一種與辣椒抗疫病基因緊密連鎖的分子標(biāo)記及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種與辣椒抗疫病基因緊密連鎖的分子標(biāo)記 及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 辣椒疫病（Phytophthora bligh)是由疫霉菌（Phytophthora capsici Leon.)引 起的一種毀滅性的土傳病害。該病1918年首次在美國(guó)發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)已在世界各地的辣椒種植區(qū) 發(fā)生。我國(guó)自20世紀(jì)50年代在江蘇發(fā)現(xiàn)辣椒疫病以來(lái)，至今已在多個(gè)省份發(fā)生過(guò)，成為影 響我國(guó)辣椒生產(chǎn)的主要障礙。該病可在辣椒生長(zhǎng)的任何時(shí)期，侵染植株的任何部位，雨水、 土壤、氣流等均可成為疫病的傳播途徑。目前生產(chǎn)上防治疫病的方法主要是化學(xué)防治，但該 方法會(huì)造成環(huán)境污染，并且由于選擇壓力的存在，疫霉菌易發(fā)生變異而產(chǎn)生抗藥性，從而增 加了防治的難度。
[0003] 國(guó)內(nèi)外研宄和生產(chǎn)實(shí)踐證明，選育抗病品種是防治和減輕疫病危害的最經(jīng)濟(jì)、安 全和有效的防治方法。為此，在抗源材料的篩選以及抗疫病基因定位方面已經(jīng)有很多報(bào)道。 現(xiàn)在被公認(rèn)的抗源材料有CM334、PI 201234、Perennial等。關(guān)于抗疫病基因的定位，大部 分研宄都是將辣椒的該抗性作為數(shù)量性狀抗性進(jìn)行定位，并將抗病性位點(diǎn)定位在多個(gè)染色 體上，但最近的研宄得出的較為一致的結(jié)論為，控制抗性的主要QTL位點(diǎn)位于辣椒的5號(hào)染 色體上，并且在該染色體的三個(gè)QTL位點(diǎn)（Pc5. l、Pc5. 2和Pc5. 3)中，Pc5. 1對(duì)抗性的貢獻(xiàn) 率最高。
[0004] 隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的迅猛發(fā)展，分子標(biāo)記輔助選擇育種成為育種工作的重要輔助 手段。該技術(shù)是利用與決定特定性狀基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，通過(guò)對(duì)標(biāo)記進(jìn)行檢測(cè)來(lái)確 定基因是否存在，從而大大加速育種進(jìn)程，節(jié)約大量成本，顯著縮短了育種周期。另外，在聚 合育種方面，分子標(biāo)記輔助選擇的優(yōu)勢(shì)更加明顯。因此，開(kāi)發(fā)有效的分子標(biāo)記對(duì)于新品種的 選育具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種用于鑒定待測(cè)辣椒是否抗辣椒疫病的引物對(duì)。
[0006] 本發(fā)明提供的用于鑒定待測(cè)辣椒是否抗辣椒疫病的引物對(duì)由SEQ ID No. 1所示的 DNA分子和SEQ ID No. 2所示的DNA分子組成。
[0007] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種用于鑒定待測(cè)辣椒是否抗辣椒疫病的PCR試劑。
[0008] 本發(fā)明提供的用于鑒定待測(cè)辣椒是否抗辣椒疫病的PCR試劑包括上述引物對(duì)。
[0009] 本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供一種用于鑒定待測(cè)辣椒是否抗辣椒疫病的試劑盒。
[0010] 本發(fā)明提供的用于鑒定待測(cè)辣椒是否抗辣椒疫病的試劑盒包括上述引物對(duì)或上 述PCR試劑。
[0011] 上述引物對(duì)或上述PCR試劑或上述試劑盒中，所述辣椒疫病的病原菌為辣椒疫病 生理小種2。
