專利名稱：生產用于預防嬰幼兒腹瀉的轉基因植物材料的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及表達人源輪狀病毒外殼蛋白轉基因植物的生產方法，并進而通過直接食用或腸道給藥方式利用這些含有人源輪狀病毒外殼蛋白的轉基因植物及其衍生物從而引起人或哺乳動物對該抗原蛋白的免疫應答反應。
背景技術：
人源輪狀病毒(human rotavirus，HRV)導致嬰幼兒腹瀉的主要病因，也是第三世界國家中兒童死亡率最高的疾病(1998年世界衛(wèi)生統(tǒng)計報告)。HRV在世界各地傳播，每年約有近百萬兒童死于RV腹瀉，在我國初步的資料表明每年也有約10萬。衛(wèi)生措施似乎對RV的傳播影響甚小，營養(yǎng)狀況對發(fā)病危險的重要性也遠低于細菌性腹瀉，因為無論發(fā)達國家或是發(fā)展中國家，3歲前的嬰兒約有90％都要受RV感染，輕者表現(xiàn)為自限性的輕度水樣便，重者可出現(xiàn)發(fā)熱、嘔吐及嚴重腹瀉，進而導致脫水、電解質紊亂和酸中毒，甚至死亡。資料顯示，由于輪狀病毒所帶來的社會負擔和社會費用是驚人的。僅在美國，每年因此增加500,000門診次數和50,000住院治療次數，直接醫(yī)療費用為2.64億美元，總社會費用超過10億美元。另外，迄今尚無治療RV的特效藥物，因此預防顯得極為重要。為此，世界衛(wèi)生組織多次呼吁各國科學家研制開發(fā)有效的輪狀病毒疫苗，指出只有疫苗預防接種才是遏制輪狀病毒腹瀉唯一有效的手段。
近年來輪狀病毒疫苗的研究策略有兩種途徑一種是研制減毒活疫苗，另一種是亞單位疫苗。前者是用G1～G4型病毒共同感染培養(yǎng)細胞，在一定選擇壓力下挑選出合適的疫苗候選株。目前僅有美國(1998年)和我國(2000年)獲準用于臨床。但其活疫苗的穩(wěn)定性以及由于病毒毒力回復帶來的安全性問題是減毒活疫苗面臨的本質上的缺陷，如美國的恒河猴輪狀病毒疫苗(RRV)就因健康兒童接種該疫苗后屢屢出現(xiàn)腸套疊問題而禁用，而且其價格偏高(如RRV疫苗需120美元)，因而大大地限制了該疫苗的推廣、普及。如何保證其安全性并降低成本成為其問題的關鍵。亞單位疫苗的研制策略是運用基因工程方法進行輪狀病毒重組多肽疫苗的研究，目前尚沒有成功應用于臨床的先例。況且，通過重組細胞培養(yǎng)系統(tǒng)生產的疫苗，因需要發(fā)酵、純化技術，使其設備復雜、成本高，目前生產的疫苗也遠不能滿足全球免疫計劃的需要。因此，如何使狀病毒疫苗更為安全、經濟、有效和更容易推廣使用將是今后各國研究的主要方向。
輪狀病毒屬呼腸弧病毒家族成員，病毒具分段的雙股RNA，含11個基因片斷。除基因11可編碼2種不同的蛋白外，每一基因片斷可分別編碼一種單一的蛋白。對輪狀病毒病毒粒體結構組成的研究表明，其包膜蛋白主要有三種，依據編碼基因的不同，分別稱為VP4、VP7和VP6(1)。
第一層外層為表面蛋白VP4形成的60個刺突狀結構向外突出，VP4即病毒血凝素，是病毒毒力的重要決定簇，病毒借以能侵入腸壁細胞。第一層內層為VP7(由基因9表達的蛋白)形成平滑的波浪形，其成分占病毒表面蛋白的30％。在此層上裂開形成132個直接通達核心的孔，以供病毒與外界傳遞信息。VP7是一種高糖蛋白，為病毒確定亞型的依據。第二層是由VP6形成的三聚體，VP6約占病毒顆粒重量的一半，為病毒組和亞組確定的依據。
早在1985年，Hoshino等人發(fā)現(xiàn)VP7是主要中和性抗原，隨后的重組輪狀病毒活疫苗正是基于這一點，選擇僅VP7被人源輪狀病毒替換的重配株，均具有較好的保護力。Anderew等人分別在1990年和1992年證實經過改造的VP7基因在重組痘苗病毒中表達，具有與相同感染滴度的SA11活病毒相當。而且其保護性免疫力可遺傳給下一代幼鼠。Wang等人1999年將豬源輪狀病毒VP7基因改造后在大腸桿菌中表達，也具有很好的中和病毒能力，何金生等人2001年以腺病毒表達人源輪狀病毒VP7免疫小鼠，產生較強的體液和粘膜免疫應答(已申請國內專利，申請?zhí)朇N 02104125.3)，次年彭世勇等人用pCI分別進行VP7、VP4和VP6基因的DNA疫苗研究，結果僅VP7誘導最強的免疫應答；其次，VP7基因是高度保守的，在相同血清型其同源性可高達94-99％，不同血清型其同源性也可高達67-85％，因而具有較寬的疫苗保護性范圍。上述研究表明輪狀病毒的外殼蛋白VP7是主要中和性抗原，在誘導機體產生體液和粘膜免疫應答、產生保護性免疫方面起決定性作用。從而為下一步制備高效輪狀病毒疫苗提供了理論和實踐依據。
絕大多數的人類病原體，是通過與粘膜表面相互作用而引起疾病的。通過這種機制起作用的細菌和病毒病原體，首先與粘膜表面接觸，它們能夠在粘膜表面粘附和克隆，或者由位于覆蓋派氏集合淋巴結和其它淋巴濾泡的上皮中的專門吸收細胞(M細胞)所吸收。當抗原傳輸到濾泡內的免疫細胞時(例如輪狀病毒)，在淋巴濾泡內可能很容易殺傷進入淋巴組織的病原體，從而激發(fā)一個潛在的保護性免疫應答。換句話說，能夠幸免于局部防御機制的病原微生物，則可能自淋巴濾泡播散，隨后引起局部的或全身性疾病(例如在免疫受損宿主中的沙門氏菌屬和脊髓灰質炎病毒。)。機體受到病原侵染后會產生免疫應答的過程至少涉及以下三種免疫機制之一粘膜、體液或細胞。粘膜免疫應答產生分泌型抗體IgA(sIgA)，sIgA通過阻止粘附和/或克隆、中和表面活性毒素或防止入侵宿主細胞，可以防止病原體與粘膜表面的最初相互作用，從而保護呼吸道、消化道、生殖系統(tǒng)和腺體表面不受侵染。粘膜抗體可阻止病原在粘膜表面定居從而構成第一道防御屏障。粘膜抗體的產生可通過分泌性腺體和組織的局部免疫而獲得，也可通過刺激腸道和呼吸道淋巴組織產生。
腸胃外注射滅活的整個細胞和整個病毒標本，在誘發(fā)抵抗病原體的保護性血清IgG和遲發(fā)性超敏反應中是有效的，在這些病原體的發(fā)病機理中有明顯的血清階段(例如傷寒沙門氏菌，乙型肝炎)。然而，腸胃外疫苗在誘發(fā)粘膜的sIgA應答時無效，并且對與粘膜表面相互作用但不入侵粘膜的細胞亦無效(例如，輪狀病毒)。
一旦抗原被提呈到派氏集合淋結內的T-淋巴細胞、B-淋巴細胞以及輔助細胞，口服途徑給藥的疫苗就能有效地誘導特異的sIgA應答，在派氏集合淋巴結內，首先啟動優(yōu)先的IgAB-細胞發(fā)育。派氏集合淋巴結包含輔助T-(TH)細胞，它能介導B-細胞同型直接從IgM細胞轉向IgA細胞。然后，B-細胞遷移至腸系膜淋巴結并且進行胸導管及全身循環(huán)，隨后種植在體內所有的內分泌組織中，包括消化道和呼吸道的固有層。然后成熟的漿細胞產生IgA，與膜結合的分泌成分形成復合體，隨后被運輸到粘膜表面，在粘膜表面與入侵的病原體相互作用。這種粘膜免疫系統(tǒng)是應用活的口服疫苗和口服免疫制劑保護性抵御病原體的基礎，這些病原體可通過首次與粘膜表面相互作用引起感染。鑒于IgA的保護力是短壽的，一個理想的粘膜疫苗應該是價廉、有效、安全和便于給藥(如口服給藥)，以便多次服用。
轉基因植物技術的發(fā)展使上述假設成為可能。含有外源基因的植物細胞可再生出完整植株，并將外源基因穩(wěn)定地遺傳給后代。迄今有些單子葉和雙子葉植物都已經進行了成功的轉化。例如煙草、馬鈴薯、西紅柿、大豆和玉米等。農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)介導的雙子葉植物轉化已有眾多報道。農桿菌介導的葉盤轉化法可有效地進行基因轉移、選擇和再生。
植物是一種多樣化、低成本和可再生的材料資源，而生物技術的迅速發(fā)展則使我們進一步拓寬了植物的使用范圍，國外在植物中采用這種“分子農業(yè)”的方法，已經成功地生產了越來越多的有用物質，其中包括一些高價值藥用蛋白多肽，如人的細胞生長因子、促紅細胞生成素、干擾素、生長激素、單克隆抗體和可作為疫苗用的抗原蛋白等，一些研究機構和公司已經開始從這些藥物蛋白的生產中獲得巨大的經濟效益。
