專利名稱：雙鏈核酸分子包被微孔板檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
轉(zhuǎn)錄因子(transcription factor)是生物蛋白質(zhì)組(proteomics)中一類負(fù)責(zé)基因表達(dá)調(diào)控(geneexpression regulation)的重要蛋白質(zhì)，是基因表達(dá)調(diào)控通路(pathway)及網(wǎng)絡(luò)(network)的樞紐，是功能基因組(functional genomics)和蛋白質(zhì)組研究的重要對(duì)象；許多疾病都與轉(zhuǎn)錄因子的異常表達(dá)(expression)及活化(activation)存在密切的關(guān)系，成為轉(zhuǎn)錄治療(transcriptional therapy)和藥物研究的重要靶點(diǎn)(drug target)。轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)及活化程度的檢測(cè)分析是研究其功能的主要手段。本專利提出了一種檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)和活化水平的新方法，該方法將為是分子生物學(xué)(molecular biology)、功能基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)及生物醫(yī)學(xué)(Biomedicine)領(lǐng)域中的轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)研究提供一種新的檢測(cè)分析技術(shù)，可促進(jìn)這些領(lǐng)域中轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)的科學(xué)研究，以及在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中提供一種疾病相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的診斷技術(shù)、以及轉(zhuǎn)錄因子為靶點(diǎn)的藥物篩選(drug screening)技術(shù)。
背景技術(shù)：
轉(zhuǎn)錄因子蛋白是生物蛋白質(zhì)組中一類負(fù)責(zé)基因表達(dá)調(diào)控的重要蛋白質(zhì)，是基因表達(dá)調(diào)控通路及網(wǎng)絡(luò)的樞紐，是功能基因組和蛋白質(zhì)組研究的重要對(duì)象；許多疾病都與轉(zhuǎn)錄因子的異常表達(dá)及活化存在密切的關(guān)系，成為轉(zhuǎn)錄治療和藥物研究的重要靶點(diǎn)。轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)及活化程度的檢測(cè)分析是研究其功能的主要手段。因此，有關(guān)檢測(cè)分析轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)及活化程度技術(shù)的研究一直受到科學(xué)界的重視。
分子生物學(xué)研究表明，在基因的上下文(context)存在一些發(fā)揮啟動(dòng)(promote)、增強(qiáng)(enhance)或衰減(attenuate)基因轉(zhuǎn)錄作用的特定DNA序列，稱為順式作用元件(cis-actingelements)，如啟動(dòng)子(promoter)、增強(qiáng)子(enhancer)、衰減子(attenuater)；轉(zhuǎn)錄因子蛋白是生物蛋白質(zhì)組中一類特殊的蛋白質(zhì)，這類蛋白質(zhì)的細(xì)胞質(zhì)中完成其翻譯(translation)后，在正常細(xì)胞功能狀態(tài)或細(xì)胞受到特定因子誘導(dǎo)下，進(jìn)入細(xì)胞核，與基因組中的順式作用元件發(fā)生特異性識(shí)別結(jié)合，組成基因轉(zhuǎn)錄機(jī)器(transcription apparatus)，實(shí)現(xiàn)其基因表達(dá)的調(diào)控功能，稱為反式作用因子(trans-acting factors)。轉(zhuǎn)錄因子蛋白與順式作用元件組成基因轉(zhuǎn)錄機(jī)器的首要環(huán)節(jié)是轉(zhuǎn)錄因子蛋白中一些具有特殊結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子直接與順式作用元件DNA序列發(fā)生序列特異性結(jié)合(sequence-specific binding)，完成基因轉(zhuǎn)錄機(jī)器組裝的第一步。因此，檢測(cè)分析轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)及活化程度的技術(shù)主要建立在DNA/蛋白質(zhì)相互作用這一層次，即運(yùn)用含有順式作用元件的DNA為探針，探測(cè)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)及活化。
時(shí)至目前，科學(xué)家們已經(jīng)建立多種基于DNA/蛋白質(zhì)相互作用這一層次的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)及活化程度的檢測(cè)分析技術(shù)。其中最經(jīng)典的是電泳遷移率變動(dòng)分析(Electrophoresis MobilityShift Assay)，即凝膠遷移實(shí)驗(yàn)(gel shift assay)。該技術(shù)一般是人工合成含有轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合序列(consensus，binding sites)的雙鏈(double-stranded)寡核苷酸(oligonucleotides)，并用放射性同位素標(biāo)記寡核苷酸，將標(biāo)記寡核苷酸與含有轉(zhuǎn)錄因子蛋白的細(xì)胞或組織抽提物混合孵育一段時(shí)間后，進(jìn)行自然聚丙烯酰胺凝膠電泳(native polyacrylamide gel eletrophoresis，PAGE)，分離游離(free DNA)和與蛋白質(zhì)結(jié)合的DNA(retarded DNA)，在通過(guò)X-光底片暴光顯現(xiàn)與蛋白質(zhì)結(jié)合的DNA(retarded DNA)，來(lái)反映轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)及活化程度。這一技術(shù)目前仍非常有效地用于轉(zhuǎn)錄因子蛋白檢測(cè)分析。但存在放射性標(biāo)記對(duì)實(shí)驗(yàn)人員及環(huán)境危害的缺陷。因此，對(duì)這一技術(shù)后來(lái)進(jìn)行了非放射性標(biāo)記的改進(jìn)。即用地高辛(digoxigenin，DIG)標(biāo)記寡核苷酸，進(jìn)行自然聚丙烯酰胺凝膠電泳，再將電泳產(chǎn)物轉(zhuǎn)印(blotting)到尼龍膜(nylon membrane)等介質(zhì)上，依靠堿性磷酸酶或辣根過(guò)氧化物酶耦聯(lián)的DIG抗體和相應(yīng)酶的生色(colorimetric)或發(fā)光(chemiluminescent)底物(substrate)，進(jìn)行化學(xué)生色或發(fā)光檢測(cè)，來(lái)反映轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)及活化程度。