專利名稱：編碼結(jié)核分枝桿菌組蛋白樣蛋白質(zhì)的hupB基因的鑒定的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及編碼結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)組蛋白樣蛋白質(zhì)的hupB的基因的鑒定。涉及一種以hupB基因為基礎(chǔ)，區(qū)分結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌(M.bovis)的方法。
背景技術(shù)：
目前有許多方法用于區(qū)分MTB集合體的成員。幾名研究人員已經(jīng)證實結(jié)核病診斷時，使用IS6110作為靶進行PCR擴增，可獲得最佳的靈敏度和特異性。然而，使用從ATCC獲得的標(biāo)準(zhǔn)分枝桿菌屬種和菌株，以及從臨床樣品分離的分枝桿菌培養(yǎng)物時，該靶區(qū)分結(jié)核分枝桿菌與其它分枝桿菌的能力有限。
基于檢測位于MTB集合體菌株DR基因座上小重復(fù)單元間的非重復(fù)間隔序列的spoligotyping，其它遺傳標(biāo)志和生化測定已被用于區(qū)分結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌、非洲分枝桿菌、田鼠分枝桿菌和canetti分枝桿菌(Niemann等人，2000)。除spoligotyping外，已報導(dǎo)有mtp40基因序列(Liebana等人，1996)、pncA基因169位的點突變(Scropio &Zhang，1996)、oxyR基因座多態(tài)性(Sreevatsan等人，1996)，可作為區(qū)分TB集合體成員的有效靶。
理想情況下，基于PCR靶點的檢測，應(yīng)不僅能區(qū)分分枝桿菌屬種，還能區(qū)分MTB集合體中彼此非常相關(guān)的成員。
雖然PCR方法已普遍用于結(jié)核病診斷的評價，但已有報導(dǎo)主要集中于結(jié)核分枝桿菌的檢測。而在區(qū)分結(jié)核性集合體和非結(jié)核性分枝桿菌方面，其成績是有限的。
在此我們報導(dǎo)一種PCR測定方法，能夠準(zhǔn)確區(qū)分MTB集合體中非常相關(guān)的分枝桿菌。編碼結(jié)核分枝桿菌組蛋白樣蛋白質(zhì)的hupB基因作為靶點，被用于檢測和區(qū)分結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌。hupB基因靶點不僅能從牛分枝桿菌中，還能從測試的其它MTB集合體成員、非結(jié)核性分枝桿菌和非分枝桿菌種屬中，將結(jié)核分枝桿菌區(qū)分出來。對于畜牧業(yè)感染發(fā)生率較高的發(fā)展中國家，該測定方法尤為實用(Grange，2001)。已知通過空氣途徑或感染/污染的乳制品消費，牛分枝桿菌已從感染的牛蔓延到人(動物傳染結(jié)核病)(Moda等人，1996；Cosivi等人，1998)。雖然在發(fā)達國家已基本根除，但最近已有牛結(jié)核復(fù)發(fā)的報導(dǎo)(www.defra.gov.uk/animalh)，牛結(jié)核在發(fā)展中國家仍有發(fā)生。在發(fā)展中國家，關(guān)于牛結(jié)核對人體健康的流行病學(xué)影響，目前尚無評價，基本為空白(lacuna)。然而隨著AIDS患者由于牛分枝桿菌感染導(dǎo)致結(jié)核病的報導(dǎo)(Bouvet等人，1993；O’Reilly等人，1995)，以及全球性結(jié)核病發(fā)病率的升高，檢測以及鑒別臨床樣品中的致病性分枝桿菌，皆需快速而可靠的診斷測定方法。其對結(jié)核病的快速診斷、治療和控制是必須的。鑒定人致病性分枝桿菌，更加關(guān)系到新一代人用候選疫苗的開發(fā)需要。
HupB蛋白質(zhì)的免疫原性有兩種方法用于區(qū)分與人體應(yīng)答有關(guān)的分枝桿菌組分，即T細胞印跡和免疫消減(immuno-subtraction)測定法(Prabhakar等人，1998)。發(fā)現(xiàn)在結(jié)核菌素反應(yīng)中，分枝桿菌裂解物中的30kDa級分，誘導(dǎo)的淋巴增殖指數(shù)最高。同樣，在免疫消減測定法中，在大約30kDa可見明顯的反應(yīng)性條帶。從SDS-PAGE凝膠上電洗脫該30kDa蛋白質(zhì)，并純化至均一。
使用內(nèi)部肽序列，得到與粘粒CY349的16個氨基酸100％相同的序列，Seq ID.No.6(VKPTSVPAFRPGAQFK)。其后相應(yīng)的基因得到闡釋，并被命名為HupB因(Rv2986c，Cole等人，1998)。利用免疫金電子顯微技術(shù)，發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)位于分枝桿菌細胞膜的胞質(zhì)內(nèi)及胞漿表面。HupB基因被歸入結(jié)核分枝桿菌的結(jié)合蛋白類(組蛋白樣)DNA(Cole等人，1998)。設(shè)計引物擴增hupB因。在結(jié)核分枝桿菌中獲得645bp的擴增子。使用α32p標(biāo)記的PCR擴增子進行Southern雜交，確定MTB集合體(結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌)成員及其它分枝桿菌種中，hupB基因的大小、流行程度和構(gòu)成。
現(xiàn)有技術(shù)缺陷雖然PCR方法已經(jīng)普遍用于結(jié)核診斷的評價，但報導(dǎo)通常集中于結(jié)核分枝桿菌的檢測。然而在區(qū)分結(jié)核性集合體和非結(jié)核性分枝桿菌方面，其成功是有限的。單獨使用IS6110，或與mtp40基因聯(lián)合使用的一步PCR方法，來區(qū)分牛分枝桿菌與結(jié)核分枝桿菌，產(chǎn)生的結(jié)果很不一致。而且，已證明mpt40并非存在于所有的結(jié)核分枝桿菌菌株中，因此不能用于區(qū)分結(jié)核分枝桿菌與牛分枝桿菌菌株。有人提出將senX3-regX3基因間區(qū)域(IR)作為區(qū)分MTB集合體成員與其它分枝桿菌的靶序列。然而使用該靶區(qū)域，即使可以將BCG與相關(guān)菌株區(qū)分開來，也由于不能區(qū)分MTB集合體成員而受到限制。目前研究已表明，hupB基因靶點容許從測試的牛分枝桿菌以及其它TB集合體成員、非結(jié)核性分枝桿菌和非分枝桿菌種屬中，將結(jié)核分枝桿菌區(qū)分出來。對于畜牧業(yè)感染發(fā)病率的較高發(fā)展中國家，該測定方法尤為有用(Grange，2001)。