特別值得指出的是，1998年4月，美國國家過敏癥和傳染病研究所(Natiomnal Instituteof Allergy and Infectious Diseases，NIAID)首次報道了人食用轉基因馬鈴薯后體內能夠產生對大腸桿菌熱不穩(wěn)定毒素B亞基的特異性抗體，在11個志愿者中有10人(91％)血清中抗體增加了4倍，有6人(55％)粘膜抗體也增加了4倍。這一研究結果清楚地表明(1)在植物中高效表達一些病原蛋白基因是可行的。
(2)病原蛋白在植物中可完成翻譯后加工過程，如糖基化和高級結構的空間折疊，從而使這種重組蛋白多肽與天然蛋白具有相同免疫原性，這是原核生物表達系統(tǒng)無法比擬的，后者無法對源自真核生物的蛋白進行糖基化。
(3)植物中產生的抗原蛋白可安全地通過動物的消化道而不會被蛋白酶降解，原因是它們能夠與腸粘膜細胞膜表面上的糖蛋白分子受體結合并刺激動物機體產生免疫應答。這類蛋白也被稱謂粘膜性抗原(mucosal immumogen)，但并不是所有的蛋白都具有這種能力，現(xiàn)僅發(fā)現(xiàn)少數病毒和細菌含有這種抗原。
(4)研究也證實了粘膜性抗原只需要口服少量蛋白，就可以產生良好的免疫應答反應，并不比肌內注射所需要量大。
這些研究結果預示植物將成為繼微生物發(fā)酵系統(tǒng)和動物細胞培養(yǎng)系統(tǒng)之后又一個新的蛋白表達系統(tǒng)。
利用植物表達系統(tǒng)生產輪狀病毒包膜蛋白抗原具有以下優(yōu)點(1)更安全轉基因植物中除只增加了輪狀病毒重組抗原蛋白外，沒有改變植物其它的遺傳組成，因此，它絕不會含有對人體有害成份，也完全排除了污染其它病毒的可能性。
(2)價格更低廉因為它不需要純化和冷藏，抗原蛋白的生產可能只是簡單地種植農作物，因此可大大降低生產成本。
(3)便用更方便接種方式只是簡單地食用含有該抗原蛋白的植物組織或由該植物組織加工而成的某種膠囊、沖劑或其它制劑，省去了較麻煩的注射過程，這種接種方式非常適用于中國或其它發(fā)展中國家。
(4)免疫力更持久人或動物每隔一定時間服用含該抗原蛋白的膠囊或沖劑，可使體內抗體始終維持在一個較高的水平，增強了對輪狀病毒感染的抵抗能力。
已有人嘗試在植物中表達牛源輪狀病毒結構蛋白VP6、鼠源非結構蛋白NSP4的B細胞表位，(3)。然而，在本發(fā)明之前，還沒有人利用植物表達人源輪狀病毒VP7蛋白抗原，而正如前文所述該蛋白具有比其它蛋白更強的免疫原性。而且，不同種屬來源的輪狀病毒抗原不能有效的保護其它種屬的輪狀病毒感染。

發(fā)明內容
概述本發(fā)明將含有輪狀病毒VP7蛋白抗原的轉基因植物加工成膠囊、沖劑或其它制劑的方法，對其中所含的抗原蛋白進行嚴格定量，從而對人或哺乳動物的食用間隔和食用量有了明確的規(guī)定，由此克服了直接食用轉基因植物存在的上述缺點。
在沒有成功的輪狀病毒疫苗可供利用的情況下，非常有必要尋找新的更加安全和廉價的抗原蛋白生產途徑。利用轉基因植物生產病原體抗原重組蛋白是一種較好的選擇，它可能為人類和哺乳動物抵御各種傳染性疾病提供一條新途徑。
本發(fā)明提供表達輪狀病毒重組外殼蛋白抗原轉基因植物以及如何應用含該重組抗原蛋白轉基因植物的方法。本項發(fā)明適用于任何國家，特別適用于中國或其它發(fā)展中國家。
本發(fā)明利用可以食用的轉基因植物生產病毒抗原蛋白，這些重組抗原蛋白在免疫原性方面與天然蛋白類似。按照一個優(yōu)先的實施方案，就是本發(fā)明提供了轉基因植物、與人或動物疾病相關的病毒重組抗原蛋白的生產方法以及如何具體應用這種含重組抗原蛋白轉基因植物的方法。這里所指的疾病是指那些具有在自然狀態(tài)下能夠引起免疫應答、特別是粘膜免疫應答反應抗原的病毒病原。按照一個優(yōu)先的實施方案，病毒病原指的是輪狀病毒，植物指的是人們日常食用的植物。
本發(fā)明克服了以前一些病毒抗原蛋白生產方法如微生物發(fā)酵和動物細胞培養(yǎng)的缺點，它利用轉基因植物生產病毒抗原蛋白，如果將其加工成口服膠囊、沖劑或其它制劑，則具有廉價、安全和使用方便的特點，會使更多人或動物得到保護。按照一個優(yōu)先的實施方案，人或哺乳動物只需食用這些轉基因植物的果實、汁液、根、莖、葉或植物的其它部分，或以腸道給藥的方式利用這些轉基因植物或轉基因植物粗提取物制備的膠囊、沖劑或其它制劑便可獲得對疾病的免疫能力。這里的植物是指人們日常所食用的，同時由于避免提純過程，降低了生產成本和存在的其它一些不利因素。
按照一個實施方案，本發(fā)明涉及利用轉基因植物生產含抗原蛋白膠囊、沖劑或其它制劑的方法。生產這種膠囊、沖劑或其它制劑的轉基因植物材料可以有多種方式，可以是完整植物，或植物的一部分如果實、葉子、莖和塊莖，或植物某一部分的粗提物、或經完全純化以及部分純化源自轉基因植物的病毒抗原蛋白。總之，采用何種方式主要取決于抗原蛋白本身的免疫原性，產生粘膜免疫應答反應所需這種源自轉基因動植物的抗原的劑量以及在這種成份中所含的干擾免疫應答反應的物質的多少，如糖類、熱原和毒素等，并盡量降低免疫耐受性的產生。
本發(fā)明所指的抗原蛋白是指在轉基因植物中生產的，首先是編碼病原抗原蛋白的基因被分離出來。然后插入到一個含有選擇標記的質粒上，啟動子位于該基因的上游，它操縱該基因在植物中的表達。外源基因在植物各器官或可食用部分中表達后，人或動物可食用這部分植物組織。
本發(fā)明提供了在植物細胞中生產病毒重組蛋白的方法，而該蛋白已知在天然狀態(tài)直可引起哺乳動物產生免疫應答反應。或者說，本發(fā)明所指的病毒重組蛋白可作為抗原，具有與源自哺乳動物和其它常規(guī)表達系統(tǒng)產生的該抗原蛋白如酵母和細菌一樣的免疫原性，或者更確切說，本發(fā)明的抗原蛋白與源自哺乳動物和其它常規(guī)表達系統(tǒng)產生的該抗原蛋白一樣，均能夠通過口服和腸道給藥的方式引起免疫應答反應。按照一個優(yōu)先的實施方案，這種病毒重組蛋白是一種抗原蛋白，它可以在植物細胞中表達產生，且具有與源自哺乳動物或其它常規(guī)表達系統(tǒng)所產生的該抗原蛋白相似的免疫原性。
本發(fā)明的抗原源自一種哺乳動物的病毒，它可在植物中表達產生。按照一個優(yōu)先的實施方案，抗原源自一種哺乳動物病毒病原。因此，可以說在植物中表達產生的最有用的病毒抗原是那些來源自哺乳動物如人的病毒病原的抗原。
本發(fā)明的抗原可在植物中表達產生，而表達產生該抗原的植物至少有一部分是可以直接食用或經過粗加工后可以食用。這種植物或植物的食用部分不應具有毒性，因此，許多常見的食用植物，例如西紅柿、萵苣、胡蘿卜、黃瓜等都包括在本發(fā)明所定義的植物范圍之內。此外，在某些情況下，如馬鈴薯，在這里也被認為是可食用植物，盡管它的某些部分被認為是有毒的(馬鈴薯塊莖部分是無毒的，因此屬于本發(fā)明的權利要求范圍之內，但它的果實是有毒的)，在這種情況下，這種植物也應包括在本發(fā)明的權利要求范圍之內。植物可以是雙子葉植物或是單子葉植物。
按照一個優(yōu)先的實施方案，本發(fā)明的抗原應該是一個粘膜性抗原。它具有引起粘膜免疫系統(tǒng)產生特異性免疫應答的能力。按照一個更加優(yōu)先的實施方案，這些粘膜抗在一定劑量范圍之內能夠引起粘膜和體液產生免疫應答反應，而不會導致產生免疫耐受性和過敏反應。免疫耐受性在這里被定義為在人或哺乳動物多次食用該抗原之后，導致隨后的特異性抗原-抗體反應能力消失。當然，本發(fā)明中的抗原也有可能產生粘膜系統(tǒng)免疫耐受性，但如果改為注射后，該抗原仍然能保持它的免疫原性。
本發(fā)明的重組抗原蛋白可以是病毒天然抗原蛋白的全部。然而，在某些具體實施方案中，抗原也可能只是該天然蛋白分子的一部分。有時，抗原可與另外一個多肽或蛋白分子如細菌病原蛋白多肽結合在一起形成融合蛋白。蛋白的融合可以通過蛋白翻譯后加工、共價結合的方式，或者通過DNA重組技術使基因在翻譯前就連接在一起。這兩種技術是本領域專家早已熟知的技術。
在某些實施方案中，本發(fā)明的抗原將指的是來自一種肝炎病毒的抗原，在某些更優(yōu)先的實施方案中，將選擇使用輪狀病毒外殼蛋白抗原。并且優(yōu)選所說的抗原是具有Seq.ID.No.4所示的核苷酸序列或其簡并序列的基因所編碼的人源輪狀病毒VP7抗原；其中術語“簡并序列”是指基于密碼子的冗余可以根據植物宿主細胞密碼子的偏好性而在編碼抗原的基因序列中引入適當的簡并密碼子加以替換，這樣得到的抗原蛋白的氨基酸序列保持不變，但是表達效率大為提高。更進一步地，所說的抗原是具有Seq.ID.No.5所示的氨基酸序列的VP7抗原。因此，按照一個進一步的實施方案，輪狀病毒外殼蛋白抗原基因在植物中表達，而該重組抗原可引起免疫應答反應、特別是粘膜免疫應答反應就如同天然蛋白或其它表達系統(tǒng)產生的抗原蛋白一樣。
