專利名稱：一種辣椒疫病生防制劑及其生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于農(nóng)作物病害生物防治技術(shù)領(lǐng)域。涉及一種防治辣椒真菌土傳病害的微生物活菌制劑的生產(chǎn)方法。本辣椒疫病生防制劑的主要有效成分為具有特定功能的放線菌。
背景技術(shù)：
辣椒是我國的特種農(nóng)產(chǎn)品，也是人們?nèi)粘Ｉ钪性鑫短砩氖卟撕驼{(diào)味品，更是重要的出口創(chuàng)匯優(yōu)勢經(jīng)濟作物。辣椒在我國種植范圍廣、面積大。據(jù)不完全統(tǒng)計，全國有27個省區(qū)有干制辣椒栽培，年種植500萬畝以上，干椒年總產(chǎn)60～70萬噸，年產(chǎn)值約50億元。陜西省種植的“秦椒”，以角果細(xì)長、顏色鮮紅、皺紋均勻、辣味佳美而久負(fù)盛名，出口遠(yuǎn)銷港澳、新加坡、馬來西亞、日韓和歐美等國家。陜西省辣椒年種植面積60～70萬畝，約占全國種植面積的15％，年產(chǎn)值6～7億元；青海省溫室辣椒種植面積約1.5萬畝，年產(chǎn)值高達1.5億元。辣椒已成為我省及其他省份辣椒主產(chǎn)區(qū)廣大農(nóng)民脫貧致富的特色經(jīng)濟作物，種植效益較高，在調(diào)整農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)和產(chǎn)業(yè)化開發(fā)中有重要意義。但由于辣椒疫病流行，嚴(yán)重阻礙了辣椒生產(chǎn)的發(fā)展。辣椒疫病防治已成了限制辣椒產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要因素之一。
辣椒疫病亦稱辣椒枯萎病、辣椒疫霉病，是由辣椒疫霉(Phytophthora capsici)引起的一種土傳病害，可稱之為“辣椒癌癥”，常造成辣椒減產(chǎn)，甚止絕收，已成為世界范圍內(nèi)辣椒的毀滅性病害。自80年代在我國發(fā)現(xiàn)以來已在陜西鳳翔、岐山、扶風(fēng)辣椒主產(chǎn)區(qū)造成了重大損失辣椒疫病發(fā)病率高達50％～80％，一般減產(chǎn)30％～50％，嚴(yán)重時造成絕收；青海、新疆、甘肅、寧夏及其它省份辣椒疫病流行造成的損失更為嚴(yán)重青海樂都、循化縣的大棚辣椒畝產(chǎn)值在1萬元以上，由于辣椒疫病絕收，有的農(nóng)民已停止種植。青海人大代表已將辣椒疫病防治作為議案提交人大會議討論，以尋求解決辦法。辣椒疫病防治已成為陜西、新疆、青海等西北五省及全國辣椒生產(chǎn)面臨的重大課題。
近十年來，人們已在查清辣椒疫病病原菌的基礎(chǔ)上進行了一系列化學(xué)防治技術(shù)研究，取得了一定的結(jié)果，但仍未從根本上解決辣椒疫病防治難題?；瘜W(xué)防治存在的主要問題辣椒疫病為土傳病，采用化學(xué)農(nóng)藥防治時農(nóng)藥必須施入土壤。而農(nóng)藥施入土壤后會發(fā)生物理、化學(xué)吸附、遷移及微生物降解轉(zhuǎn)化等一系列復(fù)雜過程，嚴(yán)重影響了化學(xué)農(nóng)藥的防治效果；若過度加大用量，不僅會影響辣椒生長，增加辣椒果實中農(nóng)藥殘留量，抑制土壤中有益微生物生長，而且會污染環(huán)境，增加生產(chǎn)成本。辣椒疫病一旦發(fā)生流行，則無法用化學(xué)農(nóng)藥控制。近20余年的化學(xué)防治研究表明，僅利用化學(xué)農(nóng)藥防治辣椒疫病并不能從根本上解決問題，在目前辣椒抗病育種尚無重大進展的情況下，探求新的突破途徑是十分必要的。
本發(fā)明的研究結(jié)果表明利用能產(chǎn)生抗生素、且能在辣椒根際土壤和根內(nèi)定植的特殊拮抗性放線菌抑制辣椒疫霉生長，從根源上消除辣椒疫病發(fā)生的條件，可以從根本上解決化學(xué)農(nóng)藥不能解決的辣椒疫病的防治難題。這是一條重要且很有希望的途徑利用微生態(tài)原理中微生物間的競爭及拮抗理論，通過選育并向辣椒根圈施入拮抗性微生物，可從根本上抑制辣椒疫霉生長繁殖，防止辣椒疫病發(fā)生。
