專(zhuān)利名稱(chēng)：結(jié)締組織生長(zhǎng)因子c區(qū)抗原的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種結(jié)締組織生長(zhǎng)因子C區(qū)抗原的制備方法。
二.
背景技術(shù)：
CTGF是高度保守的CCN多肽家族(CTGF，CYR61，Nov)成員之一，該蛋白為肝素結(jié)合型，含349個(gè)氨基酸，富含半胱氨酸，其38個(gè)保守的半胱氨酸殘基分成兩個(gè)節(jié)段，其中22個(gè)在N末端區(qū)，16個(gè)在C末端區(qū)，蛋白結(jié)構(gòu)主要分為4個(gè)區(qū)為胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白區(qū)，von Willebrand因子C型重復(fù)區(qū)，血小板反應(yīng)蛋白(thrombospondin)1型重復(fù)區(qū)以及生長(zhǎng)因子半胱氨酸群，Mr38000，主要由成纖維細(xì)胞，平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞合成分泌，成年哺乳動(dòng)物心，腦，腎，肺，肝以及胎盤(pán)中均有表達(dá)。
國(guó)外有報(bào)道，將CTGF基因克隆入pcDNA3.1載體，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，純化目的蛋白后作為抗原免疫動(dòng)物獲得抗體。由于CTGF蛋白有4個(gè)功能區(qū)，前3個(gè)功能區(qū)與血清內(nèi)其它細(xì)胞因子有共同抗原，用CTGF蛋白全序列作為抗原免疫動(dòng)物獲得的抗體，將會(huì)與血清中其它細(xì)胞因子發(fā)生交叉反應(yīng)，測(cè)定結(jié)果可能為假陽(yáng)性，給臨床診斷帶來(lái)錯(cuò)誤判斷，因此選用CTGF特異的C區(qū)作抗原獲得的抗體只爭(zhēng)對(duì)CTGF發(fā)生抗原-抗體反應(yīng)，而不與其它細(xì)胞因子發(fā)生反應(yīng)，具有高度的選擇性，消除了由于交叉反應(yīng)導(dǎo)致的假陽(yáng)性結(jié)果。因此制備CTGF特異的C區(qū)抗原具有十分重要的意義。
三、技術(shù)內(nèi)容本發(fā)明提供一種能夠提高體內(nèi)外蛋白分子穩(wěn)定性并能增強(qiáng)免疫活性的結(jié)締組織生長(zhǎng)因子C區(qū)抗原的制備方法。
本發(fā)明采用如下技術(shù)方案來(lái)解決其技術(shù)問(wèn)題本發(fā)明即一種結(jié)締組織生長(zhǎng)因子抗原的制備方法，第一步用NheI和XbaI酶對(duì)pCOMB3載體進(jìn)行雙酶切，切除兩酶切位點(diǎn)NheI和XbaI之間的272bp條帶后的載體用T4 DNA連接酶自連后轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，然后，以質(zhì)粒pET-28(a)+作模板，分別以p15’-GGCTCGAGGCCAACTCTAGTATGGCCC-3’及p25’-GGACTAGTCTAACCAGCACTTCAGTGGGAA-3’為上、下游引物，PCR擴(kuò)增后，可見(jiàn)550bp條帶的擴(kuò)增產(chǎn)物，回收該條帶，并將回收的條帶與被切除272bp后的pCOMB3載體連接，經(jīng)轉(zhuǎn)化JM109后篩選得到陽(yáng)性質(zhì)粒pKM；第二步用組織貼壁法進(jìn)行人內(nèi)皮細(xì)胞原代培養(yǎng)，用50mmol/L葡萄糖修飾的牛血清白蛋白對(duì)原代培養(yǎng)后的內(nèi)皮細(xì)胞干預(yù)8h，0.125％胰蛋白酶消化后，用Trizol法提取RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，在1.5ml管中依次加入雙蒸H2O 31.5μl，10×Taq buffer 5μl，10mol/L dNTP 1μl，濃度為25pmol/μl的引物p35’-CCCGGATCCGAAGCGGACCTAGAG-3’1μl，p45’-CCCAAGCTTTGCCATGTCTCCGTG-3’1μl，濃度為0.65μg/μl的cDNA模板10μl，濃度為5U/μl的TaqPlus聚合酶0.5μl，置于PCR儀擴(kuò)增，擴(kuò)增條件94℃ 5min變性，94℃ 1min，65℃ 30sec，72℃ 