在發(fā)展中國家，關(guān)于牛結(jié)核病對人體健康的流行病學(xué)影響，目前尚無評價，基本為空白。然而隨著AIDS患者由于牛分枝桿菌感染導(dǎo)致結(jié)核病的報導(dǎo)(Bouvet等人，1993；O’Reilly等人，1995)，以及全球性結(jié)核病發(fā)病率的升高，檢測以及區(qū)分臨床樣品中的致病性分枝桿菌，皆需快速而可靠的診斷測定方法。其對結(jié)核病的快速診斷、治療和控制是必須的。在此，我們報導(dǎo)的PCR、RFLP和巢式PCR測定方法，能夠準(zhǔn)確區(qū)分MTB集合體中緊密相關(guān)的分枝桿菌。
發(fā)明目的本發(fā)明目的在于(1)表征編碼結(jié)核分枝桿菌組蛋白樣蛋白質(zhì)的hupB因。
(2)表征分枝桿菌基因作為新的靶點，用于新型抗分枝桿菌化學(xué)治療試劑。
(3)以PCR產(chǎn)生的hupB基因擴增子的RFLP為基礎(chǔ)，區(qū)分結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌。
(4)以hupB基因PCR擴增子的序列為基礎(chǔ)，區(qū)分結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌。
(5)以hupB基因的巢式PCR為基礎(chǔ)，區(qū)分結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌。
發(fā)明概述PCR，PCR-RFLP本發(fā)明涉及方法，使用編碼組蛋白樣蛋白質(zhì)的hupB基因靶點的特異性引物，來區(qū)分分枝桿菌屬種。單一引物對可以同時擴增來自結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌的靶序列。擴增產(chǎn)物的大小，可將結(jié)核分枝桿菌與牛分枝桿菌以及有關(guān)和無關(guān)種屬區(qū)分開來。與擴增區(qū)域雜交的DNA探針，可將結(jié)核分枝桿菌與牛分枝桿菌及有關(guān)和無關(guān)種屬區(qū)分開來。進一步提供方法(RFLP)，通過PCR擴增片段的限制性消化，區(qū)分結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌hupB基因。
巢式PCR測定利用hupB基因作為靶點的應(yīng)用，就開發(fā)區(qū)分結(jié)核分枝桿菌集合體成員的分子生物技術(shù)而言，是非常重要的。由于當(dāng)前技術(shù)在區(qū)分結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌方面的困難，有關(guān)由牛分枝桿菌致人或動物疾病發(fā)病率的具體資料是缺乏/有限的。這種技術(shù)有助于確定和證明牲畜中由牛分枝桿菌所引起疾病的真實程度。所述的巢式PCR測定法對目前用于區(qū)分結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌的繁瑣方法而言，將會是一個巨大的貢獻。在印度，由于宗教和社會經(jīng)濟原因，不可能普遍實現(xiàn)結(jié)核菌素反應(yīng)性動物的強制性清除。本測定方法對于流行病學(xué)規(guī)劃以及感染動物的鑒別將十分有益?？蓪⒏腥緞游锔綦x，從而限制疾病的傳播。而且，隨著乳制品(肉和奶)廣泛應(yīng)用，此處所述巢式PCR測定方法，將有助于解決當(dāng)前人分枝桿菌病原體的鑒別難題。這些病原體都是MTB集合體成員，并且遺傳相似。


圖1hupB基因的位置和用于產(chǎn)生PCR片段的引物。
圖AhupB序列中引物的位置，使用該引物獲得PCR片段已在文中描述。hupB基因特異性的引物對N(Seq ID No.1)和S(Seq ID No.2)；hupB基因C末端部分特異性的內(nèi)部引物M(Seq ID No.3)和S(Seq IDNo.2)。
圖B，C和D使用引物對N(Seq ID No.1)和S(Seq ID No.2)(圖B)、M(Seq ID No.3)和S(Seq ID No.2)(圖C)，以及F(SeqID No.4)和R(Seq ID No.1)(圖D)，產(chǎn)生的結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌的溴化乙啶染色的擴增片段經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳。645和618bp(圖B)、318和291bp(圖C)、116和89bp(圖D)片段已標(biāo)出。泳道1&4，645bp，6&10，318bp，和13，116bp的hupB基因/C末端部分基因擴增片段，從結(jié)核分枝桿菌H37Rv獲得；泳道2&5，618bp的hupB基因，7&9，291bp和11，12，15-17，89bp的hupB基因/C末端部分的基因擴增片段，從牛分枝桿菌AN5獲得；3，8&14，100bp的分子量標(biāo)準(zhǔn)。
圖2基于PCR測定法的hupBMt特異性分析擴增片段在瓊脂糖凝膠上電泳。其溴化乙啶染色(圖A&圖B)和雜交圖，分別如圖A′和圖B′所示。使用645bp探針(使用N(Seq ID No.1)和引物S(Seq ID No.2)和結(jié)核分枝桿菌DNA，通過PCR制備)。該645bp片段已標(biāo)出。圖A&A′泳道1，結(jié)核分枝桿菌H37Rv；2，結(jié)核分枝桿菌H37Ra；3，牛分枝桿菌BCG；4，田鼠分枝桿菌；5，蟾分枝桿菌；6，偶發(fā)分枝桿菌；7，草分枝桿菌；8，戈特氏分枝桿菌；9，牝牛分枝桿菌；10，堪薩斯氏分枝桿菌；11，100bp標(biāo)準(zhǔn)；12，胞內(nèi)分枝桿菌；13，鳥分枝桿菌；14，瘰疬分枝桿菌；15，恥垢分枝桿菌；16，結(jié)核分枝桿菌P8497；17，結(jié)核分枝桿菌C1084；18，結(jié)核分枝桿菌779634；19，龜分枝桿菌；20，結(jié)核分枝桿菌P8473；21，胃分枝桿菌。
圖B&B′泳道1，結(jié)核分枝桿菌1207；2，大腸桿菌；3，星狀諾卡氏菌；4，金黃色葡萄球菌；5，銅綠假單胞菌；6，S.faecalis；7，金黃色葡萄球菌；8，黑色曲霉；9，煙曲霉；10，白色假絲酵母；11，100bp標(biāo)準(zhǔn)；12，結(jié)核分枝桿菌Erdman；13，肺炎桿菌；14，M.leprae；15，非洲分枝桿菌；16，陰性對照。圖B&B′中，使用645bp片段(質(zhì)粒pHLPMT經(jīng)PstI和Ncol消化)進行雜交。
圖3基于hupB的PCR測定法檢測結(jié)核分枝桿菌DNA的敏感性。
