專利名稱：將植物甾醇發(fā)酵制備雄二烯二酮的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般地涉及發(fā)酵方法，特別是從植物甾醇組合物到雄烯二酮和/或雄二烯二酮的生物轉(zhuǎn)化。
背景技術(shù)：
現(xiàn)在甾類藥物的制備存在兩條主要的途徑，其一是薯蕷皂甙元途徑，其二是微生物轉(zhuǎn)化途徑。薯蕷皂甙元是分離自菊科植物(薯蕷屬種)的螺酮縮醇類甾體甙元。在二十世紀(jì)四十年代的末期和五十年代的初期，主要利用化學(xué)反應(yīng)發(fā)展該途徑用于制備甾類化合物的薯蕷皂甙元途徑
盡管該途徑對(duì)于甾類的商業(yè)化制備仍然重要，在二十世紀(jì)七十年代還是考慮了替代的方法。特別是由墨西哥政府提供的薯蕷皂甙元的價(jià)格顯著增長(zhǎng)，而其原因部分歸咎于干植物量中薯蕷皂甙元含量的減少和勞動(dòng)力成本的增加等等。因此，替代的方法對(duì)于將來(lái)AD的制備是必需的。
根據(jù)二十世紀(jì)六十年代和七十年代制藥工業(yè)的廣泛研究可知，很多微生物(如節(jié)桿菌屬，短桿菌屬，微桿菌屬，精朊桿菌屬，芽孢桿菌屬，諾卡氏菌屬，鏈霉菌屬和特別是分枝桿菌屬的那些)具有將3β-羥基-Δ5-甾醇(如膽甾醇，β-谷甾醇或α-谷甾醇)或甾醇的混合物(如下所述)自然降解為二氧化碳和水的固有能力，在降解中作為中間產(chǎn)物形成4-雄烯-3，17-二酮(雄烯二酮)和1，4-雄二烯-3，17-二酮(雄二烯二酮)。
作為底物用于微生物生物轉(zhuǎn)化的植物甾醇化合物。
β-谷甾醇菜油甾醇 豆甾烷醇菜油甾烷醇 菜子甾醇 α-谷甾醇植物甾醇現(xiàn)有的商業(yè)來(lái)源之一是植物來(lái)源的油類。從這些可用的甾醇到AD和ADD的微生物轉(zhuǎn)化為甾類藥物工業(yè)提供了非常重要的途徑。
ADD在各種合成甾類的生產(chǎn)中是一種基本的原料，所述合成甾類包括抗炎藥，口服避孕藥，合成腎上腺素甾類藥，促蛋白合成類藥(生長(zhǎng)刺激)和其它合成的甾類。
一般而言，已知的發(fā)酵方法包括在適當(dāng)?shù)臓I(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中增殖分枝桿菌屬突變體，將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入含植物甾醇的生物反應(yīng)器中，隨后經(jīng)過(guò)大約120小時(shí)生物轉(zhuǎn)化為AD和/或ADD。收獲發(fā)酵肉湯，用有機(jī)溶劑對(duì)后者進(jìn)行提取，隨后在有機(jī)溶劑中結(jié)晶，通常得到白色的結(jié)晶粉末狀產(chǎn)物AD和/或ADD。涉及討論已知方法和概述早先研究的參考如下S.Kraychy，和R.D.Muir，美國(guó)專利3,684,657(1972).
W.J.Marsheck，S.Kraychy和R.D.Muir，Appl.Microbiol.，23，72(1972).
A.H.Conner，M.Nagaoka，J.W.Rowe和D.Perlman，Appl.和Environ.Microbiol.，32，310(1976)。
K.Kieslich，J.Basic Microbiol.，25，461(1985)。
已知植物甾醇生物轉(zhuǎn)化方法中所存在的問(wèn)題之一(該問(wèn)題困擾了整個(gè)甾類工業(yè))涉及在含水營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中底物(在這里是植物甾醇組合物)的不充分溶解度。不充分的溶解度是指在營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中底物僅以相對(duì)低的濃度存在，從而導(dǎo)致與微生物的接觸不充分并通常會(huì)導(dǎo)致最終產(chǎn)物的低收率。典型地需要長(zhǎng)時(shí)間的發(fā)酵以達(dá)到任何令人滿意的生物轉(zhuǎn)化度。為提供一種得到AD和ADD并致力于解決底物溶解度問(wèn)題的其它途徑，本申請(qǐng)人證明了來(lái)自林業(yè)可以以多公噸量獲得的″皂″的植物甾醇(-谷甾醇，菜油甾醇和豆甾烷醇)，能溶解和被分枝桿菌屬突變體定量地生物轉(zhuǎn)化為ADD(PCT/CA99/00267)。
已知植物甾醇生物轉(zhuǎn)化方法的另外一個(gè)問(wèn)題是植物甾醇(或植物甾醇組合物)生物轉(zhuǎn)化的最終產(chǎn)物典型地含有顯著的AD和ADD。由于AD和ADD具有相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)，將這兩種甾類產(chǎn)物進(jìn)行隨后的相互分離是困難和昂貴的。
因此，為了制備ADD，起始的發(fā)酵產(chǎn)物(AD)必須被提取，純化，隨后再進(jìn)行第二次生物轉(zhuǎn)化以制備ADD。自然地，該方法由于涉及AD發(fā)酵的中斷，第二生物轉(zhuǎn)化之前AD的移取和純化，因而是昂貴并且費(fèi)時(shí)的。
本發(fā)明的一個(gè)目的就是避免或減輕上述缺陷。
發(fā)明概述本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種將植物甾醇組合物發(fā)酵以制備雄烯二酮(雄-4-烯-3，17-二酮或″AD″)和隨后的雄二烯二酮(androstadienedione)(雄-1，4-二烯，3，17-二酮或″ADD″)的方法，該方法包括在第一營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中增殖分枝桿菌屬(Mycobacterium)的微生物培養(yǎng)物；將微生物培養(yǎng)物和植物甾醇組合物在生物反應(yīng)器中放置足夠的時(shí)間以將組合物基本上轉(zhuǎn)化為雄烯二酮(″AD溶液″)；在第二營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中增殖鐮孢屬(Fusarium)的真菌培養(yǎng)物；隨后將1)鐮孢屬物種；或2)含有鐮孢屬物種的真菌培養(yǎng)物培養(yǎng)基中的一種或多種注入生物反應(yīng)器中足夠的時(shí)間以將AD溶液轉(zhuǎn)化為雄二烯二酮。