也有采用熒光(fluorescent)標(biāo)記寡核苷酸進(jìn)行電泳遷移率變動(dòng)分析的改進(jìn)技術(shù)。這些技術(shù)也能夠很好地用于轉(zhuǎn)錄因子蛋白檢測(cè)分析。但這些技術(shù)仍然存在自身的缺點(diǎn)，即它們雖然避免了經(jīng)典放射性標(biāo)記探針凝膠遷移實(shí)驗(yàn)的缺點(diǎn)，但同時(shí)帶來(lái)實(shí)驗(yàn)流程的復(fù)雜化和更多的影響因素，如尼龍膜實(shí)驗(yàn)的高背景、轉(zhuǎn)引設(shè)備需求及實(shí)驗(yàn)成本提高等問(wèn)題。同時(shí)，這些改進(jìn)技術(shù)從根本上未擺脫種凝膠遷移實(shí)驗(yàn)的技術(shù)思想，無(wú)法克服凝膠遷移實(shí)驗(yàn)對(duì)實(shí)驗(yàn)樣品數(shù)量需求大、實(shí)驗(yàn)耗時(shí)長(zhǎng)、分析效率低等缺陷。
鑒于這些技術(shù)目前仍然存在的缺點(diǎn)，建立從技術(shù)思想角度上完全不同于凝膠遷移實(shí)驗(yàn)的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)及活化檢測(cè)及分析技術(shù)是非常必要的。為此我們已經(jīng)進(jìn)行了諸多相關(guān)研究，并發(fā)展了一些新的技術(shù)。例如，利用基因芯片技術(shù)的策略，我們?cè)?jīng)致力于將含有轉(zhuǎn)錄因子蛋白結(jié)合位點(diǎn)的雙鏈DNA固定到固相載體如玻片表面，制備雙鏈DNA微陣列芯片(double-stranded DNA microarray chip)，用于轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)及活化的檢測(cè)及分析。我們發(fā)明了數(shù)種制備雙鏈DNA微陣列芯片的技術(shù)(中國(guó)專利ZL02112780.8，02137945.9，03152881.3)，并成功制備了專用于檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子蛋白NF-κB的雙鏈DNA微陣列芯片(中國(guó)專利03132206.9)，而且由此建立了一種在“DNA/蛋白質(zhì)”相互作用的分子層面上從復(fù)雜組分物質(zhì)如中藥和組合化學(xué)混合物中高通量篩選、捕獲和分離目標(biāo)分子的技術(shù)(中國(guó)專利03152882.1)。
技術(shù)的有效性和實(shí)用性是技術(shù)的命脈。雖然我們的雙鏈DNA微陣列芯片技術(shù)已經(jīng)達(dá)到了實(shí)用化水平，但我們注意到該項(xiàng)技術(shù)的推廣應(yīng)用仍然面臨很大的困難，即芯片的制備和使用成本比較高昂。特別是芯片的實(shí)際使用中必須依賴于目前非常昂貴的基因芯片掃描裝置，極大地限制了雙鏈DNA微陣列芯片技術(shù)的商業(yè)化。由此，我們著力改進(jìn)這一技術(shù)，將DNA固相化技術(shù)與傳統(tǒng)的微孔板酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)技術(shù)結(jié)合在一起，提出了本發(fā)明“雙鏈核酸分子包被微孔板檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子蛋白”技術(shù)。這一技術(shù)將雙鏈DNA微陣列芯片技術(shù)中的DNA固定介質(zhì)有玻片改為常用于進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)的微孔板，檢測(cè)儀器自然由昂貴的基因芯片掃描裝置改變?yōu)槌杀镜土拿笜?biāo)儀。這一改進(jìn)，極大地降低了制備和使用成本，能夠很好地解決我們建立的雙鏈DNA微陣列芯片技術(shù)的應(yīng)用化問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容
(1)、發(fā)明目的本發(fā)明的目的是提供一種制備和使用成本較低的檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)和活化水平的新方法，便于在普通設(shè)備條件下制備雙鏈核酸分子包被微孔板，依靠用于傳統(tǒng)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)的酶標(biāo)儀、洗板機(jī)等低價(jià)設(shè)備，運(yùn)用成熟的酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)技術(shù)流程實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)和活化水平的高通量檢測(cè)分析。為分子生物學(xué)、功能基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)及生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域中的轉(zhuǎn)錄因子的相關(guān)研究提供一種新的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，促進(jìn)這些領(lǐng)域中轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)的科學(xué)研究，以及針對(duì)轉(zhuǎn)錄因子的臨床檢測(cè)和藥物篩選研究。
(2)、技術(shù)方案本專利提出了一種檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)和活化水平的新技術(shù)。
該技術(shù)經(jīng)過(guò)如下步驟就可以實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子蛋白表達(dá)和活化水平的檢測(cè)分析(a)準(zhǔn)備核酸分子；(b)將核酸分子連接固定到微孔板孔內(nèi)；(c)將轉(zhuǎn)錄因子蛋白與微孔板孵育；(d)將轉(zhuǎn)錄因子蛋白的抗體與微孔板孵育(e)將化學(xué)標(biāo)記轉(zhuǎn)錄因子蛋白抗體的抗體(二抗)與微孔板孵育；(f) 對(duì)化學(xué)標(biāo)記進(jìn)行檢測(cè)分析，反映轉(zhuǎn)錄因子蛋白表達(dá)和活化水平。
以上步驟的技術(shù)思想包括兩個(gè)部分，首先是雙鏈核酸分子包被微孔板的制備，其次是運(yùn)用制備的微孔板檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子蛋白。
雙鏈核酸分子包被微孔板的制備，其技術(shù)思想來(lái)源于我們對(duì)雙鏈DNA微陣列芯片技術(shù)的研究和發(fā)明，以及傳統(tǒng)分子生物學(xué)中運(yùn)用DNA包被的介質(zhì)進(jìn)行DNA結(jié)合蛋白親合層析分離純化的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。制備雙鏈核酸分子包被微孔板的技術(shù)關(guān)鍵是如何將雙鏈核酸分子牢固地連接固定到微孔板孔內(nèi)，使固定的雙鏈核酸分子既保持與液相中轉(zhuǎn)錄因子蛋白的結(jié)合活性，又能夠經(jīng)受檢測(cè)過(guò)程中頻繁的洗滌而不致脫落。
