專利名稱：刺激cpt－1作為一種減輕體重的方法
背景技術(shù)：
本發(fā)明的領(lǐng)域本發(fā)明涉及一種用于開發(fā)治療方法的方法，所述治療方法通過藥理學(xué)刺激CPT-1活性選擇性地增加脂肪酸的氧化，增加能量的產(chǎn)生，并減輕肥胖，同時保持瘦肉質(zhì)量。
現(xiàn)有技術(shù)體外MCF-7人乳腺癌細(xì)胞的淺藍(lán)菌素治療明顯抑制脂肪酸氧化，這可能是通過丙二酸單酰輔酶A水平提高獲得的(Loftus，et al.(2000)Science，2882379-2381)。C75是α-亞甲基-γ-丁內(nèi)酯家族中的一個成員，已知它們是脂肪酸合酶(FAS)的抑制劑(Kuhajda，et al.(2000)Proc.Natl.Acad Sci USA，973450-3454)。應(yīng)用C75處理小鼠引起肝脂肪酸合成的抑制，并產(chǎn)生高水平的丙二酸單酰輔酶A(Loftus，et al.(2000)；Pizer，et al.(2000)Cancer Res.，60213-218)。在腦中，C75減少下丘腦神經(jīng)肽-Y(NPY)的表達(dá)，導(dǎo)致可逆性營養(yǎng)不足(Loftus，et al，2000)。應(yīng)用C75在體內(nèi)處理ob/ob小鼠期間，盡管肝臟丙二酸單酰輔酶A水平升高，但肝臟和外周組織中脂肪出現(xiàn)極度的減少(Loftus，et al.，2000)。
丙二酸單酰輔酶A是一種有效的脂肪酸氧化的抑制劑，這是通過其作為肉堿-棕櫚酰-轉(zhuǎn)移酶-1(CPT-1)的抑制劑實現(xiàn)的(Witters，et al.(1992)J.Biol.Chem.，2672864-2867)。CPT-1可使長鏈酰基-CoA進(jìn)入脂肪酸氧化的線粒體。當(dāng)用FAS抑制劑處理時，盡管通過FAS抑制引起高水平丙二酸單酰輔酶A產(chǎn)生，但遺傳和飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠出現(xiàn)選擇性和顯著的脂肪組織丟失。因為丙二酸單酰輔酶A通過其對肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶-1(CPT-1，E.C.2.3.1.21)的抑制而成為一種有效的脂肪酸氧化抑制劑，所以脂肪組織的快速和選擇性減少是驚人的。期望在C75誘導(dǎo)營養(yǎng)不足過程中，系統(tǒng)性高水平的丙二酸單酰輔酶A可抑制脂肪酸氧化，而并不導(dǎo)致瘦肉質(zhì)量選擇性的減少。
本發(fā)明的概述本發(fā)明的一個目的是提供引起體重減輕并保持最佳體重同時不需要抑制脂肪酸合成的方法和組合物。下面一種或多種實施方式符合這個目的和其它目的。
在一個實施方式中，本發(fā)明提供誘導(dǎo)體重減輕的方法，它包括將刺激肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶-1(CPT-1)活性的物質(zhì)(agent)給予需要治療的患者，包括人類患者。在一個優(yōu)選實施方式中，以足以提高脂肪酸氧化的量給予此物質(zhì)。在另一個優(yōu)選實施方式中，以足以拮抗丙二酸單酰輔酶A對CPT-1的抑制的量給予此物質(zhì)。在再一個優(yōu)選實施方式中，以足以提高丙二酸單酰輔酶A水平的量給予此物質(zhì)。在再一個優(yōu)選實施方式中，給予此物質(zhì)時，丙二酸單酰輔酶A水平實質(zhì)上沒有升高。