本發(fā)明進(jìn)一步包括用雄烯二酮制備雄二烯二酮的方法，該方法包括在1)鐮孢屬物種；或2)鐮孢屬物種真菌培養(yǎng)物培養(yǎng)基存在的情況下，在生物反應(yīng)器中將AD發(fā)酵足夠的時(shí)間，從而將AD轉(zhuǎn)化為ADD。
本發(fā)明進(jìn)一步包括通過(guò)上述提及的方法制備的ADD組合物。
本發(fā)明所述方法的重要和顯著的優(yōu)點(diǎn)是，使用鐮孢屬物種的AD到ADD的生物轉(zhuǎn)化與先前的細(xì)菌轉(zhuǎn)化在相同的生物反應(yīng)器中發(fā)生，即與從植物甾醇組合物制備AD所用的為同一個(gè)生物反應(yīng)器。換言之，起始發(fā)酵步驟中所制得的AD不需要從生物反應(yīng)器中移出(作為本領(lǐng)域中已知和常規(guī)的手段)，反而，為了將AD溶液轉(zhuǎn)化為ADD，將1)真菌培養(yǎng)物，或2)真菌培養(yǎng)物培養(yǎng)基接種入生物反應(yīng)器中(詳細(xì)描述如下)。令人驚訝的是，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)盡管有殘留細(xì)菌培養(yǎng)物的存在，鐮孢屬物種和特別是如下文所述的優(yōu)選的菌株仍然保持將AD轉(zhuǎn)化為ADD的能力。因此，本發(fā)明的方法不涉及起始AD發(fā)酵的中斷，或第二生物轉(zhuǎn)化之前AD的移出和純化。顯著地節(jié)約了時(shí)間，能量和材料。
本發(fā)明還提供了一種鐮孢屬的新微生物，下文中以PTA-3947或FMI 33表示，其在2001年12月21日以茄病鐮孢(Fusarium solani)FMI33保藏在ATCC。


本發(fā)明通過(guò)以下非限制性附圖進(jìn)行解釋附圖1圖示了根據(jù)本發(fā)明從植物甾醇到ADD的微生物轉(zhuǎn)化；和附圖2是一個(gè)流程圖，顯示了根據(jù)本發(fā)明使用茄病鐮孢從AD到ADD的生物轉(zhuǎn)化的優(yōu)選程序。
發(fā)明詳述以下的詳細(xì)說(shuō)明幫助本領(lǐng)域技術(shù)人員實(shí)施本發(fā)明。然而，此詳細(xì)說(shuō)明并不解釋為對(duì)本發(fā)明范圍的過(guò)度限制。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以對(duì)在此討論的實(shí)施例進(jìn)行修飾和變化而不背離本發(fā)明范圍的精神。
在本發(fā)明的第一步，在營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中增殖分枝桿菌屬的微生物培養(yǎng)物。本領(lǐng)域中有許多已知和可用的適宜培養(yǎng)基和條件，本發(fā)明并不限制于其中的任何一個(gè)。但是，在優(yōu)選方式中，分枝桿菌種在含有精制廠的糖蜜(refiner’s molasses)，硝酸鈉，磷酸銨和葡萄糖的種子培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。在Kutney等的美國(guó)專利6,071,714一文中描述了適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基，在此被引入作為參考。
一般地，用于分枝桿菌屬種和鐮孢屬物種培養(yǎng)的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中應(yīng)該含有可同化的氮和碳，并在其中維持足夠補(bǔ)給量的無(wú)菌空氣，例如通過(guò)將培養(yǎng)基的大表面暴露于空氣中或使充足量的空氣通過(guò)培養(yǎng)基以支持深層生長(zhǎng)。
適宜氮源是通常用于此目的的那些，包括大豆粉，棉籽粉，酪蛋白的胰酶消化物，魚粉，玉米漿，肉膏，蛋白質(zhì)，帶有奶固形物的自溶啤酒酵母，蛋白胨，酵母膏，水解酪蛋白，硝酸鹽和/或銨類化合物。其中的大部分也能被用作碳源。其它含有碳的物質(zhì)包括碳水化合物如甘油，葡萄糖，果糖，蔗糖，乳糖，麥芽糖，肌醇，糊精，糖蜜，淀粉和乳清?？梢杂欣氖褂眠@些碳源和氮源的結(jié)合。
如果需要，可以加入磷酸鹽，鎂和/或亞鐵離子作為促生長(zhǎng)因子；還可加入緩沖液以確保生長(zhǎng)在基本中性的pH開始。消泡劑可能是有益的。當(dāng)用于誘導(dǎo)發(fā)酵的是分離的細(xì)胞或酶而不是完整和生長(zhǎng)的微生物時(shí)，不需要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的存在；但是無(wú)論是何種情形，培養(yǎng)基通常主要為含水的。
在本發(fā)明的第二步，將溶解于適宜溶劑中的或乳化形式的底物(植物甾醇組合物)和微生物培養(yǎng)物一起加入生物反應(yīng)器中。進(jìn)行發(fā)酵直到達(dá)到最大底物轉(zhuǎn)化(植物甾醇轉(zhuǎn)化為AD溶液)。
只要能促進(jìn)植物甾醇底物在溶劑中混合，從而最優(yōu)化微生物培養(yǎng)物對(duì)底物的利用率，可以使用任何乳化劑。例子包括但并不局限于聚二醇的脂肪酸酯或乙烯氧基加成化合物和商業(yè)可得的名為TeginTM，TweenTM和SpanTM的那些。
或者，可以使用增溶劑溶解植物甾醇組合物以形成澄清溶液，從而提供與在生物轉(zhuǎn)化中所用微生物良好的接觸。所選的適宜的增溶劑包括二醇(glycol)家族的成員和硅氧烷家族的成員，它們能使高濃度的植物甾醇被溶解于營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中。這將使得與微生物良好接觸，減少發(fā)酵時(shí)間，并得到最終產(chǎn)物的相對(duì)高收率。優(yōu)選先前已知的增溶劑例如向日葵油。
在本發(fā)明的第三步，在第二營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中增殖鐮孢屬的真菌培養(yǎng)物。如上所述，本領(lǐng)域中有許多已知和可用的適宜培養(yǎng)基和條件，本發(fā)明并不限制于其中的任何一個(gè)。但是，在優(yōu)選方式中，鐮孢屬物種在含有玉米漿和葡萄糖的種子培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。