在本發(fā)明的其它實施方案中，一種表達哺乳動物病毒重組抗原蛋白的轉基因植物被構建。就本發(fā)明而言，一種轉基因植物至少應該在該植物的部分細胞中表達了某種病毒抗原。按照本發(fā)明的某些優(yōu)先實施方案，本發(fā)明的轉基因植物至少有一部分是可以食用的，其所表達的抗原是輪狀病毒包膜中蛋白抗原，它能夠引起免疫應答反應，特別是粘膜免疫應答反應，就如同天然蛋白或其它表達系統(tǒng)產生的抗原蛋白一樣。
本發(fā)明涉及到了一種食物的組成問題，該食物中至少含有轉基因植物的某些食用部分，這里的轉基因植物應能夠表達輪狀病毒包膜中蛋白抗原。就本發(fā)明而言，植物或植物的某一部分被認為應該具有某些營養(yǎng)價值，它能夠為人或其它哺乳動物提供代謝所需的能量，維生素的其他輔助因子。盡管萵苣并不大量提供能量、蛋白質、碳水化合物和脂肪，但就因為它含有重組抗原蛋白而被人們特意食用的話，萵苣也應包括在本發(fā)明的權利要求范圍內。萵苣的粗纖維對哺乳動物的健康是有利的，即使哺乳動物并不能夠消化萵苣的粗纖維。
本發(fā)明涉及到了一種膠囊、沖劑或其它制劑的組成成份問題，膠囊、沖劑或其它制劑中可以含有適當的藥學上可接受的載體或賦形劑等，但至少含有轉基因植物的某些食用部分，這里的轉基因植物應能夠表達一種重組病毒抗原蛋白。就本發(fā)明而言，膠囊、沖劑或其它制劑中含有的抗原蛋白應該能夠精確定量，以避免人或動物食用后產生免疫耐受性。按照本發(fā)明的一個優(yōu)先實施方案，本發(fā)明的膠囊、沖劑或其它制劑所含有的抗原是輪狀病毒包膜中蛋白抗原，它能夠引起免疫應答反應，特別是粘膜免疫應答反應，就如同天然蛋白或其它表達系統(tǒng)產生的抗原蛋白一樣。
正如上述所述，按照本發(fā)明的某些實施方案，這里的食物將包括含有粘膜性抗原蛋白的食物，這種粘膜性抗原蛋白能夠與粘膜細胞表面糖基化分子受體結合，它可以是一種融合蛋白或者是源自某種肝炎病毒的抗原。因此，按照一個更加具體的實施方案，本發(fā)明所指的食物將至少包括轉基因植物的一部分，它具有某些營養(yǎng)價值，關含有輪狀病毒外殼蛋白抗原，而該抗原能夠與粘膜細胞表面的糖基化分子受體結合。在任何情況下，本發(fā)明的食物都包括植物的根、莖、葉、果實或所說的植物種子。
對本發(fā)明所使用方法和其它相關事項極為重要的是一些質粒載體的構建，它們在獲得本發(fā)明所指的轉基因植物以及轉基因植物的加工應用中起重要作用。用于轉化植物的質粒載體由編碼哺乳動物病毒抗原的DNA序列和操縱該DNA序列在所說的植物中表達的一個植物啟動子組成。在某些具體實施方案中，質粒載體還包括一個選擇或標記基因，主要用于轉基因植物或細胞的檢測。在某些具體實施方案中，本發(fā)明的植物啟動子是花椰菜花葉病毒35S啟動子。正如上面所述，按照某些具體的實施方案，本發(fā)明的質粒載體用于轉化可食用植物，它編碼的抗原是一種粘膜抗原，更進一步說，質粒載體所編碼的抗原能夠誘導免疫應答反應，特別是粘膜性免疫應答反應，就象天然蛋白和源自其它表達系統(tǒng)所產生的該抗原蛋白一樣。在一個優(yōu)先的實施方案中，本發(fā)明用于轉化植物的質粒載體含有編碼輪狀病毒包膜中蛋白抗原的基因以及一個植物啟動子，該基因編碼的蛋白抗原可引起免疫應答反應、特別是粘膜免疫應答反應就如同天然蛋白或源自其它表達系統(tǒng)的該抗原蛋白一樣，而植物啟動子主要是操縱該基因在植物中的表達。在一個類似的實施方案中，本發(fā)明提供的DNA片段可用于基因槍法轉化植物。
本發(fā)明也提供了獲得轉基因植物細胞的方法，它包括以下步驟1.構建一個質粒載體或者一段DNA序列，其中都含有編碼病毒抗原的基因，而且該基因被置于一個植物啟動子的操縱之下；2.用質粒載體或上述DNA片段轉化植物細胞。按照一個優(yōu)先的實施方案，還包括從轉化的植物細胞再生出完整的轉基因植株的方法。
本發(fā)明提供了各種植物細胞或植物的轉化方法。盡管在下面描述的某些優(yōu)先實施方案中僅利用了特定的轉化方法，但顯而易見的是，本領域專家所早已熟知的其它植物轉化方法也應包括在本發(fā)明的權利要求范圍之內，這些方法包括微管注射、PEG融合、電融合。按照某些優(yōu)先實施方案，使用的是農桿菌介導的轉化方法，特別指Ti質粒參與的農桿菌轉化系統(tǒng)。在其它一些優(yōu)先實施方案中，還可以使用基因槍法轉化植物細胞或植物。
本發(fā)明植物轉化方法中所用的質粒載體是一個雙元載體系統(tǒng)。按照一個實施方案，本發(fā)明使用的質粒是一個整合性載體。按照一個更加優(yōu)先的實施方案，本發(fā)明所使用的質粒是pBI121。
本發(fā)明提供了一種轉基因食物的生產方法。它包括以下步驟1.構建一個質粒載體或者一段DNA序列，其中都含有編碼病毒抗原的基因，而且該基因被置于一個植物啟動子操縱之下；2.用質粒載體或上述DNA片段轉化植物細胞；3.從轉化基因植物細胞中再生出完整的轉基因植物；4.收獲轉基因植物的食用部分；5.食用一定量的這種轉基因植物，盡量避免產生免疫耐受性，以達到預防疾病的效果。
本發(fā)明也提供了含確定數量抗原蛋白膠囊、沖劑或其它制劑的生產方法，它包括以下步驟1.構建一個質粒載體或者一段DNA序列，其中都含有編碼病毒抗原蛋白的基因，而且該基因被置于一個植物啟動子操縱之下；2.用質粒載體將上述DNA片段轉化植物細胞；3.從轉基因植物細胞中再生出完整的轉基因植物；4.自轉基因植物細胞或完整植物中提取出抗原蛋白加工成膠囊、沖劑或其它制劑。按照一個優(yōu)先的實施方案，含有抗原蛋白的完整轉基因植物或者其某些食用部分可直接進行冷凍、干燥的粉碎，然后加工成膠囊、沖劑或其它制劑，并確定其中含有的抗原蛋白數量。
本發(fā)明包括以下幾個組成部分1.利用DNA重組技木構建質粒表達載體，它含有輪狀病毒外殼蛋白抗原基因或其衍生物，人或其它哺乳動物在食用該抗原蛋白后有可能產生針對輪狀病毒的特異性中和抗體；2.選擇適宜的受體植物進行轉化，使編碼抗原蛋白的基因穩(wěn)定地整合入受體植物的染色體中并可遺傳給后代；3.從轉化的受體植物細胞中再生出完整的轉基因植物，而且該植物能夠穩(wěn)定、高效地產生輪狀病毒外殼蛋白抗原；4.人或哺乳動物直接食用這種轉基因植物或以腸道給藥的方式口服以該轉基因為主要活性成份加工而成的膠囊、沖劑或其它制劑后，有可能預防輪狀病毒的侵染。
本發(fā)明提供了表達輪狀病毒外殼蛋白或其衍生物轉基因植物的構建方法，這種轉基因植物作為食物或加工成膠囊、沖劑或其它制劑后被人們食用有可能引起人或哺乳動物的免疫應答。這種免疫應答的結果使人或哺乳動物對輪狀病毒的感染具有抵抗能力。這種免疫應答是由于在轉基因植物中表達輪狀病毒外殼蛋白抗原后而產生的結果，而輪狀病毒外殼蛋白抗原的產生則是由于該抗原蛋白基因整合入植物的基因組中并在啟動子調控下能夠穩(wěn)定地表達的結果。
附圖的簡單說明為了詳細描述本發(fā)明的某些優(yōu)先實施方案，并以相應的繪圖作參考


圖1輪狀病毒VP7基因克隆示意2輪狀病毒VP7基因重組到植物表達載體構建示意3質粒PBI121-VP7所含的結構基因及其調控表達序列圖4不同轉基因馬鈴薯植株葉片中VP7蛋白的含量圖5轉基因馬鈴薯葉片基因組總DNA Southern blot結果圖6轉基因馬鈴薯塊莖可溶性總蛋白Western blot結果圖7轉基因西紅柿果實可溶性總蛋白Western blot結果在圖3中，Nos-Pro＝胭脂堿合成酶；NPT-II＝新霉素磷酸轉移酶；Nos-Ter＝胭脂堿合成酶終止子；35S Pro＝花椰菜花葉病毒35S啟動子；RB＝T-DNA右邊邊界；LB＝T-DNA左邊邊界在圖4中，1.陰性對照株塊莖抽提可溶性總蛋白；2-21.轉基因馬玲薯塊莖抽提可溶性總蛋白；在圖5中，1.陽性對照，10ng重組PBI121-VP7質粒；2-9.轉基因馬玲薯植株；10.陰性對照株.
