專利名稱：用未分化的間充質細胞治療組織的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及含有未分化的間充質細胞的組合物和用自體的未分化的間充質細胞治療牙缺陷、皮膚和軟組織缺陷，和骨缺陷的方法。
背景諸如傷口、疾病和衰老的因素可以導致皮膚、骨、軟組織和牙組織的缺陷。已經設計了方法用于修復和/或增大受到這些條件影響的組織，但是避免瘢痕形成和加強組織生長的改進方法將是有用的。
這里完整引用美國專利號5,591,444、5,660,850、5,665,372、和5,858,390和共同待決的美國申請序號09/678,047作為參考。
概述本發(fā)明提供了矯正受試者的皮膚、軟組織和骨中化妝、審美和退變缺陷的組合物和方法。具體地，本發(fā)明的方法包括向與缺陷相鄰或者亞相鄰或者在缺陷部位的組織(例如，皮內組織)注射或者植入自體的、未分化的間充質細胞(UMC)、成纖維細胞和/或角質細胞。通過該方法可以矯正的缺陷包括，例如，皺紋(rhytids)、妊娠紋、凹陷型疤痕、非創(chuàng)傷起源的皮膚凹陷、尋常痤瘡導致的疤痕、唇發(fā)育不全、牙周缺陷、軟組織缺陷，如腭咽功能不全和皮下萎縮，骨缺陷和燒傷。如此處提供的所注射的細胞與受試者是組織相容的并且通過在細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中經傳代而擴大。所注射的細胞優(yōu)選為自體細胞。本發(fā)明的特征還在于產生包括UMC的細胞群體的體外方法。
在一個實施方案中，該組合物可以包括經傳代的自體UMC和經傳代的自體成纖維細胞。這些細胞可以源于，例如，從受試者采集的一種或多種活組織檢查樣品。在另一實施方案中，該組合物可以包括經傳代的自體UMC與生物可降解的非細胞基質，與或者不與經傳代的自體成纖維細胞。在再一個實施方案中，該組合物可以包括經傳代的自體UMC與生物可降解的非細胞填充劑，與或者不與經傳代的自體成纖維細胞。其他實施方案包含經傳代的自體角質細胞和經傳代的自體成纖維細胞，與或者不與基質或者填充劑。
本發(fā)明還提供了使得經傳代的自體UMC、成纖維細胞和角質細胞基本上無培養(yǎng)基中存在的免疫原性蛋白質(即，培養(yǎng)基血清-來源的蛋白質)，從而該細胞可用于矯正受試者中的缺陷而不刺激免疫應答的方法。本發(fā)明包括將擴大的UMC、成纖維細胞、角質細胞，或者含有一種或多種這些細胞群體的生物可降解的非細胞基質在無血清的培養(yǎng)基中孵育一段時間，隨后在含有血清(例如，胎牛血清(FBS))的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在另一實施方案中，僅在無血清的培養(yǎng)基或者含有自體血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞或者含有細胞的生物可降解的非細胞基質。
本發(fā)明部分基于發(fā)現(xiàn)自體細胞是用于增大組織的理想材料，所述組織為諸如缺陷處或者附近(例如，亞相鄰)部位的真皮、皮下組織和骨。本發(fā)明還基于認識到通過在治療缺陷前培養(yǎng)取自受試者的活組織檢查樣品可以大量提供自體細胞。本發(fā)明還基于認識到自體細胞在含有異種血清的組織培養(yǎng)基中擴大后，自體細胞含有來自該異種血清來源的大量免疫原性蛋白質，但是可以在注射到受試者之前除去所述免疫原性蛋白質。
一方面，本發(fā)明特征在于制備用于修復組織的細胞組合物的方法，該方法包括(a)提供含有未經分化的間充質細胞(UMC)的活組織檢查樣品的組織以得到起始細胞；(b)從所述活組織檢查樣品分離起始細胞；(c)培養(yǎng)所述起始細胞；和(d)從培養(yǎng)物收獲非貼壁衍生細胞群體，該非貼壁衍生細胞含有UMC。該方法可以還包括利用來自前面輪收獲的非貼壁衍生細胞群體作為起始細胞進行一或多輪(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、90、95、100、或更多輪)包括重復步驟(c)和(d)的衍生。衍生的一或多個額外輪可以包括，例如，1到20輪。含有UMC的組織可以選自皮膚組織、脂肪組織、結締組織、筋膜、固有層和骨髓。該方法可以還包括在酸性成纖維細胞生長因子(aFGF)的存在下培養(yǎng)所述非貼壁細胞。
一方面，本發(fā)明的特征在于用于修復組織的組合物。該組合物可以含有自體的、經傳代的UMC，并且可以基本上無培養(yǎng)基血清-來源的蛋白質。該組合物可以還含有自體、經傳代的成纖維細胞、該自體成纖維細胞可以來自受試者的牙床、腭區(qū)、皮膚、固有層、結締組織、骨髓、筋膜、或者脂肪組織。UMC或者成纖維細胞可以用活化化合物處理，該活化化合物為例如，抗壞血酸棕櫚酸酯、亞油酸、C-MED100(Optigene-X LLC，Shrewsbury，NJ)、奎尼酸、奎尼酸鹽、奎寧內酯、輔酶Q-10、L-羥酸、L-硫辛酸、磷酸二氫鈣、三磷酸鈣、煙酸、脫氫表雄甾酮(DHEA)、二甲基氨基乙醇(DMAE)、α-生育酚、骨形態(tài)發(fā)生蛋白質(BMP)、維生素E、維生素C、類胡蘿卜素、乙醇酸、羧基烷基酯、雌三醇、乙?；?L-肉堿、丙炔苯丙胺、番茄紅素、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)、半胱氨酸、前半胱氨酸(procysteine)、pikamilon、長春西汀、視黃酸、抗癌肽類，或者其他刺激性添加劑，如生長因子[例如，人生長激素、成纖維細胞生長因子(FGF)、血管內皮生長因子(VEGF)、類胰島素生長因子-I(IGF-I)、胰島素和長型R3IGF-1]。UMC或者成纖維細胞在施用于受試者前也可以暴露于低能量激光。該組合物可以還含有生物可降解的非細胞基質，其中UMC和/或成纖維細胞可以整合到基質內或者上。該基質在與UMC和/或成纖維細胞組合前可以含有一種或多種物質，所述物質選自膠原(例如，牛膠原、豬膠原、人膠原、工程化膠原，或者與戊二醛交聯(lián)的膠原和糖胺聚糖)、糖胺聚糖、明膠、聚乙醇酸、腸線、脫礦質骨、羥基磷灰石、透明質、透明質酸、珊瑚和無機骨。在基質上或者基質內可以整合足夠的UMC和/或成纖維細胞以基本上充滿細胞可以利用的基質上或者基質內的空間。該組合物可以還或者備選地含有生物可降解的非細胞可注射填充劑。該可降解的非細胞可注射填充劑在與UMC和/或成纖維細胞組合前可以包括一種或多種物質，所述物質選自(a)自體膠原纖維的可注射的分散劑；(b)膠原(例如，牛膠原、重構的與戊二醛交聯(lián)的牛膠原纖維，或者自體膠原)；(c)經溶解的明膠；(d)經溶解的聚乙醇酸；(e)經溶解的腸線；(f)分散在氯化鈉溶液和受試者的血漿等分試樣中的豬明膠粉和氨基己酸；和(g)透明質酸。
另一方面，本發(fā)明的特征在于制備用于修復的，由于受試者中疾病、失調或者缺陷導致該受試者中退變組織的組合物。該方法包括(a)提供來自該受試者的含有UMC的組織的活組織檢查樣品；(b)從該活組織檢查樣品分離自體UMC；(c)在產生基本上沒有培養(yǎng)基血清來源的蛋白質的自體UMC的條件下培養(yǎng)該自體UMC；和(d)將經培養(yǎng)的自體UMC暴露于導致UMC懸浮的條件。該含有UMC的組織可以選自牙床、腭區(qū)、皮膚、固有層、結締組織、筋膜、骨髓、和脂肪組織。該UMC的培養(yǎng)可以包括(1)在含有0.1％到約20％人或者非人血清的培養(yǎng)基中孵育，然后(2)在無血清的培養(yǎng)基中孵育。備選地，UMC的培養(yǎng)可以僅在無血清的培養(yǎng)基中。導致UMC懸浮的條件可以包括使用蛋白水解酶，例如，胰蛋白酶。備選地，蛋白水解酶包括分散酶和膠原酶。導致UMC懸浮的條件可以額外或者備選地包括使用EDTA。該方法可以還包括(e)提供來自受試者的含有成纖維細胞的組織的活組織檢查樣品；(f)從該活組織檢查樣品分離自體成纖維細胞；(g)在產生基本上沒有培養(yǎng)基血清來源的蛋白質的成纖維細胞的條件下培養(yǎng)該自體成纖維細胞；(h)將經培養(yǎng)的自體成纖維細胞暴露于導致成纖維細胞懸浮的條件；和(i)將UMC懸浮液與成纖維細胞懸浮液混合。含有自體成纖維細胞的組織可以選自牙床、腭區(qū)、皮膚、固有層、結締組織、筋膜、骨髓、和脂肪組織。成纖維細胞的培養(yǎng)可以包括(1)在含有0.1％到約20％人或者非人血清的培養(yǎng)基中孵育，然后(2)在無血清的培養(yǎng)基中孵育。備選地，成纖維細胞的培養(yǎng)可以僅在無血清的培養(yǎng)基中。導致成纖維細胞懸浮的條件可以包括使用蛋白水解酶，例如，胰蛋白酶。備選地，蛋白水解酶包括分散酶和膠原酶。導致UMC的懸浮的條件可以還額外或者備選地包括使用EDTA。在組合前，UMC或者成纖維細胞可以暴露于活化化合物，該活化化合物為例如，抗壞血酸棕櫚酸酯、亞油酸、C-MED100、奎尼酸、奎尼酸鹽、奎寧內酯、輔酶Q-10、L-羥酸、L-硫辛酸、磷酸二氫鈣、三磷酸鈣、煙酸、DHEA、DMAE、α-生育酚、BMP、維生素E、維生素C、類胡蘿卜素、乙醇酸、羧基烷基酯、雌三醇、乙?；?L-肉堿、丙炔苯丙胺、番茄紅素、NADH、半胱氨酸、前半胱氨酸、pikamilon、長春西汀、視黃酸、抗癌肽類，或者其他刺激性添加劑，如生長因子[例如，人生長激素、FGF、VEGF、IGF-I、胰島素和長型R3IGF-1]。UMC或者成纖維細胞可暴露于低能量激光。
另一方面，本發(fā)明的特征在于制備用于修復組織的組合物，由于受試者中疾病、失調或者缺陷導致該受試者中所述組織已經退變。該方法可以包括(a)提供自體的經傳代的UMC；(b)提供生物可降解的非細胞基質；和(c)將UMC與生物可降解的非細胞基質孵育從而UMC整合在該生物可降解的非細胞基質上或者內部，其中該孵育導致用于修復組織的組合物，并且其中孵育條件為使得該組合物基本上無培養(yǎng)基血清來源的蛋白質。提供自體的、經傳代的UMC的懸浮液的步驟可以包括(a)提供來自該受試者的含有UMC的組織的活組織檢查樣品；(b)從該活組織檢查樣品分離自體UMC；(c)培養(yǎng)該UMC；和(d)將經培養(yǎng)的UMC暴露于導致UMC懸浮的條件。該含有UMC的組織可以選自牙床、腭區(qū)、皮膚、固有層、結締組織、筋膜、骨髓、和脂肪組織。該生物可降解的非細胞基質在與UMC懸浮液組合前可以含有一種或多種物質，所述物質選自膠原(例如，與戊二醛交聯(lián)的膠原和糖胺聚糖、牛膠原、或者豬膠原)、糖胺聚糖、明膠、聚乙醇酸、腸線、脫礦質骨、羥基磷灰石、珊瑚和無機骨。培養(yǎng)條件可以包括(1)在含有0.1％到約20％人或者非人血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后(2)在無血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。備選地，培養(yǎng)可以僅在無血清的培養(yǎng)基中。在該生物可降解的非細胞基質上或者里面可以整合足夠的UMC以基本上充滿細胞可以利用的該生物可降解的非細胞基質上或者里面的空間。
該方法可以還包括提供自體的、經傳代的成纖維細胞，將該成纖維細胞與生物可降解的基質孵育從而該成纖維細胞整合到該生物可降解的非細胞基質上或者內部，其中該孵育導致用于修復組織的組合物，并且其中孵育條件為使得該組合物基本上無培養(yǎng)基血清來源的蛋白質。提供自體的、經傳代的成纖維細胞的懸浮液的步驟可以包括(a)提供來自該受試者的含有成纖維細胞的組織的活組織檢查樣品；(b)從該活組織檢查樣品分離自體成纖維細胞；(c)培養(yǎng)該成纖維細胞；和(d)懸浮該成纖維細胞。該含有成纖維細胞的組織可以選自牙床、腭區(qū)、皮膚、固有層、結締組織、筋膜、骨髓、和脂肪組織。在該生物可降解的非細胞基質上或者里面可以整合足夠的UMC和成纖維細胞以基本上充滿細胞可以利用的該生物可降解的非細胞基質上或者里面的空間。在與該生物可降解的非細胞基質孵育前，UMC和/或者成纖維細胞可以暴露于活化化合物，該活化化合物為例如，抗壞血酸棕櫚酸酯、亞油酸、C-MED100、奎尼酸、奎尼酸鹽、奎寧內酯、輔酶Q-10、L-羥酸、L-硫辛酸、磷酸二氫鈣、三磷酸鈣、煙酸、DHEA、DMAE、α-生育酚、BMP、維生素E、維生素C、類胡蘿卜素、乙醇酸、羧基烷基酯、雌三醇、乙?；?L-肉堿、丙炔苯丙胺、番茄紅素、NADH、半胱氨酸、前半胱氨酸、pikamilon、長春西汀、視黃酸、抗癌肽類，或者其他刺激性添加劑，如生長因子[例如，人生長激素、FGF、VEGF、IGF-I、胰島素和長形式R3IGF-1]。UMC或者成纖維細胞可暴露于低能量激光。UMC和成纖維細胞可以一起與該生物可降解的非細胞基質孵育，或者UMC和成纖維細胞可以分別加入該生物可降解的非細胞基質。
