專利名稱：一種快速鑒定辣椒抗疫病相關(guān)基因功能的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物育種領(lǐng)域，具體涉及一種利用病毒誘導(dǎo)的基因沉默技術(shù)鑒定辣椒抗疫病相關(guān)基因功能的方法，該方法具有操作簡(jiǎn)單、無需進(jìn)行植物遺傳轉(zhuǎn)化、周期短，且可以在不同遺傳背景下進(jìn)行鑒定等優(yōu)點(diǎn)，是一種快速、有效鑒定植物基因功能的方法。
背景技術(shù)：
辣椒(Capsicumannuum L.)屬于爺科(Solanaceae)辣椒屬(Capsicum),—年生草本植物，原產(chǎn)于中南美洲熱帶亞熱帶地區(qū)，現(xiàn)在世界各地普遍栽培，也是我國(guó)種植面積最大的蔬菜作物之一。辣椒疫病是由疫霉菌(Phytophthora capsici L.)引起的一種毀滅性土傳病害，世界上許多國(guó)家均有發(fā)生。辣椒疫病是我國(guó)辣椒產(chǎn)業(yè)的重要病害，且有逐年加重的趨勢(shì)，從而造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。目前生產(chǎn)上主要以化學(xué)防治的方法來控制辣椒疫病的發(fā)生，不僅防治效果差，而且污染產(chǎn)品和環(huán)境，造成辣椒產(chǎn)品殘毒超標(biāo)，嚴(yán)重制約著我國(guó)辣椒產(chǎn)業(yè)在國(guó)際市場(chǎng)上的競(jìng)爭(zhēng)力。選育抗病品種是控制辣椒疫病最為經(jīng)濟(jì)和有效的方法。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，很多與辣椒疫病抗性相關(guān)的基因被克隆出來(Park, C. -J. , Shin, R. , Park, J. Μ. , Lee, G. -J. , Yoo, T. H. and Paek, K. -H. A hot peppercDNA encoding a pathogenesis-related protein 4is induced during the resistanceresponse to Tobacco mosaic virus [J] · Mol. Cells, (2001a) 11，122-127),并利用傳統(tǒng)的遺傳轉(zhuǎn)化方法對(duì)其功能進(jìn)行分析。然而，這種常規(guī)遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)存在著許多的局限性，其主要表現(xiàn)在于操作程序復(fù)雜、周期長(zhǎng)、轉(zhuǎn)化條件要求苛刻、轉(zhuǎn)化效率低且受辣椒品種影響，甚至對(duì)某些生物體具有致死效應(yīng)，嚴(yán)重地制約著分子育種的進(jìn)程。因此，需要尋找一種快速高效的基因功能鑒定方法。病毒誘導(dǎo)的基因沉默(virus induced gene silencing,VIGS)是從研究病毒和寄主之間的相互作用發(fā)展而來。在這個(gè)系統(tǒng)中，帶有目的基因片段的病毒載體被傳遞到植物細(xì)胞，植物細(xì)胞識(shí)別入侵病毒的威脅并且利用保護(hù)性防衛(wèi)機(jī)制來摧毀病毒和病毒載體上所攜帶的任何外源基因，從而影響植物本身目的基因的轉(zhuǎn)錄過程，導(dǎo)致目的基因mRNA發(fā)生特異性降解。即指攜帶與植物內(nèi)源功能基因同源序列的病毒在侵染植物之后，能夠使植物發(fā)生基因沉默從而出現(xiàn)表型突變，可以通過植物表型或生理指標(biāo)上的變化來反映該基因的功倉(cāng)泛。病毒誘導(dǎo)的基因沉默是近年來發(fā)展起來的一種快速鑒定植物基因功能的方法，它能最大限度地克服傳統(tǒng)方法的局限性，具有操作簡(jiǎn)單、周期短、沉默效率高，且可以在不同遺傳背景下生效等優(yōu)點(diǎn)。因此，適用于大規(guī)模的基因功能篩選。以下是發(fā)明人給出的相關(guān)參考文獻(xiàn)I、劉珂珂，辣椒對(duì)疫病的抗性及其機(jī)理研究[D].西北農(nóng)林科技大學(xué)博士學(xué)位論文(導(dǎo)師鞏振輝)，2009。2、羅德旭，鞏振輝，李大偉.辣椒疫病抗病性分子鑒定技術(shù)研究[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2008，17 (5) 76-80o3、 Rugang Chen, Hanxia Li， Liying Zhang, Junhong Zhang, Jinghua Xiao andZhibiao Ye. CaMi, a root-knot nematode resistance gene from hot pepper (Capsiumannuum L.) confers nematode resistance in tomato[J]. Plant cell reports，2007，26(7) :895-905。4、Park, C. -J.，Shin, R.，Park, J. M.，Lee，G. -J.