本發(fā)明研制出的辣椒疫病生物防治制劑以能抑制辣椒疫霉生長的拮抗性放線菌活菌為主要有效成分，主要用于辣椒疫病生物防治，同時對其他農(nóng)作物的疫霉病害也有一定防效。
本發(fā)明研制出的辣椒疫病生物防治制劑可通過施入辣椒育苗苗床土、移栽時蘸根等方式接入辣椒根際土壤，利用拮抗菌在辣椒根際根內(nèi)大量繁殖抑制辣椒疫霉生長，從根本上防治辣椒疫病大規(guī)模流行，減少或取消化學(xué)農(nóng)藥使用，降低辣椒中農(nóng)藥殘留，提高辣椒質(zhì)量，生產(chǎn)綠色無公害農(nóng)產(chǎn)品，增加辣椒出口創(chuàng)匯，加快農(nóng)村產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整和農(nóng)民增收。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的主要目的提供一種利用微生態(tài)原理解決辣椒疫病問題的微生物產(chǎn)品及其生產(chǎn)方法。
發(fā)明的生物學(xué)原理利用能產(chǎn)生抗生素、且能在辣椒根際土壤和根內(nèi)定殖的特殊放線菌抑制辣椒根際土壤中辣椒疫霉生長及侵染辣椒根系，從根源上消除辣椒疫病發(fā)生的條件，從根本上解決辣椒疫病的防治問題。

發(fā)明內(nèi)容
從4500余株分離自青海農(nóng)田土壤放線菌中通過平皿拮抗性初篩、辣椒盆栽復(fù)篩、大田試驗驗證及拮抗菌在辣椒根系與土壤中的定殖能力測定等程序篩選出1株有實際應(yīng)用價值的高效生防菌。
1.辣椒疫病生防菌的生物學(xué)特征入選防菌代號為28G14，保藏在中國專利菌種保藏中心(CCTCC)，保藏號CCTCCNOM203077①28G14生防菌的分類地位28G14，原核微生物，屬于放線菌的鏈霉菌屬，未定種(streptomeces.spp)。
②28G14號生防菌的形態(tài)與培養(yǎng)特征形態(tài)特征在黃豆粉培養(yǎng)基上基絲分枝、發(fā)達、均勻，氣絲分枝、稀薄，分化出直狀孢子絲，孢子柱形至球形；在高氏1號上基絲分枝、發(fā)達、均勻，氣絲分枝、發(fā)達，孢子絲豐茂，鉤狀或頂端螺旋狀，孢子球形。
培養(yǎng)特征在黃豆粉培養(yǎng)基上無氣絲，基絲棕褐色，產(chǎn)褐色素；在高氏1號上孢子絲灰色、粉狀，基絲棕褐色，產(chǎn)褐色素。
生理生化特征水解淀粉；不產(chǎn)生卵磷脂酶；在石蕊牛奶培養(yǎng)基中不產(chǎn)酸、不產(chǎn)堿、不凝乳，胨化牛奶；液化明膠；產(chǎn)生H2S；在酪氨酸瓊脂上產(chǎn)生黑色素；不分解纖維素；對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、假絲酵母、青霉、西瓜枯萎病菌及黃瓜枯萎病菌均無拮抗作用。初步鑒定為鏈霉菌屬中的灰褐類群。
③28G14號生防菌的鑒定特征(表1、2、3)A.28G14號生防菌的碳源利用(表1)表1 28G14對14種碳源的利用

B.28G14號生防菌的氮源利用(表2)表2 28G14對14種氮源的利用

C.28G14號生防菌的抗藥性標(biāo)記(表3)表3 28G14對10種抗生素(mg/ml)及2種農(nóng)藥的抗藥性特征

④28G14號生防菌的在平皿內(nèi)對辣椒疫病病原菌的拮抗性28G14號生防菌對供試?yán)苯芬呙沟霓卓谷χ睆竭_到19mm。
⑤28G14號生防菌在辣椒根系中的定殖作用(表4)單接拮抗菌及拮抗菌與辣椒疫霉同時接種時，辣椒根內(nèi)的拮抗菌數(shù)量(104個/g根)分別為14.3及5.2，辣椒根內(nèi)無疫霉，辣椒不發(fā)??；單接疫霉時辣椒根內(nèi)的疫霉數(shù)量為27×104個/g根，辣椒發(fā)病死亡(表4)。
表4，28G14號生防菌在辣椒根系中的定殖作用(定殖密度104個/g根)