在圖6中，1.陽性對照，市售重組VP7蛋白；2-5.轉基因馬玲薯塊莖抽提可溶性總蛋白；6.陰性對照株塊莖抽提可溶性總蛋白.
在圖7中，1.陰性對照，未轉基因西紅柿葉片抽提總RNA；2-8.不同轉基因西紅柿植株葉片抽提總RNA.
本發(fā)明的詳細描述1.HRV疫苗的發(fā)展歷史人類輪狀病毒(HRV)是引起嬰幼兒急性腹瀉和死亡的重要病原體，占所有腸道感染病因的50％以上。全球每年因RV感染致死的病例超過100萬，衛(wèi)生條件對RV的傳播影響很小，營養(yǎng)狀況與發(fā)病危險的關系也不如細菌性腹瀉那樣密切，無論衛(wèi)生條件較好的發(fā)達國家，還是在衛(wèi)生條件較差的發(fā)展中國家，3歲以下的嬰幼兒約有90％都要受到RV的感染。美國每年由此的醫(yī)療和間接開支逾10億美元。輪狀病毒腹瀉在全球已成為一項重要的公共衛(wèi)生問題，世界衛(wèi)生組織(WHO)對開發(fā)其疫苗給予了高度重視。發(fā)展輪狀病毒疫苗，預防病毒性腹瀉是刻不容緩的任務。近20年來RV疫苗的研制工作進展很快，取得的一些突破性成果簡述如下。
第一代輪狀病毒疫苗-輪狀病毒口服減毒活疫苗 人和動物輪狀病毒的VP6具有相同的抗原性，動物毒株比人RV毒株易于在組織培養(yǎng)中生長且對人天然減毒，省去了體外減毒的步驟，因此動物RV株被用來研制減毒活疫苗。這種用動物病毒株預防人類疾病的方法稱為“琴納法”?？诜p毒活疫苗可以有效地誘導局部粘膜免疫，產生抗體和細胞介導的免疫反應，且免疫持續(xù)的時間比滅活疫苗更長，因而成為首選疫苗。比較有代表性的有(1)比利時SmithNine-RIT所發(fā)展的多次傳代減毒的牛株(RIT-4237)疫苗，是把牛輪狀病毒NCDV株在原代牛腎(或猴腎)細胞中經147次傳代后獲得的減毒株；(2)美國國立衛(wèi)生研究院Kapikian等從3～5月齡腹瀉的恒河猴糞便中分離到的病株，經猴腎細胞傳9代之后得到的減毒株，恒河猴輪狀病毒疫苗MMV-18006。該疫苗具有高度免疫原性，故接種劑量小，成本低，但引起發(fā)熱、水樣便和病毒排出率均高于RIT-4237，保護性不穩(wěn)定(0～85％)；(3)美國費城Wistar研究所和法國erenx研究所聯(lián)合研究的低傳代牛RV疫苗Wister-eneux牛株疫苗(WC3)，是將牛RVWC3株在CV-1細胞中傳12代，為G6型。主要不足仍為保護性不穩(wěn)定。
第二代輪狀病毒疫苗為多價重組疫苗 由于早期的動物輪狀病毒疫苗株型別單一，在嬰幼兒服苗者中誘發(fā)的主要是同型免疫。為了提高疫苗效力，開始了多價重配疫苗的研制。首例自然發(fā)生的人RV基因重配株37于1985年在委內瑞拉新生兒感染糞樣中分離獲取。由于不同亞群重配株在自然狀態(tài)下很難見到，人們利用輪狀病毒RNA在自然或實驗條件下易于發(fā)生基因重組的特性，運用基因重組技術構建了單基因替換重組體，使之既能誘生對人RV親本株的免疫力又保留動物RV親本株減毒特性及在體外高滴度生長的能力。由Kapikian等分別以編碼人輪狀病毒3個主要血清型的VP7基因作為親本，其余10個基因都來自恒河猴輪狀病毒(MMU18006G3型)，構建了4價恒河猴RV疫苗(RRV-TV)。申碩等組建了以羊RVLc40(G10)為背景，攜帶猴RVSA11(G3)第4，9基因片段的羊-猴RV基因重配株L-S4/9，該實驗室還以羊RV為背景，組建了羊與人RV的雜交株L13 XDS-1(G2)，L-S4/9 XHochi(G4)。羊RVLL-85的弱毒株是我國獨有的相當理想的受體株，這對于人用RV疫苗的開發(fā)具有重要意義。這些重組株對人RV所有4個血清型有刺激同源免疫的可能性，同時又獲得滿意的減毒和遺傳學穩(wěn)定性。獲得成功的是1998年8月31日在美國食品和藥物管理局(FDA)批準的Wyeth-Lederle公司生產的4價口服RRV-TV疫苗，ACIP(美國疾病控制和預防中心免疫實施咨詢委員會)批準此疫苗納入兒童計劃疫苗(VFC)中。但次年11月，該疫苗不得不撤離市場的原因是接到輪狀病毒疫苗在15名嬰兒中導致腸套疊的疫苗有害事件報告。因此，安全性是成了研制RV疫苗的首要考慮因素。
第三代RV疫苗—基因工程疫苗。隨著基因工程的興起，采用基因工程原理與技術研制的新型疫苗克服了以上傳統(tǒng)疫苗的不足，取得了不少進展。有代表性的有以下幾種(1)亞單位或多肽疫苗 運用基因工程方法采用原核或真核表達載體表達病毒的抗原基因作為免疫原進行動物免疫。如1987年Meccrea等將VP7編碼基因中的不同區(qū)段分別與pEX重組，結果只有pEX3/8/5一種重組方式較為理想，經轉化，誘導后可高產量地合成β-Gal-VP融合蛋白，用之免疫動物產生特異的高滴度的免疫抗血清。試驗證明此種疫苗安全、有效，與重組疫苗交替使用可成為其加強劑。但亞單位疫苗最大的缺點是高度純化的疫苗免疫原性較弱，不能有效地刺激機體產生抗體和局部免疫應答，而預防輪狀病毒感染恰恰需要腸道的局部免疫。
(2)DNA疫苗 DNA疫苗是90年代初發(fā)展起來的一種疫苗形式。以其良好持久的免疫反應性、制備簡單、易于保存等傳統(tǒng)疫苗難以比擬的優(yōu)點而受到普遍重視。DNA疫苗是利用基因重組技術直接將編碼某種外源蛋白的目的基因，或將幾種不同病原體的保護性抗原的DNA序列克隆到一個載體上制成的多價DNA疫苗，注入宿主體內，使之長期地在體內持續(xù)表達，從而激發(fā)免疫反應及保護性免疫應答。也可將抗原基因與某些細胞因子克隆到同一載體上，起到聯(lián)合免疫和增強免疫效果的作用。Greenberg等將編碼鼠RV VP4、VP6、VP7基因的cDNA插入表達質粒pCMV作為DNA疫苗，對同型RV有一定保護作用，表明DNA疫苗可能是控制RV腹瀉一種新方法。其缺點是免疫原性較低，口服免疫不能有效激發(fā)局部免疫。
(3)轉基因植物口服疫苗 利用轉基因植物生產重組蛋白，細胞易培養(yǎng)且保留重組蛋白天然免疫原性，轉化植株的種子易于儲存，具有安全、廉價、便于大量生產等優(yōu)點，使轉基因植物生產基因工程疫苗成為當前一大熱點，并為“生物制藥”提供了可能性。目前人們已建立了煙草、馬鈴薯、西紅柿、香蕉等轉植物基因表達系統(tǒng)，并成功地獲得了乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、鏈球菌屬突變株表面蛋白(spaA)等十幾種疫苗。在發(fā)展中國家生產并接種這種由植物制備的“可食用疫苗”為RV疫苗的研究和發(fā)展開拓了更廣闊的前景。
2.農桿菌介導的核轉化疫苗目前，研究成功的轉基因疫苗中約80％是由農桿菌介導形成的轉基因植物表達系統(tǒng)產生。這種表達系統(tǒng)的成功構建源于根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)是一種寄主非常廣泛的土壤細菌，在自然狀態(tài)下它能通過傷口侵染大多數雙子葉植物，導致冠癭瘤的發(fā)生[4]。其侵染機理是基于農桿菌體內的Ti質粒和vir基因即毒性區(qū)兩部分的共同參與，Ti質粒中有一個DNA片斷，稱為轉移DNA(Transfer DNA，T-DNA)。大多數雙子葉植物組織受到創(chuàng)傷后，誘導植物細胞分泌某些酚類物質，如乙酰丁香酮(acetosyringone，簡稱AS)或羥基乙酰丁香酮(ahydroxyacetosyringone，簡稱OH-AS)，這些酚類物質即成為創(chuàng)傷信號分子或創(chuàng)傷誘導分子。vir基因受到創(chuàng)傷信號刺激后，轉錄活化其一系列基因VirA、B、C、D、E、F、G、H等，這些基因的表達產物最終形成膜通道以便于T-DNA復合物向植物細胞轉移。T-DNA復合物通過其左右邊界各為25bp的重復序列以單拷貝或多拷貝的形式將T-DNA復合物插入到宿主基因組中。將外源基因與T-DNA左右臂相連，同樣可以將外源基因整合進植物基因組并得以表達，而且整合進植物基因組的外源DNA片斷能夠通過減數分裂以孟德爾遺傳方式傳遞給后代[5]。