，Yooj T. H. and Paekj K. _H. A hotpepper cDNA encoding a pathogenesis-related protein 4is induced during theresistance response to Tobacco mosaic virus[J]· Mol. Cells，2001，11 :122127。5、AndreC. Velasquez, Suma Chakravarthyj Gregory B. Martin. Virus-inducedGene Silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana and Tomato[J]. Journal ofVisualized Experiments, 2009, (28) :el292，DOI:10. 3791/1292。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)中關(guān)于辣椒基因功能鑒定中存在的問題，本發(fā)明的目的在于，提出一種快速鑒定辣椒抗疫病相關(guān)基因功能的方法。該方法具有操作簡(jiǎn)單、無需遺傳轉(zhuǎn)化、周期短且可以適宜不同品種遺傳背景等優(yōu)點(diǎn)，是一種快速、有效鑒定辣椒基因功能的方法。為了實(shí)現(xiàn)上述任務(wù)，本發(fā)明釆用如下的技術(shù)解決方案一種快速鑒定辣椒抗疫病相關(guān)基因的方法，其特征在于，該方法利用病毒誘導(dǎo)的基因沉默技術(shù)與辣椒離體葉片抗病性相結(jié)合的方法，進(jìn)行辣椒疫病抗性相關(guān)基因的功能分析，具體步驟如下I)辣椒材料的準(zhǔn)備供試材料為辣椒高抗疫病品種CM334，選擇籽粒飽滿的辣椒種子，55°C溫湯浸種20min，清水浸泡5h，28°C，全黑暗人工氣候箱中進(jìn)行催芽；經(jīng)4d種子露白，播于穴盤中。然后轉(zhuǎn)到25V /18°C、16h/8h晝夜溫光周期條件下進(jìn)行培養(yǎng)，期間澆Hoagland’ s營(yíng)養(yǎng)液；待苗子兩片真葉展平時(shí)，可用于病毒誘導(dǎo)的基因沉默注射；2)辣椒疫霉菌孢子懸浮液的準(zhǔn)備選擇辣椒疫霉菌生理小種phi作為接種病原菌，供試?yán)苯凡牧螩M334對(duì)辣椒疫霉菌生理小種Phl表現(xiàn)為抗性的方法(劉珂珂，辣椒對(duì)疫病的抗性及其機(jī)理研究[D].西北農(nóng)林科技大學(xué)博士學(xué)位論文，2009)。病原菌的準(zhǔn)備具體參考(羅德旭，鞏振輝，李大偉.辣椒疫病抗病性分子鑒定技術(shù)研究[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2008，17 (5) :76-80)的方法。3)重組病毒載體的構(gòu)建(I)辣椒葉片總RNA的提取與cDNA第一鏈合成采用Trizol 法提取辣椒葉片總 RNA (Rugang Chen, Hanxia Li, Liying Zhang,Junhong Zhang，Jinghua Xiao and Zhibiao Ye. CaMi,a root-knot nematode resistancegene from hot pepper (Capsium annuum L.) confers nematode resistance intomato [J]. Plant cell reports，2007，26 (7):895_905)，按 Promega 公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明進(jìn)行cDNA第一鏈合成。(2)目的基因片段的克隆用于病毒沉默載體構(gòu)建的基因片段大小一般要求在150_500bp之間，本申請(qǐng)中所涉及的基因引物設(shè)計(jì)均遵循本原則。根據(jù)NCBI公布的或已克隆的辣椒疫病抗性相關(guān)基因序列，設(shè)計(jì)合適的引物序列，以步驟(I)合成的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，DNA回收試劑盒(TaKaRa公司)回收目的基因。利用T4DNA連接酶(TaKaRa公司)將回收產(chǎn)物連接到克隆載體PMD19-T上，16°C過夜。轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a中，菌落PCR檢測(cè)初步確定連接成功后，送上海生物工程公司進(jìn)行測(cè)序。確認(rèn)克隆基因片段序列與目的基因序列一致時(shí)，即可用于構(gòu)建基因沉默表達(dá)載體。(3)重組載體構(gòu)建選擇病毒載體為煙草脆裂病毒的載體pTRVl和pTRV2。選擇合適的酶切位點(diǎn)對(duì)病毒載體pTRV2和步驟(2)經(jīng)過測(cè)序驗(yàn)證含有目的基因序列的克隆載體進(jìn)行雙酶切，37°C過夜，酶切產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳、溴化乙錠染色，凝膠成像系統(tǒng)拍照并切膠，用DNA回收試劑盒(TaKaRa公司)回收。利用T4DNA連接酶(TaKaRa公司)將回收到的目的基因片段連接到病毒載體片段上，16°C過夜。轉(zhuǎn)化DH5a，用菌落PCR和雙酶切方法檢測(cè)出目的基因片 段，證明目的基因已經(jīng)成功轉(zhuǎn)入病毒載體中。