在本發(fā)明的第四步，將1)鐮孢或2)真菌培養(yǎng)物培養(yǎng)基(包含真菌酶)中的一種或多種注入含有AD溶液的生物反應(yīng)器中，以將AD溶液轉(zhuǎn)化為ADD。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，在注入之前對(duì)生物反應(yīng)器進(jìn)行滅菌以殺滅細(xì)菌(例如在120℃左右加熱)。
進(jìn)行″注入″步驟最簡(jiǎn)單和經(jīng)濟(jì)的方法是將真菌培養(yǎng)物培養(yǎng)基中的一些接種到已滅菌的生物反應(yīng)器中?；蛘?，在另一方面，從培養(yǎng)基中分離真菌細(xì)胞(例如通過(guò)離心分離)并且僅僅注射這些細(xì)胞也是可能的。而且，為了促進(jìn)存在的酶的接近，這些細(xì)胞能被超聲或以其它方式破裂，再通過(guò)過(guò)濾分離或用溶劑如丙酮和水提取酶，隨后取代培養(yǎng)基或真菌細(xì)胞被注入生物反應(yīng)器中。
兩個(gè)″階段″(植物甾醇到AD；AD到ADD)中各自的最佳底物濃度，底物添加時(shí)間和發(fā)酵期依賴于所用微生物的類型和確切的發(fā)酵條件。確切的條件對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，不需要過(guò)度的實(shí)驗(yàn)就能容易地確定。
在本發(fā)明最優(yōu)選的方式中，通過(guò)使用分枝桿菌屬M(fèi)B 3683完成從植物甾醇組合物到AD的生物轉(zhuǎn)化。本發(fā)明最優(yōu)選的方式中，通過(guò)使用茄病鐮孢或尖孢鐮孢(Fusarium oxysporium)中的一個(gè)完成從AD到ADD的生物轉(zhuǎn)化。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，使用亞硝基胍對(duì)茄病鐮孢進(jìn)行突變制得新的突變體，所述新突變體對(duì)于在甾類轉(zhuǎn)化為AD所用的相同反應(yīng)器中進(jìn)行AD到ADD的轉(zhuǎn)化尤其有效，即該轉(zhuǎn)化不需要從第一發(fā)酵步驟中分離AD。所述突變體微生物已經(jīng)保藏在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(″ATCC″)(10801 University Blvd.，Manassas VA，USA，20110-2209)中，專利保藏號(hào)為PTA-3947，其以永久保藏的方式保藏。該微生物的傳代培養(yǎng)物在請(qǐng)求時(shí)是可獲得的，然而，要了解所述可獲得并不構(gòu)成許可實(shí)施本發(fā)明。
附圖1簡(jiǎn)略地列出了本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中微生物和真菌的發(fā)酵步驟，其中植物甾醇使用分枝桿菌種轉(zhuǎn)化為AD以及隨后AD使用鐮孢屬物種轉(zhuǎn)化為ADD和勃地酮(boldenone)。
附圖2圖示了本發(fā)明進(jìn)一步的實(shí)施方案，其中ADD直接從AD來(lái)源制備。增殖鐮孢屬物種培養(yǎng)物，在發(fā)酵條件下將接種物加入含有AD的容器中。在此之后，分離和純化ADD。
植物甾醇/植物烷醇在此使用的術(shù)語(yǔ)″植物甾醇組合物″包括所有的甾醇并且沒有限制，例如谷甾醇，菜油甾醇，豆甾醇，菜籽甾醇(包括二氫菜籽甾醇)，鏈甾醇，chalinosterol，多孔甾醇，穿貝海綿甾醇，麥角甾醇，糞甾醇，科迪甾醇(codisterol)，異巖藻甾醇(isofucosterol)，巖藻甾醇，桐甾醇，神經(jīng)甾醇(nervisterol)，7-烯膽甾烷醇，星魚甾醇，菠菜甾醇，chondrillasterol，peposterol，燕麥甾醇，異燕麥甾醇，fecosterol，pollinastasterol，膽甾醇以及它們的所有天然或合成形式和衍生物，包括異構(gòu)體。并且包括它們所有的氫化對(duì)應(yīng)物(″植物甾烷醇(phytostanols)″)。植物甾烷醇包括所有飽和或氫化的植物甾醇以及它們的所有天然或合成形式和衍生物，包括異構(gòu)體。當(dāng)在說(shuō)明書全文中存在疑問(wèn)時(shí)，需要了解的是術(shù)語(yǔ)“植物甾醇組合物”可包含植物甾醇和植物甾烷醇兩者。
用于本發(fā)明生物轉(zhuǎn)化的甾醇和甾烷醇(stanols)可以通過(guò)許多種天然來(lái)源獲得。例如，它們可以從植物油(包括水生植物)的加工中獲得，所述植物油如玉米油和其它植物油，麥胚芽油，大豆提取物，大米提取物，米糠，菜籽油，向日葵油，芝麻油和魚(以及其它水產(chǎn)來(lái)源)油。它們也可以衍生自真菌，例如麥角甾醇。因此，本發(fā)明并不限于甾醇的任何一個(gè)來(lái)源。美國(guó)專利4,420,427中教導(dǎo)了使用溶劑如甲醇從植物油渣中制備甾醇。或者，植物甾醇和植物甾烷醇可以來(lái)自林業(yè)加工副產(chǎn)品妥爾油樹脂(tall oil pitch)或制漿皂(pulping soap)，如美國(guó)專利5,770,749中所述，在此引入作為參考。
在發(fā)酵方法中，優(yōu)選溫度維持在大約30-37℃的范圍內(nèi)，更優(yōu)選25-35℃。發(fā)酵期間pH的檢測(cè)顯示pH能在起始時(shí)大約7.0到收獲時(shí)大約4.7的范圍內(nèi)變化。發(fā)酵或轉(zhuǎn)化過(guò)程一旦完成，即用本領(lǐng)域已知和常規(guī)的方法回收ADD。
以下的實(shí)施例代表實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)。然而，每個(gè)都能使用已知的工業(yè)技術(shù)擴(kuò)展用于工業(yè)規(guī)模的應(yīng)用以實(shí)施本發(fā)明。