用連續(xù)稀釋的結(jié)核分枝桿菌DNA(1ng-1fg)進行擴增反應(yīng)。溴化乙啶染色和雜交圖分別如圖A和B所示。645bp片段已標(biāo)出。泳道1，1ng；2，500pg；3，50pg；4，5pg；5，1Pg；6，500fg；7，100fg；8，50fg；9，10fg；10，5fg；11，2fg；12，1fg；13，陰性對照；14，陽性對照(結(jié)核分枝桿菌)；M，HindIII消化的λDNA。檢測極限對溴化乙啶染色是50pg，對雜交是500fg。
圖4645和318bp PCR片段的RFLP分析。
圖A描繪了hupB序列中引物位置的示意圖，使用該引物以獲得645bp和318bp的PCR片段。溴化乙啶染色顯示645bp(圖B)和318bp(圖C)的擴增片段。泳道1，結(jié)核分枝桿菌H37Rv；2，結(jié)核分枝桿菌H37Ra；3，結(jié)核分枝桿菌Erdman；4，牛分枝桿菌AN5；5，牛分枝桿菌BCG；(日本)6.牛分枝桿菌BCG(哥本哈根)；7，牛分枝桿菌IC 378；8，牛分枝桿菌IC 379；9，牛分枝桿菌IC 380；10，牛分枝桿菌IC 381；11，牛分枝桿菌IC 382；12，PCR分子量標(biāo)準(zhǔn)。圖D用HpaII(泳道1-3)和HaeIII(泳道6-9)消化645bp擴增子的RFLP聚丙烯酰胺凝膠分析泳道1，結(jié)核分枝桿菌H37Rv；2，結(jié)核分枝桿菌H37Ra；3，牛分枝桿菌BCG；4，陰性對照；M，100bp分子量標(biāo)準(zhǔn)；5，結(jié)核分枝桿菌H37Rv；6，結(jié)核分枝桿菌H37Ra；7，牛分枝桿菌BCG；8，牛分枝桿菌AN5。
圖5結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌hupB基因核苷酸序列的比對使用GCG軟件，對結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株、牛分枝桿菌臨床分離物的hupB基因C末端區(qū)域核苷酸序列(326-676bp)進行了比對。在所有牛分枝桿菌菌株hupB序列中，均可見27bp的缺失。相對于結(jié)核分枝桿菌，在385-411bp之間缺失的9個氨基酸(KAATKAPAR)，以單字母代碼顯示于第一行。序列編號參見hupB(Rv2986c)中的核苷酸位置。牛分枝桿菌菌株的編號在左側(cè)給出。
圖6結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株和牛源分離物的巢式PCR圖分枝桿菌菌株的巢式PCR擴增片段在8％天然聚丙烯酰胺凝膠上電泳。顯示于泳道1陰性對照；2分子量標(biāo)準(zhǔn)；3結(jié)核分枝桿菌(H37Rv)；3確定為結(jié)核分枝桿菌的牛分離物；4確定為牛分枝桿菌的牛分離物；牛分枝桿菌(ICC380)；以及5結(jié)核分枝桿菌(JALMA，Agra，分離物)。
發(fā)明詳述一種區(qū)分結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌的hupB基因的方法。使用3套引物測定hupB基因的大小差異性(圖1，表II)本發(fā)明的一個實施方案提供，特異性擴增分枝桿菌種屬hupB基因的寡核苷酸引物，其選自Seq ID No.1、Seq ID No.2、Seq ID No.3、SeqID No.4，Seq ID No.5。
另一個實施方案是，以編碼組蛋白樣蛋白質(zhì)例如hupB的靶基因為基礎(chǔ)，區(qū)分分枝桿菌屬種的方法。
另一個實施方案是，其中結(jié)核分枝桿菌和/或牛分枝桿菌種，選自遺傳相關(guān)的分枝桿菌屬和遺傳無關(guān)的微生物。
在另一個實施方案的方法中，寡核苷酸引物對包括，Seq ID No.1和Seq ID No.2；Seq ID No.3和Seq ID No.2；Seq ID No.4和Seq IDNo.5，其中擴增片段通過溴化乙啶染色或DNA探針雜交檢測。
另一個實施方案為一種區(qū)分方法，包括設(shè)計引物Seq ID No.1、Seq ID No.2、Seq ID No.3、Seq ID No.4、Seq ID No.5，從結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌中擴增所述hupB基因的一部分。在聚合酶酶鏈反應(yīng)中，使用所述DNA作為模板，以一對寡核苷酸引物，擴增編碼組蛋白樣蛋白質(zhì)例如分枝桿菌屬hupB的靶基因的一部分。分析并確認(rèn)擴增片段的大小。測定所述擴增片段的完整序列。從序列推定其是結(jié)核分枝桿菌還是牛分枝桿菌。
另一個實施方案為方法，其中DNA探針由Seq ID No.7或Seq ID No.8，或其互補序列，經(jīng)可檢測的標(biāo)記物標(biāo)記組成。
另一個實施方案為方法，其中區(qū)分步驟包括測定由牛分枝桿菌獲得的較小擴增片段。
另一個實施方案為方法，其中牛分枝桿菌中PCR擴增片段為618bp。
另一個實施方案為方法，其中結(jié)核分枝桿菌中PCR擴增片段為645bp。
另一個實施方案為方法，其中牛分枝桿菌中PCR擴增片段為291bp。
另一個實施方案為方法，其中結(jié)核分枝桿菌中PCR擴增片段為318bp。
另一個實施方案為方法，其中牛分枝桿菌中PCR擴增片段為89bp。
另一個實施方案為方法，其中結(jié)核分枝桿菌中PCR擴增片段為116bp。
另一個實施方案為方法，其中牛分枝桿菌中PCR擴增片段比結(jié)核分枝桿菌擴增片段小27bp。
另一個實施方案為方法，其中結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌的區(qū)分包括步驟在聚合酶鏈反應(yīng)中，使用引物Seq ID No.1和Seq ID No.2，擴增結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌hupB靶基因的部分序列。用HpaII限制性內(nèi)切酶限制性消化擴增片段，生成限制性酶切片段。通過在12％聚丙烯酰胺凝膠上電泳，分離限制性酶切片段，并經(jīng)溴化乙啶染色檢測該限制性酶切片段。
另一個實施方案為方法，其中結(jié)核桿菌中限制性酶切片段為280bp和150bp。
另一個實施方案為方法，其中牛分枝桿菌中限制性酶切片段為253bp和150bp。
另一個實施方案為基本如此處所述的HupB基因(Seq ID No.8)，前述實施方案中的方法已經(jīng)基本描述。
另一個實施方案為基本如此處所述的HupB基因(Seq ID No.7)，前述實施方案中的方法已經(jīng)基本描述。
