTA；0.1％Tween-20；1％BSA稀釋)，室溫輕搖1h。用洗滌緩沖液洗膜三次，每次10min。最后，用NBT和BCIP顯色(Promega)。結(jié)果顯示6株pGNG轉(zhuǎn)化的煙草均可觀察到一條特異性的蛋白帶，并且分子量大小與原核表達的GFP一致，表明GFP在轉(zhuǎn)基因植物中得到表達(圖2A)。4.轉(zhuǎn)基因煙草的Southernblot檢測轉(zhuǎn)基因煙草的總DNA提取稱取1g煙草的新鮮葉片，液氮冷凍充分研磨后，加入10mlCTAB提取緩沖液(Tris100mM，pH8.0；NaCl1.4M；EDTA20mM；CTAB2％)，65℃溫育45min；加入等體積預冷的氯仿顛倒混勻，10,000rpm離心10min；轉(zhuǎn)移上清至另一滅菌的50ml離心管，加入等體積異丙醇，輕輕地顛倒混勻，可見白色絮狀沉淀出現(xiàn)。輕輕挑出沉淀(或5,000rpm離心10min，轉(zhuǎn)移沉淀)放入5ml離心管中，75％乙醇洗滌，晾干。加入2ml去離子水溶解，加5μlRNase(10g/L)室溫靜置半小時除RNA。加入等體積的氯仿異戊醇(24∶1)抽提，離心后轉(zhuǎn)移上清到另一5ml離心管。加入1/10體積3M的醋酸鈉(pH5.5)及2倍體積的無水乙醇，顛倒混勻，室溫靜置1h，13,000rpm離心15min沉淀DNA。70％乙醇洗滌，沉淀，晾干，500μl去離子水溶解。取2μl電泳檢測，若純度不夠或降解太多，應重新純化或提取。煙草基因組DNA的酶解及電泳取約50μg的煙草總DNA，在500μl體系中加入足量的HindIII，將酶、緩沖液和DNA反應體系混合均勻，酶切過夜。消化完畢后，加入1/10體積3M醋酸鈉(pH5.5)及2倍體積的無水乙醇，顛倒混勻，室溫靜置2h，13,000rpm離心20min沉淀DNA。70％乙醇洗滌，沉淀，晾干，加入40μlTE溶解。電泳之前，將DNA在65℃水浴保溫10min。0.8％瓊脂糖電泳，電壓60伏，同時用HindIII處理的pBI121作為陽性對照。電泳結(jié)束后，在紫外燈下觀察并拍照。DNA向尼龍濾膜的毛細管轉(zhuǎn)移用鋒利刀片修去凝膠的無用部分，并在加樣孔一端切去一角，作為以下操作過程中凝膠方位的標記。將修理后的凝膠置于數(shù)倍體積的脫嘌呤液(0.25MHCl)中浸泡并溫和地振搖，至上樣緩沖液中的溴酚蘭變?yōu)榻埸S色；隨后以去離子水漂洗凝膠，在將其浸泡于數(shù)倍體積的變性液(0.5MNaOH；1.5MNaCl)中，室溫下溫和地振搖，至上樣緩沖液中的溴酚蘭變回原來的藍色。利用水平電泳槽作為轉(zhuǎn)膜器皿，在兩個槽中倒入轉(zhuǎn)移液(即變性液)，使兩邊液面水平一致，用一張Whatman3MM濾紙作為搭橋連接兩個槽，用一張長和寬均略大于凝膠的Whatman3MM濾紙放在平臺上，當平臺上方的濾紙浸濕后，用玻璃棒趕走氣泡；再放一張浸濕的略大于膠的3MM濾紙，趕除氣泡；裁一張尼龍膜Hybond-N+(AmershamPharmaciaBiotech)，濾膜的長度和寬度比凝膠大1毫米，并將其一角切去；濾膜用去離子水浸潤，隨后用變性液(0.5MNaOH；1.5MNaCl)浸泡5min；將凝膠從變性液中取出，放在平臺濕潤的3MM濾紙上，趕除氣泡，用Parafilm膜封閉凝膠周邊，在凝膠上方放置濕潤的尼龍膜，并使兩者的切角相重疊；在上面鋪一張浸濕的略大于膠的3MM濾紙，趕除氣泡；再放一疊略小于3MM濾紙的紙巾，并在上面放一塊鐵板，然后用一個約500g的重物壓實。DNA轉(zhuǎn)移過夜，結(jié)束后，揭去凝膠上方的紙巾和濾紙，翻轉(zhuǎn)尼龍膜以挨膜的一面在上，用鉛筆標記凝膠加樣孔的位置。濾膜用20×SSC(3MNaCl；0.3MSodiumcitrate)洗膜3min，以去除膜表面的瓊脂糖膠，用濾紙吸干后，紫外交聯(lián)4min。標記探針和雜交探針標記標記探針用RandomPrimedDNALabelingKit(購自Roche公司)。