實(shí)施例1使用分枝桿菌種和茄病鐮孢將植物甾醇生物轉(zhuǎn)化為ADD使用分枝桿菌種進(jìn)行的生物轉(zhuǎn)化(第1階段)制備分枝桿菌種的種子培養(yǎng)物在液體培養(yǎng)基中制備用于生物轉(zhuǎn)化的接種物。從瓊脂斜面(在玻璃試管中培養(yǎng))接種錐形瓶。對(duì)于不超過(guò)40L的工作體積，使用每個(gè)含200mL種子培養(yǎng)基的1L錐形瓶，而對(duì)于50L和更大體積，使用每個(gè)含400mL培養(yǎng)基的2L錐形瓶。在無(wú)菌條件下進(jìn)行接種(在防生物危害罩中)。移取無(wú)菌水(5mL)到瓊脂斜面上。用移液管末端輕輕刮下細(xì)菌培養(yǎng)物。然后移取該混懸培養(yǎng)物并放入錐形瓶中。在旋轉(zhuǎn)振蕩器上進(jìn)行細(xì)菌增殖(200rpm，1″throw，30℃室溫)。在培養(yǎng)72小時(shí)后，此種子培養(yǎng)物即可轉(zhuǎn)移至生物反應(yīng)器中。在接種前對(duì)種子培養(yǎng)物長(zhǎng)期儲(chǔ)存是不可取的。
種子培養(yǎng)方案概述如下培養(yǎng)基種子培養(yǎng)基(每L)54mL Refiners糖蜜(BC糖)5.4g NaNO30.6g NH4H2PO46.0g 葡萄糖調(diào)pH至7.0培養(yǎng)基量200mL/燒瓶接種物量每200ml新培養(yǎng)基接種來(lái)自瓊脂斜面的3ml細(xì)胞懸液容器1000mL錐形瓶攪拌振蕩器(1″throw)，200rpm溫度30℃生長(zhǎng)時(shí)間72小時(shí)培養(yǎng)注解如果在底部有黃色細(xì)胞沉淀形成則表示為良好的培養(yǎng)物生長(zhǎng)。
制備用于使用分枝桿菌種的3L實(shí)驗(yàn)的生物轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基該培養(yǎng)基制備過(guò)程僅僅用于3L工作體積的實(shí)驗(yàn)。在大規(guī)模生產(chǎn)中，過(guò)程如下所述。
生物轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基的組成如下培養(yǎng)基生物轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基(以3L培養(yǎng)基計(jì))162mL無(wú)菌糖蜜(BC糖)(5.4％v/v)16.2g NaNO3(0.54％)1.8g NH4H2PO4(0.06％)底物30.0g植物甾醇(1.0％)乳化劑480mL向日葵油(16％)在使用前一天，必需量的Refiners糖蜜(162mL)與水(300mL)混合并在錐形瓶中滅菌(121℃持續(xù)20分鐘)。
在燒瓶或燒杯中混合水(2.0L)和培養(yǎng)基組分(除植物甾醇和向日葵油以外)。用1M NaOH溶液(40g/L NaOH)調(diào)培養(yǎng)基的pH值至8.1，將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至生物反應(yīng)器中，隨后加熱至60-70℃。
在燒杯中稱重植物甾醇(30g)，加入向日葵油(480mL)，在熱板上邊加熱邊攪拌混合物，直至油變澄清。這時(shí)通常在～120℃。將油中澄清的黃色植物甾醇溶液倒入生物反應(yīng)器中已加熱的液體培養(yǎng)基中(60-70℃)，無(wú)需攪拌。
將發(fā)酵罐滅菌(121℃持續(xù)30分鐘)，然后冷卻至30℃。
上述培養(yǎng)基制備的過(guò)程僅僅適用于3L的工作體積。
注解生物轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基具有7％的干燥物質(zhì)(折射測(cè)量)。
制備用于使用分枝桿菌種的大規(guī)模實(shí)驗(yàn)的生物轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基該培養(yǎng)基的制備過(guò)程用于40L和更大的工作體積。
表1.制造商提供的植物甾醇組合物

培養(yǎng)基組成如下培養(yǎng)基生物轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基(以每升培養(yǎng)基計(jì))54mL無(wú)菌糖蜜(BC糖)(5.4％v/v)5.4g NaNO3(0.54％)0.6g NH4H2PO4(0.06％)底物 10.0g植物甾醇 (1.0％)乳化劑160mL向日葵油 (16％)
在使用前一天，必需量的Refiners糖蜜(54mL/L培養(yǎng)基)與水(100mL/L培養(yǎng)基)混合并滅菌。
發(fā)酵罐中在攪拌下混合所有組分(包括必需量的水，但不包括植物甾醇和向日葵油)，以獲得一種澄清溶液。水的必需量通過(guò)從所需最終體積中減去糖蜜、油和接種物的量而得。用NaOH水溶液(20％)調(diào)培養(yǎng)基的pH值至8.L在培養(yǎng)基中加入植物甾醇和向日葵油，并滅菌發(fā)酵罐(121℃，30-60分鐘)。
注解生物轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基具有7％的干燥物質(zhì)(折射測(cè)量)。
在發(fā)酵罐中使用分枝桿菌進(jìn)行的生物轉(zhuǎn)化在帶有有效底部攪拌的不銹鋼發(fā)酵罐中進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。所用發(fā)酵罐的主要參數(shù)列于表2中。將發(fā)酵罐中培養(yǎng)基的溫度調(diào)至30℃，在無(wú)菌條件下加入接種物。整個(gè)過(guò)程在30℃進(jìn)行。從此階段開始到最后都監(jiān)測(cè)該過(guò)程的pH值和無(wú)菌度。40小時(shí)以后開始監(jiān)測(cè)底物(植物甾醇)和產(chǎn)物(AD)。詳細(xì)的分析過(guò)程(HPLC，GC)和結(jié)果在下面給出。此過(guò)程中生物轉(zhuǎn)化混合物的pH值通常在1 pH單位內(nèi)變化并未校正。當(dāng)泡沫層中的產(chǎn)物(AD)濃度達(dá)到最大或當(dāng)?shù)孜?植物甾醇)濃度達(dá)其起始濃度的1/20時(shí)，被認(rèn)為已經(jīng)完成生物轉(zhuǎn)化。