2.辣椒疫病生防制劑在盆栽實驗中對辣椒疫病的防效(表5)表5 28G14號拮抗菌在不同生育期對辣椒疫霉的盆栽試驗抗病性(未滅菌土壤)處理試驗辣椒株數(shù) 辣椒發(fā)病率(％)試驗時間(d) 3 45辣椒幼苗期盆CK1(未接疫霉)40 0 00栽試驗 CK2(接疫霉) 40 52.9 100 10028G14+疫霉40 0 00試驗時間(d) 7 14 30開花-結(jié)椒期 CK1(未接疫霉)40 0 00辣椒盆栽試驗CK2(接疫霉) 40 0 100 10028G14+疫霉40 0 0143.辣椒疫病生防制劑在田間實驗中對辣椒疫病的防效(表6)表6 28G14蘸根接種處理對辣椒疫病的田間防效(2003年，陜西省岐山青化鄉(xiāng))

4.辣椒疫病生防制劑的發(fā)酵工藝采用固態(tài)發(fā)酵工藝，發(fā)酵培養(yǎng)基成分如下固體發(fā)酵基質(zhì)原料包括有機和無機原料。有機原料(大米粉、玉米粉、黃豆餅粉麩皮等)主要為微生物提供碳源、能源及部分氮源將大米、玉米及黃豆餅粉碎至粒徑1mm左右。無機配料土壤、黃沙，除了提供少量無機養(yǎng)分離子外，主要用作填充料，增加固態(tài)培養(yǎng)基的疏松度和通氣性。土壤，系普通黃土母質(zhì)發(fā)育土壤，在中國北方廣泛分布；黃沙，普通建筑用，過1mm篩。
生防制劑固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基1號配方大米粉∶砂∶土＝30∶35∶35，培養(yǎng)物的活菌數(shù)(1.6×1016cfu/g)；
2號配方玉米粉∶砂∶土＝20∶40∶40，培養(yǎng)物的活菌數(shù)(2.0×1016cfu/g)；生防制劑固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)方法按上述配方比例配料，再按干料∶營養(yǎng)液＝1∶0.30～0.45的比例加入高氏1號液體培養(yǎng)基，攪拌均勻，121℃×30min滅菌，冷卻，按5％～10％用量接種生防菌菌懸液，拌勻，在滅菌培養(yǎng)盤中28℃培養(yǎng)，4～5d即可。
具體實施例方式
1.二級菌種的擴大培養(yǎng)∶將生防菌28G14斜面菌種接入加有250ml黃豆粉液體培養(yǎng)基〔可溶淀粉5.0，蔗糖10.0，蛋白胨2.0，酵母膏2.0，NaCl 2.0，K2HPO4，MgSO4.7H2O 0.5，CaCO31.0，黃豆粉浸汁(1L水加50g黃豆粉煮沸30分鐘，過濾取汁)1L，pH7.2～7.4，121℃滅菌30min?！?00ml三角瓶中，在搖床上28℃恒溫振蕩培養(yǎng)3d即可用作菌劑制備的接種劑。
2.菌劑制備按1號或2號配方比例配料，再按干料∶營養(yǎng)液＝1∶0.30～0.45的比例加入高氏1號液體培養(yǎng)基，攪拌均勻，121℃×30min滅菌，冷卻，按5％～10％用量接種生防菌菌懸液，拌勻，在滅菌培養(yǎng)盤中28℃培養(yǎng)4～5d；發(fā)酵產(chǎn)物自然風(fēng)干、低溫減壓干燥或低溫通風(fēng)烘干(40～45℃)，粉碎即可。
3.生防活菌制劑的用量與用法①蘸根2～3kg/畝；按固態(tài)菌劑∶水＝1∶4～5的比例將菌劑與清水混合均勻呈糊狀，移栽前將辣椒根系浸入生防制劑糊狀物中8～10小時或直接蘸根，使根系表面充分粘附生防菌接種材料，然后按常規(guī)3株1穴的方法栽植即可。
②苗床土處理將固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物按5％～10％的用量加入苗床土中并充分混勻，其余措施同常規(guī)辣椒育苗方法。辣椒移栽時根系所帶的營養(yǎng)土中有大量生防菌，移栽后繼續(xù)在辣椒根際土壤中生存、繁殖，可以有效抑制辣椒疫霉生長及對辣椒的侵染，從而達到防病的結(jié)果。
與現(xiàn)有的辣椒疫病化學(xué)防治方法相比，本發(fā)明具有以下主要優(yōu)點1.能有效解決辣椒疫霉的流行難題辣椒連茬種植導(dǎo)致辣椒根際土壤中辣椒疫霉數(shù)量大幅度增加，引起辣椒疫病發(fā)生。辣椒育苗或移栽時接種辣椒疫病生防菌，生防菌可在辣椒根際土壤中繁殖并侵染辣椒根系，可以從根本上抑制辣椒疫霉在辣椒根際土壤中大量繁殖及侵染辣椒根系，進而達到防治辣椒疫病流行的目的。