為了使固定的雙鏈核酸分子具有與液相中轉(zhuǎn)錄因子蛋白的結(jié)合活性，要求用于固定的雙鏈核酸分子具有足夠的長(zhǎng)度，特別是雙鏈核酸分子上所嵌合的轉(zhuǎn)錄因子蛋白結(jié)合序列，要與微孔板表面間存在充分的距離，避免微孔板表面對(duì)核酸分子與蛋白質(zhì)的結(jié)合反應(yīng)造成空間障礙(steric hindrance)。用于與微孔板表面連接的核酸分子的一端應(yīng)連接較長(zhǎng)的手臂分子(arm，linker，spacer molecules)，如C12、PEG(Hexaethylene glycol)、等。另外微孔板表面固定的核酸分子密度(density)也要適宜，避免過(guò)密的核酸分子造成蛋白質(zhì)結(jié)合的空間障礙。由于與轉(zhuǎn)錄因子蛋白發(fā)生序列特異性識(shí)別結(jié)合的DNA為雙鏈DNA，因此固定的核酸分子應(yīng)在檢測(cè)的全過(guò)程中維持穩(wěn)定的雙鏈狀態(tài)，避免解鏈喪失活性，為此DNA分子的兩條鏈應(yīng)有足夠的GC含量和長(zhǎng)度，以便雙鏈DNA分子有較高的Tm值，耐受檢測(cè)過(guò)程中一定溫度和鹽濃度環(huán)境而不致解鏈。
為了牢固地將雙鏈核酸分子連接固定到微孔板孔內(nèi)，使其能夠經(jīng)受檢測(cè)過(guò)程中頻繁的洗滌而不致脫落，制備雙鏈核酸分子包被的微孔板時(shí)，應(yīng)對(duì)針對(duì)不同材質(zhì)的微孔板如玻璃底微孔板(glass-bottom microplate)、聚苯乙烯微孔板(polystyrene)、聚乙烯微孔板(polyethylene)、聚丙烯微孔板(polypropylene)，聚碳酸酯微孔板(polycarbonate)等進(jìn)行表面活化處理，如玻璃底微孔板的硅烷化處理、聚苯乙烯及聚乙烯微孔板的紫外線照射(ultravioletirradiation)、低能量多原子離子束照射(Low-Energy Polyatomic Ion Beams)、等離子處理(plasma treatment)、γ射線等物理、化學(xué)處理，使微孔板表面形成特定的反應(yīng)基團(tuán)(reactivegroups)，如氨基(amino)、醛基(aldehyde)、羧基(carboxyl)、羥基(hydroxyl)、硫醇基(thiol)、N-氧琥珀酰亞胺酯(N-oxysuccinimide esters，NOS groups)等。這些反應(yīng)基團(tuán)能夠和化學(xué)修飾在核酸分子末端的相應(yīng)反應(yīng)基團(tuán)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，形成共價(jià)鍵(covalent bond)，如希夫堿(Schiffbase)等，將核酸分子共價(jià)連接固定(immobilizing)在微孔板孔內(nèi)。除了這種共價(jià)連接外，也可以利用鏈親合素包被的微孔板(Streptavidin coated microplate)將生物素(biotinated)標(biāo)記的核酸分子固定到微孔板孔內(nèi)。另外通過(guò)在微孔板孔內(nèi)鋪設(shè)葡聚糖(allyldextran)、瓊脂糖(agarose)、聚丙烯酰胺(polyacrylamide)、親水膠(hydrogel)薄層(monolayer，layer)等手段造就反應(yīng)基團(tuán)，也可以實(shí)現(xiàn)核酸分子的固定。
用于包被微孔板的雙鏈核酸分子，包括多種來(lái)源的核酸分子，可以是固相化學(xué)合成的寡核苷酸或肽核酸分子，也可以是從生物基因中通過(guò)PCR擴(kuò)增制備的DNA片段等。為了將這些核酸分子通過(guò)共價(jià)連接固定在微孔板孔內(nèi)，應(yīng)針對(duì)要包被的微孔板的表面所具有的反應(yīng)基團(tuán)，對(duì)其進(jìn)行相應(yīng)的末端化學(xué)修飾，如在核酸分子末端化學(xué)修飾氨基、硫醇基等。PCR擴(kuò)增制備的DNA片段可以通過(guò)帶特定化學(xué)基團(tuán)的引物進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)實(shí)現(xiàn)標(biāo)記。
在微孔板內(nèi)包被雙鏈核酸分子，可以通過(guò)多種途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)。一般表現(xiàn)為兩種方式，一是首先將帶反應(yīng)基團(tuán)的一條單鏈核酸分子連接固定到微孔板表面，再通過(guò)核酸雜交復(fù)性的手段將另一條堿基序列互補(bǔ)的單鏈核酸分子退火上去，形成固定的雙鏈核酸分子；二是先將兩條堿基序列互補(bǔ)的單鏈核酸分子在液相中復(fù)性，形成雙鏈核酸分子，再將雙鏈核酸分子加入微孔板內(nèi)固定連接。PCR產(chǎn)物可以在擴(kuò)增后直接加入微孔板內(nèi)固定連接或經(jīng)純化更換溶液后再加入微孔板內(nèi)固定連接。此外，也可以先將5′端帶反應(yīng)基團(tuán)而3′端帶一段反向互補(bǔ)序列(reverse complementary sequences)的單鏈核酸分子連接固定在微孔板內(nèi)，再進(jìn)行聚合酶延伸反應(yīng)，形成固定的雙鏈核酸分子。此外，也可以先將5′或3′端帶反應(yīng)基團(tuán)的一條單鏈核酸分子連接固定在微孔板內(nèi)，之后將一寡核苷酸引物復(fù)性上去，再進(jìn)行聚合酶延伸反應(yīng)，形成固定的雙鏈核酸分子。
完成微孔板內(nèi)包被雙鏈核酸分子后，首先要采用適宜的洗滌措施，除去微孔板內(nèi)未通過(guò)化學(xué)鍵連接到微孔板表面的物理吸附的核酸分子，如用2×SSC、0.1％的洗滌液洗滌等。在洗滌除去微孔板內(nèi)未通過(guò)化學(xué)鍵連接到微孔板表面的核酸分子后，還要采用適宜的技術(shù)滅活微孔板表面剩余的反應(yīng)基團(tuán)，避免它們處于活性狀態(tài)，與蛋白質(zhì)分子發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，造成非特異性結(jié)合的假陽(yáng)性結(jié)果，如采用NaBH4溶液滅活醛基、用牛血清白蛋白(Bovine serum albumin，BSA)及Tris溶液滅活N-氧琥珀酰亞胺酯基團(tuán)等。
通過(guò)上述技術(shù)流程，則制備出了可以用于轉(zhuǎn)錄因子蛋白檢測(cè)的雙鏈核酸分子包被的微孔板。微孔板包被的質(zhì)量決定了微孔板檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子蛋白的可靠性。因此制備高質(zhì)量雙鏈核酸分子包被的微孔板是實(shí)現(xiàn)本發(fā)明轉(zhuǎn)錄因子蛋白檢測(cè)功能的關(guān)鍵所在。