本方法用于區(qū)分分枝桿菌屬種，在聚合酶酶鏈反應(yīng)中，使用所述DNA作為模板，以一對寡核苷酸引物，擴增編碼分枝桿菌屬種組蛋白樣蛋白質(zhì)hupB靶基因的一部分。檢測所述hupB基因擴增片段，以檢測是否存在分枝桿菌屬種，并以擴增片段的大小為基礎(chǔ)區(qū)分結(jié)核分枝桿菌與牛分枝桿菌。
特異性擴增分枝桿菌屬種hupB基因的寡核苷酸引物，選自Seq IDNo.1、Seq ID No.2、Seq ID No.3、Seq ID No.4，Seq ID No.5。一種以靶hupB基因為基礎(chǔ)，區(qū)分分枝桿菌屬種的方法。在聚合酶鏈反應(yīng)中使用來自培養(yǎng)物或臨床樣品的DNA作為模板。檢測所述hupB基因擴增片段，以確定是否存在分枝桿菌屬種，并以擴增片段的大小為基礎(chǔ)，區(qū)分結(jié)核分枝桿菌與牛分枝桿菌。
1)hupB基因靶DNA引物N，Seq ID No.1(5′ggagggttgggatgaacaaagcag 3′)和S，Seq ID No.2(5′gtatccgtgtgtcttgacctatttg3′)，用于擴增hupB基因序列。在結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌中，預(yù)期擴增子的大小分別為645bp和618bp。
PCR-RFLP用于區(qū)分結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌的方法。
包括步驟在聚合酶鏈反應(yīng)中，使用引物對Seq ID No.1和Seq IDNo.2/Seq ID No.3和Seq ID No.2，擴增結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌hupB靶基因。用HpaII限制性內(nèi)切酶限制性消化擴增的片段，生成限制性酶切片段。通過在12％聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離限制性酶切片段。
2)基因C末端部份的擴增使用I)內(nèi)部引物M，Seq ID No.3(5′gcagccaagaaggtagcgaa3′)，和S，Seq ID No.2(5′gtatccgtgtgtcttgacctatttg3′)，預(yù)期的擴增子為～318bp(圖1)。
在結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌中，預(yù)期擴增子的大小分別為318bp和291bp。
巢式PCR用于區(qū)分結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌的方法。
包括步驟在聚合酶鏈反應(yīng)中，從結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌中擴增hupB靶基因的一部分。使用Seq ID No.1-N和Seq ID No.2-S引物獲得的PCR片段，被用作巢式PCR的靶DNA。同時使用Seq ID No.4-F和Seq IDNo.5-R，擴增基因的C末端部分，預(yù)期的擴增子在結(jié)核分枝桿菌中為～116bp，在牛分枝桿菌中為89bp，(II)使用引物F，Seq ID No.4(5′ccaagaaggcgacaaagg3′)，和R，Seq ID No.5(5′gacagctttcttggcggg3′)。在結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌中，預(yù)期擴增子的大小分別為～116bp和89bp。
PCR擴增片段的測序通過確定擴增片段的完整序列，分析并確認(rèn)hupB基因擴增片段的大小。從序列推定其是結(jié)核分枝桿菌還是牛分枝桿菌。區(qū)分步驟包括由牛分枝桿菌獲得的較小擴增片段的確定。使用引物Seq ID No.1和2獲得的牛分枝桿菌PCR擴增片段為618bp。結(jié)核分枝桿菌PCR擴增片段為645bp。而使用引物Seq ID No.3和2獲得的PCR擴增片段，在牛分枝桿菌中為291bp，在結(jié)核分枝桿菌中為318bp。使用引物Seq ID No.4和5獲得的PCR擴增片段，在牛分枝桿菌和結(jié)核分枝桿菌中分別為89bp和116bp。牛分枝桿菌中的PCR擴增片段，比結(jié)核分枝桿菌擴增片段小27bp。
使用從結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌中提取的分枝桿菌DNA。從結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌中均獲得PCR擴增片段。不過由牛分枝桿菌獲得的擴增子略小于結(jié)核分枝桿菌擴增子。這一差異通過對從不同來源收集的50種結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌菌株進行分析得到確認(rèn)(表1)。從結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌(BCG)的3個標(biāo)準(zhǔn)菌株和4個臨床分離物中提取DNA，使用hupB引物(N，Seq ID No.1和S，Seq ID No.2/M Seq IDNo.3和S，Seq ID No.2，表II)進行擴增。通過RFLP確認(rèn)由結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌中獲得的擴增子的大小差異(圖4D)，并通過PCR片段的序列測定進行確證(圖5)。用HaeIII和HpaII消化兩種分枝桿菌的PCR片段，并在12％非變性凝膠上分析。用HpaII消化645bp片段顯示，與結(jié)核分枝桿菌中獲得的大小～280bp的條帶相比，在牛分枝桿菌中可見～250bp的片段(圖4D)。PCR片段序列分析顯示，在牛分枝桿菌中有相應(yīng)于9個氨基酸的27bp的缺失(圖5)。由于這一缺失，由牛分枝桿菌獲得的PCR擴增子為618bp，比由結(jié)核分枝桿菌獲得的PCR片段(645bp)小27bp(圖4B，C)。
用HpaII消化由M和S引物產(chǎn)生的基因C末端部分的擴增子的結(jié)果顯示與使用hupB引物(Seq ID No.1-N和Seq ID No.2-S)獲得的PCR片段差異相符，表明利用hupB引物(N，Seq ID No.1-N和S，Seq ID No.2-S)或者C末端引物(Seq ID No.3-M和S，Seq ID No.2-S)，獲得的PCR片段的PCR-RFLP測定，確實可區(qū)分桿菌結(jié)核和牛分枝桿菌。