另一方面，本發(fā)明的特征在于制備用于修復組織的組合物，由于受試者中疾病、失調或者缺陷導致該受試者中所述組織已經退變。該方法可以包括(a)提供自體的、經傳代的UMC，其中該UMC基本上無培養(yǎng)基血清來源的蛋白質；(b)提供生物可降解的非細胞填充劑；和(c)將該自體的、經傳代的UMC與該生物可降解的非細胞填充劑組合。提供自體的、經傳代的UMC的懸浮液的步驟可以包括(a)提供來自該受試者的含有UMC的組織的活組織檢查樣品；(b)從該活組織檢查樣品分離自體UMC；(c)在產生基本上沒有培養(yǎng)基血清來源的蛋白質的自體UMC的條件下培養(yǎng)該自體UMC；和(d)將經培養(yǎng)的UMC暴露于導致UMC懸浮的條件。該含有UMC的組織可以選自牙床、腭區(qū)、皮膚、固有層、結締組織、筋膜、骨髓、和脂肪組織。該UMC的培養(yǎng)可以包括(1)在含有0.1％到約20％人或者非人血清的培養(yǎng)基中孵育，然后(2)在無血清的培養(yǎng)基中孵育。備選地，UMC的培養(yǎng)可以僅在無血清的培養(yǎng)基中。導致UMC懸浮的條件可以包括使用蛋白水解酶，例如，胰蛋白酶。備選地，蛋白水解酶包括分散酶和膠原酶。導致UMC懸浮的條件可以額外或者備選地包括使用EDTA。所述生物可降解的非細胞填充劑在與UMC組合前可以含有一種或多種物質，該物質選自(a)自體膠原纖維的可注射的分散劑；(b)膠原(例如，牛膠原、重構的與戊二醛交聯(lián)的牛膠原纖維，或者自體膠原)；(c)經溶解的明膠；(d)經溶解的聚乙醇酸；(e)經溶解的腸線；(f)分散在氯化鈉溶液和受試者的血漿等分試樣中的豬明膠粉和氨基己酸；和(g)透明質酸。
該方法還包括提供自體的、經傳代的成纖維細胞，其中該自體的、經傳代的成纖維細胞基本上無培養(yǎng)基血清來源的蛋白質，和將該自體的、經傳代的成纖維細胞與該生物可降解的非細胞填充劑組合。提供自體的、經傳代的成纖維細胞的懸浮液的步驟可以包括(a)提供來自該受試者的含有成纖維細胞的組織的活組織檢查樣品；(b)從該活組織檢查樣品分離自體成纖維細胞；(c)在產生基本上沒有培養(yǎng)基血清來源的蛋白質的自體成纖維細胞的條件下培養(yǎng)該自體成纖維細胞；和(d)將經培養(yǎng)的自體成纖維細胞暴露于導致成纖維細胞懸浮的條件。該含有成纖維細胞的組織可以選自牙床、腭區(qū)、皮膚、固有層、結締組織、筋膜、骨髓、和脂肪組織。該成纖維細胞的培養(yǎng)可以包括(1)在含有0.1％到約20％人或者非人血清的培養(yǎng)基中孵育，然后(2)在無血清的培養(yǎng)基中孵育。備選地，成纖維細胞的培養(yǎng)可以僅在無血清的培養(yǎng)基中。導致成纖維細胞懸浮的條件可以包括將該成纖維細胞與蛋白水解酶，例如，胰蛋白酶接觸。備選地，蛋白水解酶包括分散酶和膠原酶。導致成纖維細胞懸浮的條件可以額外或者備選地包括使用EDTA。在與UMC和生物可降解的非細胞填充劑組合前，UMC或者成纖維細胞可以暴露于活化化合物，該活化化合物為例如，抗壞血酸棕櫚酸酯、亞油酸、C-MED100、奎尼酸、奎尼酸鹽、奎寧內酯、輔酶Q-10、L-羥酸、L-硫辛酸、磷酸二氫鈣、三磷酸鈣、煙酸、DHEA、DMAE、α-生育酚、BMP、維生素E、維生素C、類胡蘿卜素、乙醇酸、羧基烷基酯、雌三醇、乙?；?L-肉堿、丙炔苯丙胺、番茄紅素、NADH、半胱氨酸、前半胱氨酸、pikamilon、長春西汀、視黃酸、抗癌肽類，或者其他刺激性添加劑，如生長因子[例如，人生長激素、FGF、VEGF、IGF-I、胰島素和長形式R3IGF-1]。UMC或者成纖維細胞可暴露于低能量激光。
再一方面，本發(fā)明提供了修復受試者中組織的方法。該方法可以包括(a)提供含有自體的、經傳代的UMC的組合物，其中該組合物基本上無培養(yǎng)基血清來源的蛋白質；(b)鑒定受試者中組織缺陷或者組織退變的部位；和(c)將該組合物置于該部位從而組織缺陷或者退變得到修復。該組織缺陷或者組織退變可以包括軟組織缺陷、口腔粘膜缺陷、口腔粘膜創(chuàng)傷、牙周病、骨缺陷、糖尿病、皮膚潰瘍、靜脈停滯，或者皮膚的美容缺陷。軟組織缺陷可以選自面部凹陷、乳腺發(fā)育不全、乳腺缺乏、乳腺重建、聲帶缺陷、腭咽功能不全、Poland氏綜合征、雄性生殖器(例如，陰莖)發(fā)育不全、唇發(fā)育不全，和皮下萎縮或者肌肉萎縮?？谇徽衬さ膭?chuàng)傷可以是牙拔除導致的拔除牙槽。牙周病可以包括牙周退變、牙齦炎，或者腭粘膜或者齒齦粘膜的非愈合傷口。骨缺陷可以選自半面矮小癥、骨的創(chuàng)傷后非愈合、眼球陷沒、Romberg氏病、顱鉆孔缺陷、頭骨損失、鈍器創(chuàng)傷導致的缺陷、和關節(jié)炎導致的缺陷。美容缺陷可以選自皺紋、凹陷型疤痕、非創(chuàng)傷起源的皮膚凹陷、笑紋、妊娠紋、皺紋、創(chuàng)傷疤痕、痤瘡疤痕、和皮下萎縮。組織缺陷可以是唇發(fā)育不全或者或者唇皺褶。自體UMC可以來自受試者的牙床、腭區(qū)、皮膚、固有層、結締組織、筋膜、骨髓、或脂肪組織。該組合物可以還含有生物可降解的基質，其中UMC整合在該基質的內部或者上面。該組合物可以還含有生物可降解的非細胞填充劑。該組合物可以還含有自體的、經傳代的成纖維細胞。
另一方面，本發(fā)明提供了修復受試者中組織的方法。該方法可以包括(a)提供含有自體的、經傳代的UMC和自體的、經傳代的成纖維細胞的組合物，其中該組合物基本上無培養(yǎng)基血清來源的蛋白質；(b)鑒定受試者中組織缺陷或者組織退變的部位；和(c)將該組合物置于該部位從而組織缺陷或者退變得到修復。
另一方面，本發(fā)明提供了修復受試者中組織缺陷的方法。該方法可以包括(a)提供含有(1)自體的、經傳代的UMC，(2)自體的、經傳代的成纖維細胞，和(3)藥學上可接受的載體的藥物組合物；其中該藥物組合物基本上無培養(yǎng)基血清來源的蛋白質；(b)鑒定受試者中組織缺陷或者組織退變的部位，所述缺陷或者退變選自牙或者牙周缺陷、皮膚的美容缺陷，和骨缺陷；和(c)將治療有效量的該藥物組合物注射到該組織缺陷或者退變的部位，其中該注射導致所述組織缺陷或者退變的修復。該含有UMC和成纖維細胞的組織可以選自牙床、腭區(qū)、皮膚、固有層、結締組織、筋膜、骨髓、和脂肪組織。該UMC或者成纖維細胞可以已經(1)在含有0.1％到約20％人或者非人血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后(2)在無血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。該UMC或者成纖維細胞可以已經在無血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
另一方面，本發(fā)明的特征在于修復受試者中退變的組織的方法，該退變的組織是由于該受試者中疾病、失調或者缺陷導致。該方法可以包括將組合物置于受試者中退變部位上，從而所述組織得到修復。該組合物可以含有(1)自體的、經傳代的UMC，(2)自體的、經傳代的成纖維細胞，和(3)生物可降解的基質，其中該UMC或者成纖維細胞整合到該基質內或者上面，并且其中該藥物組合物基本上無培養(yǎng)基血清來源的蛋白質。
本發(fā)明的特征還在于修復由于受試者中疾病、失調，或者缺陷導致的該受試者中已經退變的組織的方法。該方法可以包括將含有(1)基本上無培養(yǎng)基血清來源的蛋白質的自體的、經傳代的UMC和(2)生物可降解的非細胞填充劑的組合物注射到該受試者中退變部位從而該組織得到修復。該組合物還可以含有自體的、經傳代的成纖維細胞。
另一方面，本發(fā)明的特征還在于修復由于受試者中疾病、失調，或者缺陷導致的該受試者中已經退變的組織的方法。該方法可以包括步驟(a)將自體的、經傳代的UMC注射到受試者中組織退變部位，其中UMC基本上無培養(yǎng)基血清來源的蛋白質；(b)將自體的、經傳代的成纖維細胞注射到組織缺陷或者所希望的組織增大的部位，其中該成纖維細胞基本上無培養(yǎng)基血清來源的蛋白質；和(c)將生物可降解的非細胞填充劑注射到該部位。所述疾病、失調或者缺陷可以是選自牙或者牙周缺陷、皮膚的美容缺陷、和骨缺陷的缺陷。該自體UMC和成纖維細胞可以來自受試者的牙床、腭區(qū)、皮膚、固有層、結締組織、筋膜、骨髓、或脂肪組織。UMC和成纖維細胞可以同時注射。UMC和成纖維細胞、和生物可降解的填充劑可以同時注射。UMC和成纖維細胞可以單獨注射。UMC和成纖維細胞可以與生物可降解的填充劑分開注射。UMC和成纖維細胞注射到受試者和生物可降解的填充劑注射到受試者之間的時間間隔可以為約兩周。
另一方面，本發(fā)明的特征在于修復受試者中燒傷傷口的方法。該方法可以包括提供自體的、經傳代的角質細胞和自體的、經傳代的成纖維細胞的懸浮液并將該懸浮液注射到被燒傷的傷口中。提供自體的、經傳代的角質細胞和自體的、經傳代的成纖維細胞的懸浮液可以包括(a)提供來自該受試者的含有角質細胞的組織的活組織檢查樣品；(b)從該活組織檢查樣品分離自體角質細胞；(c)在產生基本上沒有培養(yǎng)基血清來源的蛋白質的自體角質細胞的條件下培養(yǎng)該自體角質細胞；和(d)將角質細胞暴露于導致角質細胞懸浮的條件；(e)提供來自該受試者的含有成纖維細胞的組織的活組織檢查樣品；(f)從該活組織檢查樣品分離自體成纖維細胞；(g)在產生基本上沒有培養(yǎng)基血清來源的蛋白質的自體成纖維細胞的條件下培養(yǎng)該自體成纖維細胞；和(h)將成纖維細胞暴露于導致成纖維細胞懸浮的條件；和(i)將懸浮的角質細胞和懸浮的成纖維細胞組合。所述含有角質細胞的組織可以選自皮膚、口腔粘膜、牙床、頰組織、食管組織、外宮頸組織，和結膜組織。角質細胞的培養(yǎng)可以包括(1)在含有0.1％到約20％人或者非人血清的培養(yǎng)基中孵育，然后(2)在無血清的培養(yǎng)基中孵育。備選地，角質細胞的培養(yǎng)可以僅在無血清的培養(yǎng)基中。該含有成纖維細胞的組織可以選自牙床、腭區(qū)、皮膚、固有層、結締組織、筋膜、骨髓、和脂肪組織。成纖維細胞的培養(yǎng)可以包括(1)在含有0.1％到約20％人或者非人血清的培養(yǎng)基中孵育，然后(2)在無血清的培養(yǎng)基中孵育。備選地，成纖維細胞的培養(yǎng)可以僅在無血清的培養(yǎng)基中。導致成纖維細胞懸浮的條件可以包括將該成纖維細胞與蛋白水解酶，例如，胰蛋白酶接觸。備選地，蛋白水解酶包括分散酶和膠原酶。導致成纖維細胞懸浮的條件可以額外或者備選地包括使用EDTA。在與角質細胞組合前，成纖維細胞可以暴露于活化化合物，該活化化合物為例如，抗壞血酸棕櫚酸酯、亞油酸、C-MED100、奎尼酸、奎尼酸鹽、奎寧內酯、輔酶Q-10、L-羥酸、L-硫辛酸、磷酸二氫鈣、三磷酸鈣、煙酸、DHEA、DMAE、α-生育酚、BMP、維生素E、維生素C、類胡蘿卜素、乙醇酸、羧基烷基酯、雌三醇、乙酰基-L-肉堿、丙炔苯丙胺、番茄紅素、NADH、半胱氨酸、前半胱氨酸、pikamilon、長春西汀、視黃酸、抗癌肽類，或者其他刺激性添加劑，如生長因子[例如，人生長激素、FGF、VEGF、IGF-I、胰島素和長形式R3IGF-1]。成纖維細胞在施用于受試者之前還可暴露于低能量激光。該懸浮液可以含有比例為約1∶3的自體角質細胞和自體成纖維細胞。所述注射可以包括將該懸浮液注射到燒傷傷口的中心區(qū)域。該懸浮液可以還含有自體的、經傳代的UMC。該方法可以還包括將強化化合物注射到傷口。
本發(fā)明還提供了未分化的間充質細胞(UMCs)的用途，用于生產治療組織退變或者組織缺陷的藥物，所述組織退變或者組織缺陷選自軟組織缺陷、口腔粘膜缺陷、口腔粘膜創(chuàng)傷、牙周病、糖尿病、皮膚潰瘍、靜脈停滯，其中該藥物含有自體的、經傳代的UMCs，其基本上無培養(yǎng)基血清來源的蛋白質。優(yōu)選地，該組合物基本上無不同于經傳代的自體UMC、經傳代的自體成纖維細胞和，任選地經傳代的自體角質細胞的細胞。
本發(fā)明還提供了未分化的間充質細胞的用途，用于生產同時、順序或者單獨施用用以修復組織的藥物，所述組織由于所述受試者中疾病、失調或者缺陷而退變，其中所述UMC為基本上無培養(yǎng)基血清來源的蛋白質的經傳代的UMC；所述成纖維細胞為基本上無培養(yǎng)基血清來源的蛋白質的經傳代的自體的、經傳代的成纖維細胞。
本發(fā)明還提供了用作藥物的組合物，其中所述組合物含有自體的、經傳代的UMC和自體的、經傳代的成纖維細胞，并且其中所述組合物基本上無培養(yǎng)基血清來源的蛋白質。還提供了用于組織的美容修復的組合物，其中所述組合物含有自體的、經傳代的UMC和自體的、經傳代的成纖維細胞，并且其中所述組合物基本上無培養(yǎng)基血清來源的蛋白質。
本發(fā)明還提供了自體的、經傳代的角質細胞和自體的、經傳代的成纖維細胞的用途，用于生產藥物，該藥物用于受試者中燒傷傷口的修復。
除非另外限定，文中所用的所有技術和科學術語具有和本發(fā)明所屬的領域中技術人員通常理解的相同的含義。盡管可以用與本文中描述的那些相似或者等價的方法和材料來實施本發(fā)明，但是下面描述適宜的方法和材料。這里完整引用所有出版物、專利申請、專利和此處提到的其他參考文獻作為參考。如果出現(xiàn)沖突，由本申請(包括定義)支配。此外，材料、方法和實施例僅是闡明性的并且不打算限制。
本發(fā)明的一種或多種實施方案的細節(jié)在附圖