制備了雙鏈核酸分子包被的微孔板為本發(fā)明轉(zhuǎn)錄因子蛋白的檢測(cè)提供了工具。利用這種雙鏈核酸分子包被的微孔板檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子蛋白，首先要將含有轉(zhuǎn)錄因子蛋白的細(xì)胞或組織抽提物(cell or tissue extracts)，一般為細(xì)胞核抽提物(nuclear extracts)，與特定化學(xué)物質(zhì)配方的DNA結(jié)合緩沖液(DNA binding buffer)混合，在微孔板外孵育適當(dāng)時(shí)間，再將孵育物加入雙鏈核酸分子包被的微孔板內(nèi)，在適宜溫度下繼續(xù)孵育適當(dāng)時(shí)間，使抽提物中的轉(zhuǎn)錄因子蛋白與包被到微孔板表面雙鏈核酸分子結(jié)合，形成“核酸/蛋白質(zhì)”復(fù)合物(complex)。需要強(qiáng)調(diào)的是，此步反應(yīng)中，應(yīng)在DNA結(jié)合緩沖液中加入適量的非競(jìng)爭(zhēng)性DNA(noncompetitiveDNA)，如鮭魚(yú)精DNA(salmon sperm DNA)、鯡魚(yú)精DNA(herring sperm DNA)、擔(dān)體DNA[poly(dI-dC)、poly(dA-dT)]等，先將“非競(jìng)爭(zhēng)性DNA/抽提物/結(jié)合緩沖液”系統(tǒng)在微孔板外孵育適當(dāng)時(shí)間，才可以加入雙鏈核酸分子包被的微孔板，以防形成非特異性結(jié)合。另外，在細(xì)胞或組織抽提物與微孔板孵育前，可先用封閉劑對(duì)微孔板進(jìn)行封閉處理，如BSA、脫脂奶粉、Denhardt試劑、BLOTTO試劑、商業(yè)化Blocking試劑等，以防形成非特異性結(jié)合和增高背景。轉(zhuǎn)錄因子蛋白與雙鏈核酸分子包被的微孔板的特異性反應(yīng)，可以通過(guò)向結(jié)合體系中摻入過(guò)量的冷探針DNA觀察其對(duì)信號(hào)的影響加以評(píng)判。含有轉(zhuǎn)錄因子蛋白的細(xì)胞或組織抽提物與雙鏈核酸分子包被的微孔板反應(yīng)后，除去反應(yīng)液，再用適宜的洗滌液洗滌微孔板，如含有微量非離子去污劑Tween 20、Triton X-100的馬萊酸緩沖液(maleate buffer)、磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline，PBS)，以除去非特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)。
含有轉(zhuǎn)錄因子蛋白的細(xì)胞或組織抽提物與雙鏈核酸分子包被的微孔板孵育反應(yīng)并充分洗滌后，將轉(zhuǎn)錄因子蛋白抗體按適宜濃度稀釋到PBS或Blocking溶液中，加入微孔板孵育一定時(shí)間，使抗體與微孔板中DNA捕獲的轉(zhuǎn)錄因子蛋白發(fā)生抗原/抗體結(jié)合反應(yīng)，形成“DNA/轉(zhuǎn)錄因子蛋白/抗體”復(fù)合物。轉(zhuǎn)錄因子蛋白抗體包括能與待檢轉(zhuǎn)錄因子蛋白發(fā)生特異性結(jié)合的單抗、雙抗及肽段，一般最好為單克隆抗體，以保證檢測(cè)的特異性。轉(zhuǎn)錄因子蛋白抗體與微孔板孵育反應(yīng)后，除去反應(yīng)液，再用適宜的洗滌液洗滌微孔板，如含有微量非離子去污劑Tween 20、Triton X-100的馬萊酸緩沖液(maleate buffer)、磷酸緩沖鹽溶液(phosphate bufferedsaline，PBS)，以除去非特異性結(jié)合的抗體。
轉(zhuǎn)錄因子蛋白抗體與雙鏈核酸分子包被的微孔板孵育反應(yīng)并充分洗滌后，將化學(xué)標(biāo)記的轉(zhuǎn)錄因子蛋白抗體的抗體(二抗)按適宜濃度稀釋到PBS或Blocking溶液中，加入微孔板孵育一定時(shí)間，使二抗與微孔板中的“DNA/轉(zhuǎn)錄因子蛋白/抗體”復(fù)合物發(fā)生特異性結(jié)合，形成“DNA/轉(zhuǎn)錄因子蛋白/抗體/二抗-標(biāo)記物”復(fù)合物。轉(zhuǎn)錄因子蛋白的二抗除了IgG等抗體分子外，也可以是蛋白A(Protein A)等可與轉(zhuǎn)錄因子蛋白抗體發(fā)生特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)、肽段等。轉(zhuǎn)錄因子蛋白二抗的化學(xué)標(biāo)記，為各種有利于對(duì)其檢測(cè)分析的化學(xué)標(biāo)記，如堿性磷酸酶(Alkaline Phosphatase，AP)、過(guò)氧化物酶(Peroxidase)等酶，也可以是熒光素分子標(biāo)記，如FAM、FITC(Fluoresceinisothiocyanat)、Cy3、Cy5、綠色熒光蛋白(GFP)等。一般情況下，為降低實(shí)驗(yàn)成本和提高檢測(cè)的靈敏性，轉(zhuǎn)錄因子蛋白二抗最好用堿性磷酸酶、過(guò)氧化物酶等酶標(biāo)記。轉(zhuǎn)錄因子蛋白二抗與微孔板孵育反應(yīng)后，除去反應(yīng)液，再用適宜的洗滌液洗滌微孔板，如含有微量非離子去污劑Tween 20、Triton X-100的馬萊酸緩沖液(maleate buffer)、磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer salt solution，PBS)，以除去非特異性結(jié)合的二抗。
轉(zhuǎn)錄因子蛋白二抗與雙鏈核酸分子包被的微孔板孵育反應(yīng)并充分洗滌后，依據(jù)二抗的化學(xué)標(biāo)記種類和性質(zhì)，進(jìn)行相應(yīng)的檢測(cè)。例如，二抗用熒光素分子標(biāo)記標(biāo)記時(shí)，可以直接對(duì)微孔板進(jìn)行熒光檢測(cè)。一般情況下，轉(zhuǎn)錄因子蛋白二抗用堿性磷酸酶、過(guò)氧化物酶等酶標(biāo)記，此時(shí)，向微孔板中加入酶反應(yīng)底物(developing substrate，developing solution)。通常采用化學(xué)生色(colorimetric)或發(fā)光(chemiluminescent)技術(shù)進(jìn)行信號(hào)檢測(cè)，化學(xué)生色試劑如BCIP(5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate)、BCIP/INT[2-(4-iodophenyl)-5-(4-nitrophenyl)-3-phenyltetrazolium chloride]、BCIP/NBT、BCIP/TNBT(5-bromo-4-chloro-3-indoxylphosphate/tetranitroblue tetrazolium)、NBT(4-Nitroblue tetrazolium chloride)、pNPP(p-Nitrophenyl phosphate)、ABTS(2，2′-AZINO-bis[3-ethylbenziazoline-6-sulfonic acid])、FastRED、TMB(3，3′，5，5′-tetramethylbenzidine)等，化學(xué)發(fā)光試劑如CDP-Star、CSPD、LumiGLO、POD等。