以hupB基因作為靶點，診斷和區(qū)分牛結(jié)核中致病性分枝桿菌的應(yīng)用已得到證實(表IV-VII)。靶向hupB基因C末端部分，對臨床樣品采用巢式PCR方法，使測定方法的靈敏度和特異性顯著改善，(圖6)和(表VI-VIII)。
實施例菌株用于研究的分枝桿菌菌株和非分枝桿菌菌株列于表1中。除了10株非分枝桿菌屬種，總計80株分枝桿菌菌株被歸入研究中。80株分枝桿菌分離物中的55株為MTB集合體成員，(結(jié)核分枝桿菌-25，牛分枝桿菌-25，田鼠分枝桿菌-3，非洲分枝桿菌和canetti分枝桿菌各1)。包含的牛分枝桿菌的詳細資料如下7株來自Central MilitaryVeterinary Laboratory，Meerut，印度)感染的牛，9株來自NationalMycobacterial Repository，JALMA，Agra，印度，2株分別來自荷蘭和阿根廷，3株人分離株來自荷蘭(Drs.J.D.A.van Embden和D.vanSoolingen)。
用于特異性分析的桿菌的處理所有結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌菌株，均培養(yǎng)于固體培養(yǎng)基上(所有分枝桿菌屬均LJ斜面培養(yǎng))，用無菌牙簽從LB瓊脂(大腸桿菌)、營養(yǎng)肉汁瓊脂(黑色曲霉，星狀諾卡氏菌，銅綠假單胞菌，肺炎桿菌)或血瓊脂培養(yǎng)基(白喉棒桿菌，溶血性鏈球菌)上刮落，重懸于含0.1％Triton x-100的無菌蒸餾水中。將重懸的桿菌于100℃煮沸20分鐘，取一小份(2μl)用于PCR。
PCR分析1)23S rDNA靶物引物C，Seq ID No.9(5′gtgagcgaegggatttgcctat3′)和L，Seq ID No.10(5′accacccaaaaccggatcgat3′)，用于檢測屬分枝桿菌屬的生物體DNA的存在。預(yù)期的擴增子大小為174bp(Verma等人，1994；Dasgupta等人，1998)。
2)hupB DNA靶物引物N，Seq ID No.1(5′ggagggttgggatgaacaaagcag3′)和S，Seq ID No.2(5′gtatccgtgtgtcttgacctatttg3′)，用于擴增hupB基因序列。在結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌中，預(yù)期擴增子的大小分別為～645bp和618bp(表II，圖1)。
每一反應(yīng)(20μl)包含1.5mM MgCl2，0.5μM引物，200μM dNTPs，10mM Tris-HCl(25℃時pH8.8)，50mM KCl，0.08％Nonidet P40，和0.5單位的Taq DNA聚合酶。PCR反應(yīng)在94℃起始變性10分鐘，進行35個循環(huán)，每個循環(huán)為94℃，1分鐘，63℃1分鐘和72℃1分鐘，隨后于72℃最終延伸30分鐘。片段在1.2％瓊脂糖凝膠上分析，并用溴化乙啶染色。
使用M，Seq ID No.3(5′gcagccaagaaggtagcgaa3′)和S，Seq IDNo.2(5′gtatccgtgtgtcttgacctatttg3′)，擴增基因C末端部分，預(yù)期的擴增子為～318bp。
巢式PCR(Nested PCR)從臨床樣品/培養(yǎng)的分枝桿菌中提取DNA，進行PCR，使用引物Seq ID No.1-N和Seq ID No.2-S。通過Seq ID No.1-N和Seq ID No.2-S引物得到的PCR產(chǎn)物，被用作巢式PCR的靶DNA。
每一反應(yīng)(40μl)包含2.5mM MgCl2，0.5μM引物，200μM dNTPs，10mM Tris-HCl(25℃時pH8.8)，50mM KCl，0.08％Nonidet P40，和0.5單位的Taq DNA聚合酶。PCR反應(yīng)在95℃起始變性10分鐘，進行35個循環(huán)，每個循環(huán)為94℃1分鐘，59℃30秒，最終于72℃延伸7分鐘。片段在3.5％瓊脂糖凝膠/8％非還原聚丙烯酰胺凝膠上分析，并用溴化乙啶染色。同時使用Seq ID No.4-F(5′ccaagaaggcgacaaagg3′)與Seq IDNo.5-R(5′gacagctttcttggcggg3′)擴增基因C末端部分，預(yù)期的擴增子在結(jié)核分枝桿菌中為～116bp，在牛分枝桿菌中為～89bp(表II，圖1)。
Southern雜交將瓊脂糖凝膠分離的PCR擴增子轉(zhuǎn)移到硝基纖維素膜上(Southern，1975)。然后印跡與α-32p標(biāo)記的645bphupB基因(SeqID No.6)探針雜交，探針來自結(jié)核分枝桿菌(Pst1和Nco1消化的質(zhì)粒pHLPMT/或使用N Seq ID No.1-N和S(Seq ID No.2-S)引物和結(jié)核分枝桿菌DNA進行PCR產(chǎn)生的探針)。
限制性片段長度多態(tài)性用HpaII限制性內(nèi)切酶消化hupB擴增序列，片段在12％非變性聚丙烯酰胺凝膠上分析。凝膠用溴化乙啶染色，在紫外光下觀測DNA片段。
DNA序列分析PCR片段用Sanger的雙脫氧鏈終止法(Sanger等，1977)測序，根據(jù)操作指南使用Sequenase Ver 2.0測序試劑盒，α35SdATP和正/反向通用M13引物或hupB內(nèi)部引物進行。DNA模板經(jīng)堿變性，于-70℃與引物退火1小時。標(biāo)記前，將富含GC的分枝桿菌DNA與0.5μg單鏈結(jié)合蛋白混合。蛋白質(zhì)以0.1μg蛋白酶K，于68℃消化20分鐘，隨后終止標(biāo)記反應(yīng)。反應(yīng)物在6％尿素-聚丙烯酰胺凝膠上，1xTBE緩沖液中，以70W電泳適當(dāng)時間。凝膠用乙酸(10％)和甲醇(30％)固定，干燥，并進行放射自顯影。同時由瑞士Microsynth公司對從標(biāo)準(zhǔn)菌株和分離物獲得的PCR片段進行測序。
PCR測定特異性來自16株分枝桿菌DNA和10株非分枝桿菌屬的DNA，被用作靶物質(zhì)以建立PCR測定特異性(表1)。從結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌(BCG)的3株標(biāo)準(zhǔn)菌株和4株臨床分離物中提取DNA，使用hupB引物(Seq ID No.1-N和Seq ID No.2-S，表11，圖1)用于擴增。只在結(jié)核桿菌H37Rv、H37Ra、牛分枝桿菌BCG和5株結(jié)核分枝桿菌臨床分離物中(如圖2A中1，2，3，16，17，18和20泳道，以及圖2B中的泳道1和12)，從結(jié)核分枝桿菌中獲得的預(yù)期片段為645bp，在牛分枝桿菌中獲得的預(yù)期片段為618bp。在MTB集合體的田鼠分枝桿菌、非洲分枝桿菌、M.leprae，MAIS集合體及其它分枝桿菌屬種(快速和慢速生長物)，包括白喉棒桿菌和星狀諾卡氏菌(其共同構(gòu)成棒狀桿菌)諾卡氏菌屬和分枝桿菌(CNM)組中，均未見擴增。在其它非分枝桿菌種中也未見擴增(圖2B)。擴增片段的真實性，通過與α-32P標(biāo)記的645bp片段(Seq IDNo.6)雜交確認(rèn)(圖2A′和B′)。這證實使用任何其它模板DNA，沒有得到可能由于單獨使用溴化乙啶染色而遺漏的其它擴增。因此，hupB的5′和3′引物是結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌特異性引物。