(4)轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌利用凍融法將攜帶pTRVl載體、pTRV2空載體和步驟(3)構(gòu)建好的病毒載體分別導(dǎo)入農(nóng)桿菌菌株GV3101中，經(jīng)PCR檢測(cè)確定為目的基因，保存菌液以備用。4)農(nóng)桿菌菌液注射( I)農(nóng)桿菌菌液準(zhǔn)備將攜帶pTRVl載體、pTRV2空載體和步驟3)構(gòu)建好的病毒載體的農(nóng)桿菌菌液按已知的方法進(jìn)行活化，具體參考(Andr6C. Velasquez, Suma Chakravarthy, GregoryB. Martin.Virus-induced Gene Si lencing(VIGS) in Nicotiana benthamiana andTomato[J]. Journal of Visualized Experiments, 2009, (28) el292, DOI:10. 3791/1292)的方法。(2)注射接種先用針頭分別在辣椒兩片真葉葉脈附近打個(gè)小孔，然后用去掉針頭的I. OmL注射器在葉片正面注射菌液，若能看到整個(gè)葉面出現(xiàn)水潰狀，證明菌液已被注射進(jìn)植株體內(nèi)。將注射接種后的辣椒植株放入人工氣候箱，18°C、暗培養(yǎng)2d后，轉(zhuǎn)入22°C /18°C、16h/8h、60%濕度條件下進(jìn)行培養(yǎng)，觀察并記錄辣椒的表型變化，期間以Hoagland’s營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行澆灌。5)基因沉默效果檢測(cè)(I)沉默表型觀察辣椒葉片農(nóng)桿菌注射接種約25d左右就會(huì)出現(xiàn)不同程度的病毒癥狀，證明病毒載體已經(jīng)成功進(jìn)入植株體內(nèi)。(2)辣椒尚體葉片接種鑒定待檢測(cè)基因功能選帶有病毒癥狀的辣椒離體葉片接種辣椒疫霉菌phi。離體葉片接種濃度為I. OX IO4個(gè)，每個(gè)葉片10 μ L0接種辣椒疫霉菌孢子懸浮液后，于28°C，相對(duì)濕度95%，50001x人工氣候箱進(jìn)行培養(yǎng)，5d后觀察表型癥狀的變化。觀察方法是，在葉片接種部位出現(xiàn)明顯病斑的，說明被檢測(cè)基因與辣椒抗疫病相關(guān)；相反，在葉片接種部位沒有出現(xiàn)明顯病斑的，則說明被檢測(cè)基因與辣椒抗疫病無關(guān)，或是無功能基因。本發(fā)明創(chuàng)制的鑒定辣椒基因功能的方法操作簡(jiǎn)單、周期短、無需基因全長(zhǎng)序列、無需轉(zhuǎn)基因植株、表型獲取快等諸多優(yōu)點(diǎn)，可用于快速、高效、高通量地分析基因功能研究。


圖I為辣椒CaPOD基因沉默的表型觀察圖片。其中，左圖為pTRV_00 (空載體，不含目的基因)，右圖為pTRV-CaP0D (重組載體，攜帶目的基 因)。圖2為辣椒CaPOD基因沉默離體葉片接種辣椒疫霉菌的表型觀察圖片。其中，圖左邊為pTRV-00 (空載體，不含目的基因)，圖右邊為PTRV-CaP0D (重組載體，攜帶目的基因)。圖3為辣椒CaRGAl基因沉默的表型觀察圖片。其中，左圖為pTRV_00 ；(空載體，不含目的基因)，右圖為=PTRV-CaRGAl (重組載體，攜帶目的基因)。圖4為辣椒CaRGAl基因沉默離體葉片接種辣椒疫霉菌的表型觀察圖片。其中，圖左邊為pTRV-00 ；(空載體，不含目的基因)，圖右邊為pTRV-CaRGAl (重組載體，攜帶目的基因)。以下結(jié)合附圖和發(fā)明人給出的應(yīng)用實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。
具體實(shí)施例方式按照本發(fā)明的技術(shù)方案，發(fā)明人給出以下具體的應(yīng)用實(shí)施例，需要說明的是，以下實(shí)施例僅是說明性的，本發(fā)明的應(yīng)用并不限于這些實(shí)施例。應(yīng)用實(shí)施例I :本實(shí)施例利用病毒誘導(dǎo)的基因沉默技術(shù)與辣椒離體葉片抗病性相結(jié)合的方法，進(jìn)行辣椒疫病抗性相關(guān)基因的功能分析，具體如下I、辣椒材料的準(zhǔn)備供試材料為辣椒高抗疫病品種CM334。選擇籽粒飽滿的辣椒種子，55°C溫湯浸種20min，清水浸泡5h，28°C，全黑暗人工氣候箱中進(jìn)行催芽。經(jīng)4d種子露白，播于穴盤中。然后轉(zhuǎn)到25°C /18°C、16h/8h晝夜溫光周期條件下進(jìn)行培養(yǎng)，期間澆Hoagland’s營(yíng)養(yǎng)液。待苗子兩片真葉展平時(shí)，可用于病毒誘導(dǎo)的基因沉默注射。2.辣椒疫霉菌孢子懸浮液的準(zhǔn)備選擇辣椒疫霉菌生理小種Phl作為接種病原菌，供試?yán)苯凡牧螩M334對(duì)其表現(xiàn)為抗性(劉珂珂，辣椒對(duì)疫病的抗性及其機(jī)理研究[D].西北農(nóng)林科技大學(xué)博士學(xué)位論文，2009)。病原菌的準(zhǔn)備具體參考(羅德旭，鞏振輝，李大偉，辣椒疫病抗病性分子鑒定技術(shù)研究[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2008，17 (5) 76-80)的方法。