這里期待的丙二酸單酰輔酶A水平的實質(zhì)性提高大約相當(dāng)于丙二酸單酰輔酶A對CPT-1抑制作用的Ki的一半。在再一個優(yōu)選實施方式中，刺激CPT-1活性的物質(zhì)也抑制脂肪酸合酶(FAS)。在可選擇的實施方式中，F(xiàn)AS沒有顯著抑制。這里期待的顯著抑制小于15％抑制，優(yōu)選小于10％抑制，更優(yōu)選小于5％抑制。美國專利5,981,575中公開了測定FAS活性的方法，這里將其引用為參考文獻(xiàn)。在上面實施方式的優(yōu)選方式中，刺激CPT-1活性的物質(zhì)不是具有下式的化合物 其中R為一種取代基，它選自
(a)含3-18個碳原子的飽和直鏈或支鏈烷基，(b)含3-18個碳原子的不飽和直鏈或支鏈烷基， 和
其中R1和R2相同或不同，為H、CH3、C2H5、C3H7、C4H9、CF3、OCH3、F、Cl或Br；R3為H、CH3、C2H5、C2H5、C4H9、COOH、COOCH3、COOC2H5、COOC2H5或COOC4H9；R4為H、CH3、C2H5、C3H7或C4H9；X為NH、S或O；Z為CH2、O、NH或S；i為1至5；j為0至10；k為1至10；m為1至13；和n為1至15。
在另一個實施方式中，本發(fā)明提供一種穩(wěn)定體重的方法，它包括以對FAS不顯著抑制的量長期給予刺激CPT-1活性的物質(zhì)。在一個優(yōu)選實施方式中，以足以增加脂肪酸氧化的量給予此物質(zhì)。在另一個優(yōu)選實施方式中，以足以拮抗丙二酸單酰輔酶A對CPT-1的抑制的量給予此物質(zhì)。在再一個優(yōu)選實施方式中，以足以提高丙二酸單酰輔酶A水平的量給予此物質(zhì)。在再一個優(yōu)選方式中，給予此物質(zhì)時，丙二酸單酰輔酶A水平實質(zhì)上沒有升高。這里期待的丙二酸單酰輔酶A水平的實質(zhì)性提高大約相當(dāng)于丙二酸單酰輔酶A對CPT-1抑制作用的Ki的一半。
在本發(fā)明的另一個實施方式中，本發(fā)明提供用于篩選引起體重減輕物質(zhì)的方法，它包括確定一種候選的體重減輕物質(zhì)是否刺激CPT-1活性；以及選擇刺激CPT-1活性的物質(zhì)。優(yōu)選地，此方法還包括確定此候選的體重減輕物質(zhì)是否為丙二酸單酰輔酶A對CPT-1抑制作用的拮抗劑，以及選擇消除丙二酸單酰輔酶A對CPT-1抑制的候選物質(zhì)。
在另一個實施方式中，本發(fā)明提供了一種治療組合物，它包括一種刺激CPT-1活性的物質(zhì)和L-肉堿。優(yōu)選地，此治療組合物包括一種丙二酸單酰輔酶A對CPT-1抑制的拮抗劑。
在另一個實施方式中，本發(fā)明還提供一個營養(yǎng)組合物，它包括營養(yǎng)上足夠量的脂肪、碳水化合物和氨基酸，所述的組合物還包括一種丙二酸單酰輔酶A對CPT-1抑制的拮抗劑和L-肉堿。在一個實施方式中，此營養(yǎng)組合物適于胃腸外給藥。
為了研究C75處理過程中肝臟丙二酸單酰輔酶A高水平情況下導(dǎo)致脂肪肝反常(paradoxical)減輕的作用機(jī)理，研究了C75對CPT-1活性的影響。驚奇的是，C75和相關(guān)化合物在抑制FAS的同時，伴隨地刺激體外CPT-1活性和脂肪酸氧化。除了對CPT-1全面變構(gòu)活化作用外，C75還消除了丙二酸單酰輔酶A對體外CPT-1活性的抑制作用。作為脂肪酸氧化增加的結(jié)果，C75提高了細(xì)胞ATP水平。