基于hupB基因的PCR測定的敏感性DNA PCR擴增的敏感性(檢測水平)，通過向PCR反應(yīng)中加入連續(xù)稀釋的分枝桿菌DNA(1ng至1fg)來確定，使用引物Seq ID No.1-N和Seq ID No.2-S?？梢妴为氫寤亦と旧臋z測極限為50pg，雜交檢測極限增至500fg(圖3A和B)。這分別相當(dāng)于5000和50個基因組等價物(equivalents)。
來源于結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌的hupB基因PCR擴增子的RFLP來自結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌不同分離物中的DNA(列于表1)，使用Seq ID No.1-N和Seq ID No.2-S引物(645bp片段，表II)和(ii)SeqID No.3-M(內(nèi)部引物)和Seq ID No.2-S(318bp片段，圖4C，表II，圖1)進行擴增。由牛分枝桿菌DNA獲得的PCR擴增子(泳道4-11，圖4B和4C)的大小，比由結(jié)核分枝桿菌菌株獲得的PCR擴增子(泳道1-3，圖4B和4C)小。使用2套引物得到的PCR測定結(jié)果概括于表III。
為確認(rèn)645和618bp PCR片段的大小差異，用HpaII和HaeIII消化擴增子(圖4D)。在12％非變性聚丙烯酰胺凝膠上分析消化片段。用HpaII消化645bp片段清楚地顯示，由牛分枝桿菌獲得的～250bp片段(圖4D，泳道3)，比由結(jié)核分枝桿菌H37Ra和H37Rv獲得的～280bp條帶小(圖4D，泳道1和2)。用HaeIII消化則看不出差異(圖4D，泳道5-8)。使用Seq ID No.3-M和Seq ID No.2-S引物產(chǎn)生的基因C末端部分的擴增子(318bp)，經(jīng)HpaII消化得到的結(jié)果，呈現(xiàn)相似的差異性(結(jié)果未顯示)，表明PCR-RFLP測定方法，確實能區(qū)分結(jié)核分枝桿菌與牛分枝桿菌菌株。
PCR擴增片段的序列測定對由牛分枝桿菌和結(jié)核分枝桿菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株，包括牛源的牛分枝桿菌的本地分離物的DNA獲得的PCR擴增子進行了序列測定。對618和645bp PCR擴增子(使用Seq ID No.1-N和2-S獲得)，318和291bp(使用Seq ID No.3-M和2-S獲得)，116和89bp(使用Seq ID No.4-F和5-R獲得)進行序列測定，以確認(rèn)大小差異。序列分析表明，牛分枝桿菌在基因C末端部分，第128位密碼子之后框架中有27bp的缺失(9氨基酸)(圖5)。該牛分枝桿菌(登錄號Y18421)和結(jié)核分枝桿菌(登錄號P95109)的組蛋白樣基因序列，已提交NCBI數(shù)據(jù)庫。
PCR，RFLP和巢式PCR測定的優(yōu)點1)不同于現(xiàn)有測定方法，本測定方法提供直接用于臨床樣品、乳制品和肉制品中人致病性分枝桿菌的檢測和區(qū)分方法。本測定方法能夠鑒別屬于結(jié)核分枝桿菌復(fù)合體的人致病性分枝桿菌。
2)與現(xiàn)有方法相比，此處所述方法具有獨特的優(yōu)點——作為一種方法，既能同時檢測，又能準(zhǔn)確區(qū)分兩個密切相關(guān)的分枝桿菌，即結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌。
3)此處描述的PCR，RFLP和巢式PCR方法，利用以HupB基因作為靶物的獨特的新穎性。設(shè)計的新型引物對(Seq ID No.1&2；3&2；4&5)，便于在兩種已知的致病性分枝桿菌，即結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌中，特異性擴增hupB基因。
4)擴增片段的大小和序列差異性，賦予它們可靠的辨別性，這在迄今報導(dǎo)的所有其它方法中還是不可能的。
5)更重要的是，所述方法能夠檢測和診斷出臨床樣品中，除結(jié)核分枝桿菌外的其它致病性分枝桿菌，如牛分枝桿菌引起的雙重感染。
表I


a-P.S.Murthy，UCMS，University of Delhi，India；b-N.K.Jain，NDTC，Naw Delhi，India；c-C.N.Paramaslven，TRC，Charnai，India；d-V.M.Katooh，JALMA.Agre，India；e-Y.M.Yates，Public Health Laboratory，DulwichHospitel，London，UK；t-P.Draper，NMR，Mill Hill，London，UK；g-Kathieen Eisenach，University of Arkeriesa，USA；h-Dept.of Micnobiology，AIMS，New Delhi，Indier i-Microbioiogcat Type Cuiture Coliection，IMTECH，Chandigarh，India；j-Shivkumar，Anna Universlty，Chennat，India；k-Z.U.Khan，V.P.Chast Institute，Deihl，India；I-Jack Crawtort，CDC，Atlanta，GA，USA；m-GIBCO BRL，USA；n-Suman Laal，VA Medical Center，NY U，School ofMediclne，New York，USA；o-J.D.A，van Embden，Netheriands；p-Centrai Milttary Veterinary Laboratory，Meerut，India；q-Dept.of Paediatrics，AIIMS，New Deihi，India；(″)Human vacclne strain；Numbers in bold-human Isolates.