3、重組病毒載體的構(gòu)建(I)辣椒葉片總RNA的提取與cDNA第一鏈合成采用Trizol法提取辣椒葉片總RNA (Rugang Chen, Hanxia Li, Liying Zhang, Junhong Zhang, Jinghua Xiao and ZhibiaoYe. CaMij a root-knot nematode resistance gene from hot pepper (Capsium annuumL) confers nematode resistance in tomato[J]. Plant cell reports，2007，26 (7):895-905)，按Promega公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明進(jìn)行cDNA第一鏈合成。(2)目的基因片段的克隆用于病毒沉默載體構(gòu)建的基因片段大小一般要求在150-500bp之間，本申請(qǐng)中所涉及的基因引物設(shè)計(jì)均遵循本原則。根據(jù)申請(qǐng)人課題組克隆的辣椒過氧化物酶(CaPOD)基因序列(NCBI GenBank登錄號(hào)FJ596178)(劉珂珂，辣椒對(duì)疫病的抗性及其機(jī)理研究[D]. 2009)，設(shè)計(jì)合成一對(duì)帶有Xba I和Bam HI雙酶切位點(diǎn)的引物序列(正向引物5’ -GGGTCTAGAGTGCTCAACACACACTTTATTCTTCTC-3> ;反向引物5’ -GGG GGATCCCCAAGAATGACAACAGAGTCCCTA-3J )，片段大小為480bp。以步驟(I)合成的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，DNA回收試劑盒(TaKaRa公司)回收目的基因。利用T4DNA連接酶(TaKaRa公司)將回收產(chǎn)物連接到克隆載體pMD19_T上，16°C過夜。轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a中，菌落PCR檢測(cè)初步確定連接成功后，送上海生物工程公司進(jìn)行測(cè)序。經(jīng)分析得出擴(kuò)增的基因片段序列與設(shè)計(jì)目的基因序列一致，即可用于基因沉默載體的構(gòu)建。(3)重組載體構(gòu)建用于本實(shí)施例的病毒載體為煙草脆裂病毒的載體pTRVl和PTRV2。選用Xba I和Bam HI內(nèi)切酶對(duì)病毒載體pTRV2和經(jīng)步驟(2)驗(yàn)證過的克隆載體T-CaPOD進(jìn)行雙酶切，37°C過夜，酶切產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳、溴化乙錠染色，凝膠成像系統(tǒng)拍照并切膠，用DNA回收試劑盒(TaKaRa公司)回收。利用T4DNA連接酶(TaKaRa公司)將回收到的目的基因片段連接到病毒載體片段上，16°C過夜。轉(zhuǎn)化DH5a，用菌落PCR和雙酶切方法檢測(cè)出480bp大小的目的基因片段，證明重組病毒載體pTRV-CaPOD已經(jīng)構(gòu)建成功，可用于下一步農(nóng)桿菌侵染。 (4)轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌利用凍融法將攜帶pTRVl載體、pTRV2空載體和步驟(3)構(gòu)建好的病毒載體pTRV-CaPOD分別導(dǎo)入農(nóng)桿菌菌株GV3101中，PCR檢測(cè)確定擴(kuò)增出480bp的目的條帶，保存菌液以備用。4、農(nóng)桿菌菌液注射(I)農(nóng)桿菌菌液準(zhǔn)備將攜帶pTRVl載體、pTRV2空載體和步驟3構(gòu)建好的病毒載體pTRV-CaPOD的農(nóng)桿菌菌液按已知的方法進(jìn)行活化，具體參考(Andr6C. Velasquez, SumaChakravarthy, Gregory B. Martin. Virus-induced Gene Silencing(VIGS) in Nicotianabenthamiana and Tomato [J]. Journal of Visualized Experiments,2009, (28) e1292，DOI: 10. 3791/1292)方法。(2)注射接種先用針頭分別在辣椒兩片真葉葉脈附近打個(gè)小孔，然后用去掉針頭的I. OmL注射器在葉片正面注射菌液，若能看到整個(gè)葉面出現(xiàn)水潰狀，證明菌液已被注射進(jìn)植株體內(nèi)。將注射接種后的辣椒植株放入人工氣候箱，18 °C、暗培養(yǎng)2d后，轉(zhuǎn)入22 °C /18 °C、16h/8h、60%濕度條件下進(jìn)行培養(yǎng)，觀察并記錄辣椒的表型變化，期間以Hoagland’s營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行燒灌。5.基因沉默效果檢測(cè)(I)沉默表型觀察農(nóng)桿菌注射接種大約25d后，辣椒葉片出現(xiàn)明顯的病毒癥狀表現(xiàn)(見圖I):部分葉脈褪綠，周圍出現(xiàn)黃綠色病毒斑點(diǎn)，有些葉片邊緣甚至卷曲，說明重組病毒載體pTRV-CaPOD已經(jīng)成功進(jìn)入植株體中。(2)辣椒尚體葉片接種鑒定待檢測(cè)基因功能選帶有病毒癥狀的pTRV-CaPOD辣椒離體葉片進(jìn)行辣椒疫霉菌phi接種。