利用農桿菌的這一特性，人們已構建了多種Ti質粒載體系統(tǒng)。Ti質粒載體系統(tǒng)包括兩個基本要素第一，含有T-DNA邊界序列的一個重組質粒載體，這個質粒能夠在大腸桿菌和農桿菌之間進行穿梭。這是因為Ti質粒是一個大質粒，很難對其進行常規(guī)的基因克隆操作，必須借助于一個中間的載體質粒，在大腸桿菌上進行常規(guī)的基因操作，連接上外源基因，然后轉移到土壤農桿菌中，與相應的Disarmed Ti質粒共同組成一個完整的Ti質粒載體系統(tǒng)；第二，作為載體系統(tǒng)的質粒和農桿菌株必須含有完整的vir基因。
目前，廣泛用于轉基因植物的Ti質粒載體系統(tǒng)有共整合載體系統(tǒng)和雙元載體系統(tǒng)。共整合載體是指Ti質粒上編碼致瘤基因的序列被一段pBR322 DNA所替代，帶外源基因的pBR322衍生中間載體由大腸桿菌轉入農桿菌后，二者相同的pBR322序列發(fā)生同源重組，外源基因就此整合到disarmed Ti質粒上。雙元載體系統(tǒng)是指一個農桿菌株系中含有兩個彼此分離的質粒一個是含有T-DNA和外源基因重組的多功能克隆載體質粒，它即能在大腸桿菌中進行復制，又能在農桿菌中進行復制，并能從大腸桿菌遷移到土壤農桿菌中；另一個是含有vir基因序列的Ti衍生質粒。
3.植物轉化方法有許多種方法可以將外源基因導入單子葉植物和雙子葉植物。將外源基因穩(wěn)定整合入植物染色體基因組DNA的主要方法包括1)農桿菌介導法；2)DNA直接攝入法，包括PEG介導的原生質融合法、電激法、微管注射法以及使用基因槍將DNA直接送入植物細胞和組織等。
農桿菌介導法是利用質粒載體將特定的DNA片段整合入植物染色體基因組DNA。植物組織的轉化方法因植物和農桿菌系統(tǒng)而異。最常用的方法是葉盤法，它適用于任何易于再生成完整植株的植物外植體。農桿菌轉化方法特別適用于雙子葉植物的轉化。
正如上面已提到的各種DNA直接攝入轉化方法，電激法是先將原生質體置于放在一個強電場中，在電流作用下將外源DNA送入原生質體內。微管注射法是用微管將DNA直接注射入細胞中?；驑尫ㄊ菍NA先吸附在硫酸鎂或鎢粒上，這些顆粒被加速射入植物細胞或組織中。
按照本發(fā)明的一個優(yōu)先實施方案，農桿菌Ti質粒系統(tǒng)被選用。農桿菌的Ti質粒中含有一段叫做轉移DNA(T-DNA)的，它可以進入植物細胞并整合入植物的染色體中。轉移載體的構建分為兩步，首先是構建一個可以在大腸桿菌中復制的質粒，這個質粒含有目的基因(在這里專指輪狀病毒外殼蛋白抗原基因)；抗原基因的兩端含有T-DNA邊界序列，它負責目的基因在植物基因組中的插入位點。通常另外一個選擇標志基因(如抗卡那霉素抗性基因)也被包含在T-DNA的左右邊界序列中，該基因在植物細胞中表達后可提供一個選擇標記證實植物或植物細胞是否含有整合的T-DNA序列。載體構建的第二步是將質粒從大腸桿菌轉移到農桿菌中。這可以通過電穿孔直接導入方式完成。為了T-DNA的轉移，所用的農桿菌菌株中還要含有一套誘導基因，它們在T-DNA轉移到植物細胞中起重要作用。
植物組織的轉化方法因植物和農桿菌介導系統(tǒng)而異。最常用的是植物葉盤轉化法，它適于多種易于再生的植物外植體。在某些情況下，還需要加入一些輔助細胞。其他的轉化方法包括原生質體轉化，繼而由原生質體再生出植物細胞及完整植株。
4.基因表達啟動子在受體植物和轉化方法確定之后，一個組成型的、發(fā)育調節(jié)型的或組織特異型的表達啟動子被選擇以便外源基因能夠在植物中表達。
所有已知能操縱外源基因在植物細胞中轉錄的啟動子都可以在應用在本發(fā)明中。這些啟動子可從植物或病毒中獲得，如花椰菜花葉病毒35S啟動子(包括經過拼接、加倍和突變改造后的35S啟動子)；光誘導基因啟動子如核糖二磷酸羧化酶小亞基(rbcS)；逆境誘導基因如乙醇脫氫酶(Adh1)或玉米肌動蛋白基因啟動子生成，但不僅限于此。本發(fā)明也可利用已知在植物可食部分高效表達的啟動子如馬鈴薯質體基因啟動子。
用于植物轉化的質粒通常含有一個選擇標志基因。許多有此功能的基因已被開發(fā)出來。
本發(fā)明的具體實施方式
下面以轉基因馬鈴薯和西紅柿生產輪狀蛋白抗原為例，描述一個優(yōu)先的實施方案。
實施例1輪狀病毒外殼蛋白抗原植物表達載體PBI121/VP7構建如圖1所示，輪狀病毒(血清型G1)總RNA被從腹瀉患兒的糞便中分離出來作為模版，根據已知的輪狀病毒RNA核酸序列合成特定的引物，具體堿基序列見序列表中Seq.ID.No.1-2，并通過多聚酶鏈式反應(PCR)擴增獲得了輪狀病毒外殼蛋白VP7基因。在3’端引物中引入了內質網滯留序列SEKDEL，具體堿基序列見序列表中Seq.ID.No.3，以上述擴增成功的PCR產物為模板，上游引物不變，再次擴增。將此PCR產物回收，純化，直接克隆到PUC-T載體，經酶切鑒定選擇反向插入的克隆，命名為PUC/VP7，通過進一步的序列分析，確定輪狀病毒外殼蛋白基因VP7閱讀框正確、完整，并已和內質網滯留序列SEKDEL融合。
用限制性內功酶XbaI和SacI雙酶切將輪狀病毒蛋白基因VP7切下來，通過瓊脂糖凝膠電泳分離獲得該DNA片段，隨后插入到質粒pBI121原GUS基因位點上(XbaI和SacI雙酶切)便構建成雙元表達載體PBI121/VP7。
質粒pBI121購自美國Clonetech公司，它的XbaI和SacI限制性酶切位點分別位于花椰菜花葉病毒35S啟動子和GUS基因起始密碼之間以及GUS基因終止序列和NOS終止子之間。選用質粒pBI121是因為用XbaI和SacI雙酶切可將GUS基因刪除，而隨后可插入另一個蛋白基因。新基因將能夠在植物細胞內表達。質粒pBI121還含有新霉素磷酸轉移II基因(NPTII)，它編碼的酶可為植物細胞提供卡那霉素抗性，從而可將含有T-DNA的細胞和組織篩選出來。NPT II基因有自己的啟動子和多聚腺酸信號序列，它們源自胭脂堿(Nopaline)合成酶(NOS)基因。
質粒PBI121/VP7含有1)新霉素合成酶基因II(NPT II)，它提供給植物細胞卡那霉素抗性；2)輪狀病毒外殼蛋白抗原基因VP7及操縱基因的花椰菜花葉病毒35S啟動子；3)T-DNA左右邊界序列，它可將NPT II基因和輪狀病毒外殼蛋白抗原基因VP7轉移到植物體內并整合到植物染色體中。PBI121/VP7的結構如圖4所示。
實施例2.將表達載體PBI121/VP7導入農桿菌(A.tumefaciens)含有輪狀病毒外殼蛋白抗原基因VP7的質粒PBI121/VP7被通過電穿孔的方式轉移到農桿菌LBA4404菌株中，該菌株來自美國Clonetech公司。菌株LBA4404現(xiàn)已被廣泛應用是因為它是一改造后的農桿菌，它含有完整Vir基因，但T-DNA已經被刪除。Vir基因可反式調節(jié)T-DNA自質粒PBI121/VP7向植物細胞內的轉移。
將OD值為0.6～0.8的農桿菌液20ml離心后，去離子水洗兩次，重懸于1ml 10％甘油；以40μl菌液加入2μl(約50ng)重組質粒PBI121/VP7，充分混勻；參數設置電穿孔杯為0.1cm，電容25μF，電阻200Ω，電場強度18kv/cm。經電擊后加入LB 0.8ml和1M葡萄糖20μl混勻，轉入1.5ml離心管，28℃225轉/分振蕩培養(yǎng)3hr；取100μl鋪于含鏈霉素125mg/ml、卡那霉素50mg/ml的LB平板上，28℃培養(yǎng)36h，含有PBI121/VP7重組質粒的農桿菌菌落開始產生。
用堿裂解法從農桿菌中提取質粒DNA，并用限制性內切酶酶切可檢測PBI121/VP7質粒DAN是否存在。
實施例3.農桿菌介導的植物遺傳轉化植物的遺傳轉化首先是植物組織器官與農桿菌共培養(yǎng)，在培養(yǎng)約2天后，將植物外植體移置相應的選擇培養(yǎng)基中。植物外植體可以是原生質體、愈傷組織或其它器官組織，因植物而異。我們選用子葉或莖段轉化方法。