1min，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min，4℃保溫，再用SpeI和XhoI酶對(duì)PCR產(chǎn)物與陽(yáng)性質(zhì)粒pKM分別進(jìn)行雙酶切后，用T4DNA連接酶使兩個(gè)片段通過(guò)粘性末端相連，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，從中獲得陽(yáng)性質(zhì)粒pKMc1；編碼結(jié)締組織生長(zhǎng)因子C區(qū)242-349位氨基酸的核苷酸序列第三步將含陽(yáng)性質(zhì)粒pKMc1的大腸桿菌JM109單菌落擴(kuò)增后，用異丙基-β-D-硫代半乳糖苷37℃誘導(dǎo)3h，得到含有結(jié)締組織生長(zhǎng)因子C區(qū)242-349位氨基酸的大腸桿菌，超聲破碎細(xì)胞，用鎳離子樹(shù)脂親和層析獲得結(jié)締組織生長(zhǎng)因子抗原。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果本發(fā)明從血管內(nèi)皮細(xì)胞中提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。設(shè)計(jì)特異性引物，擴(kuò)增CTGF C區(qū)242-349基因，插入噬菌體包膜蛋白基因III的上游，兩個(gè)基因用GGT GGC GGT GGC TCT相連，在啟動(dòng)子LacZ的作用下，翻譯成CTGF-GGGGS-pIII的融合蛋白。該融合蛋白在引導(dǎo)肽的作用下，定位于細(xì)胞周質(zhì)并自動(dòng)折疊成具有免疫活性的蛋白分子。
a.用DNA重組技術(shù)將結(jié)締組織生長(zhǎng)因子C區(qū)抗原與絲狀噬菌體III基因蛋白通過(guò)GGGGS柔性連接肽相連，在啟動(dòng)子LacZ的作用下翻譯成結(jié)締組織生長(zhǎng)因子-GGGGS-pIII的融合蛋白。該融合蛋白在引導(dǎo)肽的作用下，定位于細(xì)胞周質(zhì)并自動(dòng)折疊成具有免疫活性的蛋白分子，避免胞漿內(nèi)蛋白酶的切割。
b.由于pIII蛋白片段是噬菌體包膜蛋白成分，對(duì)于人體來(lái)說(shuō)是一種異源蛋白，與人體血清或血漿成分無(wú)交叉反應(yīng)，因此可以作為標(biāo)準(zhǔn)品或質(zhì)控品不影響結(jié)果，同時(shí)可在體外顯著增加抗原的穩(wěn)定性。
c.該融合蛋白由于含有噬菌體包膜蛋白成分，因此作為異種抗原免疫動(dòng)物，對(duì)于制備分子量小于20000的CTGF C區(qū)的抗體時(shí)，該片段是一種較好的免疫增強(qiáng)劑。
d.與真核表達(dá)載體相比原核表達(dá)載體具有較高的產(chǎn)量。
四

圖1是本發(fā)明陽(yáng)性質(zhì)粒pKMc1圖。
五、具體實(shí)施方案1融合表達(dá)載體的構(gòu)建1.1 pCOMB3第二個(gè)克隆位點(diǎn)的切除用NheI+XbaI對(duì)購(gòu)于美國(guó)SCRIPPS研究所的pCOMB3進(jìn)行雙酶切，可見(jiàn)272bp條帶，切除上述片段后，將切除272bp條帶后的剩余大片段回收，并用T4DNA連接酶自連后轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，擴(kuò)增后抽提質(zhì)粒，分別用NheI，XbaI，SpeI，XhoI及XhoI+SpeI酶切鑒定，結(jié)果顯示XbaI，NheI無(wú)酶切，SpeI，XhoI可見(jiàn)單酶切條帶，酶切位點(diǎn)正確；1.2片段插入及鑒定以購(gòu)于美國(guó)NOVAGEN公司的pET-28(a)+作模板，p15’-GGCTCGAGGCCAACTCTAGTATGGCCC-3’，p25’-GGACTAGTCTAACCAGCACTICAGTGGGAA-3，為上、下游引物，PCR擴(kuò)增后，可見(jiàn)550bp條帶，回收片段后與相同酶切的切除272bp的pCOMB3連接，轉(zhuǎn)化JM109后篩選陽(yáng)性質(zhì)粒，1.5％瓊脂糖電泳條帶出現(xiàn)在空載體之后，隨機(jī)挑選10個(gè)單菌落進(jìn)行PCR檢查，其中9個(gè)出現(xiàn)550bp條帶，陽(yáng)性率90％。SpeI+XhoI雙酶切檢查，可見(jiàn)550bp及3800bp條帶。