表2.用分枝桿菌種進(jìn)行植物甾醇發(fā)酵的參數(shù)

注意事項(xiàng)為了與微生物最大化接觸，必須伴有高效的攪拌。通常來(lái)說(shuō)，″泡沫牛奶(milk-shake)″外觀表征為良好的乳化。
形態(tài)學(xué)觀察(使用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行的研究)
在每階段(從瓊脂斜面到最終的收獲)，細(xì)胞的形態(tài)維持不變，也就是說(shuō)，細(xì)胞具有兩極細(xì)胞核并且是桿狀的。
使用茄病鐮孢進(jìn)行的生物轉(zhuǎn)化(第2階段)制備茄病鐮孢的種子培養(yǎng)物在液體培養(yǎng)基(10g/L玉米漿，10g/L葡萄糖，pH 6.5)中增殖真菌培養(yǎng)物茄病鐮孢。從在燕麥粉瓊脂上在30℃生長(zhǎng)了120小時(shí)的培養(yǎng)物接種錐形瓶(1L體積，0.2L培養(yǎng)基)。在旋轉(zhuǎn)振蕩器(26℃，120rpm，1″throw)中增殖液體培養(yǎng)基培養(yǎng)物72小時(shí)。
也可以將鐮孢從液體到液體培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)，直至4-5代或直到下一個(gè)培養(yǎng)物變?yōu)榉奂t色。
搖瓶接種物在4℃下儲(chǔ)存不超過(guò)1個(gè)月，其活性不會(huì)發(fā)生顯著的變化。
使用茄病鐮孢的生物轉(zhuǎn)化的制備使用從第一階段得到的全部生物轉(zhuǎn)化肉湯進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化的第二階段。
在完成植物甾醇到AD的轉(zhuǎn)化之后(2.3.1.4部分)，將必需的組分(10g/L葡萄糖，10g/L玉米漿)加入第一階段所得的肉湯中，并用HCl水溶液(4％)調(diào)pH至6.7。滅菌肉湯(121℃，30min)，隨后將溫度調(diào)至30℃。
使用第一階段所得的肉湯和茄病鐮孢將AD生物轉(zhuǎn)化為ADD生物轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)在帶有有效底部攪拌的不銹鋼發(fā)酵罐中進(jìn)行。所用發(fā)酵罐的主要參數(shù)列于表3中。將發(fā)酵罐中培養(yǎng)基的溫度調(diào)至30℃并在無(wú)菌條件下加入接種物。
表3.用茄病鐮孢進(jìn)行植物甾醇發(fā)酵的參數(shù)

整個(gè)過(guò)程在30℃進(jìn)行。從該階段開始到最后監(jiān)測(cè)過(guò)程的pH值和無(wú)菌度。15小時(shí)以后開始監(jiān)測(cè)底物(AD)和產(chǎn)物(ADD)。詳細(xì)的分析過(guò)程(HPLC，GC)在4.1部分中給出。過(guò)程的監(jiān)測(cè)結(jié)果在4.2部分中給出。在此過(guò)程中生物轉(zhuǎn)化混合物的pH值通常在1pH單位內(nèi)變化并未校正。當(dāng)泡沫層中的產(chǎn)物(ADD)濃度達(dá)到最大或當(dāng)?shù)孜?AD)濃度達(dá)其起始濃度的1/20時(shí)，被認(rèn)為已經(jīng)完成生物轉(zhuǎn)化。
該過(guò)程通過(guò)滅菌結(jié)束(121℃，30min)。
實(shí)施例2使用茄病鐮孢將AD生物轉(zhuǎn)化為ADD的一階段法制備茄病鐮孢的種子培養(yǎng)物在液體培養(yǎng)基(10g/L玉米漿，10g/L葡萄糖，pH6.5)中增殖真菌培養(yǎng)物茄病鐮孢。從在燕麥粉瓊脂上在30℃生長(zhǎng)了120小時(shí)的培養(yǎng)物接種錐形瓶(1L體積，0.2L培養(yǎng)基)。在旋轉(zhuǎn)振蕩器(26℃，120rpm，1″throw)中增殖液體培養(yǎng)基培養(yǎng)物72小時(shí)。
鐮孢也可以從液體到液體培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)，直至4-5代或直到下一個(gè)培養(yǎng)物變?yōu)榉奂t色。
搖瓶接種物在4℃下儲(chǔ)存不超過(guò)1個(gè)月，其活性不會(huì)發(fā)生顯著的變化。
用于茄病鐮孢的生物轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基的制備該方法使用已分離的AD進(jìn)行。
生物轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基的組成如下
培養(yǎng)基生物轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基(用于3L培養(yǎng)基)30g葡萄糖 (10％)30mL 玉米漿 (10％v/v)底物 30.0g AD(1.0％)乳化劑480mL 向日葵油 (16％)燒瓶或燒杯中混合水(2.5L)和培養(yǎng)基組分(除AD和向日葵油以外)。用1M NaOH溶液(40g/L NaOH)調(diào)培養(yǎng)基的pH值至6.5，將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至生物反應(yīng)器中，隨后加熱至60-70℃。
燒杯中稱重AD(30g)，加入向日葵油(480mL)，在熱板上邊加熱邊攪拌混合物，直至油變澄清。將油中澄清的黃色AD溶液倒入生物反應(yīng)器中已經(jīng)加熱的液體培養(yǎng)基中(60-70℃)，無(wú)需攪拌。
滅菌發(fā)酵罐(121℃持續(xù)30分鐘)，然后冷卻至30℃。
不銹鋼發(fā)酵罐中AD到ADD的生物轉(zhuǎn)化在帶有有效底部攪拌的不銹鋼發(fā)酵罐中進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。所用發(fā)酵罐的主要參數(shù)列于表4中。將發(fā)酵罐中培養(yǎng)基的溫度調(diào)至30℃，在無(wú)菌條件下加入接種物。整個(gè)過(guò)程在30℃進(jìn)行。從此階段開始到最后監(jiān)測(cè)過(guò)程的pH值和無(wú)菌度。15小時(shí)以后開始監(jiān)測(cè)底物(AD)和產(chǎn)物(ADD)。詳細(xì)的分析過(guò)程(HPLC，GC)和結(jié)果在下面給出。此過(guò)程中生物轉(zhuǎn)化混合物的pH值通常在1pH單位內(nèi)變化并未校正。當(dāng)泡沫層中的產(chǎn)物(ADD)濃度達(dá)到最大或當(dāng)?shù)孜?AD)濃度達(dá)其起始濃度的1/20時(shí)，被認(rèn)為已經(jīng)完成生物轉(zhuǎn)化。