和下面的描述中給出。根據(jù)該說明書和權利要求書，本發(fā)明的其他特征、目的和優(yōu)點將是顯而易見的。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供了治療導致受試者中組織退變的失調或者缺陷的組合物和方法。這些失調或者缺陷包括口腔粘膜缺陷、口腔粘膜創(chuàng)傷(例如，牙拔除導致的拔除牙槽)、口腔骨如上頜骨或者下頜骨的創(chuàng)傷、牙周病、糖尿病、皮膚潰瘍、或靜脈停滯。可導致組織退變的牙周病的實例包括，但不限于，牙周退變、牙齦炎，或者腭粘膜或者齒齦粘膜的非愈合傷口，或者骨退變。用本文提供的組合物和方法可以治療的其他缺陷包括，但不限于，皮膚缺陷如疤痕、皺紋、笑紋、妊娠紋、凹陷型疤痕、非創(chuàng)傷起源的皮膚凹陷、痤瘡、創(chuàng)傷、先天性畸形或者老化導致的痤瘡疤痕或者皮下萎縮。此外，本發(fā)明的組合物和方法可用于治療缺陷，如唇發(fā)育不全、唇褶、或者骨缺陷，例如，骨的缺陷，例如，面部骨，包括眼窩、顴骨、顱骨、顎裂骨缺陷，和鼻骨，以及脊柱骨和長骨缺陷。骨缺陷包括，例如，半面矮小癥、任何骨(例如，手、腕、褪、脊柱或者臉的骨)的創(chuàng)傷后非愈合、眼球陷沒、Romberg氏病、顱鉆孔缺陷、和頭骨損失。本發(fā)明的組合物和方法還可用于幫助任何骨的手術后愈合。本發(fā)明還可用于改善軟組織缺陷，包括面部凹陷、乳腺發(fā)育不全、乳腺缺乏、聲帶缺陷、腭咽功能不全、Poland氏綜合征，和任何皮下萎縮或者肌肉萎縮，包括小兒麻痹癥后萎縮和臀、腓，或者雄性生殖器發(fā)育不全。
1.含有細胞的組合物本發(fā)明提供了含有細胞的組合物，所述細胞為例如，自體的、經傳代的UMC；任何來源的自體的、經傳代的成纖維細胞，和/或自體的、經傳代的角質細胞。本發(fā)明的組合物基本上無免疫原性蛋白質(例如，培養(yǎng)基血清來源的蛋白質)。本文中，如應用于施用于受體的組合物的組分的術語“自體的”指從供體取出并施用于受體的身體組分(例如，細胞或者生物分子，如蛋白質、核酸、碳水化合物或者脂質)，其中供體和受體是同一個體。本文中，“基本上無培養(yǎng)基血清來源的蛋白質”的細胞是這樣的細胞，其中該細胞所摻入的流體含有小于0.1％(例如小于0.05％，小于0.01％，小于0.005％，小于0.001％)的異種或者同種異體血清，其中該血清是所述細胞在其中培養(yǎng)的組織培養(yǎng)基中所含有的。類似地，“基本上無培養(yǎng)基血清來源的蛋白質”的組合物是這樣的組合物，其中該組合物中細胞周圍的流體含有小于0.1％(例如小于0.05％，小于0.01％，小于0.005％，小于0.001％)的異種或者同種異體血清，其中該血清是所述細胞在其中培養(yǎng)的組織培養(yǎng)基中所含有的。
為了得到基本上無培養(yǎng)基血清來源的蛋白質的細胞，可以將所培養(yǎng)的細胞在不含有血清的培養(yǎng)基中擴大。備選地，細胞可以首先在含有血清(例如，0.1％到20％血清)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，隨后在無血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。從而通過這些方法避免了細胞懸浮液中可能的免疫原性血清來源的蛋白質的存在。
此處所用的細胞可來自任何哺乳動物物種(例如，人，非人靈長類、狗、奶牛、馬、豬、綿羊、貓、兔、小鼠、大鼠、豚鼠、倉鼠，或者沙鼠)，條件是所述細胞是自體的。自體人細胞(例如，自體人UMC、成纖維細胞，和角質細胞)尤其有用。注意到當動物是近交的并且從而是等基因(例如，如在諸如大鼠和小鼠的動物的某些近交實驗室品系中)時，“自體的”可指來自相同物種的另一個體。此處所用的細胞可以是非-自體(例如，從不同于受體的受試者或者從細胞系得到的)的。
通常通過從受試者得到組織活檢樣品，從該活檢樣品分離所希望的細胞，通過適當次數(shù)的傳代培養(yǎng)細胞以得到所希望的細胞量，并懸浮細胞來制備此處提供的組合物。本文中，“貼壁”細胞是粘附到標準組織培養(yǎng)容器的材料(例如，塑料)的細胞。本文中，“非貼壁”細胞包括不粘附到標準組織培養(yǎng)容器的材料(例如，塑料)的細胞，以及當空間和營養(yǎng)受到限制時從組織培養(yǎng)容器的表面脫落的細胞。一旦收獲這些細胞并將它們置于適宜的條件中，它們可以貼壁并擴大。從而組合物可以含有可以培養(yǎng)擴大的任何細胞。UMC和成纖維細胞可以從例如皮膚組織或者脂肪組織分離。UMC和成纖維細胞還可以從，但不限于，筋膜、固有層、毛囊的球區(qū)、骨髓，和結締組織的任何來源得到。自體角質細胞可以從例如，受試者的完整厚度的皮膚活組織檢查樣品、頭皮或者從毛囊得到。通過差別蛋白水解，例如，胰蛋白酶作用，并富集或者通過梯度純化或者使用菲可(Ficoll)或者帕可(Percoll)富集可以將貼壁和不貼壁的細胞基本上相互分開。菲可或者帕可可以從Amersham Biosciences(Amersham Place，LittleChalfont，Buckinghamshire，HP79NA，UK)得到。
由于本領域中眾所周知的同種異體(或者異種)排斥現(xiàn)象，優(yōu)選所培養(yǎng)的細胞與受體是組織相容的。通過從所要治療的受試者得到細胞(例如，外周血單核細胞)并使用這些細胞確定該受試者的主要組織相容性復合體(MHC)單元型確保組織相容性。然而，可以理解，可以從受試者的相同的雙胞胎，或者從在MHC與受試者相同的個體得到這些細胞?？梢耘囵B(yǎng)從活組織檢查樣品分離的細胞使得它們基本上無培養(yǎng)基血清來源的蛋白質。該步驟減小了細胞活化受試者中不利的免疫應答的能力。
開始細胞培養(yǎng)前，可以將活組織檢查樣品用抗生素和抗真菌劑反復洗滌以便減小隨后的培養(yǎng)物的污染的可能性。適宜的“洗滌培養(yǎng)基”可以含有例如，組織培養(yǎng)基，如Dulbecco氏改良的Eagle培養(yǎng)基(EMEM)、Iscove氏改良的Dulbecco氏培養(yǎng)基(EMDM)，或者任何適宜的培養(yǎng)基，以及一些或者所有下面的試劑慶大霉素、兩性霉素B(FUNGIZONE)、除支原體劑(MRA；Dianippon PharmaceuticalCompany，日本)、plasmocin和泰樂菌素(可以從例如，Serva，Heidelberg，德國得到)。慶大霉素可以以10到100μg/ml(例如，25到75μg/ml，或者約50μg/ml)的濃度使用。兩性霉素B可以以0.5到12.5μg/ml(例如1.0到10.0μg/ml，或者約2.5μg/ml)的濃度使用。MRA可以以0.1到1.5μg/ml(例如，0.25到1.0μg/ml，或者約0.5μg/ml)的濃度使用。Plasmocin可以以1到50μg/ml(例如，10到40μg/ml，或者約25μg/ml)的濃度使用。泰樂菌素可以以0.012到1.2mg/ml(例如，0.06到0.6mg/ml，或者約0.12mg/ml)的濃度使用。
用于細胞培養(yǎng)的生長培養(yǎng)基可以補加抗生素以防止例如，細菌、真菌、酵母和支原體對細胞的污染。支原體污染是組織培養(yǎng)中經常并且尤其麻煩的問題。為了防止或者最小化支原體污染，可以向生長培養(yǎng)基中加入諸如泰樂菌素的試劑。還可以用一種或多種抗生素/抗真菌劑(例如，慶大霉素、環(huán)丙沙星、azithromycin、MRA、plasmocin和四環(huán)素)。泰樂菌素可以以0.006到0.6mg/ml(例如，0.01到0.1mg/ml或者約0.06mg/ml)的濃度使用。慶大霉素可以以0.01到0.1mg/ml(例如，0.03到0.08mg/ml，或約0.05mg/ml)的濃度使用。環(huán)丙沙星可以以0.002到0.05mg/ml(例如，0.005到0.03mg/ml，或約0.01mg/ml)的濃度使用。Alatrofloxacine可以以0.2到5.0μg/ml(例如，0.5到3.0μg/ml，或約1.0μg/ml)的濃度使用。Azithromycin可以以0.002到0.05mg/ml(例如，0.005到0.03mg/ml，或約0.01mg/ml)的濃度使用。MRA可以以0.1到1.5μg/ml(例如，0.2到1.0μg/ml，或約0.75μg/ml)的濃度使用。Plasmocin可以以1到50μg/ml(例如，l0到40μg/ml，或約25μg/ml)的濃度使用。四環(huán)素可以以0.004到0.1mg/ml(例如，0.008到0.05mg/ml，或約0.02mg/ml)的濃度使用?？股乜纱嬖谟谡麄€培養(yǎng)期間或者培養(yǎng)期的一部分。
通過瓊脂培養(yǎng)方法使用例如，可以從bioMérieux(Marcyl’Etiole，法國)得到的或者可以在室內制備的支原體瓊脂板，或者通過PCR測定支原體污染。美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC，Manassas，VA)上市了PCR“支原體檢測試劑盒”。含有泰樂菌素(0.06mg/ml)、慶大霉素(0.1mg/ml)、環(huán)丙沙星(0.01mg/ml)、alatrofloxacine(1.0μg/ml)、azithromycin(0.01mg/ml)、和四環(huán)素(0.02mg/ml)的培養(yǎng)基可尤其用于防止支原體污染?？捎糜诜乐怪гw污染的另一種試劑是4-氧-喹啉-3-羧酸(OQCA)的衍生物，其可通過商業(yè)途徑從ICN Pharmaceuticals，Inc.(Costa Mesa，CA)作為“支原體去除劑”得到。該試劑通常以0.1到2.5mg/ml(例如，0.2到2.0mg/ml，或者0.5mg/ml)的濃度使用?？股鼗旌衔锘蛘咂渌噭┛梢栽谄鹗己箢^兩周存在于成纖維細胞培養(yǎng)物中。適宜的培養(yǎng)時間(例如，2周)后，通常將含有抗生素的培養(yǎng)基用無抗生素的培養(yǎng)基替換。一旦培養(yǎng)物中存在足夠細胞數(shù)，可以檢查這些細胞的支原體、細菌和真菌污染。在本發(fā)明的方法中僅使用沒有檢測到污染的細胞。
可以在細胞施用于受試者之前向細胞加入藥學上可接受的載體。短語“藥學上可接受的”指分子實體和組合物，當將它們施用于人時，它們對細胞無毒，是生理上可耐受的，并且通常不產生變態(tài)反應或者類似的不良反應，如反胃、眩暈，等等。這些組合物包括多種緩沖液成分(例如Tris-HCl、乙酸鹽、磷酸鹽)、pH和離子強度的生理上可接受的稀釋劑。
備選地，如果細胞不是立即施用，那么收獲后可以將它們在約4℃孵育長達24-48小時。對于這種孵育，可以將細胞懸浮在具有適宜的摩爾滲透壓濃度并且已經檢查了致熱原和內毒素的生理溶液中。這種溶液通常不含有酚紅pH指示劑，并且任何血清優(yōu)選為受試者的血清(即，自體血清)而不是胎牛血清(FBS)或者另一種異種血清(例如，馬血清或者山羊血清)?？梢詫⒓毎麘腋≡诶?，含有5％右旋糖的Krebs-Ringer溶液，或者任何其他生理溶液中?？梢晕黾毎⒃诜跤囵B(yǎng)基中施用于受試者。其中懸浮該細胞的鹽水或者孵育培養(yǎng)基的體積通常與一些因素有關，如所要注射的細胞的數(shù)目，和由于組織退變或者缺陷導致的損傷程度。
可以將此處所用的細胞在適于保存細胞類型，如UMC、成纖維細胞、和角質細胞的任何培養(yǎng)基(例如，任何通過商業(yè)途徑可以得到的冷凍培養(yǎng)基)中冷凍。由約70％(v/v)生長培養(yǎng)基，約20％(v/v)FBS和約10％(v/v)二甲亞砜(DMSO)組成的培養(yǎng)基尤其有用?？梢杂煤?％右旋糖的Krebs Ringer替換FBS，并用例如甘油代替DMSO。經解凍的細胞可用于開始繼代培養(yǎng)以制備以后用于同一受試者的另外的懸浮液，從而避免得到另一樣品的麻煩。
2.含有自體UMC的組合物本發(fā)明提供了含有自體UMC的組合物。這些組合物可用于治療病癥，所述病癥包括例如，牙缺陷(例如，口腔粘膜缺陷、口腔粘膜的創(chuàng)傷，或者牙周病)、骨缺陷和骨移植，和皮膚的美容缺陷(例如，笑紋、妊娠紋、皺紋、傷疤、痤瘡疤痕，或者皮下萎縮)。通過開始培養(yǎng)從受試者(例如，人)采集的活組織檢查樣品可以在體外收獲并富集UMC。如本文中所述，可從例如，皮膚活組織檢查或者脂肪組織或者骨髓的活組織檢查得到UMC。從皮膚組織分離的UMC尤其有用，因為它們易于得到和擴大。本文中所用術語“UMC”指處于完全分化的結締組織細胞，如成纖維細胞之前的分化的某個“階段”的細胞。因為UMC不能分化成體細胞的每種類型，所以UMC不同于全能干細胞。除了成纖維細胞，UMC還可分化成脂肪組織、軟骨、腱、骨，或者肌肉細胞。