2.無化學(xué)農(nóng)藥殘留，無毒副作用本發(fā)明的理論基礎(chǔ)是微生物生態(tài)學(xué)，用于辣椒疫病防治的生防菌來源于農(nóng)田土壤，經(jīng)過工業(yè)發(fā)酵擴大培養(yǎng)后再施入農(nóng)田，對人及其它動物無毒副作用，使用后無任何化學(xué)農(nóng)藥殘留，對生產(chǎn)綠色食品有重要意義。
3.推廣應(yīng)用后社會及經(jīng)濟效益明顯本發(fā)明產(chǎn)品的生產(chǎn)原料主要為農(nóng)產(chǎn)品或農(nóng)副產(chǎn)品，原料來源廣，價格低廉，生產(chǎn)成本低；辣椒預(yù)防接種時辣椒生防制劑用量少，用法簡單，田間使用時不增加作業(yè)難度；企業(yè)生產(chǎn)及農(nóng)民施用該制劑均有明顯的社會、經(jīng)濟及生態(tài)效益。
4.本制劑可采用固態(tài)法發(fā)酵生產(chǎn)設(shè)備投入少，管理較為簡單，易于中小企業(yè)使用。
權(quán)利要求
1.一種用于辣椒疫病防治的生物活菌制劑。其特征在于放線菌為活菌制劑的主要有效成分；制劑主要用固態(tài)培養(yǎng)法生產(chǎn)；該制劑的主要防治對象為辣椒疫霉(Phytophthoracapsici)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的辣椒疫病生物防治活菌制劑，其特征在于活菌制劑的有效放線菌為鏈霉菌屬(streptomeces.spp)。該生防菌的形態(tài)與培養(yǎng)特征如下形態(tài)特征①在黃豆粉培養(yǎng)基(成分公知)上基絲分枝、發(fā)達、均勻；氣絲分枝、稀薄，分化出直狀孢子絲，孢子柱形至球形；②在高氏1號上基絲分枝、發(fā)達、均勻，氣絲分枝、發(fā)達，孢子絲豐茂，鉤狀或頂端螺旋狀，孢子球形。培養(yǎng)特征①在黃豆粉培養(yǎng)基上無氣絲，基絲棕褐色，產(chǎn)棕褐色素；②在高氏1號(成分公知)上孢子絲灰色、粉狀，基絲棕褐色，產(chǎn)棕褐色素。生理生化特征水解淀粉；不產(chǎn)生卵磷脂酶；在石蕊牛奶培養(yǎng)基中不產(chǎn)酸、不產(chǎn)堿、不凝乳，胨化牛奶；液化明膠；產(chǎn)生H2S；在酪氨酸瓊脂上產(chǎn)生黑色素；不分解纖維素；對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、假絲酵母、青霉、西瓜枯萎病菌及黃瓜枯萎病菌均無拮抗作用。該生防菌的碳源、氮源利用其抗藥性標(biāo)記特征(表1、2、3)如下表1 28G14對14種碳源的利用
表2 28G14對14種氮源的利用
表3 28G14對10種抗生素(mg/ml)及2種農(nóng)藥的抗藥性特征
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的辣椒疫病生物防治活菌制劑，其特征在于該發(fā)明的基本原理是從農(nóng)田及辣椒根際土壤中篩選具有雙重功能的特殊放線菌①能產(chǎn)生拮抗辣椒疫霉的抗生素，②能在辣椒根際土壤和辣椒根內(nèi)定植；利用所選特殊放線菌制成活菌制劑，通過蘸根或施入苗床土的方法給辣椒根系接種，進而使辣椒根系及根際土壤中辣椒疫霉拮抗菌的數(shù)量達到一定水平，實現(xiàn)抑制辣椒根際土壤中辣椒疫霉生長及侵染辣椒根系的目的，從根源上消除辣椒疫病發(fā)生的條件，從根本上解決辣椒疫病流行難題。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的辣椒疫病生物防治活菌制劑，其特征在于該活菌制劑用固態(tài)發(fā)酵法培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度28～30℃，培養(yǎng)時間3～5d；