該過(guò)程通過(guò)滅菌結(jié)束(121℃，30min)。
表4.用茄病鐮孢進(jìn)行植物甾醇發(fā)酵的參數(shù)

實(shí)施例3發(fā)酵肉湯的提取收獲發(fā)酵肉湯到分液漏斗中。在肉湯中加入乙酸乙酯(6.0L)并振蕩2-3分鐘。15分鐘后該混合物分為兩層(乙酸乙酯上層和含水底層)。移去乙酸乙酯層并將其轉(zhuǎn)入其它的容器中。用第二份乙酸乙酯(4.0L)萃取含水底層，移去上層(乙酸乙酯)并將其與第一份乙酸乙酯萃取物合并。將合并的乙酸乙酯萃取物在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上濃縮形成一種紅色粘稠的油(～450ml)，其用于進(jìn)一步的純化。
每份乙酸乙酯萃取物和含水殘留物通過(guò)HPLC進(jìn)行甾類分析。兩階段法的結(jié)果列于表5中，一階段法的結(jié)果列于表6中。
從油中分配ADD將己烷(1.25L)與油性殘留物(～450ml)很好的混合。用甲醇(2.0L×2)萃取油-己烷溶液。將這兩份甲醇萃取物進(jìn)行合并并蒸發(fā)直至干燥形成淺褐色油性殘留物。真空干燥殘留物。己烷和甲醇層各個(gè)均進(jìn)行HPLC分析，以控制分配的完成。
A)從植物甾醇發(fā)酵為ADD的兩階段發(fā)酵物將ADD結(jié)晶第一次結(jié)晶在一些實(shí)驗(yàn)中甲醇蒸發(fā)后的殘留物被真空干燥。如果這樣的話，殘留物(～40-50g，ADD含量17-18g，HPLC測(cè)得的純度為30-40％)溶于乙酸乙酯(100ml)中。
如果甲醇蒸發(fā)后的殘留物不進(jìn)行真空干燥，隨后將殘留物溶于乙酸乙酯(250ml)中，用Na2SO4干燥并濃縮至較小體積(100ml)。
加入活性炭(4.0g)并將混合物回流1小時(shí)。冷卻后，在燒結(jié)玻璃漏斗上過(guò)濾混合物，并用乙酸乙酯洗滌過(guò)濾物?；蛘?，通過(guò)硅藻土墊(Celite pad)過(guò)濾溶液并用乙酸乙酯洗滌。將濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上濃縮直至干燥。加入己烷(200ml)，混合物回流攪拌20分鐘，冷卻至室溫并放置30分鐘以分離。將上層己烷轉(zhuǎn)入另一個(gè)容器中并放置過(guò)夜用于結(jié)晶。從己烷溶液過(guò)濾ADD晶體，用己烷/乙酸乙酯(3/1)洗滌，并減壓干燥，以形成白色的ADD晶體(0.23g)。將粘性油溶于乙酸乙酯(8ml)中并加熱攪拌10分鐘。將溶液冷卻至室溫并放置過(guò)夜。過(guò)濾ADD晶體，用己烷/乙酸乙酯(3/1)洗滌，并減壓干燥，以形成白色的ADD晶體(2.51g)。將晶體和母液進(jìn)行HPLC分析。
第二次結(jié)晶將第一次結(jié)晶后留下的母液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上濃縮。加入乙酸乙酯(4ml)，混合物回流攪拌10分鐘，冷卻至室溫并放置過(guò)夜用以結(jié)晶。過(guò)濾ADD晶體，用己烷/乙酸乙酯(3/1)洗滌，并減壓干燥，以形成白色的ADD晶體(1.25g)。將產(chǎn)物和母液進(jìn)行HPLC分析。
表5.來(lái)自兩階段法的產(chǎn)物(ADD)的萃取和分配結(jié)果

第三次結(jié)晶將第二次結(jié)晶后留下的母液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上濃縮。乙酸乙酯(2ml)和己烷(1mL)混合物回流攪拌10分鐘，冷卻至室溫并放置過(guò)夜用以結(jié)晶。過(guò)濾ADD晶體，用己烷/乙酸乙酯(3/1)洗滌，并減壓干燥，以形成白色的ADD晶體(0.16g)。將產(chǎn)物和母液進(jìn)行HPLC分析。
結(jié)晶的ADD的總量為4.25g。
B)從AD發(fā)酵為ADD的一階段發(fā)酵物分離ADD第一次結(jié)晶如果將甲醇蒸發(fā)后的殘留物真空干燥，殘留物(～40-50g，ADD含量17-18g，HPLC測(cè)得的純度為30-40％)溶于乙酸乙酯(150ml)中。
如果甲醇蒸發(fā)后的殘留物不真空干燥，隨后將殘留物溶于乙酸乙酯(250ml)中，用Na2SO4干燥并濃縮至較小體積(150ml)。
加入活性炭(4.0g)并將混合物回流1小時(shí)。冷卻后，在燒結(jié)玻璃漏斗上過(guò)濾混合物，并用乙酸乙酯洗滌過(guò)濾物?；蛘?，通過(guò)硅藻土墊(Celite pad)過(guò)濾溶液。將濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上濃縮直至干燥，然后邊加熱邊將殘留物溶于乙酸乙酯(6ml)中，并冷卻至室溫用以結(jié)晶。在放置過(guò)夜后，過(guò)濾ADD晶體，用己烷/乙酸乙酯(3/1)洗滌，并減壓干燥，以形成白色的ADD晶體。將晶體和母液進(jìn)行HPLC分析。
第二次結(jié)晶將第一次結(jié)晶后留下的母液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上濃縮。加入己烷(50ml)，混合物回流攪拌1小時(shí)，冷卻至室溫并放置30分鐘用以分離。上層己烷被轉(zhuǎn)入另外一個(gè)容器中并放置過(guò)夜用以結(jié)晶。粘性油與乙酸乙酯(2ml)、己烷(1ml)混合，邊加熱邊攪拌10分鐘。溶液冷卻至室溫并放置過(guò)夜。過(guò)濾ADD晶體，用己烷/乙酸乙酯(3/1)洗滌，并減壓干燥，以形成白色的ADD晶體。該己烷層也產(chǎn)生了一部分的ADD晶體。將晶體和母液進(jìn)行HPLC分析。