離體葉片接種濃度為I. OX IO4個(gè)每個(gè)葉片10 μ L。接種辣椒疫霉菌孢子懸浮液后，于28°C，相對(duì)濕度95%，50001x人工氣候箱進(jìn)行培養(yǎng)，5d后觀察到的表型癥狀變化情況(見圖2)pTRV-CaPOD病毒沉默植株離體葉片出現(xiàn)明顯的壞死反應(yīng)，而對(duì)照pTRV_00植株的離體葉片沒有壞死斑，這一結(jié)果說明CaPOD與辣椒的抗疫病相關(guān)。應(yīng)用實(shí)施例2:本實(shí)施例利用病毒誘導(dǎo)的基因沉默技術(shù)與辣椒離體葉片抗病性相結(jié)合的方法，進(jìn)行辣椒疫病抗性相關(guān)基因的功能分析，具體如下I、辣椒材料的準(zhǔn)備供試材料為辣椒高抗疫病品種CM334。選擇籽粒飽滿的辣椒種子，55°C溫湯浸種20min，清水浸泡5h，28°C，全黑暗人工氣候箱中進(jìn)行催芽。經(jīng)4d種子露白，播于穴盤中。然后轉(zhuǎn)到25°C /18°C、16h/8h晝夜溫光周期條件下進(jìn)行培養(yǎng)，期間澆Hoagland’s營(yíng)養(yǎng)液。待苗子兩片真葉展平時(shí)，可用于病毒誘導(dǎo)的基因沉默注射。2、辣椒疫霉菌孢子懸浮液的準(zhǔn)備選擇辣椒疫霉菌生理小種phi作為接種病原菌，供試?yán)苯凡牧螩M334對(duì)其表現(xiàn)為抗性(劉珂珂，辣椒對(duì)疫病的抗性及其機(jī)理研究[D].西北農(nóng)林科技大學(xué)博士學(xué)位論文，2009)。病原菌的準(zhǔn)備具體參考(羅德旭，鞏振輝，李大偉.辣椒疫病抗病性分子鑒定技術(shù)研究[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2008，17 (5):76-80)的方法。
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3、重組病毒載體的構(gòu)建(I)辣椒葉片總RNA的提取與cDNA第一鏈合成采用Trizol法提取辣椒葉片總RNA (Rugang Chen, Hanxia Li, Liying Zhang, Junhong Zhang, Jinghua Xiao and ZhibiaoYe. CaMi, a root-knot nematode resistance gene from hot pepper(Capsium annuumL.) confers nematode resistance in tomato[J]. Plant cell reports, 2007，26 (7):895-905),按Promega公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明進(jìn)行cDNA第一鏈合成。(2)目的基因片段的克隆用于病毒沉默載體構(gòu)建的基因片段大小一般要求在150-500bp之間，本發(fā)明中所涉及的基因引物設(shè)計(jì)均遵循本原則。根據(jù)申請(qǐng)人課題組克隆的辣椒CaRGAl基因序列(NCBI GenBank登錄號(hào)GQ386945. I),設(shè)計(jì)合成一對(duì)帶有Eco RI和Bam HI雙酶切位點(diǎn)的引物序列(正向引物5，-GGGGAATTCAAGTCCTCAAACCACACCCCT-3'反向引物5’ -GGGGGATCCCAACATACTCCACCTCCGCAG-3’)，片段大小為 210bp。以步驟(I)合成的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，DNA回收試劑盒(TaKaRa公司)回收目的基因。利用T4DNA連接酶(TaKaRa公司)將回收產(chǎn)物連接到克隆載體pMD19-T上，16°C過夜。轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a中，菌落PCR檢測(cè)初步確定連接成功后，送上海生物工程公司進(jìn)行測(cè)序。經(jīng)分析得出擴(kuò)增的基因片段序列與設(shè)計(jì)目的基因序列一致，即可用于構(gòu)建基因沉默載體。(3)重組載體構(gòu)建用于本實(shí)施例的病毒載體為煙草脆裂病毒的載體pTRVl和PTRV2。選用Eco RI和Bam HI內(nèi)切酶對(duì)病毒載體pTRV2和經(jīng)步驟(2)驗(yàn)證過的克隆載體T-CaRGAl進(jìn)行雙酶切，37°C過夜，酶切產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳、溴化乙錠染色，凝膠成像系統(tǒng)拍照并切膠，用DNA回收試劑盒(TaKaRa公司)回收。利用T4DNA連接酶(TaKaRa公司)將回收到的目的基因片段連接到病毒載體片段上，16°C過夜。轉(zhuǎn)化DH5a，用菌落PCR和雙酶切方法檢測(cè)出2IObp大小的目的基因片段，證明重組病毒載體pTRV-CaRGAl構(gòu)建成功，可用于下一步的農(nóng)桿菌侵染。(4)轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌利用凍融法將攜帶pTRVl載體、pTRV2空載體和步驟(3)構(gòu)建好的病毒載體的PTRV-CaRGAl分別導(dǎo)入農(nóng)桿菌菌株GV3101中，PCR檢測(cè)確定擴(kuò)增出210bp的目的條帶，保存菌液以備用。4、農(nóng)桿菌菌液注射