反應條件是大約100ngGUS基因片段溶于9μl去離子水，100℃水浴10min，放置在冰上；在上述體系中再加入以下組分Hexanucleotidemixture2μldATP、dGTP、dTTP混合物3μlKlenow酶1μl[α-32P]dCTP5μl37℃保溫30min后，在體系中加入EDTA(0.2M，pH8.0)2μl，100℃水浴5min。用去離子水浸潤交聯(lián)的濾膜，之后放入雜交管中，膜上含有DNA的一面朝向管內(nèi)，加入15ml溶解好的預雜交液(1.5×SSPE；1％SDS；0.5％BSA；0.5g/LSpermDNA；10％DextranSulfate)，65℃預雜交2h后，在雜交管中加入標記好的探針混合液，65℃雜交過夜。倒掉雜交液，用2×SSC(含SDS0.1％)溶液200ml洗膜15min，重復2次換用1×SSC(含SDS0.1％)溶液200ml洗膜15min，重復2次；以上過程均在雜交箱中完成。用蓋革計數(shù)器檢測檢測尼龍膜上的放射性活性，放射強度應呈現(xiàn)明顯梯度，膜上不含雜交探針的部分只有很微弱的信號。否則用0.1×SSC(含SDS0.1％)溶液洗膜。將洗好的濾膜取出，除去膜上殘存的液體，用保鮮膜包好，壓X光片，在-80℃放射自顯影一定時間后沖洗膠片。Southern雜交結(jié)果表明在所選擇的4株轉(zhuǎn)基因苗中，pGNG的T-DNA已穩(wěn)定整合到植物的基因組中(圖2B)。結(jié)合轉(zhuǎn)基因株系T1代苗的Kan抗性實驗結(jié)果(表1)，確證G1含單拷貝T-DNA，而G4和G6也可能是單拷貝轉(zhuǎn)基因煙草，我們選擇G1和G4兩個轉(zhuǎn)基因煙草株系進行消除nptII的操作。表1pGNG轉(zhuǎn)基因煙草T1代中Kan抗性基因的分離情況實施例2病毒表達載體的改造及其檢測。1.病毒表達載體的改造SalI+XhoI酶切pCambia1300(RichardJEFFERSON博士惠贈)13后回收6.8kb片段，自連生成pCambia1300del，去除了pCambia1300中的潮霉素抗性基因(35SP-hpt)。用T1(5′-GTATTTTTACAACAATTACCAACAACAAC-3′)和T2(5′-ATCTATTCTAGAAAACTTACAAAACCAGG-3′)為上游和下游引物，從30B載體(WilliamDAWSON博士惠贈)14中PCR擴增出TMVRNA的5′端片段TMVF1；擴增的程序與實施例1.1相同，只是循環(huán)過程中72℃延伸時間為90s。XbaI處理TMVF1，與StuI+XbaI酶切的pCassSK(改建ShouweiDING博士惠贈的pCass2而成)1516連接，構建成pCassTMVF1，測序證實PCR擴增的片段完全正確。PstI和PvuII酶切pCassTMVF1，回收35SP-TMVF1-35ST片段，克隆到同樣酶處理的pCambia1300del中構建pCambia1300del-TMVF1。30B載體用NcoI酶切，補齊，XbaI酶切后回收約4.4kb片段(TMVRNA的中間部分)；pCambia1300del-TMVF1用SacII部分酶切，削平，再用XbaI酶切，回收約8.7kb的片段，將兩片段連接獲得pCambia1300del-TMVF2。SphI酶切30B載體，削平，再用ApaI處理回收約1.6kb片段(TMVRNA的3′端片段)；SacI部分酶切pCambia1300del-TMVF2，削平，再用ApaI酶切回收約13kb質(zhì)粒片段；將兩片段連接構建成重組載體pCambia1300del-TMV，命名為p35S-30B17。為了改善病毒表達載體在煙草中的移動能力，根據(jù)Toth等的報道，用引物MP1(5′-AAGCTTATTGATAGTGGATACGTCTGTTTAGCCGGTGTCGTCACG-3′)和引物MP2(5′-AGCCGACGAGGCCCT-3′)將三個最有效的突變位點，即L72(TTG)→V72(GTT)和T104(ACT)→T104(ACC)(在引物中用方框示出)18，引30B的MP基因，構建p35S-m30B。