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的辣椒疫病生物防治活菌制劑，其特征在于該活菌制劑的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基成分包括有機和無機原料兩部分有機原料，主要為微生物提供碳源、能源及部分氮源，包括大米粉、玉米粉、黃豆餅粉及麩皮等；無機配料土壤、黃沙等。配料前需將大米、玉米及黃豆餅粉碎至粒徑1mm左右。土壤，系普通黃土母質(zhì)發(fā)育土壤，在中國北方廣泛分布；黃沙，普通建筑用。黃沙過1mm篩。生防制劑固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基成分(質(zhì)量比)1號配方大米粉∶砂∶土＝30∶35∶35；2號配方玉米粉∶砂∶土＝20∶40∶40。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的辣椒疫病生物防治活菌制劑，其特征在于生防制劑固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)方法如下①二級菌種的擴大培養(yǎng)將生防菌28G14斜面菌種接入加有250ml黃豆粉液體培養(yǎng)基(可溶淀粉5.0，蔗糖10.0，蛋白胨2.0，酵母膏2.0，NaCl2.0，K2HPO4，MgSO4.7H2O0.5，CaCO31.0，黃豆粉浸汁(1L水加50g黃豆粉煮沸30分鐘，過濾取汁)1L，pH7.2～7.4，121℃滅菌30min。)的500ml三角瓶中，在搖床上28℃恒溫振蕩培養(yǎng)3～4d，即可用作菌劑制備的接種劑。②菌劑制備按1號配方或2號配方配料，再按干料∶營養(yǎng)液＝1∶0.30～0.45的比例加入高氏1號液體培養(yǎng)基(成分公知)，攪拌均勻，121℃×30min滅菌，冷卻，按5％～10％用量接種生防菌菌懸液，拌勻，在滅菌培養(yǎng)盤中28℃培養(yǎng)4～5d；發(fā)酵產(chǎn)物自然風(fēng)干、低溫減壓干燥或低溫烘干(40～45℃)，粉碎即可。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的辣椒疫病生物防治活菌制劑，其特征在于生防活菌制劑的用量與用法如下①蘸根30～40kg/公頃；按固態(tài)菌劑∶水＝1∶4～5的比例將菌劑與清水混合均勻呈糊狀，移栽前將辣椒根系浸入生防制劑糊狀物中8～10小時或直接蘸根，使根系表面充分粘附生防菌接種材料，然后按常規(guī)3株1穴的方法栽植即可。②苗床土處理將固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物按5％～10％的用量加入苗床土中并充分混勻，其余育苗措施同常規(guī)辣椒育苗。辣椒移栽時根系所帶的營養(yǎng)土中有大量生防菌，移栽后繼續(xù)在辣椒根際土壤中生存、繁殖，可有效抑制辣椒疫霉生長及其對辣椒的侵染，從而達到防病的目的。
全文摘要
本發(fā)明屬于農(nóng)作物病害生物防治技術(shù)領(lǐng)域。涉及一種防治辣椒真菌土傳病害的微生物生防活菌制劑的生產(chǎn)及使用方法。本制劑的主要有效成分為放線菌利用能產(chǎn)生抗生素、且能在辣椒根際土壤和根內(nèi)定殖的拮抗性特殊放線菌在辣椒根際土壤及辣椒根系大量繁殖抑制辣椒疫霉生長，從根源上消除辣椒疫病發(fā)生條件，解決化學(xué)農(nóng)藥難以解決的辣椒疫病防治難題；采用固態(tài)培養(yǎng)法生產(chǎn)，原料主要為農(nóng)副產(chǎn)品，來源廣，價格低廉；本制劑的主要防治對象為辣椒疫霉(Phytophthora.capsici)。本制劑可通過施入辣椒苗床土、移栽時蘸根等方式接入辣椒根際土壤，用量少，用法簡單。使用該制劑無化學(xué)農(nóng)藥殘留，推廣應(yīng)用后社會及經(jīng)濟效益明顯。
文檔編號C12N1/20GK1543801SQ200310116789
公開日2004年11月10日 申請日期2003年11月22日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月22日
發(fā)明者薛泉宏, 蔡艷, 司美茹, 涂璇, 陳占全, 袁虎林, 來航線, 牛小磊 申請人:西北農(nóng)林科技大學(xué), 楊凌科瑞微生物工程研究所