(I)農(nóng)桿菌菌液準(zhǔn)備將攜帶pTRVl載體、pTRV2空載體和步驟3構(gòu)建好的病毒載體pTRV-CaRGAl的農(nóng)桿菌菌液按已知的方法進(jìn)行活化,具體參考(Andr6C. Velasquez, SumaChakravarthy, Gregory B. Martin. Virus-induced Gene Silencing(VIGS) in Nicotianabenthamiana and Tomato[J].Journal of Visualized Experiments,2009, (28) e1292，DOI: 10. 3791/1292)方法。(2)注射接種先用針頭分別在辣椒兩片真葉葉脈附近打個(gè)小孔，然后用去掉針頭的I. OmL注射器在葉片正面注射菌液，若能看到整個(gè)葉面出現(xiàn)水潰狀，證明菌液已被注射進(jìn)植株體內(nèi)。將注射接種后的辣椒植株放入人工氣候箱，18 °C、暗培養(yǎng)2d后，轉(zhuǎn) 入22 °C /18 °C、16h/8h、60%濕度條件下進(jìn)行培養(yǎng)，觀察并記錄辣椒的表型變化，期間以Hoagland’s營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行燒灌。5.基因沉默效果檢測(cè)(I)沉默表型觀察農(nóng)桿菌注射接種大約25d后，辣椒葉片出現(xiàn)不同程度的病毒癥狀(見圖3):即葉片表面有花綠色病毒斑點(diǎn)出現(xiàn)，證明重組病毒載體pTRV-CaRGAl已成功導(dǎo)入辣椒體內(nèi)。(2)辣椒尚體葉片接種鑒定待檢測(cè)基因功能選帶有病毒癥狀的pTRV-CaRGAl辣椒離體葉片，接種辣椒疫霉菌phi。離體葉片接種濃度為I. OX IO4個(gè)· mr1，每個(gè)葉片10 μ L。接種辣椒疫霉菌孢子懸浮液后，于28°C，相對(duì)濕度95%，50001x人工氣候箱進(jìn)行培養(yǎng)，5d后觀察到的表型癥狀變化情況(見圖4)pTRV-CaRGAl病毒沉默植株離體葉片出現(xiàn)輕度的壞死斑，而對(duì)照pTRV_00植株幾乎沒變化，證明CaRGAl參與辣椒對(duì)疫病的抗性反應(yīng)。應(yīng)用實(shí)施例3:本實(shí)施例利用病毒誘導(dǎo)的基因沉默技術(shù)與辣椒離體葉片抗病性相結(jié)合的方法，進(jìn)行辣椒疫病抗性相關(guān)基因的功能分析，具體如下I、辣椒材料的準(zhǔn)備供試材料為辣椒高抗疫病品種CM334。選擇籽粒飽滿的辣椒種子，55°C溫湯浸種20min，清水浸泡5h，28°C，全黑暗人工氣候箱中進(jìn)行催芽。經(jīng)4d種子露白，播于穴盤中。然后轉(zhuǎn)到25°C /18°C、16h/8h晝夜溫光周期條件下進(jìn)行培養(yǎng)，期間澆Hoagland’s營(yíng)養(yǎng)液。待苗子兩片真葉展平時(shí)，可用于病毒誘導(dǎo)的基因沉默注射。2、辣椒疫霉菌孢子懸浮液的準(zhǔn)備選擇辣椒疫霉菌生理小種phi作為接種病原菌，供試?yán)苯凡牧螩M334對(duì)其表現(xiàn)為抗性(劉珂珂，辣椒對(duì)疫病的抗性及其機(jī)理研究[D].西北農(nóng)林科技大學(xué)博士學(xué)位論文，2009)。病原菌的準(zhǔn)備具體參考(羅德旭，鞏振輝，李大偉.辣椒疫病抗病性分子鑒定技術(shù)研究[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2008，17 (5):76-80)的方法。3、重組病毒載體的構(gòu)建(I)辣椒葉片總RNA的提取與cDNA第一鏈合成采用Trizol法提取辣椒葉片總RNA (Rugang Chen, Hanxia Li, Liying Zhang, Junhong Zhang, Jinghua Xiao and ZhibiaoYe. CaMij a root-knot nematode resistance gene from hot pepper (Capsium annuumL.) confers nematode resistance in tomato[J]. Plant cell reports，2007，26 (7):895-905)，按Promega公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明進(jìn)行cDNA第一鏈合成。(2)目的基因片段的克隆用于病毒沉默載體構(gòu)建的基因片段大小一般要求在150-500bp之間，本發(fā)明中所涉及的基因引物設(shè)計(jì)均遵循本原則。根據(jù)NCBI公布的辣椒線粒體Caatp6基因序列(GenBank登錄號(hào)DQ: 126681),設(shè)計(jì)合成一對(duì)帶有Eco RI和Bam HI雙酶切位點(diǎn)的引物序列(正向引物5’ -CCGGAATTCGCTTCGCCTTCGTATAGTAGTTC-3，;反向引物5’ -CGCGGATCCAGTCATAGTGCTCACCCTGTTTG-3> )，片段大小為 300bp。以步驟(I)合成的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，DNA回收試劑盒(TaKaRa公司)回收目的基因。