以pBIN35S-mgfp5-ER12為模板，用引物GF3(5′-ATTAATTAATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTC-3′)和GF4(5′-ACTCGAGTTATTTGTATAGTTCATCCATGCC-3′)進行PCR擴增gfP，擴增的程序與實施例1.1相同，只是循環(huán)過程中72℃延伸時間為1min。回收大約800kb的擴增片段，克隆到pGEM-Tvector(購自Promega公司)中，得到攜帶有gfP的pGEM-T-GFP，經(jīng)序列測定證實gfP與原始序列相同。在pGEM-T-GFP中，gfP的5′端經(jīng)PCR引入了PacI酶切位點，3′端引入了XhoI酶切位點；用PacI+XhoI酶切pGEM-T-GFP回收gfP，分別克隆到p35S-30B和p35S-m30B構建成病毒表達載體p35S-30BGFP和p35S-m30BGFP。將p35S-30B和p35S-m30B分別轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA1019，在含Rif(30mg/L)、Kan(50mg/L)的LB培養(yǎng)基上篩選得到重組農(nóng)桿菌agro35S-30BGFP和agro35S-m30BGFP。2.農(nóng)桿菌注射法接種接種重組農(nóng)桿菌agro35S-30BGFP和agro35S-m30BGFP到3.5ml的LB培養(yǎng)基中，在28℃、300rpm的搖床上培養(yǎng)過夜；1ml過夜培養(yǎng)物接種到50ml新的LB中，含有30mg/L的Rif、50mg/L的Kan、20μM乙酰丁香酮(acetosyringone)和10mMMES(pH5.6)，在28℃、300rpm的搖床上培養(yǎng)過夜；用離心機在3000rpm收集農(nóng)桿菌，用MMA(10mMMgCl2；10mMMESpH5.6；100μMacetosyringone)調(diào)OD600等于1.0；室溫下靜置3h，用2ml注射器(不帶針頭)對煙草SR1植株的葉片作注射。繼續(xù)培養(yǎng)兩周后進行GFP熒光觀測。3.病毒侵染煙草的熒光觀察在手提式紫外燈(UVProducts，modelB100AP)的長波長紫外線(UV)下，觀察接種植物的綠色熒光，并用數(shù)碼相機(NikonCoolpi×995)照相。盡管在農(nóng)桿菌接種的煙草中均可觀測到GFP熒光，但是注射接種agro35S-30BGFP的煙草，只能在接種的葉片上觀測到病毒的擴散(圖3B)，而接種MP改造過的agro35S-m30BGFP的煙草，病毒擴散速度比較快，可在非接種葉片上觀測到綠色熒光(圖3A)。結(jié)果表明病毒載體的MP改造后，移動能力確實被改善，這樣，在相同的時間內(nèi)，m30B載體應該比30B載體能侵染更多的宿主細胞，所以我們選擇MP改造的病毒載體來瞬時表達Cre重組酶，希望可以提高無標記基因轉(zhuǎn)化體在所有再生植株中的比例。實施例3瞬時表達的Cre重組酶在轉(zhuǎn)基因煙草葉片中介導的重組、無選擇標記基因的再生植株的檢測。1.病毒表達載體p35S-m30Bcre的構建用引物Cl(5′-ATTAATTAATGTCCAATTTACTGACCGTACAC-3′)和C2(5′-ACTCGAGCTAATCGCCATCTTCCAGCAG-3′)從pCambia1300-Cre11中PCR擴增出Cre基因，PCR操作的程序與實施例1.1相同，只是循環(huán)過程中72℃延伸時間為90s。擴增后回收大約1kb的片段，克隆到pGEM-Tvector中，生成pGEM-T-Cre，經(jīng)序列測定證實Cre基因序列完全正確。用PacI+XhoI處理pGEM-T-Cre，回收Cre基因，克隆到同樣酶處理的p35S-m30B中，生成病毒表達載體p35S-m30Bcre(圖1D)，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA1019后獲得重組農(nóng)桿菌agro35S-m30Bcre，保藏號是CGMCCNO.1176。2.