[0012] 上述引物對(duì)或上述PCR試劑或上述試劑盒在鑒定或輔助鑒定待測(cè)辣椒是否抗辣 椒疫病中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0013] 上述引物對(duì)或上述PCR試劑或上述試劑盒在鑒定或輔助鑒定待測(cè)辣椒是否為抗 辣椒疫病品種中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0014] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種鑒定或輔助鑒定待測(cè)辣椒是否抗辣椒疫病的方 法。
[0015] 本發(fā)明提供的鑒定或輔助鑒定待測(cè)辣椒是否抗辣椒疫病的方法包括如下步驟：
[0016] (1)用上述引物對(duì)對(duì)待測(cè)辣椒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；
[0017] (2)檢測(cè)所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的大??；
[0018] 若PCR擴(kuò)增產(chǎn)物含有大小為195bp的片段，則待測(cè)辣椒抗辣椒疫病或候選抗辣椒 疫??；
[0019] 若PCR擴(kuò)增產(chǎn)物含有大小為152bp的片段且不含有195bp，則待測(cè)辣椒不抗椒疫病 或候選不抗辣椒疫??；
[0020] 上述方法中，所述PCR擴(kuò)增的模板為待測(cè)辣椒的基因組DNA。
[0021] 上述方法中，所述PCR擴(kuò)增的退火溫度為50°C。
[0022] 上述引物對(duì)或上述PCR試劑或上述試劑盒或上述方法在辣椒疫病分子標(biāo)記輔助 育種或抗病基因定位中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0023] 本發(fā)明的有益效果：
[0024] (1)本發(fā)明所提供的分子標(biāo)記ZL6726(引物對(duì)）可用于分子標(biāo)記輔助育種，具有特 異性強(qiáng)、穩(wěn)定性尚的特點(diǎn)；
[0025] (2)本發(fā)明的分子標(biāo)記ZL6726(引物對(duì)）對(duì)檢測(cè)設(shè)備和底物模板質(zhì)量的要求不 高，且所擴(kuò)增的特異片段較小且在抗感材料間差異明顯，檢測(cè)周期短，適合高通量、自動(dòng)化 操作，適用于現(xiàn)代分子標(biāo)記輔助育種的實(shí)踐；
[0026] (3)本發(fā)明為辣椒抗疫病基因的精細(xì)定位及克隆提供了重要的遺傳學(xué)信息，可進(jìn) 一步通過(guò)染色體步移法精細(xì)定位基因，從而克隆該基因；
[0027] (4)本發(fā)明的分子標(biāo)記ZL6726(引物對(duì)）可應(yīng)用于辣椒育種工作，不僅可以極大降 低辣椒疫病流行對(duì)辣椒生產(chǎn)造成的經(jīng)濟(jì)損失，還可降低生產(chǎn)成本，降低農(nóng)藥的使用量。
[0028] 本發(fā)明采用灌根接種法對(duì)辣椒抗疫病材料PI 201234和高度感病材料上海園椒 及其構(gòu)建的Fp F2、BC1Pp BC1P2群體進(jìn)行抗病性鑒定，通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)PI 201234對(duì)辣椒疫病 生理小種2的抗性符合單基因顯性遺傳模式。通過(guò)引物篩選以及對(duì)F2群體的基因型進(jìn)行 分析，發(fā)現(xiàn)位于5號(hào)染色體上的分子標(biāo)記ZL6726與抗病基因緊密連鎖。根據(jù)連鎖遺傳圖譜 顯示，分子標(biāo)記ZL6726(引物對(duì)）與抗病基因的遺傳距離均為1.3cM。通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明：本發(fā) 明的分子標(biāo)記ZL6726 (引物對(duì)）特異性強(qiáng)，可用于辣椒分子標(biāo)記輔助育種，通過(guò)苗期篩選即 可對(duì)抗病植株進(jìn)行選擇，可節(jié)約成本，提高選擇效率，大大加速育種進(jìn)程，為進(jìn)一步通過(guò)染 色體步移法精細(xì)定位并克隆抗病基因奠定了基礎(chǔ)。
【附圖說(shuō)明】
[0029] 圖1為辣椒抗疫病基因的SSR標(biāo)記連鎖遺傳圖譜。其中，X代表抗病基因。