根據(jù)二抗的不同的化學(xué)標(biāo)記種類和性質(zhì)，選擇相應(yīng)的檢測(cè)儀器，如化學(xué)生色標(biāo)記可以采用酶標(biāo)儀(如SUNRISE酶標(biāo)儀)進(jìn)行檢測(cè)分析，化學(xué)發(fā)光標(biāo)記可以采用帶化學(xué)發(fā)光檢測(cè)功能的凝膠成相系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)分析(3)、技術(shù)效果轉(zhuǎn)錄因子蛋白因負(fù)責(zé)基因表達(dá)的調(diào)控成為目前基因組和蛋白組研究所重視的一類重要蛋白質(zhì)，而且許多疾病與轉(zhuǎn)錄因子異常表達(dá)及活化間存在的密的關(guān)系，引起了生物醫(yī)藥領(lǐng)域?qū)D(zhuǎn)錄因子研究的關(guān)注，轉(zhuǎn)錄因子已經(jīng)成為轉(zhuǎn)錄治療和藥物研究的重要靶點(diǎn)。在這些背景下，有關(guān)轉(zhuǎn)錄因子功能檢測(cè)及分析的技術(shù)研究受到科學(xué)界的重視。多種基于DNA/蛋白質(zhì)相互作用這一層次的轉(zhuǎn)錄因子檢測(cè)分析技術(shù)得到發(fā)展，如電泳遷移率變動(dòng)分析。這一技術(shù)及相關(guān)的改進(jìn)技術(shù)目前雖然有效地用于轉(zhuǎn)錄因子的檢測(cè)分析，但它們存在放射性標(biāo)記對(duì)實(shí)驗(yàn)人員及環(huán)境危害的缺陷、對(duì)實(shí)驗(yàn)樣品數(shù)量需求大、實(shí)驗(yàn)耗時(shí)長(zhǎng)、分析效率低及難以高通量化獲取生物等缺陷。為了建立從技術(shù)思想角度上完全不同于凝膠遷移實(shí)驗(yàn)的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)及活化檢測(cè)及分析技術(shù)，我們已經(jīng)進(jìn)行了諸多相關(guān)研究，并發(fā)展了一些新的技術(shù)。其中，最重要的是利用基因芯片技術(shù)的策略，將含有轉(zhuǎn)錄因子蛋白結(jié)合位點(diǎn)的雙鏈DNA固定到固相載體如玻片表面，制備雙鏈DNA微陣列芯片，用于轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)及活化的檢測(cè)及分析(中國(guó)專利ZL02112780.8，02137945.9，03152881.3，03132206.9)，并將這些技術(shù)用于從復(fù)雜組分物質(zhì)如中藥和組合化學(xué)混合物中高通量篩選、捕獲和分離目標(biāo)分子(中國(guó)專利03152882.1)。
但我們注意到這些技術(shù)目前的推廣應(yīng)用仍然面臨很大的困難，特別是價(jià)值昂貴的芯片制備和信號(hào)獲取設(shè)備，極大地限制了雙鏈DNA微陣列芯片技術(shù)的商業(yè)化。因此，我們采用本發(fā)明提出的技術(shù)對(duì)雙鏈DNA微陣列芯片技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)，即將DNA固相化技術(shù)與傳統(tǒng)的微孔板酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)技術(shù)結(jié)合在一起，提出了“雙鏈核酸分子包被微孔板檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子蛋白”的技術(shù)。這一技術(shù)將雙鏈DNA微陣列芯片技術(shù)中的DNA固定介質(zhì)有玻片改為常用于進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)的微孔板，檢測(cè)儀器自然由昂貴的基因芯片掃描裝置改變?yōu)槌杀镜土拿笜?biāo)儀等。這一改進(jìn)，保持了雙鏈DNA微陣列芯片技術(shù)的高通量分析功能，但極大地降低了制備和使用成本，能夠很好地解決我們建立的雙鏈DNA微陣列芯片技術(shù)的應(yīng)用化問(wèn)題。
本發(fā)明提供了一種制備和使用成本較低的檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)和活化水平的新方法，便于在普通設(shè)備條件下制備雙鏈核酸分子包被微孔板，依靠用于傳統(tǒng)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)的酶標(biāo)儀、洗板機(jī)等低價(jià)設(shè)備，運(yùn)用成熟的酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)技術(shù)流程實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)和活化水平的高通量檢測(cè)分析。我們的研究及產(chǎn)品研發(fā)實(shí)驗(yàn)說(shuō)明，在普通實(shí)驗(yàn)設(shè)備條件下，使用較小的資金消耗，就可以實(shí)現(xiàn)雙鏈核酸分子包被微孔板、轉(zhuǎn)錄因子蛋白及抗體的制備等重要生產(chǎn)，出產(chǎn)出可投入到科研、醫(yī)療等產(chǎn)品應(yīng)用場(chǎng)所所能夠使用的雙鏈核酸分子包被微孔板試劑盒。質(zhì)量檢測(cè)和分析表明，雙鏈核酸分子包被微孔板試劑盒可穩(wěn)定可靠地用于在短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)對(duì)轉(zhuǎn)錄因子蛋白的表達(dá)、活化及其與DNA相互作用的檢測(cè)分析。因此，該技術(shù)將為分子生物學(xué)、功能基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等領(lǐng)域中的轉(zhuǎn)錄因子的相關(guān)研究提供一種新的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，促進(jìn)這些領(lǐng)域中轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)的科學(xué)研究。
需要特別說(shuō)明的是，我們利用本發(fā)明專利技術(shù)生產(chǎn)的雙鏈核酸分子包被微孔板試劑盒，將在臨床輔助診斷和生物醫(yī)學(xué)中針對(duì)轉(zhuǎn)錄因子的藥物篩選研究具有非常重要的應(yīng)用價(jià)值。例如，轉(zhuǎn)錄因子p53、NF-kB的表達(dá)及活化異常，在許多疾病中發(fā)揮的重要作用，因此成為臨床診斷中觀測(cè)的重要靶點(diǎn)，同時(shí)也是轉(zhuǎn)錄治療和藥物篩選重要靶點(diǎn)。我們目前已經(jīng)著手申報(bào)該產(chǎn)品的藥證及建立系統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄治療藥物篩選體系，促進(jìn)產(chǎn)品的商業(yè)化應(yīng)用。
四