利用T4DNA連接酶(TaKaRa公司)將回收產(chǎn)物連接到克隆載體pMD19-T上，16°C過夜。轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a中，菌落PCR檢測(cè)初步確定連接成功后，送上海生物工程公司進(jìn)行測(cè)序。經(jīng)分析得出擴(kuò)增的基因片段序列與設(shè)計(jì)目的基因序列一致，即可用于構(gòu)建基因沉默載體。(3)重組載體構(gòu)建用于本發(fā)明的病毒載體為煙草脆裂病毒的載體pTRVl和PTRV2。選用Eco RI和Bam HI內(nèi)切酶對(duì)病毒載體pTRV2和經(jīng)步驟(2)驗(yàn)證過的克隆載體T-Ca-atp6-2進(jìn)行雙酶切，37°C過夜，酶切產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳、溴化乙錠染色，凝膠成像系統(tǒng)拍照并切膠，用DNA回收試劑盒(TaKaRa公司)回收。利用T4DNA連接酶(TaKaRa公司)將回收到的目的基因片段連接到病毒載體片段上，16°C過夜。轉(zhuǎn)化DH5a，用菌落PCR 和雙酶切方法檢測(cè)出300bp大小的目的基因片段，證明重組病毒載體pTRV-Ca-atp6-2構(gòu)建成功，可用于下一步的農(nóng)桿菌侵染。(4)轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌利用凍融法將攜帶pTRVl載體、pTRV2空載體和步驟(3)構(gòu)建好的病毒載體pTRV-Ca-atp6-2分別導(dǎo)入農(nóng)桿菌菌株GV3101中，PCR檢測(cè)確定擴(kuò)增出300bp的目的條帶，保存菌液以備用。4、農(nóng)桿菌菌液注射(I)農(nóng)桿菌菌液準(zhǔn)備將攜帶pTRVl載體、pTRV2空載體和步驟3構(gòu)建好的病毒載體pTRV-Ca-atp6-2的農(nóng)桿菌菌液按已知的方法進(jìn)行活化,具體參考(Andr6C. Velasquez, SumaChakravarthy, Gregory B. Martin. Virus-induced Gene Silencing(VIGS) in Nicotianabenthamiana and Tomato[J]. Journal of Visualized Experiments,2009, (28)el292, DOI: 10. 3791/1292)方法。(2)注射接種先用針頭分別在辣椒兩片真葉葉脈附近打個(gè)小孔，然后用去掉針頭的I. OmL注射器在葉片正面注射菌液，若能看到整個(gè)葉面出現(xiàn)水潰狀，證明菌液已被注射進(jìn)植株體內(nèi)。將注射接種后的辣椒植株放入人工氣候箱，18 °C、暗培養(yǎng)2d后，轉(zhuǎn)入2 2 °C /18 °C、16 h / 8 h、6 O %濕度條件下進(jìn)行培養(yǎng)，觀察并記錄辣椒的表型變化，期間以Hoagland’s營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行燒灌。5.基因沉默效果檢測(cè)(I)沉默表型觀察農(nóng)桿菌注射接種大約25d后，辣椒葉片出現(xiàn)輕度病毒病斑癥狀，葉片有卷曲現(xiàn)象，證明重組病毒載體pTRV-Ca-atp6-2已成功導(dǎo)入辣椒植株體內(nèi)。(2)辣椒離體葉片接種鑒定待檢測(cè)基因功能選帶有病毒癥狀的pTRV-Ca-atp6_2辣椒離體葉片，接種辣椒疫霉菌phi。離體葉片接種濃度為I. OX IO4個(gè)每個(gè)葉片10 μ L0接種辣椒疫霉菌孢子懸浮液后，于28°C，相對(duì)濕度95%，50001x人工氣候箱進(jìn)行培養(yǎng)，5d后觀察到的表型癥狀變化情況，發(fā)現(xiàn)pTRV-Ca-atp6-2病毒沉默植株離體葉片與對(duì)照pTRV-ΟΟ植株離體葉片無明顯差異，說明Ca-atp6-2基因與辣椒疫病抗性無關(guān)。
權(quán)利要求
1. 一種快速鑒定辣椒抗疫病相關(guān)基因的方法，其特征在于，該方法利用病毒誘導(dǎo)的基因沉默技術(shù)與辣椒離體葉片抗病性相結(jié)合的方法，進(jìn)行辣椒疫病抗性相關(guān)基因的功能分析，具體步驟如下 1)辣椒材料的準(zhǔn)備 供試材料為辣椒高抗疫病品種CM334。選擇籽粒飽滿的辣椒種子，55°C溫湯浸種20min,清水浸泡5h，28°C，全黑暗人工氣候箱中進(jìn)行催芽；經(jīng)4d種子露白，播于穴盤中，然后轉(zhuǎn)到25°C/18°C、16h/8h晝夜溫光周期條件下進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)期間澆Hoagland’s營(yíng)養(yǎng)液，待苗子兩片真葉展平時(shí)，用于病毒誘導(dǎo)的基因沉默注射； 2)辣椒疫霉菌孢子懸浮液的準(zhǔn)備 選擇辣椒疫霉菌生理小種Phl作為接種病原菌，供試?yán)苯凡牧螩M334對(duì)辣椒疫霉菌生理小種phi表現(xiàn)為抗性的方法。