農(nóng)桿菌注射法接種和GUS表達的觀察農(nóng)桿菌注射法接種與實施例2.2相同，只是重組農(nóng)桿菌為CGMCCNo.1176agro35S-m30Bcre，而接種植物為pGNG轉(zhuǎn)化的煙草植株。接種兩周后對接種植株的葉片進行GUS染色。先用50mM磷酸緩沖液(pH7.0)漂洗葉片，然后浸入1mMX-Gluc的緩沖液中(4℃避光保存)，抽真空5min后37℃反應過夜。用70％乙醇65℃脫色1h，觀察并用數(shù)碼相機(NikonCoolpi×995)照相。結(jié)果表明在agro35S-m30Bcre接種的pGNG轉(zhuǎn)基因苗中，所有接種葉片中均檢測到GUS的表達，表明在接種葉片的組織中Kan抗性基因已被消除。但是在接種植株的系統(tǒng)葉片上沒有檢測到GUS活性(圖4)。3.農(nóng)桿菌共培養(yǎng)法獲得無選擇標記基因的煙草與實施例1.2中煙草葉盤轉(zhuǎn)化操作完全相同，只是植物材料是轉(zhuǎn)基因煙草G1和G4的有GFP熒光的T1代無菌苗，所用農(nóng)桿菌是agro35S-m30Bcre；另外，共培養(yǎng)完畢后，將葉片置于不含任何抗生素的分化培養(yǎng)基上誘導植株再生。農(nóng)桿菌共培養(yǎng)法轉(zhuǎn)化后，共獲得32株再生苗。取這些植株的不同部位進行GUS組織染色，操作與實施例3.2相同。結(jié)果表明有11株再生苗可檢測到GUS活性，但是絕大多數(shù)轉(zhuǎn)化體(8株)只能在一些組織中檢測到GUS表達，其中只有3株(G1R1；G1R3；G4R4)在所有組織中均可檢測到GUS的活性(表2)，推測這3株轉(zhuǎn)基因苗可能已被消除了選擇標記基因。取G1R1、G1R3和G4R4的葉片作為外植體，快速擴繁獲得154株再生苗，其中65株來自G1R1、36株來自G1R3、53株來自G4R4，用X-Gluc進行GUS染色，結(jié)果表明154株擴繁苗在所有組織中表達GUS。提取轉(zhuǎn)化體G1R1、G1R3和G4R4的基因組DNA作Southernblot分析，具體操作與實施例1.4相同，只是在這個實驗中，在檢測選擇標記基因消除時用NindIII+EcoRI處理30μg煙草總DNA，用32P標記的GUS編碼區(qū)作雜交探針；在檢測病毒載體cDNA是否整合到煙草染色體中時，用EcoRI酶切煙草總DNA，用32P標記的Cre編碼區(qū)作雜交探針。Southern雜交結(jié)果表明，確實發(fā)生了Cre重組酶介導的切除反應，因為pGNG中兩個lox位點間的DNA片段被切除后，使HindIII+EcoRI的酶切片段的大小由4.1kb轉(zhuǎn)變?yōu)?.0kb(圖1B；圖1C)，結(jié)果與預測的相符(圖5A)。但是p35S-m30Bcre的T-DNA未整合到植物染色體中(圖5B)，這樣就無需后代分離即可獲得無選擇標記、表達目的基因蛋白(GUS)的轉(zhuǎn)化體。表2agro35S-m30Bcre侵染G1和G4獲得的再生苗的分析4.去除選擇標記基因的再生植物的RT-PCR檢測用鹽酸胍的方法從G1R1、G1R3和G4R4中提取植物總RNA，用試劑盒AMVReverseTranscriptase(Promega，USA)合成cDNA的第一條鏈(具體操作按試劑盒說明書進行)。然后以這條鏈為模板進行PCR反應。用引物C3(5′-AGATATCTCACGTACTGACGGTGG-3′)和C2(5′-ACTCGAGCTAATCGCCATCTTCCAGCAG-3′)擴增Cre基因，擴增的程序與實施例1.1相同，只是循環(huán)過程中72℃延伸時間為90s。用引物CR1(5′-TGAACTGGTTCGTGGAACTGGC-3′)和CR2(5′-GGCCGCTACCCGCGGTTA-3′)擴增病毒載體中的CP基因，擴增的程序與實施例1.1相同，但是循環(huán)過程中72℃延伸時間為1min。反應結(jié)束后，在1.0％瓊脂糖凝膠上電泳。結(jié)果表明，盡管獲得的轉(zhuǎn)基因苗中有病毒的存在，但是Cre基因并不存在了(圖6)，可能是因為插入病毒載體的Cre基因已經(jīng)通過病毒內(nèi)部重組丟失了，這樣Cre重組酶只是在病毒載體侵染的初期瞬時表達。