第三次結(jié)晶將第二次結(jié)晶后的母液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上濃縮。粘性油與乙酸乙酯(1ml)、己烷(3ml)混合，邊加熱邊攪拌10分鐘。冷卻后，溶液放置過(guò)夜以結(jié)晶。過(guò)濾ADD晶體，用己烷/乙酸乙酯(3/1)洗滌，并減壓干燥，以形成ADD晶體。將晶體和母液進(jìn)行HPLC分析。
ADD結(jié)晶的結(jié)果列于表6中表6.來(lái)自一階段法的ADD的萃取，分配和結(jié)晶結(jié)果

實(shí)施例5定性(TLC)和定量(HPLC和GC)分析TLC定性分析從發(fā)酵罐底部取肉湯樣品(每份大約40mL)。用乙酸乙酯(0.5mL)提取肉湯樣品(0.5mL)。在硅膠預(yù)涂布板(60F254，厚0.2mm)上對(duì)0.050mL乙酸乙酯萃取物進(jìn)行TLC分析。所用流動(dòng)相為己烷/乙酸乙酯＝3∶1；氯仿/丙酮＝3∶1，或二氯甲烷/丙酮＝9∶1。板展開后，使用下列噴霧(或浸漬)試劑之一。
Cerrium試劑含有(以100mL計(jì))水(94mL)，硫酸鈰(IV)(1.0g)，磷鉬酸水合物(2.5g)，硫酸(6ml)。這些組分以所列順序溶解。該試劑能保存一年以上。
鉬酸鹽試劑含有(以100mL計(jì))水(90mL)，鉬酸銨(ammoniummolibdate)(10.85g)，硫酸(6ml))。這些組分以所列順序溶解。該試劑能保存一年以上。
隨后將板在150℃加熱3分鐘。最終的藍(lán)斑表明了下述化合物的存在(己烷/乙酸乙酯＝3/1)Rf＝0.75-向日葵油；Rf＝0.53-植物甾醇；Rf＝0.47-雄烯二酮(AD)；和Rf＝0.02-雄二烯二酮(ADD)。
AD，ADD和副產(chǎn)物的HPLC監(jiān)測(cè)樣品(2g泡沫或2mL液體或10mg晶體)用甲醇稀釋至50.0mL，很好的混合并放置10分鐘以沉淀蛋白和植物甾醇。過(guò)濾溶液的等分試樣(Millipore過(guò)濾器HV型0.45μm)。使用徑向填充柱(固定相C185μm，4×100mm，Waters)進(jìn)行HPLC分析。
流動(dòng)相水/甲醇＝4∶6(恒溶劑的)，流速1ml/min，在280nm檢測(cè)。
AD的標(biāo)準(zhǔn)曲線(mg)＝(8.39×面積+2033)×10-5；其中面積范圍為0到30000。
ADD的標(biāo)準(zhǔn)曲線(mg)＝(7.43×面積+72.22)×10-4；其中面積范圍為0到100000。
標(biāo)準(zhǔn)曲線根據(jù)雄烯二酮(AD)和雄二烯二酮(ADD)純樣品測(cè)定結(jié)果繪制。產(chǎn)物的保留時(shí)間如下化合物 保留時(shí)間(min)AD 8.73ADD 13.20底物和產(chǎn)物的GC監(jiān)測(cè)在容量瓶中，將樣品(50mg晶體)溶于乙酸乙酯中并稀釋至50.0mL。或者，用50mL乙酸乙酯萃取2mL生物轉(zhuǎn)化混合物。然后乙酸乙酯溶液用于植物甾醇、AD和ADD的GC分析。
條件SAC-5柱，烘箱溫度278℃，注射溫度300℃，檢測(cè)器FID。
產(chǎn)物的保留時(shí)間如下化合物 保留時(shí)間(min)AD8.06ADD 9.21菜籽甾醇 20.53菜油甾醇 23.20菜油甾烷醇(campestanol) 23.66豆甾醇24.70β-谷甾醇 27.71谷甾烷醇(豆甾烷醇)28.27植物甾醇和AD生物轉(zhuǎn)化為ADD的結(jié)果表7.兩階段生物轉(zhuǎn)化法的監(jiān)測(cè)概述

表8.兩階段生物轉(zhuǎn)化法的監(jiān)測(cè)概述

實(shí)施例6新突變體茄病鐮孢FMI33的鑒定采用方法產(chǎn)生大亞基(LSU)rRNA基因序列數(shù)據(jù)。從分離自FMI33真菌菌落的基因組DNA，PCR擴(kuò)增始于3344位的LSU rRNA基因的大約300個(gè)堿基對(duì)。使用Microcon100分子量濾膜(Amicon)從過(guò)量的引物和dNTPs中純化擴(kuò)增產(chǎn)物，并通過(guò)將部分產(chǎn)物在瓊脂糖膠上跑膠來(lái)檢測(cè)其質(zhì)量和數(shù)量。
使用AmpliTaq FS DNA聚合酶和dRhodamine染料終止劑進(jìn)行LSU rRNA擴(kuò)增產(chǎn)物的循環(huán)測(cè)序。使用Sephadex G-50離心柱除去序列測(cè)定反應(yīng)中過(guò)量的染料標(biāo)記的終止劑。通過(guò)離心分離收集產(chǎn)物，真空干燥并冷凍在-20℃直至用于加樣。將樣品再懸浮于甲酰胺/藍(lán)葡聚糖/EDTA溶液中，并在加樣前進(jìn)行變性。樣品在ABI Prism 377 DNA序列測(cè)定儀上進(jìn)行電泳。使用PE/應(yīng)用生物系統(tǒng)DNA編輯和裝配軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。
使用微生物分析軟件對(duì)樣品FMI 33和MicroSeq數(shù)據(jù)庫(kù)(MicroSeq database)中的其它微生物進(jìn)行比較。發(fā)現(xiàn)FMI 33與下一個(gè)最接近的對(duì)比物，茄病鐮孢，具有0.94％的遺傳圖距，這表明FMI33是一個(gè)獨(dú)立的真菌突變體。
FMI 33的序列數(shù)據(jù)AGACCGATAGCGAACAAGTAGAGTGATCGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTTAAACAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGCGCTTGTGACCAGACTTGGGCTTGGTTGATCATCCGGGGTTCTCCCCGGTGCACTCTTCCGGCCAGGCCAGCATCAGTTCGCCCTGGGGGACAAAGGCATCGGGAACGTGGCTCTCTCCGGGGAGTGTTATAGCCCGTTGCGTAATACCCTGCGGCGGACTGAGGTTCGCGCATTCGCAAGGATGCTGGCGTAATGGTCATCAGTGACCCGTCTTGAAACACGGACCAAG
序列表序列表<110>Forbes Modi-Tech Inc.