圖1雙鏈核酸分子包被微孔板及檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子蛋白實(shí)驗(yàn)流程注解PBS蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)(Protein Binding Site)PB蛋白質(zhì)結(jié)合(Protein Binding)PAB初級(jí)抗體結(jié)合(Primary Antibody Binding)SAB二級(jí)抗體結(jié)合(Secondary Antibody Binding)DS檢測(cè)溶液(Developing Solution)S掃描(Scanning)圖2雙鏈核酸分子包被微孔板檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子蛋白結(jié)果示例圖注解列1不連接DNA但不加蛋白質(zhì)的BluePhosMicrowell Phosphatase SubstrateSystem生色檢測(cè)結(jié)果列2連接DNA但不加蛋白質(zhì)的BluePhosMicrowellPhosphatase Substrate System生色檢測(cè)結(jié)果列3連接DNA并加蛋白質(zhì)的BluePhosMicrowell Phosphatase Substrate System生色檢測(cè)結(jié)果該示例圖為本說(shuō)明書(shū)第五項(xiàng)具體實(shí)施方式
中3的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
五具體實(shí)施例方式
此處僅以制備雙鏈核酸分子包被微孔板及檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子蛋白NF-κB的實(shí)驗(yàn)，示例說(shuō)明本發(fā)明專利的具體實(shí)施方式
。
1、雙鏈核酸分子的設(shè)計(jì)及化學(xué)合成NF-κB(Nuclear Factor kappaB)是一類序列特異性轉(zhuǎn)錄因子，當(dāng)細(xì)胞受到炎癥介質(zhì)、病毒感染、氧化應(yīng)激等多種物質(zhì)刺激后，NF-κB在胞質(zhì)內(nèi)被激活，進(jìn)入細(xì)胞核與病毒、細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞粘附分子、急性相反應(yīng)蛋白、酶等基因增強(qiáng)子序列結(jié)合，增強(qiáng)基因轉(zhuǎn)錄；因而在一系列由細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)及蛋白酶類參與的疾病的發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮重要作用。大量研究表明NF-κB過(guò)度活化與炎癥、血管疾病、腫瘤、病毒感染、腦血管疾病、阿爾茨海默病、帕金森氏病、過(guò)敏性腦炎、感染性休克、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、支氣管哮喘、動(dòng)脈粥樣硬化、潰瘍性結(jié)腸炎等病理過(guò)程存在非常密切的關(guān)系。目前，NF-κB已成為新藥開(kāi)發(fā)的重要靶點(diǎn)，許多生物和生化抑制劑能夠阻斷NF-κB信號(hào)通路或抑制NF-κB/DNA結(jié)合，從而有助于NF-κB相關(guān)疾病的治療。
NF-κB是由RelA/p65、RelB、c-Rel、NF-κB1/p50和NF-κB2/p52五種蛋白構(gòu)成的一個(gè)蛋白家族，五種蛋白間可以形成同二聚體(homodimer)或異二聚體(heterodimer)，與基因組DNA中的共同基序(consensus)DNA序列發(fā)生序列特異性識(shí)別結(jié)合，調(diào)控今音的表達(dá)?；蚪M中與NF-κB結(jié)合的共同基序DNA序列表達(dá)一般為5′-GGGACTTTCC-3′。因此，設(shè)計(jì)和制備用于檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的雙鏈核酸分子包被微孔板時(shí)，所準(zhǔn)備的雙鏈核酸分子上必須含有NF-κB結(jié)合的共同基序DNA序列，此處我們使用最常見(jiàn)的5′-GGGACTTTCC-3′位點(diǎn)。
我們?cè)O(shè)計(jì)并由中國(guó)上海博亞生物技術(shù)有限公司合成如下兩條堿基序列反向互補(bǔ)的寡核苷酸，用于包被微孔板NF-κB-NH25′...NH2-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC...3′NF-κB-NC3′...TCAACTCCCCTGAAAGGGTCCG...5′將寡核苷酸NF-κB-NH2以100μM濃度溶解在寡核苷酸結(jié)合緩沖液(50mM Na3PO4，pH8.5，1mM EDTA)中，將寡核苷酸NF-κB-NC以50nM濃度溶解在標(biāo)準(zhǔn)雜交液(5×SSC，0.02％SDS，0.1％N-lauroylsarcosine，1×blocking solution，其中blocking solution為Roche產(chǎn)品，Cat.No.1096176)中。
2、雙鏈核酸分子包被微孔板的制備我們選用Coming Costar公司生產(chǎn)的DNA-BINDTM透明聚苯乙烯96微孔板(DNA-BINDTMclear 96 well polystyrene microplate，Cat.No.2505，Coming Costar)來(lái)制備雙鏈核酸分子包被的微孔板。該類聚苯乙烯96微孔板表面已經(jīng)包備了一層反應(yīng)性N-氧琥珀酰亞胺酯(N-oxysuccinimide esters，NOS groups)基團(tuán)，即NOS基團(tuán)。NOS基團(tuán)被共價(jià)連接在聚苯乙烯微孔板表面，可與α-氨基(primary amino)等親核基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)，從而將氨基末端修飾的DNA分子共價(jià)連接到聚苯乙烯微孔板表面。其反應(yīng)程式如下具體操作中，將100μM濃度溶解在寡核苷酸結(jié)合緩沖液中的寡核苷酸NF-κB-NH2再用寡核苷酸結(jié)合緩沖液稀釋到DNA濃度為1pmol/μl，再將稀釋后的DNA溶液以每孔100μl的體積加入DNA-BINDTM聚苯乙烯96微孔板中。將微孔板在4℃冰箱孵育過(guò)夜。
次日從4℃冰箱中取出微孔板，吸去DNA溶液，用馬萊酸緩沖液(100mM maleate，150mMNaCl，pH7.5)洗滌微孔板3次，除去未藕聯(lián)(coupled)的DNA。
向微孔板中加入200μl含有3％BSA的寡核苷酸結(jié)合緩沖液，37℃孵育30分鐘，再吸干溶液。該步處理的目的在于封閉微孔板表面未反應(yīng)的活性基團(tuán)。
微孔板封閉處理后，每孔內(nèi)加入100μl溶解在標(biāo)準(zhǔn)雜交液中的寡核苷酸NF-κB-NC，56℃孵育60分鐘。吸干雜交液，用56℃預(yù)熱的2×SSC，0.1％SDS溶液洗滌微孔板兩次，并浸泡5分鐘，吸干溶液。
至此，則制備好了可用于檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的雙鏈核酸分子包被微孔板。包被好的微孔板應(yīng)密閉保存在4℃冰箱。
3、用雙鏈核酸分子包被微孔板檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子NF-κB(純蛋白)向上面制備的雙鏈核酸分子包被微孔板中加入200μl 1×blocking溶液(Cat.No.1096176，Roche)。37℃孵育30分鐘，再吸干溶液。
將轉(zhuǎn)錄因子NF-κB蛋白[rhNF-κB(p50)，Cat.No.E3770，Promega)]以不同的濃度稀釋在DNA結(jié)合緩沖液(10mM HEPES pH7.9，50mM KCl，2.5mM DTT，0.1mM EDTA，0.05％NP-40，10％Glycerol，5％fetal bovine serum)中，37℃孵育10分鐘后，以每孔100μl的體積加入雙鏈核酸分子包被微孔板中，37℃繼續(xù)孵育50分鐘。吸干DNA結(jié)合緩沖液，用含0.3％Tween20的馬萊酸緩沖液洗滌微孔板2次，每次10分鐘。