實施例4無選擇標記基因轉(zhuǎn)化體的后代檢測1.無選擇標記基因轉(zhuǎn)化體T1代苗的PCR檢測在G1R1、G1R3和G4R4的T1代苗中，選擇有GUS活性的煙草植株。稱取煙草葉片50mg，液氮冷凍研磨后，加入400μl提取緩沖液(2％CTAB；100mMTrispH8.0；20mMEDTA；1.4MNaCl)，65℃溫浴30min，每隔15min輕輕混勻一下。加入等體積的氯仿異戊醇(24∶1)，混勻；10,000rpm離心5min，吸出上清。再用等體積的氯仿異戊醇(24∶1)抽提一次；吸出上清，加入等體積的異丙醇，混勻，可觀察到DNA沉淀生成。14,000rpm離心20min，棄上清，用75％乙醇洗一次。晾干，加入適量的去離子水溶解DNA。取1μl(約200ng-1μg)總DNA，用35S啟動子上的引物P1(5′-CTCAGAAGACCAAAGGGC-3′)和gus上的引物P2(5′-CACGGGTTGGGGTTTCTACAGG-3′)進行PCR擴增，擴增的程序與實施例1.1相同。PCR完畢后，取5μlPCR反應混合物，在1％瓊脂糖膠上電泳。結(jié)果表明，從所有轉(zhuǎn)化體中均擴增出一個約450bp的片段，與預測的大小相同(圖7)。將PCR產(chǎn)物克隆入pGEM-Tvector，連接后進行測序，結(jié)果顯示確實發(fā)生了Cre重組酶介導的位點特異重組兩個lox位點間的DNA序列被消除，使GUS基因緊接在CaMV35S啟動子之后。2.無標記基因轉(zhuǎn)化體的后代的Kan抗性檢測、GFP熒光觀測和GUS染色在含Kan(100mg/L)的MS培養(yǎng)基上萌發(fā)G1R1、G1R3、G4R4的T0代種子，觀測后代對Kan的抗性。結(jié)果表明，G1R1、G1R3、G4R4的T0代種子在含Kan的培養(yǎng)基上萌發(fā)后，幼苗全部白化，說明它們均失去了Kan抗性。在不含Kan的MS培養(yǎng)基上萌發(fā)G1R1、G1R3、G4R4的T0代種子，藍光激發(fā)下，用熒光顯微鏡(OlympusSZX9，Japan)觀察幼苗的綠色熒光并拍照，發(fā)現(xiàn)在MS萌發(fā)的幼苗可正常發(fā)育，但是T1代苗均無GFP熒光，表明兩個lox位點間的DNA序列已被切除。對G1R1、G1R3、G4R4的T1代幼苗進行GUS組織化學染色，方法與實施例3.2中敘述的相同，處理后在解剖鏡下觀察并照相，發(fā)現(xiàn)盡管G1R1和G1R3的后代中只有約75％幼苗有GUS活性，但是所有的G4R4的后代都可用X-Gluc染成藍色(圖8)，推測agro35S-m30Bcre侵染時所選的G1的T1代苗為雜合體，而G4的T1代苗為純合體。最后用RT-PCR擴增CP基因以在無標記基因轉(zhuǎn)化體的后代中分析病毒載體，方法與實施例3.4中相同，結(jié)果表明無標記基因轉(zhuǎn)化體的T1代苗中不存在病毒。結(jié)論利用農(nóng)桿菌注射法在煙草SR1上接種agro35S-30BGFP和agro35S-m30BGFP，通過綠色熒光的觀察，證實TMV的MP改造后，病毒載體移動的能力得到改善(圖3)；在pGNG轉(zhuǎn)化的煙草上注射接種agro35S-m30Bcre，通過GUS染色證實在接種葉片中，病毒載體瞬時表達的Cre重組酶可介導兩個同向lox位點間發(fā)生切除重組(圖4)。用agro35S-m30Bcre轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)基因煙草株系G1和G4，結(jié)果在獲得的32株再生苗中，3株為無選擇標記基因的轉(zhuǎn)基因苗，即G1R1、G1R3和G4R4，并且它們可通過組織培養(yǎng)大量擴繁無選擇標記基因再生苗。通過Southern雜交證實選擇標記基因的消除是因為Cre重組酶介導了兩個同向lox位點間的DNA的切除，并且病毒載體基因組的cDNA未整合的植物的染色體中(圖5)。而RT-PCR結(jié)果表明G1R1、G1R3和G4R4中存在的病毒是已經(jīng)丟失了Cre基因的重組病毒(圖6)，說明Cre重組酶是在植株再生過程中瞬時表達的。