<120>將植物甾醇發(fā)酵制備雄二烯二酮的方法<130>Forb-ADD-PCT<140>PCT/CA03/00131<141>2003-02-03<150>10/066395<151>2002-02-01<160>1<170>PatentIn Ver. 2.1<210>1<211>319<212>DNA<213>鐮孢屬<400>1agaccgatag cgaacaagta gagtgatcga aagatgaaaa gaactttgaa aagagagtta 60aacagtacgt gaaattgttg aaagggaaga gcttgtgacc agacttggga ttggttgatc 120atccggggtt ctccccggtg cactcttccg gccaggccag catcagttcg ccctggggga 180caaaggcatc gggaacgtgg ctctctccgg ggagtgttat agcccgttgc gtaataccct 240gcggcggact gaggttcgcg cattcgcaag gatgctggcg taatggtcat cagtgacccg 300tcttgaaaca cggaccaag 319
權(quán)利要求
1.將植物甾醇組合物發(fā)酵以制備雄烯二酮(雄-4-烯-3，17-二酮)和隨后制備雄二烯二酮(雄-1，4-二烯，3，17-二酮)的方法，其中包括在第一營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中增殖分枝桿菌屬的微生物培養(yǎng)物；將微生物培養(yǎng)物和植物甾醇組合物在生物反應(yīng)器中放置足夠的時(shí)間以將該組合物基本上轉(zhuǎn)化為雄烯二酮(″AD溶液″)；在第二營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中增殖鐮孢屬的真菌培養(yǎng)物；將1)鐮孢屬物種和2)真菌培養(yǎng)物培養(yǎng)基中的一種或多種注入生物反應(yīng)器中足夠的時(shí)間以將AD溶液轉(zhuǎn)化為雄二烯二酮。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中真菌培養(yǎng)物是茄病鐮孢。
3.權(quán)利要求1所述的方法，其中真菌培養(yǎng)物是尖孢鐮孢。
4.權(quán)利要求1所述的方法，其中的微生物培養(yǎng)物是分枝桿菌MB3683。
5.權(quán)利要求1的方法，其中的真菌培養(yǎng)物是茄病鐮孢FMI33，以PTA-3947保藏在ATCC。
6.權(quán)利要求1所述的方法，其中植物甾醇組合物來(lái)自妥爾油樹脂或制漿皂。
7.權(quán)利要求1的所述的方法，其中植物甾醇組合物來(lái)自適宜的經(jīng)選擇的植物油。
8.權(quán)利要求7所述的方法，其中植物油選自大豆，菜籽，玉米，棉籽，向日葵，橄欖，亞麻籽或米糠。
9.權(quán)利要求1所述的方法，其中植物甾醇組合物包括下述中的一種或多種谷甾醇，菜油甾醇，豆甾醇，菜籽甾醇，鏈甾醇，chalinosterol，多孔甾醇，穿貝海綿甾醇，以及它們所有的氫化對(duì)應(yīng)物和所有天然或合成形式和衍生物，包括異構(gòu)體。
10.權(quán)利要求1所述的方法，其中第一營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基包含Refiners糖蜜和無(wú)機(jī)鹽。
11.權(quán)利要求1所述的方法，其中第二營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基包括葡萄糖和玉米漿。
12.權(quán)利要求1所述的方法，其中發(fā)酵在有氧條件下進(jìn)行。
13.權(quán)利要求1所述的方法，其中使用增溶劑將植物甾醇組合物溶于溶液中并隨后加至生物反應(yīng)器中。
14.權(quán)利要求13所述的方法，其中增溶劑是二醇家族中的成員。
15.權(quán)利要求13所述的方法，其中增溶劑是聚丙二醇。
16.權(quán)利要求13所述的方法，其中增溶劑是硅氧烷家族中的成員。
17.權(quán)利要求1所述的方法，其中生物反應(yīng)器在注入1)真菌培養(yǎng)物或2)真菌培養(yǎng)物培養(yǎng)基之前經(jīng)過(guò)滅菌以及隨后的冷卻。
18.一種用雄烯二酮(AD)制備雄二烯二酮(ADD)的方法，包括在1)鐮孢屬物種、2)由此得來(lái)的酶或3)鐮孢屬物種真菌培養(yǎng)物培養(yǎng)基存在的情況下，在生物反應(yīng)器中將AD發(fā)酵足夠的時(shí)間以將AD轉(zhuǎn)化為ADD。
19.權(quán)利要求18所述的方法，其中鐮孢屬物種是以PTA-3947保藏在ATCC的茄病鐮孢FMI33。
20.以PTA-3947保藏在ATCC的茄病鐮孢FMI33。
21.含有通過(guò)權(quán)利要求1所述方法制備的ADD的組合物。
22.含有通過(guò)權(quán)利要求18所述方法制備的ADD的組合物。
全文摘要
將植物甾醇組合物發(fā)酵以制備雄烯二酮(雄－4－烯－3，17－二酮)和隨后的雄二烯二酮(雄－1，4－二烯，3，17－二酮)的方法，其包括在第一營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中增殖分枝桿菌屬的微生物培養(yǎng)物；將微生物培養(yǎng)物和植物甾醇組合物在生物反應(yīng)器中放置足夠的時(shí)間以將組合物基本上轉(zhuǎn)化為雄烯二酮(“AD溶液”)；在第二營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中增殖鐮孢屬的真菌培養(yǎng)物；將1)鐮孢屬物種或2)真菌培養(yǎng)物培養(yǎng)基中的一種或多種注入生物反應(yīng)器中，反應(yīng)足夠的時(shí)間以將AD溶液轉(zhuǎn)化為雄二烯二酮。
文檔編號(hào)C12P33/00GK1639354SQ03804973
公開日2005年7月13日 申請(qǐng)日期2003年2月3日 優(yōu)先權(quán)日2002年2月1日
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