為了產生本發(fā)明的組合物，可以從例如，受試者的牙床、頭皮、耳后、腭或者皮膚的完全厚度(例如，1-5mm，或者如果可以得到足夠組織，5mm以上)的皮膚活組織檢查樣品開始UMC培養(yǎng)。真皮剛好位于表皮下，并且通常具有0.5到3mm的厚度。使用例如，穿孔活組織檢查方法可以得到皮膚樣品?？梢詮睦纾蟮钠つw得到皮膚活組織檢查樣品?？梢酝ㄟ^例如，收獲并從皮(例如，皮膚)活組織檢查(例如，見實施例1)的培養(yǎng)可以分離UMC?？梢杂^察到旺盛生長的UMC的漂浮(即，不貼壁)的集落在這種培養(yǎng)物中漂浮。通過吸出并從細胞培養(yǎng)物離心培養(yǎng)基可以收獲集落并將集落重新接種在新鮮的組織培養(yǎng)基中將集落擴大。當培養(yǎng)中的貼壁細胞匯合或者未匯合時可以收獲漂浮的集落。也可以從脂肪組織(例如，通過抽脂或者其他手術去除收獲的脂肪)的培養(yǎng)物分離漂浮UMC的集落。可以將組織切成小塊，除去膜材料，并將所得組織置于導致UMC從脂肪組織主動脫落的培養(yǎng)條件下?？梢詫е轮鲃用撀涞臈l件的實例包括，但不限于，使用含有較低濃度的胎牛血清(FBS)的培養(yǎng)基或者含有酸性成纖維細胞生長因子(aFGF)的培養(yǎng)基。例如，可以存在約0％到約2.5％FBS。例如，可以存在約2.5到10ng/ml aFGF。備選地，從脂肪球除去膜后可以用約0.1％到1％膠原酶將脂肪組織解離。類似地，可以從骨髓的活組織檢查樣品開始UMC培養(yǎng)(見，例如，Marko等人，(1995)Endocrinol.1364582-4588)。
可以用適于從活組織檢查樣品增殖UMC的任何組織培養(yǎng)技術擴增細胞。可用于擴增經培養(yǎng)的細胞的技術可以在例如，R.I.Freshney，編者，Animal Cell CultureA Practical Approach，(IRL Press，Oxford，英國，1986)和R.I.Freshney，編者，Culture of Animal CellsA Manual of Basic Techhiques，(Alan R.Liss & Co.，New York，1987)中發(fā)現(xiàn)。
細胞培養(yǎng)基可以是適于原代UMC培養(yǎng)物生長的任何培養(yǎng)基。培養(yǎng)基可以含有抗生素、抗真菌劑，和/或防止支原體生長的試劑，如上述。培養(yǎng)基中存在酸性成纖維細胞生長因子(aFGF)、類胰島素生長因子-I(IGF-I)、胰島素，或者任何生長因子可以防止UMC分化成成纖維細胞。該培養(yǎng)基可以無血清，或者可以補加人或者非人血清[例如，自體人血清、非自體人A/B血清、馬血清，或者胎牛血清(FBS)]以促進細胞生長。當培養(yǎng)基中包含血清時，該血清的量通常為約0.1％到約20％v/v(例如，約0.5％到約19％，約1％到約15％，約5％到約12％，或約10％)。尤其有用的培養(yǎng)基含有葡萄糖DMEM，其補加約2mM谷氨酰胺，約10mg/L丙酮酸鈉、約10％(v/v)FBS，和抗生素(通常稱作“完全培養(yǎng)基”)，其中葡萄糖的濃度為約1,000mg/L到約4,500mg/L。UMC還可以在無血清的培養(yǎng)基中擴增；這樣，UMC從不暴露于異種或者同種異體血清蛋白質并且不需要在無血清的培養(yǎng)基中額外培養(yǎng)，當細胞在含有非自體血清的培養(yǎng)基中擴增時需要實施所述額外培養(yǎng)。
施用前，可以將UMC與活化化合物孵育。本文中所用的“活化化合物”是可以刺激細胞增殖或者延長細胞壽命(例如，通過刺激導致細胞增殖的特定基因的表達，或者通過激活DNA修復和延長細胞生命或者防止凋亡)的化合物。UMC分化成成纖維細胞后，活化化合物還可以刺激膠原產生?；罨衔镆部梢耘c含有UMC的組合物一起或者單獨地施用于受試者，并且可以增強含有UMC的組合物所使用的部位中細胞的增殖、壽命或者膠原產生。當細胞組合物和活化化合物單獨使用時，該施用可以是同時或者順序的(以任何順序)。當順序施用時，施用可以相隔數(shù)分鐘(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、或55分鐘)，數(shù)小時(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、14、18、22、或23小時)，數(shù)天(例如，1、2、3、4、5、或6天)，或數(shù)周(例如，1、2、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、40、50、或更多周)。備選地，不存在經傳代的UMC時施用一種或多種活化化合物可以用于體內刺激或者分化UMC。
可以與UMC(和/或其他細胞，如成纖維細胞)施用的其他化合物為強化化合物。本文中所用的“強化化合物”為不一定作用于所施用的細胞本身，但是例如，或者是所要修復的組織的結構組分(例如，任何類型的膠原)或者作用于宿主組分(例如，宿主細胞或者細胞外基質組分)的化合物。從而，強化化合物可用于強化所施用的細胞的修復功效。強化化合物可與含有UMC和/或其他細胞如成纖維細胞的組合物一起或者單獨施用于受試者。當細胞組合物和強化化合物單獨施用時，該施用可以為同時或者順序的(以任何順序)。如上述，順序施用可以相隔數(shù)分鐘(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、或55分鐘)，數(shù)小時(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、14、18、22、或23小時)，數(shù)天(例如，1、2、3、4、5、或6天)，或數(shù)周(例如，1、2、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、40、50、或更多周)。備選地，完全不存在經傳代的UMC時施用一種或多種強化化合物可以用于體內刺激或者分化UMC。
可以與UMC一起施用的活化化合物包括，例如，抗壞血酸、抗壞血酸棕櫚酸酯、亞油酸、C-MED100(Optigene-X LLC，Shrewsbury，NJ)、奎尼酸、奎尼酸鹽、奎寧內酯、輔酶Q-10、L-羥酸、L-硫辛酸、煙酸、脫氫表雄甾酮(DHEA)、二甲基氨基乙醇(DMAE)、α-生育酚、維生素E、維生素C、類胡蘿卜素、乙醇酸、羧基烷基酯、雌三醇、乙?；?L-肉堿、丙炔苯丙胺、番茄紅素、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)、半胱氨酸、前半胱氨酸、pikamilon、長春西汀、視黃酸、抗癌肽類，和其他刺激性添加劑，如生長因子[例如，人生長激素、成纖維細胞生長因子(FGF)、血管內皮生長因子(VEGF)、IGF-I、胰島素和長形式R3IGF-1和轉化生長因子-β(TGF-β)]。如上面指出的，這些活化化合物還可以與UMC一起或者單獨施用于受試者?？捎米鲝娀衔锏幕衔锇ò被核帷⒋迫?、和乙酰膽堿酯酶，例如，這些化合物的一些為抗氧化劑(例如，L-硫辛酸、C-MED100、和輔酶Q-10)，其他的影響DNA修復(例如，維生素E、羧基烷基酯、和類胡蘿卜素)，其他的可以誘導骨細胞的發(fā)育(例如，三磷酸鈣和單磷酸鈣)。其他有用的活化劑包括轉錄因子、組蛋白乙?；D移酶、甲基結合蛋白、乙酰膽堿前體、細胞膜保護劑，和分化因子。
可以理解當目標活化和強化化合物都是蛋白質時，將要施用于受試者的細胞(例如，UMC或者成纖維細胞)可以受到一種或多種(例如，1、2、3、4、5、6或更多種)表達載體(例如，質?；蛘卟《据d體，如牛痘、腺病毒或者逆轉錄病毒載體)的穩(wěn)定或者瞬時轉染、轉導、轉化或者感染，每種表達載體含有一種或多種(例如，1、2、3、4、5、6或更多種)核酸序列，該核酸序列編碼一種或多種(例如，1、2、3、4、5、6或更多種)活化和/或強化化合物(例如，任何類型的膠原(如I型、II型、或III型膠原)，或者轉錄因子、端粒酶、或者影響DNA甲基化的因子)。
細胞(例如，UMC)在施用于受試者之前可以通過暴露于低能量激光得到激活。例如，細胞可以經氦-氖激光或者砷化鎵激光照射，所述激光可以增強成纖維細胞的膠原產生(見，例如，Halcin和Uitto，“低能量激光的生物效應”，″BiolLasers in Cutaneous and AestheticSurgery，第一版(1997)，Arndt和Dover，編者，Lippincott Williams& Wilkins(Philadelphia，PA)，303-328頁)。激光處理還可以影響細胞增殖、免疫調節(jié)，和傷口愈合中的細胞外基質產生?？梢栽趯⒓毎┯糜谑茉囌咔坝玫退郊す庠谌魏芜m宜的時間段(例如，數(shù)小時到數(shù)周)內照射細胞一次或多次(例如，2、3、4、5或5次以上)。
本發(fā)明還提供了制備含有自體的、經傳代的UMC的組合物的方法。該方法可以包括提供來自受試者的含有UMC的組織的活組織檢查樣品，從該活組織檢查樣品分離自體UMC，在一定條件下培養(yǎng)UMC，所述條件導致基本上沒有培養(yǎng)基來源的蛋白質的細胞。當在源自例如，皮膚活組織檢查的貼壁成纖維細胞的培養(yǎng)中將UMC制備為非貼壁細胞集落時，可以將UMC傳代或者通過從培養(yǎng)物除去含有培養(yǎng)基的非貼壁細胞并離心收集UMC。當將要傳代UMC時，可以將它們重懸浮在新鮮培養(yǎng)基中并分散到適當?shù)慕M織培養(yǎng)容器，例如，組織培養(yǎng)瓶中。當UMC將施用于受試者時，可以將UMC重懸浮在適宜的溶液(例如，生理鹽水、含有5％右旋糖的Krebs Ringer，無酚紅的組織培養(yǎng)基，或者等滲并且適于注射到受試者如哺乳動物或者人的任何其他溶液)中?？梢杂萌我环N其他適宜的方法分離并培養(yǎng)UMC，該方法包括美國專利號5,858,390中公開的方法，將該專利完整引用作為參考。
3.含有自體成纖維細胞和UMC的組合物除了UMC，本發(fā)明的組合物可以含有基本上無免疫原性蛋白質(例如，培養(yǎng)基血清來源的蛋白質)的自體的、經傳代的成纖維細胞。組合物可以含有可以培養(yǎng)擴大的任何成纖維細胞。從皮膚組織分離的成纖維細胞尤其有用，因為它們容易得到和擴大。然而，可以從含有成纖維細胞的任何組織，例如，受試者的牙床、腭或者皮膚的活組織檢查樣品得到自體成纖維細胞。此外，可以從，但不限于，筋膜、固有層、毛囊的球區(qū)、骨髓，或結締組織的任何來源得到成纖維細胞。此外，例如，通過細胞培養(yǎng)可以從UMC得到成纖維細胞?？梢允褂糜糜谂囵B(yǎng)和分化UMC的任何適宜的方法，例如，如本文中描述的方法。通過，例如，在不存在酸性成纖維細胞生長因子或者本領域中公知的任何其他適宜的分化抑制因子時培養(yǎng)可以將UMC誘導分化成成纖維細胞。
如果希望，可以用無菌顯微解剖分離源于含有角質化組織的表皮和含有脂肪細胞的皮下組織的活組織檢查中的皮膚組織。然后用例如，解剖刀或者剪刀切碎或剪碎組織，將活組織檢查樣品分成小塊。在一些實施方案中，用蛋白酶(例如，膠原酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶、或者木瓜凝乳蛋白酶)消化組織小塊。用200-1000U/ml II型膠原酶消化10分鐘到24小時尤其有用，盡管可以使用任何類型的膠原酶(例如，0.05％到0.1％IV型膠原酶對于脂肪組織的消化尤其有用)。如果使用酶促消化，那么可以通過離心收集細胞并置于組織培養(yǎng)瓶中。
如果不將組織酶消化，可以將切碎的組織小塊單獨置于組織培養(yǎng)瓶的干燥表面上并允許粘附約2到約10分鐘?？梢跃徛尤肷倭颗囵B(yǎng)基以便不移動所附著的組織碎片。對于經消化的細胞，可以用培養(yǎng)基洗滌細胞以除去殘留的酶，將細胞懸浮在新鮮培養(yǎng)基中，并置于一個或多個培養(yǎng)瓶中。孵育約48-72小時后，可以向培養(yǎng)瓶添加額外的培養(yǎng)基。當用T-25瓶開始培養(yǎng)時，培養(yǎng)基的最初量通常為約1.5到2.0毫升。源于活組織檢查樣品的細胞系的建立需約2到3周，此時可以從最初的培養(yǎng)容器除去細胞用于擴增。
在培養(yǎng)的早期，希望組織碎片保持粘附到培養(yǎng)容器底部。脫落的碎片可以重新移植到新的容器中。根據(jù)標準技術，將成纖維細胞短暫暴露于EDTA-胰蛋白酶可以刺激該細胞生長。這種暴露于胰蛋白酶太短暫而不會使成纖維細胞從它們所附著的培養(yǎng)容器壁釋放。培養(yǎng)物建立并且接近匯合后，可以立即處理成纖維細胞樣品以在例如，液氮中冷凍保存?？梢允褂美鋬黾毎娜魏芜m宜的方法，其包括本領域中公知的關于成功冷凍細胞備用的許多方法的任一種。見，例如，上面公開的冷凍方法。冷凍并保存早傳代成纖維細胞而不是晚傳代成纖維細胞是優(yōu)選的，因為正常人成纖維細胞的細胞培養(yǎng)中傳代次數(shù)是有限的。
可以用適于從活組織檢查樣品增殖皮膚成纖維細胞的任何組織培養(yǎng)技術擴增細胞。細胞培養(yǎng)基可以是適于生長原代成纖維細胞培養(yǎng)物的任何培養(yǎng)基。培養(yǎng)基可以補加如上述的人或者非人血清(例如，自體人血清、非自體人A/B血清、馬血清，或者胎牛血清(FBS)]。成纖維細胞也可以在無血清的培養(yǎng)基中擴增；這樣，成纖維細胞從不暴露于異種或者同種異體血清蛋白質并且不需要在無血清的培養(yǎng)基中額外培養(yǎng)，當成纖維細胞在含有非自體血清的培養(yǎng)基中擴增時需要實施所述額外培養(yǎng)。