表II用于擴增hupB分桿菌DNA靶的引物

序列名稱Seq ID No.6生物名稱hup B結(jié)核分枝桿菌，Rv2986c，登錄號P95109atgaacaaag cagagctcat tgacgtgctc acacagaaat tgggctcgga ccgtcggcag60gcgaccgccg ccgtcgagaa tgtcgttgac acgattgtgc gtgcggtaca caaaggcgac 120agcgtcacca ttaccgggtt cggtgtgttc gaacagcgtc gccgcgcggc tcgagtggcc 180cgcaatccgc gtaccggcga gacagtaaag gtgaagccga cgtcggtgcc ggcgttccgc 240ccgggcgcgc aattcaaagc ggttgtgtct ggcgcgcagc gtctcccggc agaaggaccc 300gctgttaagc gtggtgtggg ggccagtgca gccaagaagg tagcgaagaa ggcacctgcc 360aagaaggcga caaaggccgc caagaaggcg gcgaccaagg cgcccgccag gaaggcggcg 420accaaggcgc ccgccaagaa agcggcgacc aaggcgcccg ccaagaaagc tgtcaaggcc 480acgaagtcac ccgccaagaa ggtgaccaag gcggtgaaga agaccgcggt caaggcatcg 540gtgcgtaagg cggGgaccaa ggcgccggca aagaaggcag cggccaagcg gccggctacc 600aaggctcccg ccaagaaggc aaccgctcgg cggggtcgca aatag 645
序列名稱Seq ID No.7生物名稱HIP牛分枝桿菌，登錄號Y18421atgaacaaag cagagctcat gacgtgctc acacagaaat tgggctcgga ccgtcggcag60gcgaccgccg ccgtcgagaa tgtcgttgac acgattgtgc gtgcggtaca caaaggcga 120agcgtcacca ttaccgggtt cggtgtgttc gaacagcgtc gccgcgcggc tcgagtggcc 180cgcaatccgc gtaccggcga gacagtaaag gtgaagccga cgtcggtgcc ggcgttccgc 240ccgggcgcgc aattcaaagc ggttgtgtct ggcgcgcagc gtctcccggc agaaggaccc 300gctgttaagc gtggtgtggg ggccagtgca gccaagaagg tagcgaagaa ggcacctgcc 360aagaaggcga caaaggccgc caagaaggcg gcgaccaagg cgcccgccaa gaaagcggcg 420accaaggcgc ccgccaagaa agctgtcaag gccacgaagt cacccgccaa gaaggtgacc 480Daaggcggtga agaagaccgc ggtcaaggca tcggtgcgta aggcggcgac caaggcgccg 540gcaaagaagg cagcggccaa gcggccggct accaaggctc ccgccaagaa ggcaaccgct 600cggcggggtc gcaaatag618表III A結(jié)核分枝桿菌hupB PCR測定的典型結(jié)果

a-Dr.Kathleen Eisenach.Universitv of Arkansas.USAb-Dr.C.N.Paramasivan，Tuberculosis Research Centre，Chennai，India
表IIIB牛分枝桿菌hupB PCR測定的典型結(jié)果

c-Dr.V.M.Katoch.JALMA.Agra.India；d-Dr.J.D.A.vanEmbden，Netherlandse-Pediatrics Dept.of AIIMS，New Delhi.
表IV采用牛樣品進行直接PCR測定的結(jié)果

發(fā)現(xiàn)如下牛的樣品適于PCR測定檢測牛分枝桿菌淋巴腺活檢組織標(biāo)本并發(fā)現(xiàn)牛奶最佳(Chi方檢驗，p值＜0.05，處于顯著水平，(SAS8.0統(tǒng)計軟件).