通過對G1R1、G1R3和G4R4的T1代苗的分析(圖7)(圖8)，證實無選擇標記基因的性狀可以穩(wěn)定遺傳，并且T1代苗已經(jīng)脫毒。因此，用病毒載體瞬時表達Cre重組酶來消除轉(zhuǎn)基因植物中選擇標記基因是一個簡便、有效的新方法。主要參考文獻1.HohnB，LevyAA，PuchtaH.Eliminationofselectionmarkersfromtransgenicplants.CurrOpinBiotechnol，2001，12139-143.2.HarePD，ChuaNH.Excisionofselectablemarkergenesfromtransgenicplants.NatBiotechnol，2002，20575-580.3.CraigN.Themechanismofconservativesite-specificrecombination.AnnuRevGenet，1988，2277-105.4.DaleEC，OwDW.Genetransferwithsubsequentremovaloftheselectiongenefromthehostgenome.ProcNatlAcadSciUSA，1991，8810558-10562.5.CorneilleS，LutzK，SvabZ，MaligaP.EfficienteliminationofselectablegenesfromtheplastidgenomebytheCRE-loxsite-specificrecombinationsystem.PlantJ，2001，27171-178.6.HajdukiewicsPT，GilbertsonL，StaubJM.MultiplepathwaysforCre/lox-mediatedrecombinationinplastids.PlantJ，2001，27160-170.7.CoppoolseER，deVroomenMJ，RoelofsD，SmitJ，vanGennipF，HersmusBJ，NijkampHJ，vanHaarenMJ.Crerecombinaseexpressioncanresultinphenotypicaberrationsinplants.PlantMolBiol，2003，51263-279.8.GleaveAP，MitraDS，MudgeSR，MorrisBA.Selectablemaker-freetransgenicplantswithoutsexualcrossingtransientexpressionofcrerecombinaseanduseofaconditionallethaldominantgene.PlantmolBiol，1999，40223-235.9.ZuoJ，NuiQ-W，GeirMφllerS，ChuaN-H.Chemical-regulated，site-specificDNAexcisionintransgenicplants.NatBiotechnol，2001，19157-161.10.HorschRB，F(xiàn)ryJE，HoffmanNL，EichholzD，RogersSG，F(xiàn)raleyRT.Asimpleandgeneralmethodfortransferringgenesintoplants.Science1985，2271229-1231.11.賈洪革，呂玲飛，龐永奇，陳曉英，方榮祥.用綠色熒光蛋白監(jiān)測轉(zhuǎn)基因植物中選擇標記基因的消除.生物工程學報，2004，2010-15.12.HaseloffJ，SiemeringKR，PrasherDC，HodgeS.RemovalofacrypticintronandsubcellularlocalizationofgreenfluorescentproteinarerequiredtomarktransgenicArabidopsispl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