通過胰蛋白酶化，自體成纖維細胞可以傳代到新的培養(yǎng)瓶中。為了擴增，單個瓶可以以例如1∶3到1∶5的比例分開。具有總培養(yǎng)面積450cm2的三底T150瓶適于擴增成纖維細胞。三底T150瓶可以根據(jù)細胞大小接種例如，約1×106到約3×106個細胞，或者每平方厘米約8×103個細胞。這種培養(yǎng)瓶通常能夠產生約6×106到約1×107個細胞。當達到瓶的容量(這需要培養(yǎng)約5-7天)時，可以用無血清的培養(yǎng)基替換生長培養(yǎng)基。通常可以將細胞在約30℃到約37.5℃孵育至少4小時(例如，過夜或者約18小時)。在無血清的培養(yǎng)基中孵育可以基本上除去源于加入到培養(yǎng)基中的非自體血清(例如，F(xiàn)BS)的蛋白質，如果該蛋白質存在于注射到受試者的組合物中，將會引起不希望的免疫應答。無血清培養(yǎng)基可以含有，例如，補加約2mM谷氨酰胺，與或者不與約110mg/L丙酮酸鈉的葡萄糖DMEM，其中葡萄糖的濃度可以為約1,000mg/L到約4,500mg/L。約4,500mg/L的葡萄糖濃度尤其有用。無血清培養(yǎng)基可以還含有一種或多種如上面描述的抗生素。
在無血清的培養(yǎng)基中孵育結束時，可以使用例如，胰蛋白酶-EDTA從組織培養(yǎng)瓶除去細胞。施用于受試者前，通常將成纖維細胞在無血清并且無酚紅的培養(yǎng)液或者血清中洗滌2到4次。通過離心或者重懸浮可以洗滌細胞，然后將細胞重懸浮在等體積的可注射的等滲溶液中用以注射，該溶液具有適宜的生理摩爾滲透壓濃度并且基本上沒有致熱原和外源蛋白質。等滲鹽水是尤其有用的等滲溶液。生長到容量的5個三底T-150瓶可以產生約3.5×107到約7×107個細胞，這些細胞足夠組成約1.2ml到約1.4ml懸浮液。然后可以將藥學上可接受的載體加到經傳代的自體成纖維細胞以形成藥物組合物。
對于UMC，成纖維細胞可以在施用于受試者前與活化化合物孵育(見上文)。適宜的活化化合物包括例如上文中描述的那些。與這些化合物孵育可以刺激成纖維細胞并增強它們的膠原產生。一種或多種活化化合物也可以與含有自體經傳代的成纖維細胞的組合一起施用于受試者。備選地，不存在經傳代的成纖維細胞時活化化合物的使用可以用于體內刺激成纖維細胞。
此外，與UMC體內使用的上述相同的強化化合物可以與含有UMC和成纖維細胞或者僅成纖維細胞的組合物一起使用。
如上，通過用低能量激光照射可以激活成纖維細胞。
還可以使用任何其他適宜的方法制備含有自體、經傳代的成纖維細胞的組合物。見，例如，美國專利號5,858,390；5,665,372；5,660,850；5,591,444；和6,342,710以及國際申請?zhí)朩O 99/60951，將所有這些文獻完整引用作為參考。
本發(fā)明提供了制備含有自體、經傳代的UMC和自體、經傳代的成纖維細胞的組合物的方法。這些方法包括(1)提供來自受試者的含有UMC的組織的活組織檢查樣品，從該活組織檢查樣品分離UMC，并培養(yǎng)UMC以傳代多次以便得到所希望的細胞量，培養(yǎng)條件為導致基本上無培養(yǎng)基血清來源的蛋白質的UMC的培養(yǎng)條件；(2)提供來自受試者的含有成纖維細胞的組織的活組織檢查樣品，從該活組織檢查樣品分離成纖維細胞，并培養(yǎng)成纖維細胞以傳代多次以便得到所希望的細胞量，培養(yǎng)條件為導致基本上無培養(yǎng)基血清來源的蛋白質的成纖維細胞的培養(yǎng)條件，并將成纖維細胞暴露于導致該成纖維細胞懸浮的條件(例如，胰蛋白酶)；和(3)將UMC與成纖維細胞合并。注意到UMC和成纖維細胞可以從單個活組織檢查樣品得到并且，進而可以共同培養(yǎng)。從而最后的合并步驟不是必須的。
4.含有自體角質細胞的組合物本發(fā)明的組合物可以含有經傳代的角質細胞。該角質細胞可以是自體或者非自體的(例如，來自另一受試者或者來自細胞系)，盡管自體角質細胞是尤其優(yōu)選的。自體角質細胞可以從例如，皮膚、牙床、頰組織、食管組織、外宮頸組織、毛囊和結膜組織的活組織檢查分離。自體角質細胞通常從容易接近但是從美容立場不是高度可見的部位得到。非自體角質細胞可以來自角質細胞細胞系。這些細胞可以通過商業(yè)途徑從，例如ATCC得到。此處所用的角質細胞通常為懸浮的并且通過例如，注射施用于受試者。
本發(fā)明提供了制備用于修復或者改善受試者中組織缺陷如燒傷傷口的組合物。在典型的愈合過程中，角質細胞從傷口的外邊緣向傷口的中心生長，這通常導致形成傷疤。可以將含有角質細胞的懸浮液的組合物施用(例如，注射)于燒傷傷口以促進愈合而減小傷疤形成。角質細胞懸浮液基本上無免疫原性蛋白質(例如，培養(yǎng)基血清來源的蛋白質)。
可以從例如，皮膚活組織檢查樣品收獲角質細胞?？梢允褂猛暾穸然蛘咂书_厚度的人皮膚。該人皮膚可以來自身體的任何部分，包括包皮。如果使用完整厚度的皮膚，可以盡可能地裁減真皮。可以將皮膚在含有抗生素和/或抗真菌劑(例如，青霉素、鏈霉素，和Fungizone)的培養(yǎng)基或者上述含有抗生素的培養(yǎng)基中洗滌一次或多次。然后可以將該組織切成小(例如，4mm2)塊并在胰蛋白酶(例如，磷酸緩沖液中的0.25％胰蛋白酶，沒有Ca++或者Mg++)中孵育使真皮與表皮分離[Eisinger(1985)Method in Skin Research，Ed.Skerrow，193頁]。胰蛋白酶處理可以在適宜的溫度(例如4℃)中進行適宜長的時間(例如，2到18小時)。胰蛋白酶化后，可以使用小鑷子小心地將表皮和真皮分開。可以將真皮丟棄或者用于生長成纖維細胞，可以將表皮漂浮在溶液中，該溶液含有例如，8g/L M NaCl，0.4g/L KCl，1g/L右旋糖，0.58g/L NaHCO3，0.5g/L胰蛋白酶，和0.2g/L versene(二鈉鹽)。
當收集了所有表皮時，通過用鑷子機械梳理將表皮細胞相互分離。可以將洗脫到上清液中的細胞轉移到新的組織培養(yǎng)皿中并通過，例如，用Pasteur移液器劇烈移液以得到單個細胞的懸浮液，這些細胞可以在顯微鏡下觀察。然后將細胞收集到無菌胎牛血清(FBS)中并通過例如，無菌紗布網(wǎng)過濾除去任何剩余的組織塊或小片。將新鮮培養(yǎng)基加到剩余的表皮組織，并且可以重復該過程直到所有組織完全分開。通過離心可以沉淀在FBS中收集的細胞，將其重懸在角質細胞生長培養(yǎng)基中，并以約5×105到8×105個細胞/ml接種在塑料組織培養(yǎng)容器中。該細胞通常在5％CO2和95％空氣存在下和80％濕度和35℃到36℃下培養(yǎng)。12到14天后，可以收集角質細胞并且其可用于傳代培養(yǎng)或者施用于受試者。
復制的表皮角質細胞培養(yǎng)物可以保持在成纖維細胞飼養(yǎng)層(例如，3T3細胞層)，或者可以在動物血清(例如，F(xiàn)BS)的存在下培養(yǎng)，以建立原代培養(yǎng)物和傳代培養(yǎng)。在這些條件下，可以對角質細胞傳代培養(yǎng)直到它們實現(xiàn)20到50次群體翻番?？梢詫⒓毎囵B(yǎng)在例如，最小必需培養(yǎng)基(MEM)中，該培養(yǎng)基含有10％FBS，100U/ml青霉素，100％g/ml鏈霉素，0.6μg/ml Fungizone，0.5μg/ml氫化可的松，200mM L-谷氨酰胺，和10mM MEM-非必需氨基酸。處理青霉素、鏈霉素和Fungizone，還可以使用用于UMC和成纖維細胞培養(yǎng)的上述抗生素的混合物。也已開發(fā)出不需要血清或者飼養(yǎng)層用于維持克隆生長、連續(xù)增殖和表皮角質細胞分化的體外系統(tǒng)[Peehl和Ham(1980)In Vitro 16516-525；和Tsao等人，(1982)J.Cell.Physiol.110219-229]。這些系統(tǒng)可以包括使用用于成纖維細胞培養(yǎng)的條件培養(yǎng)基。
可以修飾角質細胞培養(yǎng)條件以增強細胞生長。例如，可以使用更大濃度的氫化可的松(例如，10μg/ml)、腐胺(例如，10-5M)、維生素B12(例如，10-5M)，或者J-雌二醇(例如，3.7×10-6M)以增強非條件培養(yǎng)基中角質細胞的生長[見，例如，Peehl和Ham，如前]。角質細胞生長培養(yǎng)基可以還含有諸如表皮生長因子和/或胰島素的組分。還可以調節(jié)鈣濃度以影響角質細胞增殖速度[Hennings等人，(1980)Cell 19245-265]。在含有0.05到0.1mM Ca++的培養(yǎng)基中培養(yǎng)表皮細胞例如，可以增加增殖速度，而在培養(yǎng)基中通常發(fā)現(xiàn)的條件下(例如，1.2mM Ca++)下生長可導致細胞的最終分化?？梢杂萌魏纹渌m宜的分離和培養(yǎng)角質細胞的方法產生此處提供的組合物。這些方法包括例如，美國專利號4,254,226、5,282,859、和6,029,760中公開的方法，本文完整引用這些專利作為參考。
本發(fā)明提供了制備含有角質細胞的組合物的方法。這些方法可以包括提供含有角質細胞的組織的活組織檢查，從該組織的活組織檢查分離角質細胞，通過多次傳代培養(yǎng)角質細胞將細胞擴大到所希望的量，培養(yǎng)條件為導致細胞基本上無培養(yǎng)基血清來源的蛋白質的培養(yǎng)條件，并將細胞暴露于導致細胞懸浮的條件(例如，胰蛋白酶)下。
含有角質細胞的組合物也可以含有成纖維細胞(例如，自體的、經傳代的成纖維細胞)和/或UMC(例如，自體的、經傳代的UMC)?？梢苑蛛x成纖維細胞并如文中描述的(見上文小節(jié)3)制備懸浮液。本文中提供的方法包括得到一種或多種組織活組織檢查樣品，制備自體的、經傳代的角質細胞和自體的、經傳代的成纖維細胞的懸浮液，并將該角質細胞和成纖維細胞合并以產生可用于治療諸如燒傷傷口的病癥的組合物。注意到可以從單個活組織檢查(例如，完整厚度的皮膚活組織檢查)得到和制備角質細胞和成纖維細胞?？梢允褂贸衫w維細胞和角質細胞的任何適宜的比例，盡管約3∶1(成纖維細胞∶角質細胞)尤其有用。
5.含有生物可降解的非細胞基質組分的組合物含有自體、經傳代的細胞(例如UMC與或不與成纖維細胞)的本發(fā)明組合物還可以包含生物可降解的非細胞基質組分。無細胞基質組分通常完成結構角色。例如，其可以填充組織中缺陷、洞、空間或者腔并提供環(huán)境，在該環(huán)境中經注射的細胞可以附著到基質或者圍繞組織并生長和產生由于新組織生長導致的結構因子和其他因子(如趨化因子)。在許多情況中，基質的缺口填充功能是暫時的并且僅持續(xù)到受移植的和/或宿主細胞遷移到該區(qū)域并形成新的組織。優(yōu)選地，無細胞基質是生物可降解的。該基質優(yōu)選為固態(tài)或者半固態(tài)物質，其在生理條件下是不可溶的。此外，生物可降解的非細胞基質組分可以包括在含有經傳代的角質細胞的任何組合物中。這些組合物適于注射或者移植到受試者中以修復退變的組織。本文中所用的術語“生物可降解的”表示不是生物上有害的并且可以化學降解或者通過自然效應物(例如，天氣、土壤細菌、植物、動物)可以分解的組合物。可用于本發(fā)明的基質的實例包括，但不限于，含有自體和非自體蛋白質的無細胞基質，和含有生物可降解的聚合物的無細胞基質。
含有非自體蛋白質的許多生物可降解的非細胞基質的任一種都可用于此處提供的組合物中。生物可降解的非細胞基質的實例包括含有任何類型的膠原(例如，牛、豬、人、或者生物工程膠原)，或者具有與例如，戊二醛交聯(lián)的糖胺聚糖(GAG)的任何類型的膠原的基質。含有膠原的基質包括，但不限于，可吸收的膠原海綿、膠原膜、和骨松質。膠原的有用類型包括，例如，牛膠原(例如，ZYDERM和ZYPLAST，可通過商業(yè)途徑從McGhan Medical Corporation，SantaBarbara，CA得到)、豬膠原、人尸體膠原(例如，F(xiàn)ASCIA(FasciaBiosystems，LLC，Beverly Hills，CA)、CYMETRATM(LifeCellCorp.，Branchburg，NJ)、或DERMALOGENTM(以前由CollagenesisCorp.生產)、生物工程化膠原(例如，F(xiàn)ORTAPERMTM，可從Organogenesis，Inc.，Canton，MA得到)，和自體人膠原(AUTOLOGEN，見下文)。FASCIATM尤其有用。該產品可以以5種不同的顆粒大小得到，任一種都可用于此處描述的組合物和方法中。大小為0.25mm的顆粒尤其有用。
可吸收的膠原海綿可從例如，Sulzer Calcitek，Inc.(Carlsbad，CA)購買。這些膠原海綿敷料以COLLATAPE、COLLACOTE和COLLAPLUG的名稱銷售，從牛深屈肌(Achilles)腱提取的交聯(lián)膠原和GAG制備。這些產品是軟的、易彎、不易碎的并且無致熱原的。90％以上的膠原海綿通常由開孔組成。
生物可降解的非細胞基質可以含有形成例如薄膜的膠原(例如，牛或豬I型膠原)。一種這樣的膜由Sulzer Calcitek生產并且以BIOMENDTM上市。另一種這樣的膜基質由Geistlich Shne AG(Wolhusen，瑞士)以BIO-GIDE上市并且由豬I型和III型膠原生產。BIO-GIDE具有雙層結構，其一個表面是多孔的并且允許細胞的向內生長，另一個表面致密并且防止纖維性組織的向內生長。