馬鈴薯無菌苗[品種為臺灣紅(Taiwanhong)，西南農業(yè)大學生物技術中心提供]。生長在23℃光照培養(yǎng)箱中，輔之以中等光照強度下，每隔3個星期剪取頂端幼芽，重新扦插在不含任何抗生素的MS固體培養(yǎng)基中，生長2星期的馬鈴薯莖段最適于轉化。西紅柿(重慶市農作物研究所提供)則以7-10日齡的子葉或下胚軸無菌外植體進行轉化。
含有表達載體PBI121/VP7的農桿菌LBA4404接種在50ml YEP培養(yǎng)基(含50mg/ml卡那霉素和125mg/ml鏈霉素)中28℃培養(yǎng)2天，5000g離心5分鐘收集菌體，用25ml液體MS培養(yǎng)液(含抗生素)洗滌一次，再用MS重新懸浮至OD600nm＝0.5-0.8。將有傷口的葉片浸入稀釋后的農桿菌培養(yǎng)液中3-5分鐘，用無菌濾紙吸干葉片上多余的菌液，然后將葉片移置不含任何抗生素的再生培養(yǎng)基上23-25℃共培養(yǎng)2天。將外置體移置新鮮的選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)，該培養(yǎng)基中含有100-200ug/ml卡那霉素和500ug/ml羧芐青霉素，以后每兩周更換一次培養(yǎng)基。當葉片傷口處愈傷有幼芽形成并長至足夠大時，將幼芽切下(通常在轉化后45天或更長)轉移到生根培養(yǎng)基上生長。當根出現(xiàn)后，將再生植株移置無菌條件下生長或轉移到土壤中，給予適宜的溫度、光照和營養(yǎng)條件下生長。
實施例4.抽提陽性轉化株植物的總DNA按照CTAB法(McCouch，1988)，取100mg新鮮植物的葉片、莖、塊莖或果實，液氮冷凍后研成粉末狀，加入兩倍體積60℃預熱的勻漿緩沖液(CTAB 2％V/W，NaCl 1.4mol/L，EDTA0.02mol/L，Tris-HCl 0.1mol/L)輕輕顛倒混勻，60℃保溫45分鐘。加等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)，混勻。5,000rpm，15-20℃離心5分鐘。取上清，加等體積的氯仿/異戊醇，混勻。5,000rpm，15-20℃離心5分鐘。取上清，加2/3體積預冷的異戊醇，混勻。-20℃放置2-3小時或過夜。11,000rpm離心10分鐘。棄上清，沉淀干燥，加適量的TE溶解沉淀。加1/10體積的3mol/L NaAc(pH5.2)和2-3倍體積預冷的無水乙醇，-20℃過夜。11,000rpm離心10min，棄上清。自然晾干沉淀，加適量TE溶解沉淀，紫外分光光度計上測定OD260nm、OD280nm及其比值，并進行DNA的定量。然后置-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 上述抽提的總DNA稀釋10倍后取1ul作為PCR模板，按前面擴增vp7的條件進行擴增，取5μlPCR產物在1％瓊脂糖凝膠上電泳。待DNA條帶遷移到合適位置，終止電泳并在紫外燈下照相紀錄結果。
實施例5.轉基因馬鈴薯的RNA分析利用地高辛標記的包膜中蛋白基因探針，對PBI121/VP7表達載體轉化后的卡那霉素抗性馬鈴薯植株RAN進行了雜交分析。
轉基因馬鈴薯植株的葉片總RNA被提取，方法見參考文獻(27)。取2g材料放入研缽中，倒入液氮，研成粉末。收進50ml離心管中，加入10ml(5ml/g)65℃預熱的抽提buffer，振蕩30s。65℃水浴，振蕩2-3min。加入等體積氯仿，振蕩10min。18℃，12000g離心5min。(重復一次)加入1/4體積的LiCl(10M)，4℃過夜。4℃，10000g離心20min。500μl 0.5％SDS溶解沉淀。加入等體積氯仿，再次抽提一次。加入2倍體積無水乙醇，-20℃，2h。10000g，4℃，離心20min；吹干沉淀10min。DEPC處理水溶解沉淀(或用70％乙醇懸浮，-70℃保存)。沉淀溶于DEPC處理過的無RNA酶水中，RNA濃度可用紫外分光光度通過測定130nm的吸光值進行估算定量，置-20℃保存?zhèn)溆?。假?mg/ml的RNA吸光值是25單位。
取10μg RNA樣品，約5μl，與2倍體積RNA樣品緩沖(10ml去離子甲酰胺，3.5ml37％甲醛，2ml 5X MOPS)混合后，65℃加熱5分鐘，冷卻后，加入3μl RNA加樣緩沖液(50％甘油，1mM EDTA，0.4％溴酚藍)，然后經過1％的RNA瓊脂糖凝膠電泳。核酸通過毛吸管法轉移到尼龍膜(Roche公司產品Cat.NO.1417240)上，所用的緩沖液為20×SSC，pH7.2(3M NaCl，300mM醋酸鈉，pH7.0)，轉移時間為16小時。核酸通過紫外線照射后被交連在尼龍膜上，將膜置于預雜交液中[50％甲酰胺，5×SSPE，2×Denhardt試劑，0.1％SDS]，68℃預雜交3小時，然后更新的雜交液[50％甲酰胺，5×SSPE，2×Denhardt試劑，0.1％SDS 0.02％SDS，1％的封閉劑(Roche公司試劑盒提供)，5ml雜交液中加入變性的地高辛標記的DNA探針60ng進行雜交，探針是來自質粒PBI121/VP7的XbaI和SacI的酶切片段，包括了輪狀病毒vp7基因的全部編碼序列和內質網滯留序列SEKDEL。在雜交液中68℃雜交24小時后，取出雜交膜，于200ml 2×SSC，0.1％SDS緩沖液中室溫下洗膜2次，然后于100ml 0.1×SSC，0.1％SDS緩沖液中68℃洗膜2次。顯色反應基本依據試劑盒中提供的方法(Roche公司試劑盒)，尼龍膜先于洗脫緩沖液
中平衡5分鐘，然后用50ml 1×封閉緩沖液封閉30分鐘，加入堿性磷酸酶標記的地高辛的抗體至濃度為75mU/ml，室溫下反應30分鐘，用洗脫緩沖液2次，每次15分鐘。將膜移置20ml顯色緩沖液(0.1M Tris-HCl，pH9.5；0.1M NaCl；50mM MgCl2)中平衡5分鐘，更換新的底物緩沖液(200ul NBT/BCIP底物加入10ml顯色緩沖液)，遮光條件下顯色16小時，待所期望的條帶出現(xiàn)后，用水終止反應。
攜帶有質粒PBI121/VP7的轉基因植株和陰性對照植物的RNA雜交。不同轉基因植株的RNA雜交信號變異很大，這可能是由于基因的插入位點和基因的拷貝數不同引起的。和標準RNA分子量相比，轉錄的RNA約有1kb長，與預先估計的相一致。陰性對照植物的RNA沒有觀察到雜交信號。
實施例6.不同轉基因馬鈴薯植株輪狀病毒外殼蛋白含量的測定取不同轉基因馬鈴薯植株葉片0.1g，各加入1.5ml去離子水，在4℃下用玻璃勻漿器磨碎。勻漿液16000g 4℃離心5分鐘，利用Bradford法(蛋白測定試劑盒購自Bio-Rad公司)，取部分上清液測定可溶性蛋白含量，以BSA作為標準蛋白質。以MA104細胞培養(yǎng)的人源輪狀病毒總蛋白為陽性對照(VP7蛋白含量為總病毒蛋白含量的30％)。陽性對照被稀釋成不同蛋白水平(即VP7蛋白含量為0.01-5.0ng)，在顏色反應后，讀取492nm光吸收值，制備一條標準吸收曲線。如圖4中所示，通過比較發(fā)現(xiàn)，陰性對照植物中(柱1)沒有發(fā)現(xiàn)含有輪狀病毒VP7蛋白，而在轉基因馬鈴薯植株中則可以檢測到不同含量的輪狀病毒VP7蛋白，含量約為植物可溶性蛋白2-380ng/mg(柱2至柱21)。不同轉基因馬鈴薯之間差異比較大這可能是由于基因插入的拷貝數和插入位點不同引起的。
實施例7.轉基因馬鈴薯不同組織器官輪狀病毒VP7蛋白含量的測定取轉基因馬鈴薯葉片、莖和塊組織各0.2g，處理和測定方法同上。表2中列出了轉基因馬鈴薯不同組織器官中輪狀病毒VP7蛋白的含量。
馬鈴薯葉子中的輪狀病毒VP7蛋白表達量最高約為可溶性蛋白的0.014％，為380ng/g鮮重。馬鈴薯塊莖中的輪狀病毒VP7蛋白含量略高，為可溶性蛋白的0.013％，約為420ng/g鮮重，這就為加工和利用馬鈴薯塊提供了極大的方便。
表2 馬鈴薯葉子、莖和塊莖中的包膜中蛋白含量器官Ng/bm可溶性蛋白(＝％) ng/g鮮重葉子140(0.014％)380塊莖130(0.013％)420