質(zhì)粒送生工測(cè)序，結(jié)果與預(yù)期序列一致，測(cè)序結(jié)果正確的質(zhì)粒命名為pKM；2結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)C區(qū)基因的克隆2.1人內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)及總RNA的提取用組織貼壁法進(jìn)行人內(nèi)皮細(xì)胞原代培養(yǎng)，含20％小牛血清的DMEM傳代后，用50mmol/L葡萄糖修飾的AGF-BSA干預(yù)8h，0.125％胰蛋白酶消化后加5mlTrizol試劑，用26號(hào)針頭抽吸2次，室溫5min，加1ml氯仿激烈震蕩15s，4℃10000r/min離心10min，棄上清，沉淀用75％乙醇洗滌，12000r/min離心15min，棄上清，室溫干燥5～10min，用DEPC處理的雙蒸水溶解，-70℃保存。取適量稀釋后測(cè)定OD260與OD280的比值，計(jì)算RNA濃度(OD260×稀釋倍數(shù)×40μg)為0.65μg/μl，取5μl用1.2％瓊脂糖電泳，結(jié)果顯示RNA完整；2.2 cDNA第一鏈的合成RNA20μl(13μg)加2μl Oligo(dT)18primer，混勻3～5s，70℃ 5min，冰浴冷卻5min，以次加入5×M-Mulv buffer 4μl，10mmol/L dNTP 2μl，核酶抑制劑(5U/μl)1μl，37℃ 5min，加M-Mulv 1μl(100U/μl)，37℃反應(yīng)60min，最后70℃10min滅活，-20℃保存；2.3結(jié)締組織生長(zhǎng)因子C區(qū)基因的擴(kuò)增在Eppendorf管中以次加入dd H2O 31.5μl，10×Taq buffer 5μl，10mol/LdNTP 1μl，p3(25pmol/μl)5’-CCCGGATCCGAAGCGGACCTAGAG-3’1μl，p4(25pmol/μl)5’-CCCAAGCTTTGCCATGTCTCCGTG-3’1μl，cDNA第一鏈(6.5μg)10μl，TaqPlus(5U/μl)0.5μl，最后加一滴礦物油，置于PCR儀。擴(kuò)增條件94℃5min變性，94℃1min ，65℃30sec，72℃1min，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min ，4℃保溫。產(chǎn)物用1.2％瓊脂糖電泳檢查，結(jié)果顯示在350bp處有特異擴(kuò)增條帶。
3陽(yáng)性質(zhì)粒-結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(pKM-CTGF)表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定PCR產(chǎn)物與載體pKM經(jīng)SpeI+XhoI雙酶切，回收相應(yīng)片段，用T4連接酶使兩個(gè)片段通過(guò)粘性末端相連，轉(zhuǎn)化JM109。隨機(jī)挑取8個(gè)轉(zhuǎn)化子擴(kuò)增后抽提質(zhì)粒，分別用PCR及SpeI+XhoI雙酶切等方法作鑒定。其中有1個(gè)克隆出現(xiàn)350bp條帶，酶切鑒定出現(xiàn)3800bp及350bp兩條帶。陽(yáng)性質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果與預(yù)期序列一致。該質(zhì)粒命名為陽(yáng)性質(zhì)粒pKMc1(圖1)。
4結(jié)締組織生長(zhǎng)因子CTGF融合蛋白的表達(dá)及純化挑取含pKMc1質(zhì)粒的JM109單菌落接種400ml含Amp(50mg/L)的LB中，37℃振搖至OD600為0.5，加IPTG至終濃度1mmol/L，37℃誘導(dǎo)3h。分裝50ml離心管，5000r/min，離心15min，棄上清，加入20mlNTA-0 Buffer及1mmol/LPMSF，4mg溶菌酶，混勻使細(xì)胞懸浮，冰上放置30min，超聲破碎細(xì)胞。加入2ml Triton X-100，充分混勻，冰上放置15min，繼續(xù)超聲破碎細(xì)胞至粘稠度下降。加入1mmol/L MgCl2及200μg DNase混勻，室溫放置10min，15000r/min4℃離心15min，取上清，置于-20℃保存。
將NTA Resin裝入2×5cm玻璃柱中，用10倍體積NTA-0 Buffer平衡，將樣品加入柱中，流速控制在15ml/h左右，用5倍體積的NTA-0 Buffer洗滌，流速控制在30ml/h左右。然后分別用NTA-20 Buffer，NTA-40 Buffer，NTA-60Buffer，NTA-80 Buffer，NTA-100 Buffer，NTA-200 Buffer，NTA-1000 Buffer洗脫，流速控制在15ml/h左右，收集洗脫峰，每管收集一個(gè)NTA體積。紫外檢測(cè)蛋白分布情況，并用SDS/PAGE鑒定蛋白純度。結(jié)果顯示在35ku處出現(xiàn)很濃的蛋白條帶，與預(yù)期分子量一致，而pKM及JM109在相應(yīng)位置未出現(xiàn)條帶，掃描分析該條帶占菌體總蛋白的40.3％，樣品經(jīng)NTA Resin純化后呈現(xiàn)單條帶。