含有膠原的其他適宜的基質包括COLLAGRAFT，其由NeuCell，Inc.(Campbell，CA)生產，和OSTEOSET硫酸鈣α半水合物沉淀，其由Wright Medical Technology(Arlington，TN)生產。
還可以從骨松質制備生物可降解的非細胞基質，將其形成粒劑或者塊狀體。該材料由動物(例如，人、非人靈長類、牛、綿羊、豬或山羊)的骨組成，其中已經從該骨除去了基本上所有的有機物質(例如，蛋白質、脂質、核酸、碳水化合物、和小有機分子，如維生素和非蛋白質激素)。該類型的基質在此處稱作“非有機基質”。一種這樣的基質以BIO-OSS松質粒劑和BIO-OSS塊狀體上市，由GeistlichShne AG生產。該公司還生產了塊狀體類型的基質(BIO-OSS膠原)，其含有非有機骨并且還含有按重量計約10％膠原纖維。
其他有用的生物可降解的非細胞基質可以含有明膠、腸線、去礦化骨、非有機骨、珊瑚或者羥基磷灰石、或者這些物質的混合物。從去礦化人骨制備的基質例如，形成小塊狀體并且由GenSciRegeneration Laboratories，Inc.(Toronto，Ontario)以DYNAGRAFT上市，由Tutogen Medical，Inc.(Clifton，NJ)以TUTOPLAST上市，或者由Osteotech，Inc.(Eatontown，NJ)以GRAFTON去礦化骨基質上市。含有去礦化的骨可以與例如，膠原組合產生海綿、塊狀體或者膜形式的基質。生物可降解的基質可以含有糖胺聚糖，如粘多糖或者唾液酸。此外，從一種或多種單體制備的合成聚合物可用于生產可用于本文中的生物可降解的非細胞基質。這些合成聚合物包括，例如，聚(乙醇酸)、聚(乳酸)、和聚(乙醇酸)-聚(乳酸)。合成聚合物還可以與上面提到的物質的任一種組合形成基質。形成單一基質的不同聚合物可以在分開的隔室或者層中。例如，W.L.Gore & Associates，Inc.(Flagstaff，AZ)生產了多孔的生物可降解的非細胞基質(GORE RESOLUT XT再生材料)。該基質由合成的生物可吸收的乙交酯和三亞甲基碳酸酯共聚物纖維組成，細胞可以遷移到該基質內，粘附到由合成的生物可吸收的乙交酯和丙交酯共聚物組成的閉合膜，該膜不允許細胞的向內生長。適宜的生物可降解的基質的其他實例可以在例如，美國專利號5,885,829中發(fā)現(xiàn)。
選擇了生物可降解的非細胞基質后，細胞(例如，自體經傳代的UMC與或不與自體、經傳代的成纖維細胞)的濃縮懸浮液可以均勻分布在該基質的表面上。通常使用濃縮懸浮液以避免超出基質吸收液體懸浮液的能力。例如，應用于GORE RESOLUT XT基質的細胞懸浮液通常具有約94μl到約125μl的體積，并且每平方厘米基質含有約2.0×106到約4.0×106個細胞。不進一步加入培養(yǎng)基可以允許細胞粘附到基質。細胞與基質的孵育可以在，例如，約37℃下約1到2小時。孵育約60分鐘后，細胞通常附著并均勻地分布到基質中。此時，可以用額外的生長培養(yǎng)基補加含有細胞負荷的基質的培養(yǎng)容器，并且細胞可以在基質中培養(yǎng)約3到4天。因為細胞以高密度加入基質中從而基本上填充了基質內內的空間，在3-4天的培養(yǎng)期間內幾乎沒有或者沒有發(fā)生增殖。實際上，在該期間內顯著的細胞增殖通常是不希望的，因為正在分裂的成纖維細胞可以分泌能夠降解或者部分降解該基質的酶(例如，膠原酶)。
通常用鹽水或者沒有血清和酚紅的培養(yǎng)基洗滌(例如，至少洗滌3次，每次10分鐘)洗滌基質與細胞，目的是基本上除去免疫原性蛋白質(例如，如果培養(yǎng)基含有用于基質接種步驟的非自體血清，則為培養(yǎng)基血清來源的蛋白質)，這些蛋白質當施用于受試者時可引起免疫應答。新鮮PBS可用于每次洗滌。然后可以將基質在使用前在新鮮PBS或者無血清的培養(yǎng)基中孵育(例如，長2小時的孵育)。孵育后，含有自體、經傳代的UMC與或者不與經傳代的成纖維細胞的基質可以置于組織退變或者缺陷區(qū)域。
對于膠原海綿基質(例如，COLLACOTE)，可以將約1.5ml生長培養(yǎng)基中的約1.5×107到2.0×107個細胞接種在2cm×4cm的薄(約2.5到3.0mm厚)海綿上。然后該海綿可以不用添加培養(yǎng)基在37℃孵育約1-2小時以允許基本上所有細胞附著到該基質材料。細胞附著后，可以向基質和細胞組合物加入額外的生長培養(yǎng)基，該組合物可以在37℃孵育3-4天，每天更換培養(yǎng)基。如果含有非自體血清的培養(yǎng)基用于細胞接種步驟，那么可以從含有該血清的生長培養(yǎng)基除去該組合物并將其用PBS反復洗滌(例如，3次或更多次)。每次加入PBS后，可以將基質孵育10-20分鐘后拋棄PBS。最后洗滌后，該組合物可直接施用于受試者，或者可以轉移到含有生理溶液(例如，Kreb’sRinger溶液)的運輸小瓶中并在約4℃孵育約24-48小時。
對于膜基質(例如，BIOMENDTM)，將約100μl生長培養(yǎng)基中的約3×106到8×106個細胞(例如，UMC或者UMC與成纖維細胞)接種到15mm×20mm的薄(例如，0.5到1.0mm厚)的膜上。該膜可以不用添加培養(yǎng)基在37℃孵育約30-60分鐘以允許基本上所有細胞附著到該基質材料。細胞附著后，可以向基質和細胞組合物加入額外的生長培養(yǎng)基，該組合物可以在37℃孵育2-3天，每天更換培養(yǎng)基。細胞通常以高密度(見上文)加入基質以基本上填充細胞可利用的基質內的空間。洗滌組合物并且可以將其立即使用或者可以如上面關于海綿基質所描述的孵育該組合物。
對于塊狀基質，如上文描述的非有機基質(例如，BIO-OSS塊狀體)或者去礦化的骨基質(例如，DYNAGRAFTTM基質)，可以將約100到150μl中約1.2×107到2.0×107個細胞接種在基質材料的1cm×1cm×2cm立方體塊中。通常將細胞緩慢接種在塊狀體表面的一個面上。一旦培養(yǎng)基和細胞被吸收到該塊狀體，可以以相似的方式接種該塊狀體的另一個面?？梢灾貜驮摲椒ㄖ钡皆搲K狀體的所有表面都得到接種并且用培養(yǎng)基完全飽和該塊狀體。應該小心避免加入過量培養(yǎng)基從而導致培養(yǎng)基和細胞從塊狀體泄漏。然后將該組合物在37℃孵育約60-120分鐘而不加入額外的培養(yǎng)基以允許基本上所有細胞都附著到基質材料。細胞粘附后，可以向該基質和細胞組合物加入額外的生長培養(yǎng)基，然后將該組合物在37℃孵育2-3天，每天更換培養(yǎng)基。細胞通常以高密度(見上文)加入基質以基本上填充細胞可利用的基質內的空間，得到與上述相同的結果。洗滌組合物并且可以將其立即使用或者可以如上面關于海綿基質所描述的孵育該組合物。
通過混合組分，例如，將它們來回穿過通過Luer鎖緊套口連接的兩個注射器可以制備含有自體、經傳代的細胞和小顆粒生物可降解的基質(例如，F(xiàn)ASCIANTM、CYMETRATM、或DERMALOGENTM)的組合物。例如，通?？梢栽谧⑸淦?例如3cc注射器)中以80mg/注射器得到FASCIANTM。FASCIANTM顆?？梢栽谑褂们爸苯釉谧⑸淦髦邢礈?，通過將小體積(例如，1.5ml)洗滌緩沖液(例如，等滲鹽水或者含有右旋糖的Kreb’s Ringers溶液)吸收到注射器中，將第一個注射器通過luer鎖緊套口與第二個注射器連接，并將顆粒和洗滌溶液反復穿過兩個注射器之間數(shù)次可以實現(xiàn)所述洗滌。為了將顆粒與洗滌溶液分離，可以將混合物轉移到無菌管中并讓FASCIANTM顆粒沉降?？梢猿?例如，倒出或者吸出)溶液，并且可以如所希望的通過將顆粒吸到新注射器(例如，通過18號或者20號針頭)可以重復洗滌方法。
當適當洗滌顆粒時，可以使用與洗滌相同的方法將顆粒與細胞(例如，UMC，任選地，成纖維細胞)混合。可以將細胞(例如，1×107到3×107個細胞)懸浮在溶液(例如，含有5％右旋糖的1.5ml Kreb’sRingers溶液)并吸到注射器中。含有細胞的注射器可以通過luer鎖緊套口連接含有填充劑顆粒的注射器，通過將兩種組分反復穿過注射器將它們混合?？梢詫⒒旌衔镛D移到T-25組織培養(yǎng)瓶或者組織培養(yǎng)皿或者管從而細胞可以附著到填充劑顆粒。備選地，混合物可以保留在注射器中而發(fā)生貼壁，盡管這可能對細胞更有害?？梢詫⒒旌衔镞^夜孵育并轉移到容器(例如，小瓶或者管)中以遞送給臨床醫(yī)生，或者轉移到注射器中以施用于受試者。遞送給臨床醫(yī)生的容器可以在遞送期間在冰上保持。當使用這種小顆粒無細胞生物可降解的基質時，可以任選地將含有細胞的顆粒懸浮液注射而不是將其植入到組織退變或者缺陷區(qū)域。
當含有生物可降解的非細胞基質的組合物中包括兩種細胞類型(例如UMC和成纖維細胞)時，可以在將細胞接種到基質前將細胞一起混合。備選地，可以將它們單獨接種到基質中。當一種細胞類型(例如，成纖維細胞)在另一種細胞類型(例如，UMC)之前或者之后接種時，可以在第一種接種即刻后或者第一次接種的細胞基本上附著到基質材料之后進行第二種接種。
本發(fā)明還提供了制備含有細胞(例如，自體的、經傳代的UMC)和基質組分的組合物的方法。這些方法通常包括提供基本上無免疫原性蛋白質(例如，培養(yǎng)基血清來源的蛋白質)的自體的、經傳代細胞的懸浮液，提供生物可降解的非細胞基質，將該生物可降解的非細胞基質與該細胞懸浮液孵育使得細胞整合在基質上或者內部，從而形成用于修復或者增大組織的組合物。這些方法還可以包括將細胞(例如，自體、經傳代的成纖維細胞)的第二種懸浮液與第一種細胞懸浮液一起或者分別加到基質中。
6.含有填充劑材料的組合物本發(fā)明的組合物可以含有細胞(例如，自體的、經傳代的UMC)與一種或多種生物可降解的非細胞可注射的填充劑材料(即，膨脹劑)。該組合物適于注射到受試者中以便修復已經退變的組織。填充劑材料通常完成結構功能。例如，其可以填充組織中缺陷、洞、空間或者腔并提供環(huán)境，在該環(huán)境中經注射的細胞可以附著到周圍組織并生長和產生由于新組織生長導致的結構因子和其他因子(如趨化因子)。在許多情況中，填充劑的缺口填充功能是暫時的并且僅持續(xù)到受移植的和/或宿主細胞遷移到該區(qū)域并形成新的組織。優(yōu)選地，填充劑是生物可降解的。通常以粘稠溶液或者懸浮液提供并使用填充劑。填充劑可以與一種或多種細胞類型(例如，UMC和成纖維細胞)組合。細胞通常以約1∶1的體積比與填充劑組合，然而可以使用任何適宜的比例。
多種類型的生物可降解的、非細胞可注射填充劑可加入本發(fā)明的組合物。填充劑可以由自體蛋白質組成，該自體蛋白質包括從受試者得到的任一類型的膠原。這種填充劑的實例為Autologen(以前由Collagenesis Corp.(Beverly，MA)生產)。Autologen是源于受試者的自體皮膚膠原纖維的分散劑，因此當與細胞如UMC和任選地，成纖維細胞再施用于該受試者時不引起甚至最小的免疫應答。為了得到Autologen，從受試者得到組織(例如，真皮、胎盤或者臍帶)標本并送到Collagenesis Corp.，在那里將該標本加工成富含膠原的分散劑。約1.5平方英寸皮膚組織可以產生1立方厘米(cc)Autologen。可以根據(jù)矯正缺陷或者改善受試者中的組織所需的量調節(jié)Autologen的濃度。分散劑中Autologen的濃度可以為例如，至少約25mg/L(例如，至少約30mg/L，至少約40mg/L，至少約50mg/L，或至少約100mg/L)。
非細胞可注射的填充劑材料還可以含有非自體蛋白質，包括任何類型的膠原。多種膠原產品是通過商業(yè)途徑可得到的并且可以用于本發(fā)明的組合物。人膠原產品也是通過商業(yè)途徑可得到的。通過商業(yè)途徑可得到的膠原的實例包括，但不限于，牛膠原，例如，重構的牛膠原產品，如Zyderm和Zyplast，其含有與戊二醛交聯(lián)的重構的牛膠原纖維，該膠原纖維懸浮在含有0.3％利多卡因的磷酸緩沖生理鹽水中。這些產品由MeGhan Medical Corporation of Santa Barbara，CA生產。豬膠原產品也是通過商業(yè)途徑可得到的。用于本發(fā)明的膠原可以分離自適當物種的組織，或者可以將它們制備成重組蛋白。重組蛋白可以具有與天然發(fā)生的蛋白質相同的氨基酸序列，或者它們可以具有含有置換、缺失或者插入的氨基酸序列，所述置換、缺失或者插入提高了該蛋白質的功能。
有用的填充劑材料的其他實例包括，但不限于，經溶解的明膠、聚乙醇酸(例如，經溶解的聚乙醇酸或者聚乙醇酸的顆粒)，或者腸線。適宜的明膠基質植入物，例如，以商標Fibril銷售。該填充劑含有等體積的(1)分散在0.9％(體積)氯化鈉溶液中的豬明膠粉末和鄰氨基己酸，和(2)來自受試者的血漿等分試樣?？捎米魈畛鋭┑钠渌镔|包括透明質、透明質酸、restalyn和parleane。
當含有生物可降解的非細胞填充劑的組合物中包括兩種細胞類型(例如，UMC和成纖維細胞)時，這些細胞可以在與填充劑混合前相互混合。備選地，它們可以順序地與填充劑混合。當一種細胞類型(例如，成纖維細胞)在另一細胞類型(例如，UMC)之前或者之后與填充劑混合，可以在第一種混合即刻后或者適宜的孵育時間后進行第二種混合。