實施例8.Western blot檢測轉基因馬鈴薯塊莖中輪狀病毒VP7蛋白選擇陽性轉化株，取其試管薯塊莖進行可溶性蛋白提取。同時以具體操作為取新鮮馬鈴薯塊莖，用解剖刀切成小薄片放入研缽，加入液氮冷凍后，迅速用研缽磨成粉末。按200μl/100mg的比例加入提取緩沖液(200mmol/L Tris-HCl pH8.0，100mmol/L NaCl，14mmol/L巰基乙醇，400mmol/L蔗糖，1mmol/L PMSF，0.05％Tween-20)，待樣品充分溶解后，于4℃、13000rpm離心20min取上清備用。用Bradford法測定蛋白質濃度。
取50μl轉基因植物蛋白抽提液加入等體積的樣品緩沖液(20％蔗糖，0.05％溴酚蘭，0.125％mol/L Tris·HCl pH6.8，4％SDS，14mmol/L巰基乙醇)，沸水煮5min，冰水浴2min使冷卻。離心棄沉淀后樣品用于電泳分析。取樣品30-40μl上樣12％SDS-PAGE凝膠，同時上樣蛋白標準分子量Marker，75V電泳30min后，150V電泳2-3h待溴酚蘭帶遷移到凝膠末端結束電泳。用Bio-Rad半干電泳轉印儀將蛋白轉移至甲醇預處理的PVDF膜上(蛋白質轉移緩沖液為25mmol/L Tris·HCl pH8.3，192mmol/L甘氨酸，20％甲醇)，恒流30mA，電轉2Hr或過夜。麗春紅染色后標上標準蛋白分子量以便后面檢測靶蛋白的大小。然后用水輕輕洗去染料。將膜置于4℃封閉過夜。次日按試劑盒說明書進行抗原抗體反應和發(fā)光實驗，最后于暗盒中對X-片曝光10秒，并進行后續(xù)處理。
雜交反應結果如圖6。它表明了來自轉基因馬鈴薯組織的蛋白與輪狀病毒特異性抗體發(fā)生了特異性抗原抗體反應，從而證實了輪狀病毒VP7蛋白存在于轉基因馬鈴薯組織中。其分子量大小約38KD，與預期的VP7蛋白的大小一致。而陰性對照植物塊莖則未觀察到任何雜交反應信號，說明雜交反應特異、結果可信。
實施例9西紅柿的轉化方案西紅柿種子(中蔬5號，重慶市農作物研究所提供)在20％的次氯酸鈉溶液中浸泡消毒20分鐘，然后用無菌的超純水，仔細漂洗3次或更多次。大約50粒消毒過的種子，各自播種在含有1/2 MSO培養(yǎng)基的一個濕盒中。農桿菌侵染生長7-10天后子葉或下胚軸無菌外植體，該外植體不需預培養(yǎng)，而是在切下后立即浸入農桿菌菌液中5-10分鐘，取出后用濾紙吸干多余的菌液，后移置共培養(yǎng)培養(yǎng)基MS1(MS基本培養(yǎng)基中加入1mg/L玉米素)，25℃遮光條件下共培養(yǎng)2天。然后將外植體轉移到選擇培養(yǎng)基MS2(MS基本培養(yǎng)基中加入1mg/L玉米素，100mg/L卡那霉素和500mg/L羧芐青霉素)誘導愈傷組織形成和幼苗分化(28)。在4到6周內，出現(xiàn)最初的發(fā)芽。當這些芽苗長到至少2厘米時，便從外植體上切下來，并確保至少包含有一個莖節(jié)，放入含有西紅柿根選擇性培養(yǎng)基中。新生根在約2星期內開始出現(xiàn)。然后轉移到滅菌土壤中，給予適宜的條件培養(yǎng)生長。
實施例10.PCR檢測輪狀病毒VP7基因在西紅柿中的整合情況西紅柿基因組DNA的提取方法基本同前實施例4馬鈴薯基因組DNA的提取(29)。取100mg新鮮葉片或塊莖，液氮冷凍后研成粉末狀，加入兩倍體積60℃預熱的勻漿緩沖液(CTAB 2％V/W，NaCl 1.4mol/L，EDTA 0.02mol/L，Tris-HCl 0.1mol/L)輕輕顛倒混勻，60℃保溫45分鐘。加等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)，混勻。5,000rpm，15-20℃離心5分鐘。取上清，加等體積的氯仿/異戊醇，混勻。5,000rpm，15-20℃離心5分鐘。取上清，加2/3體積預冷的異丙醇，混勻。-20℃放置2-3小時或過夜。11,000rpm離心10分鐘。棄上清，沉淀干燥，加適量的TE溶解沉淀。加1/10體積的3mol/L NaAc(pH5.2)和2-3倍體積預冷的無水乙醇，-20℃過夜。11,000rpm離心10min，棄上清。自然晾干沉淀，加適量TE溶解沉淀，紫外分光光度計上測定OD130、OD280及其比值，并進行DNA的定量。然后置-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 取上述西紅柿基因組DNA 1μg約1μl作為模版，加入針對輪狀病毒VP7基因序列的特異性引物各1μl，10×PCR緩沖液3μl，dNTP(各2.5mM)3μl，Taq酶0.5μl約2.5U，加水至總體積50ul。94℃5分鐘熱變性，然后94℃45秒，55℃30秒，72℃1分鐘，共進行35個循環(huán)，然后72℃10分鐘結束反應，取5ul擴增樣品進行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測。陰性對照植物中沒有發(fā)現(xiàn)特異性的條帶，而在轉基因西紅柿植物中則可擴增出1個約1000bp的特異性條帶，該結果表明輪狀病毒VP7蛋白基因已整合進入西紅柿基因組DNA中。
11.轉基因西紅柿的RNA分析轉基因西紅柿葉片和未成熟果實中RNA的提取方法如同實施例5。RNA樣品被倍比稀釋后，通過點雜交轉移到尼龍膜上(Roche公司產品Cat.NO.1209299)，紫外光照射3分鐘進行交連，風干。雜交與顯色反應如同實施例5。
輪狀病毒VP7基因在轉基因植物聽表達量可以通過RNA印跡反應進行評估。分別從轉基因西紅柿葉子、綠色果實和非轉基因西紅柿植株葉片中提取的總RNA，通過點雜交裝置被轉移到尼龍膜上，用地高辛標記的輪狀病毒VP7蛋白編碼序列DNA探針進行雜交。圖7是轉基因西紅柿葉子和果實中總RNA與探針雜交的結果，從雜交信號的強度比較來看。葉子中輪狀病毒VP7蛋白mRNA含量是果實中的2-3倍。而非轉基因西紅柿的葉子總RNA在高濃度下有較弱的雜交信號產生，但與轉基因西紅柿葉子相比可以認為是非特異性的。由于在雜交中同時加入了已知含量的PBI121/VP7質粒DNA(含輪狀病毒VP7蛋白編碼序列)作為陽性對照，相互比較發(fā)現(xiàn)，VP7蛋白基因在轉基因西紅柿葉子和被忠實轉錄并積累到較高水平，約占植物mRNA的0.01％，屬豐富mRNA。在成熟果實中RNA的含量很低，不能通過RNA印跡分析。
實施例12.葉子和果實中輪狀病毒VP7蛋白含量的測定VP7蛋白含量的測定方法同前實施例6，用研缽將植物組織磨碎，在磨碎過程中加入液氮，植物組織粉末中加入10倍體積滅菌無離子水進行稀釋。植物勻漿液16000g 4℃離心5分鐘，依據Bradford試劑盒(Bio-Rad)提供的方法，取部分上清液測定可溶性蛋白含量，以BSA作為標準蛋白質。以MA104細胞培養(yǎng)的人源輪狀病毒總蛋白為陽性對照(VP7蛋白含量為總病毒蛋白含量的30％)。陽性對照被稀釋成不同蛋白水平(即VP7蛋白含量為0.01-5.0ng)，在顏色反應后，讀取492nm光吸收值，制備一條標準吸收曲線。
表3中列出了轉基因西紅柿葉子和果實中包膜中蛋白的含量。取在溫室中生長的轉基因西紅柿的綠葉和紅色果實進行可溶性蛋白和輪狀病毒VP7蛋白含量的測定，就象上述所描述的那樣。非轉基因植物葉子和果實中檢測不到輪狀病毒VP7蛋白。
表3西紅柿葉子和果實中的包膜中蛋白含量器官ng/mg可溶性蛋白 ng/g鮮重葉子36(0.0036％)162果實(紅)48(0.0048％)102西紅柿葉子的包膜中蛋白含量略高于馬鈴薯葉片，表達量為可溶性蛋白的0.0036％。在成熟果實中包膜中蛋白的含量約占可溶性蛋白的0.0048％，或為102ng/g鮮重。因為果實的密度比較高，西紅柿果實中的包膜中蛋白表達量集中了西紅柿植株包膜中蛋白的大部分，一個重100克的西紅柿果實含有大約10ug包膜中蛋白重組抗原。