5結(jié)締組織生長(zhǎng)因子CTGF融合蛋白免疫活性測(cè)定將純化后的CTGF融合蛋白按250ng/孔包被96孔板，以含pKM的JM109菌體蛋白作陰性對(duì)照，4℃過(guò)夜。含20％小牛血清PBS 37℃封閉2h，PBST洗滌5次，每孔加CTGF單抗(1μg/ml)100μl，37℃1h，PBST洗滌5次，每孔加HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗100μl，37℃1h，PBST洗滌5次后加TMB顯色劑100μl，室溫反應(yīng)20min，加1mol/L HCl終止反應(yīng)，在全自動(dòng)酶標(biāo)儀上掃描測(cè)定在λ＝450nm時(shí)的吸光度值。結(jié)果顯示CTGF融合蛋白包被孔OD450平均值為2.96，陰性對(duì)照OD450平均值為0.18，以測(cè)定值大于2倍陰性對(duì)照OD值為CutOff值，判定測(cè)定結(jié)果為陽(yáng)性。
CTGF融合蛋白分別置于-20℃、4℃、37℃保存，每周測(cè)定一次免疫學(xué)活性，至12周時(shí)OD450平均值分別為2.85、2.79和2.61，活性分別為96.3％、94.2％和88.2％，顯示該融合蛋白具有較高的穩(wěn)定性。
權(quán)利要求
1.一種結(jié)締組織生長(zhǎng)因子C區(qū)抗原的制備方法，其特征在于第一步用NheI和XbaI酶對(duì)pCOMB3載體進(jìn)行雙酶切，切除兩酶切位點(diǎn)NheI和XbaI之間的272bp條帶后的載體用T4 DNA連接酶自連后轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，然后，以質(zhì)粒pET-28(a)+作模板，分別以p15’-GGCTCGAGGCCAACTCTAGTATGGCCC-3’及p25’-GGACTAGTCTAACCAGCACTTCAGTGGGAA-3’為上、下游引物，PCR擴(kuò)增后，可見(jiàn)550bp條帶的擴(kuò)增產(chǎn)物，回收該條帶，并將回收的條帶與被切除272bp后的pCOMB3載體連接，經(jīng)轉(zhuǎn)化JM109后篩選得到陽(yáng)性質(zhì)粒pKM；第二步用組織貼壁法進(jìn)行人內(nèi)皮細(xì)胞原代培養(yǎng)，用50mmol/L葡萄糖修飾的牛血清白蛋白對(duì)原代培養(yǎng)后的內(nèi)皮細(xì)胞干預(yù)8h，0.125％胰蛋白酶消化后，用Trizol法提取RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，在1.5ml管中依次加入雙蒸H2O 31.5μl，10×Taq buffer 5μl，10mol/LdNTP 1μl，濃度為25pmol/μl的引物p35’-CCCGGATCCGAAGCGGACCTAGAG-3’1μl，p45’-CCCAAGCTTTGCCATGTCTCCGTG-3’1μl，濃度為0.65μg/μl的cDNA模板10μl，濃度為5U/μl的TaqPlus聚合酶0.5μl，置于PCR儀擴(kuò)增，擴(kuò)增條件94℃ 5min變性，94℃ 1min，65℃ 30sec，72℃ 1min，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min，4℃保溫，再用SpeI和XhoI酶對(duì)PCR產(chǎn)物與陽(yáng)性質(zhì)粒pKM分別進(jìn)行雙酶切后，用T4DNA連接酶使兩個(gè)片段通過(guò)粘性末端相連，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，從中獲得陽(yáng)性質(zhì)粒pKMc1；第三步將含陽(yáng)性質(zhì)粒pKMc1的大腸桿菌JM109單菌落擴(kuò)增后，用異丙基-β-D-硫代半乳糖苷37℃誘導(dǎo)3h，得到含有結(jié)締組織生長(zhǎng)因子C區(qū)242-349位氨基酸的大腸桿菌，超聲破碎細(xì)胞，用鎳離子樹(shù)脂親和層析獲得結(jié)締組織生長(zhǎng)因子抗原。
全文摘要
結(jié)締組織生長(zhǎng)因子抗原的制備方法，對(duì)pCOMB
文檔編號(hào)C12P19/34GK1552890SQ20031011267
公開(kāi)日2004年12月8日 申請(qǐng)日期2003年12月18日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月18日
發(fā)明者劉乃豐, 吳國(guó)球 申請(qǐng)人:東南大學(xué)