3)重組病毒載體的構(gòu)建 (1)辣椒葉片總RNA的提取與cDNA第一鏈合成 采用Trizol法提取辣椒葉片總RNA,按Promega公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明進(jìn)行cDNA第一鏈合成； (2)目的基因片段的克隆 用于基因沉默表達(dá)載體構(gòu)建的基因片段大小要求在150-500bp之間；根據(jù)NCBI公布的或已克隆的辣椒疫病抗性相關(guān)基因序列，設(shè)計(jì)合適的引物序列；以步驟(I)合成的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，DNA回收試劑盒回收目的基因；利用T4DNA連接酶將回收產(chǎn)物連接到克隆載體pMD19-T上，16°C過夜，然后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a中，菌落PCR檢測(cè)初步確定連接成功后，進(jìn)行測(cè)序，確認(rèn)克隆基因片段序列與目的基因序列一致時(shí)，即可用于構(gòu)建基因沉默表達(dá)載體； (3)重組載體構(gòu)建 選擇病毒載體為煙草脆裂病毒的載體pTRVl和pTRV2 ;選擇合適的酶切位點(diǎn)對(duì)病毒載體pTRV2和步驟(2)經(jīng)過測(cè)序驗(yàn)證含有目的基因序列的克隆載體進(jìn)行雙酶切，37°C過夜，酶切產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳、溴化乙錠染色，凝膠成像系統(tǒng)拍照并切膠，用DNA回收試劑盒回收，利用T4DNA連接酶將回收到的目的基因片段連接到病毒載體片段上，16°C過夜，轉(zhuǎn)化DH5a，用菌落PCR和雙酶切方法檢測(cè)出目的基因片段，證明目的基因已經(jīng)成功轉(zhuǎn)入病毒載體中； (4)轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌 利用凍融法將攜帶PTRVl載體、pTRV2空載體和步驟(3)構(gòu)建好的病毒載體分別導(dǎo)入農(nóng)桿菌菌株GV3101中，經(jīng)PCR檢測(cè)確定為目的基因，保存菌液以備用。
4)農(nóng)桿菌菌液注射 (1)農(nóng)桿菌菌液準(zhǔn)備 將攜帶PTRVl載體、pTRV2空載體和步驟3)構(gòu)建好的病毒載體的農(nóng)桿菌菌液按已知的方法進(jìn)行活化； (2)注射接種先用針頭分別在辣椒兩片真葉葉脈附近打個(gè)小孔，然后用去掉針頭的I.OmL注射器在葉片正面注射菌液，若能看到整個(gè)葉面出現(xiàn)水潰狀，證明菌液已被注射進(jìn)植株體內(nèi)；將注射接種后的辣椒植株放入人工氣候箱，18 °C、暗培養(yǎng)2d后，轉(zhuǎn)入22 °C /18 °C,16h/8h、60%濕度條件下進(jìn)行培養(yǎng)，觀察并記錄辣椒的表型變化，培養(yǎng)期間以Hoagland’s營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行澆灌； 5)基因沉默效果檢測(cè) (1)沉默表型觀察 辣椒葉片農(nóng)桿菌注射接種25d就會(huì)出現(xiàn)不同程度的病毒癥狀，證明病毒載體已經(jīng)成功導(dǎo)入植株體內(nèi)； (2)辣椒尚體葉片接種鑒定待檢測(cè)基因功能 選帶有病毒癥狀的辣椒離體葉片接種辣椒疫霉菌phi。離體 葉片接種濃度為1.0X104個(gè)-mr1,每個(gè)葉片10 μ L ;接種辣椒疫霉菌孢子懸浮液后，于28°C，相對(duì)濕度95%，50001x人工氣候箱中進(jìn)行培養(yǎng)，5d后觀察表型癥狀的變化； 觀察方法是，在葉片接種部位出現(xiàn)明顯病斑的，說明被檢測(cè)基因與辣椒抗疫病相關(guān)；相反，在葉片接種部位沒有出現(xiàn)明顯病斑的，則說明被檢定基因與辣椒抗疫病無關(guān)，或是無功能基因。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種快速鑒定辣椒抗疫病相關(guān)基因功能的方法。利用病毒誘導(dǎo)的基因沉默技術(shù)與辣椒離體葉片抗病性技術(shù)相結(jié)合的方法對(duì)辣椒的抗疫病相關(guān)基因CaPOD和CaRGA1進(jìn)行功能鑒定，主要包括構(gòu)建基因沉默表達(dá)載體，經(jīng)農(nóng)桿菌GV3101介導(dǎo)侵染辣椒葉片并觀察葉片的表型變化，產(chǎn)生沉默效果的辣椒植株葉片表現(xiàn)出明顯地病毒癥狀；對(duì)沉默植株的離體葉片接種辣椒疫霉菌病原，在葉片接種部位出現(xiàn)明顯壞死病斑的，說明被檢測(cè)基因與辣椒抗疫病相關(guān)；相反，在葉片接種部位沒有出現(xiàn)明顯病斑的，則說明被檢定基因與辣椒抗疫病無關(guān)，或是無功能基因。該發(fā)明為大規(guī)模驗(yàn)證辣椒抗病基因功能奠定了基礎(chǔ)，從而可極大地加快辣椒分子育種的進(jìn)程。
文檔編號(hào)A01G7/06GK102812836SQ201210296540
公開日2012年12月12日 申請(qǐng)日期2012年8月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月20日
發(fā)明者鞏振輝, 王軍娥, 李大偉, 張瑩麗, 賀玉梅 申請(qǐng)人:西北農(nóng)林科技大學(xué)