表V臨床 & AFB情況下牛直接PCR結(jié)果的比較分析

A-結(jié)核菌素陽性，有結(jié)核病臨床表現(xiàn)B-結(jié)核菌素陽性，外觀健康動物C-結(jié)核菌素陰性，有結(jié)核病臨床表現(xiàn)D-結(jié)核菌素陰性，外觀健康動物E-感染非-分枝桿菌的動物在研究的動物臨床類別中，與其它類別相比，從感染非-分枝桿菌微生物的動物檢測到的牛結(jié)核最少(類別E)(p＜0.05，(Chi方檢驗，p值＜0.05，處于顯著水平，(SAS 8.0統(tǒng)計軟件)。
表VI基于巢式PCR鑒別牛來源樣品中的病原性分枝桿菌

a-每一類別測試64個樣品b.hupB基因C末端區(qū)域巢式PCRc-含檸檬酸鹽的血液表VII臨床 & AFB情況下牛巢式PCR結(jié)果的比較分析

A-結(jié)核菌素陽性，有結(jié)核病臨床表現(xiàn)B-結(jié)核菌素陽性，外觀健康動物C-結(jié)核菌素陰性，有結(jié)核病臨床表現(xiàn)D-結(jié)核菌素陰性，外觀健康動物E-感染非-分枝桿菌的動物表VIII牛來源分枝桿菌分離物細菌學(xué)比較和基于PCR-RFLP/巢式PCR的鑒別

權(quán)利要求
1.特異性擴增分枝桿菌屬種hupB基因的寡核苷酸引物，選自SeqID No.1、Seq ID No.2、Seq ID No.3、Seq ID No.4、Seq ID No.5。
2.基于編碼組蛋白樣蛋白質(zhì)例如hupB的靶基因區(qū)分分枝桿菌屬種的方法，包括a)從培養(yǎng)物或臨床樣品獲得DNA，b)在聚合酶鏈反應(yīng)中，使用所述DNA作為模板，使用根據(jù)權(quán)利要求1所述的一對寡核苷酸引物，擴增編碼組蛋白樣蛋白質(zhì)例如分枝桿菌屬種hupB的靶基因的一部分，c)檢測所述hupB基因的擴增片段，以檢測是否存在分枝桿菌屬種，并基于擴增的片段的大小，區(qū)分結(jié)核分枝桿菌與牛分枝桿菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求2a所述的方法，其中所述結(jié)核分枝桿菌和/或牛分枝桿菌屬種，選自遺傳相關(guān)的分枝桿菌和無關(guān)的微生物。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中寡核苷酸引物對包括Seq IDNo.1和Seq ID No.2。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中寡核苷酸引物對包括Seq IDNo.3和Seq ID No.2。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中寡核苷酸引物對包括Seq IDNo.4和Seq ID No.5。
7.權(quán)利要求2c所述方法，其中擴增的片段通過溴化乙啶染色或DNA探針雜交檢測。
8.權(quán)利要求2所要求的方法，其中區(qū)分步驟包括以下步驟a)設(shè)計一套根據(jù)權(quán)利要求1所述的引物，Seq ID No.1、Seq ID No.2、Seq ID No.3、Seq ID No.4、Seq ID No.5，用于擴增所述的來自結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌的hupB基因的一部分，b)從培養(yǎng)物或臨床樣品中獲得DNA，c)在聚合酶鏈反應(yīng)中，使用所述DNA作為模板，利用根據(jù)權(quán)利要求1所述的一對寡核苷酸引物，擴增編碼組蛋白樣蛋白質(zhì)例如分枝桿菌屬種hupB的靶基因的一部分，d)分析并確認(rèn)擴增片段的大小，e)確定所述擴增的片段的完整序列，f)從序列推定其是結(jié)核分枝桿菌還是牛分枝桿菌。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中DNA探針由Seq ID No.7或SeqID No.8，或其互補序列，經(jīng)可檢測的標(biāo)記物標(biāo)記組成。
10.權(quán)利要求2所述的方法，其中區(qū)分步驟包括從牛分枝桿菌中獲得的較小擴增片段的測定。
11.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中在牛分枝桿菌中PCR擴增片段為618bp。
12.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中在結(jié)核分枝桿菌中PCR擴增片段為645bp。
13.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中在牛分枝桿菌中PCR擴增片段為291bp。
14.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中在結(jié)核分枝桿菌中PCR擴增片段為318bp。
15.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中在牛分枝桿菌中PCR擴增片段為89bp。
16.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中在結(jié)核分枝桿菌中PCR擴增片段為116bp。
17.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中牛分枝桿菌中PCR擴增片段比結(jié)核分枝桿菌擴增片段小27bp。
18.權(quán)利要求2所述的方法，其中區(qū)分結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌包括步驟a)在聚合酶鏈反應(yīng)中，使用引物Seq ID No.1和Seq ID No.2，擴增來自結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌的hupB靶基因的一部分，b)用HpaII限制性內(nèi)切酶限制性消化擴增的片段，生成限制性酶切片段，c)通過12％聚丙烯酰胺凝膠電泳分離限制性酶切片段，d)通過溴化乙啶染色檢測限制性酶切片段。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中在結(jié)核分枝桿菌中，限制性酶切片段為280bp和150bp。
20.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中在牛分枝桿菌中，限制性酶切片段為253bp和150bp。
21.如權(quán)利要求1所述的HupB基因(Seq ID No.8)，基本如此處所述。
22.如前述權(quán)利要求的方法，基本如此處所述。
23.如權(quán)利要求1所述的HupB基因(Seq ID No.7)，基本如此處所述。
24.前述權(quán)利要求的方法，基本如此處所述。
全文摘要
用于特異性擴增分枝桿菌屬種hupB基因的寡核苷酸引物，選自SeqID NO.1、Seq ID NO.2、Seq ID NO.3、Seq ID NO.4、Seq ID NO.5，以及一種方法，以編碼組蛋白樣蛋白質(zhì)例如hupB的靶基因為基礎(chǔ)，區(qū)分分枝桿菌種屬，包括a)從培養(yǎng)物或臨床樣品中獲得DNA；b)在聚合酶鏈反應(yīng)中，使用所述DNA作為模板，以根據(jù)權(quán)利要求1的一對寡核苷酸引物，擴增編碼組蛋白樣蛋白質(zhì)，例如分枝桿菌屬種hupB靶基因的部分區(qū)域；c)檢測所述hupB基因的擴增片段，以檢測是否存在分枝桿菌屬種，并以擴增片段的大小為基礎(chǔ)，區(qū)分結(jié)核分枝桿菌與牛分枝桿菌。
文檔編號C12Q1/68GK1742099SQ03825875
公開日2006年3月1日 申請日期2003年9月9日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月18日
發(fā)明者K·P·哈努曼莎帕, S·普拉哈卡爾, A·米施拉, T·J·西瓦斯瓦米 申請人:生物技術(shù)部, 全印度醫(yī)學(xué)科學(xué)院