實施例13.轉基因植物在小鼠中引發(fā)的免疫反應實驗小鼠直接口服以轉輪狀病毒VP7基因馬鈴薯塊莖。對照組小鼠則直接口服未轉基因的馬鈴薯塊莖。給每一只實驗小鼠所服用的抗原的劑量相當，例如所含VP7蛋白量為42或者84微克。在給藥前一天，所有小鼠除水外停止一切進食并分籠飼養(yǎng)。在免疫的第0、7、14、42天，直接稱取轉基因馬鈴薯塊莖(1g或2g/每份)，用解剖刀切成薄片，涂上免疫佐劑(CT或CTB)，用長約6-8cm的注射針頭將馬鈴薯片串起來，置小鼠籠上。待小鼠吃完馬鈴薯片或24h后給飼料。在免疫前0、7、14、21、35、42、67天收集血液、尿液、唾液和糞便，作適當處理后-20℃凍存?zhèn)溆谩?br> 用ELISA方法檢測結果表明，各試驗組的動物免疫了馬鈴薯后，均檢測到體液和粘膜免疫應答反應。其中，血清中只檢測到IgG抗體，IgG抗體滴度從免疫后開始隨著免疫時間的延長而逐漸增加，在免疫后第42天達到最高滴度，而在第67天略有下降，表明轉VP7基因馬鈴薯疫苗可以誘導體液免疫應答。試驗組小鼠的唾液、糞便和尿液中均檢測到IgA，未檢測到IgG抗體，而轉空載體馬鈴薯免疫小鼠粘膜相關組織分泌液中(對照組)均未檢測到任何HVP7特異性IgA和IgG抗體?？贵w滴度從免疫后開始隨著免疫時間的延長而逐漸增加，在免疫后第42天達到最高滴度，而在第67天基本維持。鑒于抗體在免疫后第42天達到最高峰，我們選取免疫前和免疫后第42天這兩個時間點分別檢測了唾液、尿液和糞便中的特異性抗體濃度。結果表明，在免疫后第42天可以檢測到抗VP7特異性IgA抗體，而在免疫前檢測不到抗VP7特異性IgA抗體。糞便中的抗VP7特異性IgA抗體滴度最高，唾液次之，尿液中最低，幾乎檢測不到，表明轉VP7基因馬鈴薯疫苗可以誘導粘膜免疫應答。
為了檢測抗體的中和病毒能力，我們進行了體外病毒中和試驗。在進行RV接種MA104細胞的同時，加入不同稀釋度的IgA或IgG抗體共同培養(yǎng)。以綠色熒光標記抗HRV抗體檢測細胞。熒光顯微鏡下觀察綠色熒光細胞，當樣品孔發(fā)光細胞數比陽性對照發(fā)光細胞數減少了60％，表明該孔加入的抗體有中和病毒的效力。結果表明，當稀釋倍數低于40-60倍時，加了IgA的樣品孔發(fā)熒光細胞數均低于陽性對照孔細胞數60％以上，且隨著IgA稀釋倍數的增加，發(fā)光細胞數也相應增加，表明當IgA稀釋倍數低于40-60時，IgA抗體起到了中和病毒的作用，從而抑制了RV感染細胞。同樣，加入了IgG抗體的樣品孔細胞進行熒光檢測，但僅有稀釋倍數低于2-4倍時，IgG才具有中和病毒的效力，當高于2-8倍時，熒光染色的細胞與陽性對照孔沒有差別，因而判定為IgG基本無中和效力。
上述結果表明，VP7轉基因植物疫苗可以在體誘導系統(tǒng)免疫應答和局部免疫應答，局部免疫應答所產生的特異性抗體主要為分泌型IgA，在中和病毒方面IgA發(fā)揮了關鍵性作用，這與以往的研究一致。因此，VP7轉基因植物疫苗是HRV感染的預防性疫苗的候選形式。
本發(fā)明的進一步描述只是一些特別的優(yōu)先實施方案，是按照專利申請要求和為了解釋和說明本專利的內容。很顯然，在不背離本發(fā)明的精神和范圍之內，可在此基礎上，做進一步的改進和變化。
權利要求
1.一種用于轉化植物的質粒載體，特征在于其包括一段編碼A組輪狀病毒蛋白抗原或其片段或其融合蛋白的的DNA序列，該蛋白在天然狀態(tài)下具有免疫原性；一個與所說的DNA序列連接的植物啟動子，該啟動子操縱所說的基因在所說的植物中表達。
2.如權利要求1中所述的質粒載體，它含有一個選擇或標記基因。
3.如權利要求1中所述的質粒載體，其中所說的植物啟動子是花椰菜花葉病毒35S啟動子。
4.如權利要求1中所述的質粒載體，其中所說的植物至少有一部分是可食用性的。
5.如權利要求1中所述的質粒載體，其中所說的植物是西紅柿、馬鈴薯、萵苣、胡蘿卜、黃瓜或其它可食用的植物。
6.如權利要求1中所述的質粒載體，其中所說的A組輪狀病毒蛋白抗原是A組輪狀病毒外殼蛋白。
7.如權利要求1中所述的質粒載體，其中所說的A組輪狀病毒外殼蛋白是VP7。
8.如權利要求1中所述的質粒載體，其中所說的A組輪狀病毒蛋白抗原融合蛋白是指人源A組輪狀病毒的外殼抗原VP7與內質網滯留序列SEKDEL的融合蛋白。
9.如權利要求1中所述的質粒載體，其中所說的A組輪狀病毒蛋白抗原是具有Seq.ID.No.4所示的核苷酸序列或其簡并序列的基因所編碼的VP7抗原。
10.如權利要求1中所述的質粒載體，其中所說的A組輪狀病毒蛋白抗原是具有Seq.ID.No.5所示的氨基酸序列的VP7抗原。
11.一種用于基因槍法轉化植物的DNA序列包括一段編碼輪狀病毒蛋白抗原VP7或其片段或其融合蛋白的的DNA序列，該蛋白在天然狀態(tài)下具有免疫原性。一個與所說的DNA序列連接的植物啟動子，該啟動子操縱所說的基因在所說的植物中表達。
12.如權利要求11中所述的DNA序列，它含有一個選擇或標記基因。
13.如權利要求11中的DNA序列，其中包含有一個內質網滯留序列SEKDEL。
14.如權利要求13中的DNA序列，其編碼Seq.ID.No.5所示的蛋白抗原。
15.如權利要求14中的DNA序列，其具有Seq.ID.No.4所示的堿基序列。
16.如權利要求11中所述的DNA序列，其中的所說的植物啟動子是花椰菜花葉病毒35S啟動子。
17.如權利要求11中所述的DNA序列，其中所說的輪狀病毒蛋白抗原是人源A組輪狀病毒外殼蛋白。
18.如權利要求11中所述的DNA序列，其中所說的植物至少有一部分是可食用性的。
19.如權利要求11中所述的DNA序列，其中所說的植物是西紅柿、馬鈴薯、萵苣、胡蘿卜、黃瓜或其它可食用的植物。
20.一種構建轉基因植物細胞的方法，特征在于其包括構建一種如權利要求1-10任一項中所述的質粒載體或一種如權利要求11-19任一項中所述的DNA序列，其中都含有編碼A組輪狀病毒外殼蛋白的基因和可操縱該基因在所說的植物中表達的植物啟動子，該蛋白在天然狀態(tài)下具有免疫原性；并利用所說的質粒載體或DNA序列轉化植物細胞。
21.如權利要求20中所述的方法，它包括從所說的轉基因植物細胞中再生出完整的轉基因植株。
22.一種利用轉基因植物生產膠囊、沖劑或其它制劑的方法，特征在于其包括構建一種如權利要求1-10任一項中所述的質粒載體或一種如權利要求11-19任一項中所述的DNA序列，其中都含有編碼A組輪狀病毒外殼蛋白的基因和可操縱該基因在所說的植物中表達的植物啟動子，該外殼蛋白在天然狀態(tài)下具有免疫原性；用該質粒載體或其DNA序列轉化植物細胞；將轉基因植物的食用部分冷凍、干燥和磨碎后制作成膠囊、沖劑或其它制劑。
23.如權利要求22的方法，其中還包括在利用轉基因植物作為食物以及加工成膠囊、沖劑或其它制劑之前，應從所說的轉基因植物細胞中再生出完整的轉基因植株。
24.如權利要求22中的方法，其中還包括從所說的植物細胞中部分純化、完全純化出所說的抗原蛋白作為膠囊、沖劑或其它制劑的活性組成部分。
25.如權利要求22中的方法，其中包括至少收獲所說的轉基因植物的某一部分。
26.如權利要求22中的方法，其中所說的植物細胞是一個雙子葉植物的細胞，或是一個單子葉植物的細胞。
27.如權利要求22中的方法，其中所說的植物是西紅柿、馬鈴薯、萵苣、胡蘿卜、黃瓜或其它可食用的植物。
28.如權利要求22中的方法，其中所說的植物細胞是通過農桿菌系統(tǒng)轉化的。
29.如權利要求22中的方法，其中所說的農桿菌系統(tǒng)是農桿菌Ti質粒系統(tǒng)。
30.如權利要求22中的方法，其中所說的質粒載體是一個雙元載體系統(tǒng)。
31.如權利要求22中的方法，其中所說的質粒載體是一個整合性載體。
32.如權利要求22中的方法，其中所說的質粒載體是PBI121。
33.如權利要求22中的方法，其中所說的植物細胞是通過除農桿菌轉化系統(tǒng)以外的其它轉化方法如基因槍法、微管注射法、PEG吸收法以及電融合法等方法轉化的。
全文摘要
本發(fā)明涉及表達人源輪狀病毒外殼蛋白轉基因植物的生產方法，并進而通過直接食用或腸道給藥方式利用這些含有人源輪狀病毒外殼蛋白的轉基因植物及其衍生物從而引起人或哺乳動物對該抗原蛋白的免疫應答反應。
文檔編號C12N15/87GK1661022SQ200410021929
公開日2005年8月31日 申請日期2004年2月26日 優(yōu)先權日2004年2月26日
發(fā)明者吳玉章, 李晉濤 申請人:中國人民解放軍免疫學研究所