[0030] 圖2為分子標(biāo)記ZL6726在雙親、抗感池以及F2群體中隨機(jī)挑選的抗病和感病單 株中的擴(kuò)增結(jié)果。其中，1:感病親本上海園椒；2:抗病親本PI 201234 ;3:感病池；4:抗病 池；5-14 :F2群體中10株抗病單株；15-24 :F2群體中10株感病單株。
[0031] 圖3為分子標(biāo)記ZL6726在各抗感品種中的擴(kuò)增結(jié)果。其中，1 :農(nóng)大40 ;2 :茄門； 3 !Early Calwonder ;4 :卡佩諾；5 :脆龍216 ;6 :超級(jí)108 ;7 :益都紅；8 :辛香4號(hào)；9 :遵椒 2 號(hào)；10 :PI201234 ;11 :PBC602。
【具體實(shí)施方式】
[0032] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0033] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0034] 下述實(shí)施例所用的辣椒感疫病品種上海園椒作為母本（P1),辣椒抗疫病品種 PI201234作為父本（P2)，利用兩個(gè)親本配制得到Fp BC1Pn BC1PjP F 2群體。
[0035] 下述實(shí)施例中的辣椒感疫病品種上海園椒在文獻(xiàn)"青椒一代雜種上海園椒X茄 門及其制種技術(shù)"中公開(kāi)過(guò)；辣椒抗疫病品種PI 201234在文獻(xiàn)"Resistance To Foliar Blight And Crown Rot Of Pepper Caused by Phytophthora capsici" 中公開(kāi)過(guò)，公眾可 從中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院獲得。
[0036] 茄門和Early Calwonder均為高度感病的辣椒品種，茄門在文獻(xiàn)"A Novel Pepper(Capsicum annuum L. )WRKY Gene, CaffRKY30, Is Involved in Pathogen Stress Responses" 中公開(kāi)過(guò)；EarIy Calwonder 在文獻(xiàn)"Effect of soil matric potential and periodic floodingon mortality of peppercaused by Phytophthora capsici" 中公開(kāi) 過(guò)，公眾可從中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院獲得。
[0037] 下述實(shí)施例中的辣椒疫病的病原菌屬于生理小種2,在文獻(xiàn)"Genetically Diverse Long-Lived Clonal Lineages of Phytophthora capsici from Pepper in Gansu，China"中公開(kāi)過(guò)，公眾可從中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院獲得。
[0038] 下述實(shí)施例中的辣椒疫病病原菌的孢子懸浮液的制備方法：用直徑為Icm的打孔 器在辣椒疫病的病原菌菌落邊緣選取帶有菌絲的培養(yǎng)基，將其置于裝有CA培養(yǎng)基（CA培養(yǎng) 基的制備方法：稱取200g胡蘿卜，切成小塊放入榨汁機(jī)并加少量水，將其粉碎后用四層紗 布將濾液過(guò)濾到燒杯中，稱取Hg瓊脂粉放入濾液中并混勻，加水將溶液定容至1L，將混勻 后的溶液轉(zhuǎn)入2L的錐形瓶中，高壓蒸汽滅菌40分鐘，每個(gè)培養(yǎng)皿中倒入約15ml培養(yǎng)基） 的培養(yǎng)皿中心，密封好后將培養(yǎng)皿置于培養(yǎng)箱中，溫度控制在25°C，暗培養(yǎng)5~6天。然后， 將培養(yǎng)皿換至光照下培養(yǎng)，光周期為12h光照/12h黑暗，溫度為25°C。光暗交替培養(yǎng)5-7 天后，疫霉菌可產(chǎn)生大量孢子囊，在培養(yǎng)基表面加入IOml無(wú)菌去離子水，然后將培養(yǎng)皿放 到4°C冰箱內(nèi)，30min后移至室溫放置，30~60min后游動(dòng)孢子釋放。用兩層紗布過(guò)濾得到 孢子懸浮液，借助于血球計(jì)數(shù)板計(jì)算孢子的數(shù)量，用無(wú)菌去離子水稀釋至每毫升約IO 5個(gè)孢 子，得到辣椒疫病病原菌的孢子