本發(fā)明還提供了制備含有細胞(例如，自體、經傳代的UMC與或者不與自體、經傳代的成纖維細胞)和生物可降解的非細胞填充劑的組合物的方法。這些方法通常包括提供細胞(例如，自體、經傳代的UMC和，任選地，成纖維細胞)，其基本上無免疫原性蛋白質(例如，培養(yǎng)基血清來源的蛋白質)，提供一種或多種生物可降解的非細胞填充劑材料，和將該填充劑與該細胞懸浮液合并。備選地，不同細胞類型的單獨的懸浮液可以與填充劑合并。
7.使用含有UMC與或者不與成纖維細胞的組合物的方法本發(fā)明的細胞組合物可用于治療例如，皮膚、骨，或者軟組織的缺陷。細胞組合物可用于代替atelocollagen溶液，具有上面提出的優(yōu)點。可以用本發(fā)明組合物治療的導致組織退變的疾病、失調或者缺陷包括口腔粘膜缺陷、口腔粘膜或者口骨如上頜或者下頜骨的創(chuàng)傷(例如，牙拔除)、牙周病、糖尿病、皮膚潰瘍、和靜脈停滯。此外，導致組織退變的牙周病的實例包括，但不限于，牙周退變、齒齦炎、或者腭粘膜或者齒齦粘膜的非愈合傷口，或者骨退變。用本發(fā)明可以治療的其他缺陷包括皮膚缺陷，如疤痕、皺紋、笑紋、妊娠紋、凹陷型疤痕、非創(chuàng)傷起源的皮膚凹陷、痤瘡疤痕、和痤瘡、創(chuàng)傷、先天性畸形或者老化導致的皮下萎縮。此外，本發(fā)明的組合物可用于治療諸如唇發(fā)育不全、唇皺褶的缺陷，或者骨缺陷，例如，面部骨，包括眼窩、下顎骨、maxillae、顴骨、顱骨、和鼻骨，以及脊柱骨和長骨缺陷。
本文中所用的“預防”指完全防止疾病癥狀，延遲疾病癥狀的發(fā)作，或者減輕隨后發(fā)生的疾病癥狀的嚴重性。“防止”應該指疾病(例如，癌癥)的癥狀基本上不存在。本文中所用的“治療”可以指完全消除疾病的癥狀或者減輕疾病癥狀的嚴重性。
可以對受試者施用本發(fā)明的組合物以治療組織缺陷(例如，上文描述的缺陷)。可通過任何適宜的方法，例如，注射、植入，或者移植進行施用。
可以如下實施本發(fā)明的一個實施方案，即治療細小的淺的面紋。將所要治療的區(qū)域用乙醇準備并拉伸以得到緊繃的表面。用裝有細胞懸浮液并用安裝30號或者更大(例如，22號、18號、或者12號)針頭的注射器注射。針頭盡可能淺地插入皮膚部位；斜角的方向不是關鍵的?？梢允褂梅派湫灾笇?。通過輕微的壓力進行皮內注射直到看見輕微變白?？梢赃M行多次連續(xù)注射。
在其他實施方案中，注射物置于obicularis肌肉組織中以治療唇發(fā)育不全，或者置于皮下組織中以治療深的皮下缺陷。
在備選實施方案中，通過皮膚磨損到中部或者深處真皮的水平可以治療痤瘡的廣泛區(qū)域。然后可以形成含有成纖維細胞的凝塊以便覆蓋被磨損的表面并應用，從而凝塊的成纖維細胞接種側與經磨損的皮膚表面并列。然后所應用的凝塊可以經手術敷料，如Xeroform3、Adaptic3或者任何nonocclusive手術敷料覆蓋。
在多數(shù)情況中，當施用UMC和成纖維細胞時，它們作為單一組合物或者分開的組合物一起使用。然而，可以理解UMC和成纖維細胞可以單獨制備并且單獨使用。盡管單獨施用這兩種細胞群體，但是施用可以是同時或者順序(以任何順序)的。當順序施用時，施用可以相隔數(shù)分鐘(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、或55分鐘)，數(shù)小時(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、14、18、22、或23小時)，數(shù)天(例如，1、2、3、4、5、或6天)，或數(shù)周(例如，1、2、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、40、50、或更多周)。
8.含有角質細胞和成纖維細胞的組合物的使用方法角質細胞組成表皮的主要細胞群體，并且在完成受損表皮組織的修復和再生中起主要作用。本發(fā)明提供了通過注射含有角質細胞與或者不與成纖維細胞的細胞懸浮液增強組織缺陷(例如，燒傷傷口)的修復。如上文描述，由于角質細胞從傷口的外邊緣向中心生長，傷口愈合通常導致疤痕。通過向傷口的中心區(qū)域注射角質細胞(例如，自體、經傳代的角質細胞)，可以促進愈合并且可以減小或者完全避免疤痕形成。含有角質細胞和成纖維細胞和/或UMC的組合物尤其可用于治療燒傷(例如，小燒傷或者更大燒傷的殘留的、未愈合的部分)，盡管也可以使用含有這些細胞類型的僅一種的組合物。所要治療的燒傷傷口通常直徑約3到5厘米，但是可以是任何大小或者尺寸。該類型的治療可以用于“填充”和重建創(chuàng)傷如燒傷所破壞的表皮。
9.裝置本發(fā)明提供了修復受試者中皮膚缺陷的裝置。這些裝置可以包括具有注射器腔的皮下注射器、處于注射器腔內的活塞，和與注射器腔連通的孔。該注射器腔可以含有細胞懸浮液，例如，自體、經傳代的UMC和自體、經傳代的成纖維細胞的懸浮液或者此處公開的任何其他細胞組合物或者細胞混合物的懸浮液。細胞懸浮液可以基本上無培養(yǎng)基血清來源的蛋白質。細胞可以懸浮在培養(yǎng)基(例如，無血清培養(yǎng)基)或者藥學上可接受的載體溶液(例如，無菌水或者生理鹽水)中。該裝置還可以具有固定到與注射器腔連通的孔的皮下注射針頭。
本發(fā)明還提供了制備上述裝置的方法。這些方法可以包括使用本文中描述的任一種方法制備細胞懸浮液，然后將該細胞懸浮液置于注射器的注射腔中。
將通過下面的實施例進一步描述本發(fā)明，這些實施例不限制權利要求書中描述的本發(fā)明范圍。
實施例實施例1-自體UMC和成纖維細胞的分離如下從正常健康人類志愿者所得的皮膚活組織檢查收獲細胞并通過啟動培養(yǎng)體外富集細胞。從耳后部位得到約3到5mm3的活組織檢查，并且使用含有4500mg/L D-葡萄糖、2mM L-谷氨酰胺、非必需氨基酸和10％FBS的DMEM如上所述啟動成纖維細胞組織培養(yǎng)。傳代兩次或三次貼壁成纖維細胞達到完全匯合后觀察到非貼壁的、旺盛生長的細胞的集落。通過在低血清并存在5ng/ml aFGF時，或者通過在血漿凝塊(見實施例2)中生長并加入300mM CaCl2到終濃度15到30mM可以縮短該過程。每個集落含有2到約80個細胞，它們與上皮樣細胞相似并且旺盛分裂。通過吸出含有漂浮集落的培養(yǎng)基并離心該培養(yǎng)基收集集落。通過直接接種在含有aFGF和肝素的新鮮培養(yǎng)基(含有4500mg/L D-葡萄糖、2mM L-谷氨酰胺、2.5％熱滅活的FBS、5ng/mL重組人aFGF，和5μg/mL肝素的DMEM)將離心沉淀的細胞轉移到新的組織培養(yǎng)容器中。將細胞懸浮液加入新鮮組織培養(yǎng)瓶，將該瓶在37℃孵育。細胞經每周喂飼兩次，并當達到匯合時經傳代或者差別胰蛋白酶化(通常1到2周內)。在開始培養(yǎng)的約3-6周內觀察到鵝卵石樣細胞的集落。分離這些集落并在新鮮組織培養(yǎng)容器中培養(yǎng)導致細胞變得貼壁。
如下還從人脂肪組織分離非貼壁細胞的集落。將組織切成小塊并除去所有可見的膜。將組織置于含有4500mg/L D-葡萄糖、2mM L-谷氨酰胺、2.5％熱滅活的FBS、1-10ng/mL重組人aFGF，和5μg/mL肝素的DMEM中培養(yǎng)。在這些條件下，鵝卵石樣細胞主動地從脂肪組織脫落，并繼續(xù)生長一段時間。洗滌脂肪組織小塊并將其置于新的組織培養(yǎng)容器中。約2周內，通過用膠原酶IV在37℃處理約5-15分鐘從組織分離UMC。源于脂肪組織的新細胞保持培養(yǎng)中旺盛生長1年以上，直到結束培養(yǎng)。一旦培養(yǎng)物完全生長，觀察到非貼壁細胞群。當將這些細胞再接種在新的組織培養(yǎng)瓶中時，觀察到相同細胞類型旺盛生長。
存在aFGF時，來自皮膚和脂肪組織的培養(yǎng)中的細胞在外觀上是形態(tài)均一的，像上皮樣的細胞，具有鵝卵石樣形態(tài)。然而，當從培養(yǎng)基除去aFGF時，多數(shù)細胞完全分化成貼壁成纖維細胞。使用Marko等人(如前)描述的方法在從骨髓開始的培養(yǎng)物中也觀察到鵝卵石樣的貼壁細胞。推斷從皮膚建立的成纖維細胞培養(yǎng)物或者脂肪組織或者骨髓的培養(yǎng)物收獲的非貼壁的類似上皮樣的細胞的至少一個亞群是UMC。
實施例2血漿凝塊中細胞的分離和生長在血漿凝塊凝膠中培養(yǎng)如本文中描述的分離的細胞。該方法用于分離和純化多種細胞類型。使用自體人血漿、牛血漿或者小牛血漿制備血漿凝塊，血纖蛋白或者氯化鈣用作凝固劑。制備血漿凝塊凝膠，將其預洗滌，然后接種從培養(yǎng)瓶直接轉移的所希望的細胞類型?？扇菀椎貜哪龎K凝膠直接分離細胞集落。備選地，通過克隆裝置或者孔盤插入物分離細胞，在這種情況下將細胞接種在插入物中并且用于生長因子遞送的支持細胞(例如，成纖維細胞或者其他所希望的細胞類型)被接種在插入物下面。
實施例3用成纖維細胞懸浮液治療燒傷傷口通過向傷口直接注射無酚紅的DMEM中的約30到40×106個成纖維細胞/ml的懸浮液治療覆蓋全部前額的6個月久的非愈合燒傷傷口的患者。以2周間隔類似地再注射燒傷傷口兩次，盡管通過第二次注射，傷口幾乎完全封閉。該傷口隨后愈合，其具有最小的疤痕形成。治療激光燒傷的其他患者得到類似的成功。第三次注射后，如果需要，將未使用的細胞保存在液氮中備用。含有角質細胞以及成纖維細胞的組合物將至少和只含有成纖維細胞的那些組合物一樣有效，可能更有效。此外，考慮到UMC可以分化成成纖維細胞，無論UMC不與或者與成纖維細胞一起施用，都和成纖維細胞一樣有效。
實施例4用活化因子優(yōu)化UMC的治療實施體外實驗以確定加入到UMC培養(yǎng)中的活化化合物的最佳濃度。將在基質或者單層中的UMC培養(yǎng)物與多種濃度的活化化合物(如本文中公開的那些)孵育。通過評估哪種濃度與細胞增殖的最大水平相關來確定最佳濃度。備選地，最佳濃度為導致膠原產生的最大水平的濃度。膠原被分泌到培養(yǎng)基中，通過免疫學測定法如蛋白質印跡或者ELISA檢測膠原。用成纖維細胞試驗的活化化合物的最佳濃度對于抗壞血酸為10-5M，抗壞血酸基棕櫚酸酯10-7M，和L-硫辛酸為10-6-10-7M。
其他實施方案可以理解盡管關于本發(fā)明的詳細描述描述了本發(fā)明，但是前面的描述用于闡明而不是限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍由所附權利要求書的范圍限定。其他方面、優(yōu)點，和修改在所附權利要求書的范圍內。
權利要求
1.用于修復組織的組合物，其中所述組合物含有自體的、經傳代的UMC和自體的、經傳代的成纖維細胞，并且其中所述組合物基本上無培養(yǎng)基血清來源的蛋白質。
2.權利要求1的組合物，其中所述自體成纖維細胞來自所述受試者的牙床、腭區(qū)、皮膚、固有層、結締組織、骨髓、筋膜、或者脂肪組織。
3.權利要求1的組合物，其中所述UMC來自皮膚組織、脂肪組織、結締組織、筋膜、固有層、或骨髓。
4.權利要求1的組合物，其中所述UMC或所述成纖維細胞已經經一種或多種活化化合物處理。
5.權利要求4的組合物，其中所述一種或多種活化化合物選自抗壞血酸棕櫚酸酯、亞油酸、奎尼酸、奎尼酸鹽、奎寧內酯、輔酶Q-10、L-羥酸、L-硫辛酸、磷酸二氫鈣、三磷酸鈣、煙酸、脫氫表雄甾酮(DHEA)、二甲基氨基乙醇(DMAE)、E-生育酚、骨形態(tài)發(fā)生蛋白質(BMP)、維生素E、維生素C、類胡蘿卜素、乙醇酸、羧基烷基酯、雌三醇、乙?；?L-肉堿、丙炔苯丙胺、番茄紅素、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)、半胱氨酸、前半胱氨酸、pikamilon、長春西汀、視黃酸、抗癌肽類，和生長因子。
6.權利要求1的組合物，其中所述UMC或所述成纖維細胞已經暴露于低能量激光。
7.權利要求1的組合物，其中組合物還含有生物可降解的基質，其中所述UMC和所述成纖維細胞整合到所述基質的內部或者上面。
8.權利要求7的組合物，其中所述基質與所述UMC和所述成纖維細胞組合前，含有選自膠原、糖胺聚糖、明膠、聚乙醇酸、腸線、脫礦質骨、羥基磷灰石和無機骨的一種或多種物質。
9.權利要求1的組合物，其還含有生物可降解的非細胞可注射填充劑。
10.權利要求9的組合物，其中所述生物可降解的非細胞可注射填充劑在與所述UMC組合前，含有選自(a)自體膠原纖維的可注射的分散劑；(b)膠原；(c)經溶解的明膠；(d)經溶解的聚乙醇酸；(e)經溶解的腸線；(f)分散在氯化鈉溶液和受試者的血漿等分試樣中的豬明膠粉和氨基己酸；和(g)透明質酸的一種或多種物質。
11.修復受試者中組織的方法，其中所述方法包括(a)提供含有自體的、經傳代的UMC的組合物，其中該組合物基本上無培養(yǎng)基血清來源的蛋白質；(b)鑒定受試者中組織缺陷或者組織退變的部位；和(c)將所述組合物置于所述部位從而組織缺陷或者退變得到修復；其中所述組織缺陷或者退變包括軟組織缺陷、口腔粘膜缺陷、口腔粘膜創(chuàng)傷、牙周病、糖尿病、皮膚潰瘍、靜脈停滯，或者皮膚的美容缺陷。
12.權利要求11的方法，其中所述軟組織缺陷選自面部凹陷、乳腺發(fā)育不全、乳腺缺乏、聲帶缺陷、腭咽功能不全、Poland氏綜合征、陰莖發(fā)育不全、唇發(fā)育不全，和皮下萎縮或者肌肉萎縮。