將轉(zhuǎn)錄因子NF-κB蛋白的抗體(NF-kB p50 antibodyRabbit polyclonal to Fib p50 N-terminusof the human protein，Cat.No.ab7549，abcam)以1∶1500的濃度稀釋在1×blocking溶液(Cat.No.1096176，Roche)中，以每孔100μl的體積加入轉(zhuǎn)錄因子NF-κB蛋白結(jié)合過(guò)的微孔板中，37℃孵育60分鐘。吸干抗體溶液，用含0.3％Tween 20的馬萊酸緩沖液洗滌微孔板2次，每次10分鐘。
將堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗(Rabbit IgG antibody，Cat.No.ab6722，abcam)以1∶2000的濃度稀釋在1×blocking溶液(Cat.No.1096176，Roche)中，以每孔100μl的體積加入轉(zhuǎn)錄因子NF-κB蛋白結(jié)合過(guò)的微孔板中，37℃孵育60分鐘。吸干抗體溶液，用含0.3％Tween 20的馬萊酸緩沖液洗滌微孔板2次，每次10分鐘。
將堿性磷酸酶化學(xué)生色底物(BluePhosMicrowell Phosphatase Substrate System，Cat.No.50-88-00，KPL)室溫預(yù)熱(SolutionA，Solution B)，按實(shí)驗(yàn)所需量等量混合SolutionA和SolutionB，混勻后以每孔100μl的體積加入二抗結(jié)合過(guò)的微孔板中，室溫孵育適宜時(shí)間。加入100μl2.5％的EDTA溶液，終止顯色反應(yīng)。
將終止顯色反應(yīng)的微孔板置入SUNRISE酶標(biāo)儀(TECAN)，在602nm波長(zhǎng)下讀取吸光值。依據(jù)蛋白梯度和吸光值制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。
4、用雙鏈核酸分子包被微孔板檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子NF-κB(核抽提物)向上面制備的雙鏈核酸分子包被微孔板中加入200μl 1×blocking溶液(Cat.No.1096176，Roche)。37℃孵育30分鐘，再吸干溶液。
將5-10μg含有轉(zhuǎn)錄因子NF-κB蛋白的核抽提物(HeLa Nuclear Extract，TNF-α-stimulated，20min)稀釋在DNA結(jié)合緩沖液[10mM HEPES pH7.9，50mM KCl，2.5mM DTT，0.1mM EDTA，0.05％NP-40，10％Glycerol，5％fetal bovine serum，0.05mg/ml poly(dI-dC)]中，37℃孵育10分鐘后，以每孔100μl的體積加入雙鏈核酸分子包被微孔板中，37℃繼續(xù)孵育50分鐘。吸干DNA結(jié)合緩沖液，用含0.3％Tween 20的馬萊酸緩沖液洗滌微孔板2次，每次10分鐘。
將轉(zhuǎn)錄因子NF-κB蛋白的抗體(NF-kB p50 antibodyRabbit polyclonal to Fib p50 N-terminusof the human protein，abcam)以1∶1500的濃度稀釋在1×blocking溶液(Cat.No.1096176，Roche)中，以每孔100μl的體積加入轉(zhuǎn)錄因子NF-κB蛋白結(jié)合過(guò)的微孔板中，37℃孵育60分鐘。吸干抗體溶液，用含0.3％Tween 20的馬萊酸緩沖液洗滌微孔板2次，每次10分鐘。
將堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗(Rabbit IgG antibody，ab6722，abcam)以1∶2000的濃度稀釋在1×blocking溶液(Roche)中，以每孔100μl的體積加入轉(zhuǎn)錄因子NF-κB蛋白結(jié)合過(guò)的微孔板中，37℃孵育60分鐘。吸干抗體溶液，用含0.3％Tween 20的馬萊酸緩沖液洗滌微孔板2次，每次10分鐘。
將堿性磷酸酶化學(xué)生色底物(BluePhosMicrowell Phosphatase Substrate System，50-88-00，KPL)室溫預(yù)熱(Solution A，Solution B)，按實(shí)驗(yàn)所需量等量混合Solution A和SolutionB，混勻后以每孔100μl的體積加入二抗結(jié)合過(guò)的微孔板中，室溫孵育適宜時(shí)間。加入100μl2.5％的EDTA溶液，終止顯色反應(yīng)。
將終止顯色反應(yīng)的微孔板置入SUNRISE酶標(biāo)儀(TECAN)，在602nm波長(zhǎng)下讀取吸光值。依據(jù)蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量。
權(quán)利要求
1.雙鏈核酸分子包被微孔板檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子蛋白，提出了一種檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)和活化水平的新方法，其特征在于運(yùn)用該方法分析轉(zhuǎn)錄因子蛋白表達(dá)和活化水平包括如下步驟(a)準(zhǔn)備核酸分子；(b)將核酸分子連接固定到微孔板孔內(nèi)；(c)將轉(zhuǎn)錄因子蛋白與微孔板孵育；(d)將轉(zhuǎn)錄因子蛋白的抗體與微孔板孵育；(e)將化學(xué)標(biāo)記轉(zhuǎn)錄因子蛋白抗體的抗體(二抗)與微孔板孵育；(f)對(duì)化學(xué)標(biāo)記進(jìn)行檢測(cè)分析，反映轉(zhuǎn)錄因子蛋白表達(dá)和活化水平。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙鏈核酸分子包被微孔板檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子蛋白，其特征在于步驟(a)中準(zhǔn)備的核酸分子，包括化學(xué)合成的寡核苷酸和來(lái)自生物基因組的核酸分子；
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙鏈核酸分子包被微孔板檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子蛋白，其特征在于步驟(a)中準(zhǔn)備的核酸分子，為兩條堿基序列反向互補(bǔ)的核酸分子，其中至少一條核酸分子的末端依據(jù)微孔板表面的化學(xué)基團(tuán)進(jìn)行了相應(yīng)的化學(xué)修飾，以便將準(zhǔn)備的核酸分子通過(guò)化學(xué)反應(yīng)連接固定到微孔板表面；
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙鏈核酸分子包被微孔板檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子蛋白，其特征在于步驟(a)中準(zhǔn)備的核酸分子，其序列中含有轉(zhuǎn)錄因子蛋白可識(shí)別并與之結(jié)合的核苷酸序列；