13.權利要求11的方法，其中所述口腔粘膜創(chuàng)傷是牙拔除導致的拔除牙槽。
14.權利要求11的方法，其中所述牙周病包括牙周退變、牙齦炎，或者腭粘膜或者齒齦粘膜的非愈合傷口。
15.權利要求11的方法，其中所述美容缺陷選自皺紋、凹陷型疤痕、非創(chuàng)傷起源的皮膚凹陷、笑紋、妊娠紋、皺紋、創(chuàng)傷疤痕、痤瘡疤痕、和皮下萎縮。
16.權利要求11的方法，其中所述組織缺陷是唇發(fā)育不全或者或者唇皺褶。
17.權利要求11的方法，其中所述自體UMC來自所述受試者的牙床、腭區(qū)、皮膚、固有層、結締組織、筋膜、骨髓、或脂肪組織。
18.權利要求11的方法，其中所述組合物還含有生物可降解的基質，其中所述UMC整合在該基質的內部或者上面。
19.權利要求11的方法，其中所述組合物還含有生物可降解的非細胞填充劑。
20.修復受試者中組織缺陷的方法，其中該方法包括(a)提供含有自體的、經傳代的UMC和自體的、經傳代的成纖維細胞的組合物，其中該組合物基本上無培養(yǎng)基血清來源的蛋白質；(b)鑒定受試者中組織缺陷或者組織退變的部位；和(c)將該組合物置于該部位從而組織缺陷或者退變得到修復。
21.修復受試者中組織缺陷的方法，其中所述方法包括(a)提供含有(1)自體的、經傳代的UMC，(2)自體的、經傳代的成纖維細胞，和(3)其藥學上可接受的載體的藥物組合物；其中所述藥物組合物基本上無培養(yǎng)基血清來源的蛋白質；(b)鑒定所述受試者中組織缺陷或者組織退變的部位，所述缺陷或者退變選自牙或者牙周缺陷、皮膚的美容缺陷、和骨缺陷；和(c)將治療有效量的所述藥物組合物注射到所述組織缺陷或者退變的鄰近部位，其中所述注射導致所述組織缺陷或者退變的修復。
22.修復受試者中由于所述受試者的疾病、失調或者缺陷導致的退變的組織的方法，所述方法包括將權利要求9的組合物注射到所述受試者中所述退變部位以便所述組織得到修復。
23.修復受試者中由于所述受試者中疾病、失調或者缺陷導致的退變的組織的方法，所述方法包括將權利要求7的組合物置于所述受試者中所述退變部位以便所述組織得到修復。
24.修復受試者中由于所述受試者中疾病、失調或者缺陷導致的退變的組織的方法，所述方法包括步驟(a)將自體的、經傳代的UMC注射到所述受試者中組織退變部位，其中所述UMC基本上無培養(yǎng)基血清來源的蛋白質；(b)將自體的、經傳代的成纖維細胞注射到所述受試者中組織缺陷或者所希望的組織增大的部位，其中該成纖維細胞基本上無培養(yǎng)基血清來源的蛋白質；和(c)將生物可降解的非細胞填充劑注射到該部位。
25.制備用于修復組織的細胞組合物的方法，所述方法包括(a)提供含有未經分化的間充質細胞(UMC)的組織的活組織檢查樣品以得到起始細胞；(b)從所述活組織檢查樣品分離起始細胞；(c)培養(yǎng)所述起始細胞；和(d)從所述培養(yǎng)物收獲非貼壁衍生細胞群體，其中所述非貼壁衍生細胞含有UMC。
26.權利要求25的方法，其還包括利用來自前面輪收獲的非貼壁衍生細胞群體作為起始細胞重復步驟(c)和(d)的一輪或多輪衍生。
27.權利要求26的方法，其中所述一輪或多輪衍生包括1到20輪。
28.權利要求25的方法，其中所述含有UMC的組織選自皮膚組織、脂肪組織、結締組織、筋膜、固有層和骨髓。
29.權利要求25的方法，其還包括在酸性成纖維細胞生長因子的存在下培養(yǎng)所述非貼壁細胞。
30.制備修復受試者中由于所述受試者中疾病、失調或者缺陷導致的退變的組織的組合物的方法，所述方法包括(a)提供來自所述受試者的含有UMC的組織的活組織檢查樣品；(b)從所述活組織檢查樣品分離自體UMC；(c)在產生基本上沒有培養(yǎng)基血清來源的蛋白質的自體UMC的條件下培養(yǎng)所述自體UMC；(d)將所述經培養(yǎng)的自體UMC暴露于導致所述UMC懸浮的條件；(e)提供來自所述受試者的含有成纖維細胞的組織的活組織檢查樣品；(f)從所述活組織檢查樣品分離自體成纖維細胞；(g)在產生基本上沒有培養(yǎng)基血清來源的蛋白質的成纖維細胞的條件下培養(yǎng)所述自體成纖維細胞；(h)將所述經培養(yǎng)的自體成纖維細胞暴露于導致所述成纖維細胞懸浮的條件；和(i)將所述UMC懸浮液與所述成纖維細胞懸浮液混合。
31.權利要求30的方法，其中所述含有UMC的組織選自牙床、腭區(qū)、皮膚、固有層、結締組織、筋膜、骨髓、和脂肪組織。
32.權利要求30的方法，其中所述含有自體成纖維細胞的組織選自牙床、腭區(qū)、皮膚、固有層、結締組織、筋膜、骨髓、和脂肪組織。
33.權利要求30的方法，其中在所述組合前，所述UMC或者所述成纖維細胞暴露于一種或多種活化化合物。
34.權利要求33的方法，其中所述一種或多種活化化合物選自抗壞血酸棕櫚酸酯、亞油酸、奎尼酸、奎尼酸鹽、奎寧內酯、輔酶Q-10、L-羥酸、L-硫辛酸、磷酸二氫鈣、三磷酸鈣、煙酸、DHEA、DMAE、E-生育酚、BMP、維生素E、維生素C、類胡蘿卜素、乙醇酸、羧基烷基酯、雌三醇、乙酰基-L-肉堿、丙炔苯丙胺、番茄紅素、NADH、半胱氨酸、前半胱氨酸、pikamilon、長春西汀、視黃酸、抗癌肽類，和生長因子。
35.權利要求30的方法，其中所述UMC或所述成纖維細胞暴露于低能量激光。
36.制備修復受試者中由于所述受試者中疾病、失調或者缺陷導致的退變的組織的組合物的方法，所述方法包括(a)提供自體的經傳代的UMC；(b)提供自體的經傳代的成纖維細胞；(c)提供生物可降解的非細胞基質；和(d)將所述UMC和所述成纖維細胞與所述生物可降解的非細胞基質孵育從而所述UMC和/或成纖維細胞整合在所述生物可降解的非細胞基質上或者內部，其中該孵育導致用于修復組織的組合物，并且其中所述孵育的條件為使得所述組合物基本上無培養(yǎng)基血清來源的蛋白質的條件。
37.權利要求36的方法，其中提供自體的經傳代的UMC的步驟包括(a)提供來自所述受試者的含有UMC的組織的活組織檢查樣品；(b)從所述活組織檢查樣品分離自體UMC；(c)培養(yǎng)所述UMC；和(d)將所述經培養(yǎng)的UMC暴露于導致所述UMC懸浮的條件。
38.權利要求37的方法，其中所述含有UMC的組織選自牙床、腭區(qū)、皮膚、固有層、結締組織、筋膜、骨髓、和脂肪組織。
39.權利要求36的方法，其中所述生物可降解的非細胞基質在與所述UMC和所述成纖維細胞組合前含有一種或多種物質，所述物質選自膠原、糖胺聚糖、明膠、聚乙醇酸、腸線、脫礦質骨、羥基磷灰石、珊瑚和無機骨。
40.權利要求36的方法，其中提供自體的經傳代的成纖維細胞的步驟包括(a)提供來自所述受試者的含有成纖維細胞的組織的活組織檢查樣品；(b)從所述活組織檢查樣品分離自體成纖維細胞；(c)培養(yǎng)所述成纖維細胞；和(d)懸浮所述成纖維細胞。
41.權利要求40的方法，其中所述含有成纖維細胞的組織選自牙床、腭區(qū)、皮膚、固有層、結締組織、筋膜、骨髓、和脂肪組織。
42.權利要求36的方法，其中在與所述生物可降解的非細胞基質的所述孵育前，所述UMC或者所述成纖維細胞暴露于一種或多種活化化合物。
43.權利要求42的方法，其中所述一種或多種活化化合物選自抗壞血酸棕櫚酸酯、亞油酸、奎尼酸、奎尼酸鹽、奎寧內酯、輔酶Q-10、L-羥酸、L-硫辛酸、磷酸二氫鈣、三磷酸鈣、煙酸、DHEA、DMAE、E-生育酚、BMP、維生素E、維生素C、類胡蘿卜素、乙醇酸、羧基烷基酯、雌三醇、乙酰基-L-肉堿、丙炔苯丙胺、番茄紅素、NADH、半胱氨酸、前半胱氨酸、pikamilon、長春西汀、視黃酸、抗癌肽類，和生長因子。
44.權利要求36的方法，其中所述UMC或所述成纖維細胞暴露于低能量激光。
45.制備修復受試者中由于所述受試者中疾病、失調或者缺陷導致的退變的組織的組合物的方法，所述方法包括(a)提供自體的、經傳代的UMC，其中所述UMC基本上無培養(yǎng)基血清來源的蛋白質；(b)提供自體的、經傳代的成纖維細胞，其中所述自體的、經傳代的成纖維細胞基本上無培養(yǎng)基血清來源的蛋白質；(c)提供生物可降解的非細胞填充劑；和(d)將所述自體的、經傳代的UMC、所述自體的、經傳代的成纖維細胞與所述生物可降解的非細胞填充劑組合。
46.權利要求45的方法，其中提供自體經傳代的UMC的步驟包括(a)提供來自所述受試者的含有UMC的組織的活組織檢查樣品；(b)從所述活組織檢查樣品分離自體UMC；(c)在導致基本上無培養(yǎng)基血清來源的蛋白質的UMC的條件下培養(yǎng)所述自體UMC；和(d)將所述經培養(yǎng)的UMC暴露于導致所述UMC懸浮的條件。
47.權利要求46的方法，其中所述含有UMC的組織選自牙床、腭區(qū)、皮膚、固有層、結締組織、筋膜、骨髓、和脂肪組織。
48.權利要求45的方法，其中所述生物可降解的非細胞填充劑在與所述UMC和所述成纖維細胞組合前，含有選自(a)自體膠原纖維的可注射的分散劑；(b)膠原；(c)經溶解的明膠；(d)經溶解的聚乙醇酸；(e)經溶解的腸線；(f)分散在氯化鈉溶液和受試者的血漿等分試樣中的豬明膠粉和氨基己酸；和(g)透明質酸的一種或多種物質。
49.權利要求46的方法，其中提供自體經傳代的成纖維細胞的步驟包括(a)提供來自所述受試者的含有成纖維細胞的組織的活組織檢查樣品；(b)從所述活組織檢查樣品分離自體成纖維細胞；(c)在導致基本上無培養(yǎng)基血清來源的蛋白質的成纖維細胞的條件下培養(yǎng)所述自體成纖維細胞；和(d)將所述經培養(yǎng)的自體成纖維細胞暴露于導致所述成纖維細胞懸浮的條件。
50.權利要求49的方法，其中所述含有成纖維細胞的組織選自牙床、腭區(qū)、皮膚、固有層、結締組織、筋膜、骨髓、和脂肪組織。
51.權利要求45的方法，其中在與所述生物可降解的非細胞填充劑的所述組合前，所述UMC或者所述成纖維細胞暴露于一種或多種活化化合物。
52.權利要求51的方法，其中所述一種或多種活化化合物選自抗壞血酸棕櫚酸酯、亞油酸、奎尼酸、奎尼酸鹽、奎寧內酯、輔酶Q-10、L-羥酸、L-硫辛酸、磷酸二氫鈣、三磷酸鈣、煙酸、DHEA、DMAE、E-生育酚、BMP、維生素E、維生素C、類胡蘿卜素、乙醇酸、羧基烷基酯、雌三醇、乙?；?L-肉堿、丙炔苯丙胺、番茄紅素、NADH、半胱氨酸、前半胱氨酸、pikamilon、長春西汀、視黃酸、抗癌肽類，和生長因子。
53.權利要求45的方法，其中所述UMC或所述成纖維細胞暴露于低能量激光。
54.修復受試者中燒傷傷口的方法，所述方法包括提供自體的、經傳代的角質細胞和自體的、經傳代的成纖維細胞的懸浮液并將所述懸浮液注射到所述燒傷傷口中。
55.權利要求54的方法，其中所述提供自體的、經傳代的角質細胞和自體的、經傳代的成纖維細胞的懸浮液包括(a)提供來自所述受試者的含有角質細胞的組織的活組織檢查樣品；(b)從所述活組織檢查樣品分離自體角質細胞；(c)在產生基本上沒有培養(yǎng)基血清來源的蛋白質的自體角質細胞的條件下培養(yǎng)所述自體角質細胞；(d)將所述角質細胞暴露于導致所述角質細胞懸浮的條件；(e)提供來自所述受試者的含有成纖維細胞的組織的活組織檢查樣品；(f)從所述活組織檢查樣品分離自體成纖維細胞；(g)在產生基本上沒有培養(yǎng)基血清來源的蛋白質的自體成纖維細胞的條件下培養(yǎng)所述自體成纖維細胞；(h)將所述成纖維細胞暴露于導致所述成纖維細胞懸浮的條件；和(i)將所述懸浮的角質細胞和懸浮的成纖維細胞組合。
56.權利要求54的方法，其中所述含有角質細胞的組織選自皮膚、口腔粘膜、牙床、頰組織、食管組織、外宮頸組織，和結膜組織。
57.權利要求54的方法，其中所述含有成纖維細胞的組織選自牙床、腭區(qū)、皮膚、固有層、結締組織、筋膜、骨髓、和脂肪組織。
58.權利要求54的方法，其中在與所述角質細胞組合前，所述成纖維細胞暴露于一種或多種活化化合物。
59.權利要求58的方法，其中所述一種或多種活化化合物選自抗壞血酸棕櫚酸酯、亞油酸、奎尼酸、奎尼酸鹽、奎寧內酯、輔酶Q-10、L-羥酸、L-硫辛酸、磷酸二氫鈣、三磷酸鈣、煙酸、DHEA、DMAE、E-生育酚、BMP、維生素E、維生素C、類胡蘿卜素、乙醇酸、羧基烷基酯、雌三醇、乙?；?L-肉堿、丙炔苯丙胺、番茄紅素、NADH、半胱氨酸、前半胱氨酸、pikamilon、長春西汀、視黃酸、抗癌肽類，和生長因子。
60.權利要求54的方法，其中所述成纖維細胞暴露于低能量激光。
61.權利要求54的方法，其中所述懸浮液還含有自體的、經傳代的UMC。
62.權利要求54的方法，其還包括將強化化合物注射到所述傷口。
全文摘要
本發(fā)明提供了矯正受試者的皮膚、軟組織和骨中化妝、審美和退變缺陷的組合物和方法。具體地，本發(fā)明的方法包括向與缺陷相鄰或者亞相鄰或者在缺陷部位的組織(例如，皮下組織)注射或者植入自體的UMC、成纖維細胞和/或角質細胞。如本文中提供的注射的細胞與受試者組織相容(例如，自體的)并且已經通過在細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中傳代而擴增。
文檔編號C12N5/08GK1735685SQ03825841
公開日2006年2月15日 申請日期2003年4月7日 優(yōu)先權日2002年11月21日
發(fā)明者O·馬科, W·K·小波斯 申請人:埃索拉根技術有限公司