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙鏈核酸分子包被微孔板檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子蛋白，其特征在于步驟(b)中所用于連接固定核酸分子的微孔板，包括各種類型和材料的微孔板，并且為便于將核酸分子連接固定到微孔板孔內(nèi)，對(duì)微孔板進(jìn)行了物理或化學(xué)處理，使微孔板表面帶有某種化學(xué)基團(tuán)；
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙鏈核酸分子包被微孔板檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子蛋白，其特征在于步驟(b)中將核酸分子連接固定到微孔板孔內(nèi)的過(guò)程，是核酸分子末端所修飾的化學(xué)基團(tuán)與微孔板表面修飾的化學(xué)基團(tuán)間發(fā)生的化學(xué)反應(yīng)，將核酸分子牢固地固定到微孔板表面；
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙鏈核酸分子包被微孔板檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子蛋白，其特征在于步驟(c)中與微孔板孵育的轉(zhuǎn)錄因子蛋白，為各種來(lái)源的轉(zhuǎn)錄因子蛋白，包括人工表達(dá)制備的轉(zhuǎn)錄因子蛋白、從細(xì)胞或組織裂解物中分離純化的轉(zhuǎn)錄因子蛋白、含有轉(zhuǎn)錄因子蛋白的細(xì)胞或組織抽提物；
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙鏈核酸分子包被微孔板檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子蛋白，其特征在于步驟(c)中轉(zhuǎn)錄因子蛋白與微孔板的孵育，是轉(zhuǎn)錄因子蛋白與微孔板表面固定的核酸分子間特異性識(shí)別并結(jié)合的過(guò)程；
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙鏈核酸分子包被微孔板檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子蛋白，其特征在于步驟(d)中轉(zhuǎn)錄因子蛋白的抗體，包括與轉(zhuǎn)錄因子蛋白可特異性識(shí)別結(jié)合的單克隆抗體、多克隆抗體和合成肽分子；
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙鏈核酸分子包被微孔板檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子蛋白，其特征在于步驟(d)中轉(zhuǎn)錄因子蛋白的抗體，可對(duì)其進(jìn)行化學(xué)修飾或改造；
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙鏈核酸分子包被微孔板檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子蛋白，其特征在于步驟(d)中轉(zhuǎn)錄因子蛋白的抗體與微孔板的孵育，是轉(zhuǎn)錄因子蛋白抗體與微孔板表面核酸分子在步驟(c)所捕獲的轉(zhuǎn)錄因子蛋白間的特異性識(shí)別并結(jié)合的過(guò)程；
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的轉(zhuǎn)錄因子蛋白抗體的化學(xué)修飾或改造，其特征在于使用這樣處理的轉(zhuǎn)錄因子蛋白抗體，則可省略步驟(e)，而直接進(jìn)行步驟(f)，就可以反映轉(zhuǎn)錄因子蛋白表達(dá)和活化水平；
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙鏈核酸分子包被微孔板檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子蛋白，其特征在于步驟(e)中轉(zhuǎn)錄因子蛋白抗體的抗體(二抗)的化學(xué)標(biāo)記，為各種有利于對(duì)其檢測(cè)分析的化學(xué)標(biāo)記，包括堿性磷酸酶、過(guò)氧化物酶等生物化學(xué)標(biāo)記等；
14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙鏈核酸分子包被微孔板檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子蛋白，其特征在于步驟(e)中轉(zhuǎn)錄因子蛋白抗體的抗體(二抗)與微孔板的孵育，是轉(zhuǎn)錄因子蛋白二抗與步驟(d)結(jié)合在轉(zhuǎn)錄因子蛋白上的抗體之間的特異性識(shí)別并結(jié)合的過(guò)程；
15.根據(jù)權(quán)利要求1所述檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)和活化水平的新方法，其特征在于步驟(f)中對(duì)化學(xué)標(biāo)記進(jìn)行的檢測(cè)分析，包括生化發(fā)色和生物發(fā)光等檢測(cè)手段，化學(xué)標(biāo)記的檢測(cè)分析結(jié)果間接地反映轉(zhuǎn)錄因子蛋白表達(dá)和活化水平。
全文摘要
轉(zhuǎn)錄因子是生物蛋白質(zhì)組中一類負(fù)責(zé)基因表達(dá)調(diào)控的重要蛋白質(zhì)，是基因表達(dá)調(diào)控通路及網(wǎng)絡(luò)的樞紐，是功能基因組和蛋白質(zhì)組研究的重要對(duì)象；許多疾病都與轉(zhuǎn)錄因子的異常表達(dá)及活化存在密切的關(guān)系，成為轉(zhuǎn)錄治療和藥物研究的重要靶點(diǎn)。轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)及活化程度的檢測(cè)分析是研究其功能的主要手段。本發(fā)明“雙鏈核酸分子包被微孔板檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子蛋白”提出了一種檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)和活化水平的新方法。運(yùn)用該方法分析轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)和活化水平包括如下步驟(a)準(zhǔn)備核酸分子；(b)將核酸分子連接固定到微孔板孔內(nèi)；(c)含轉(zhuǎn)錄因子的細(xì)胞或組織抽提物與微孔板孵育；(d)轉(zhuǎn)錄因子抗體與微孔板孵育；(e)化學(xué)標(biāo)記轉(zhuǎn)錄因子二抗與微孔板孵育；(f)對(duì)化學(xué)標(biāo)記檢測(cè)分析。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1721548SQ20041004140
公開(kāi)日2006年1月18日 申請(qǐng)日期2004年7月16日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月16日
發(fā)明者王進(jìn)科 申請(qǐng)人:王進(jìn)科, 南京新益華集團(tuán)有限公司