為了試驗C75對體內(nèi)脂肪酸氧化的作用，采用整個動物量熱法測量C75處理小鼠的呼吸交換率(RER)。C75治療后，RER在2小時內(nèi)下降到0.7的范圍，表明脂肪酸的氧化。這種RER的下降率類似于從用鼠糧自由喂養(yǎng)的動物處撤回食物。這些研究表明，盡管存在肝臟高水平的丙二酸單酰輔酶A，C75處理的動物自由地進(jìn)行脂肪酸的氧化。
這些數(shù)據(jù)提示C75阻斷了丙二酸單酰輔酶A對體內(nèi)CPT-1活性的抑制作用，導(dǎo)致FAS抑制期間脂肪肝和脂肪質(zhì)量的減少。本發(fā)明描述了一種開發(fā)治療方法的方法，所述治療方法通過CPT-1活性的藥理學(xué)刺激，選擇性地減輕肥胖，同時保持瘦肉質(zhì)量。
附圖的簡要說明附

圖1顯示在MCF-7細(xì)胞中C75對脂肪酸氧化的作用，與乙莫克舍的作用相比較。
附圖2顯示C75對CPT-1活性的濃度依賴性刺激作用和丙二酸單酰輔酶A引起的抑制作用。
附圖3顯示C75對CPT-1的可逆性刺激作用。
附圖4顯示不同C75類似物對CPT-1的刺激作用。
附圖5顯示在MCF-7細(xì)胞中C75引起的細(xì)胞ATP水平的濃度依賴性提高。
附圖6顯示在小鼠脂肪細(xì)胞中C75對脂肪酸氧化的濃度依賴性刺激作用。
附圖7顯示在小鼠脂肪細(xì)胞中C75引起的細(xì)胞ATP水平的濃度依賴性提高。
附圖8顯示間接量熱法測定的小鼠呼吸交換率(RER)，(A)為沒有C75的結(jié)果，(B、C)為C75存在下的結(jié)果。
優(yōu)選實施方式的詳細(xì)描述已經(jīng)表明體內(nèi)脂肪酸合酶的抑制可引起快速而顯著的體重減輕。淺藍(lán)菌素為一種天然產(chǎn)物，C-75為一種合成小分子，當(dāng)將它們經(jīng)腦室內(nèi)(i.c.v.)應(yīng)用于大鼠時，兩者均可引起類似的體重減輕。當(dāng)進(jìn)行全身治療(例如腹膜內(nèi)給藥)時，C-75引起更顯著的體重減輕，甚至體重減輕大于饑餓的動物。這些數(shù)據(jù)表明C-75對體重減輕的外周(非CNS)作用大于淺藍(lán)菌素。
在研究C-75這種顯著外周作用的機(jī)理的同時，本發(fā)明人最近發(fā)現(xiàn)，除了FAS的抑制外，C-75及其α-亞甲基-γ-丁內(nèi)酯家族直接刺激肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶-1(CPT-1)，導(dǎo)致線粒體脂肪酸氧化的增加。相反，通過FAS抑制引起高水平丙二酸單酰輔酶A的產(chǎn)生，淺藍(lán)菌素導(dǎo)致CPT-1活性的降低和脂肪酸氧化的減少。
體外MCF-7細(xì)胞的C75處理刺激CPT-1活性從150至160％。同時也伴隨脂肪酸氧化的增加。在C75類似物中，對CPT-1的刺激活性來說，C6-C16的碳鏈長度最佳。在C75存在的情況下，丙二酸單酰輔酶A不再能抑制CPT-1的活性，這提示除了其刺激作用外，C75還阻止了丙二酸單酰輔酶A對CPT-1的抑制作用。在CPT-1和C75之間沒有發(fā)現(xiàn)可檢測到的共價相互作用。
因此，C75的外周性(非CNS)體重減輕作用至少部分是由于CPT-1的刺激作用和脂肪酸氧化的增加，同時伴隨脂肪酸合成的抑制。這些數(shù)據(jù)將α-亞甲基-γ-丁內(nèi)酯家族等同于丙二酸鹽或丙二酸單酰輔酶A模擬物，并將CPT-1確定為體重減輕療法中的靶位。更廣泛的是，我們的數(shù)據(jù)提示，可設(shè)計并合成其它的丙二酸鹽或丙二酸單酰輔酶A模擬物，使其成為有效的體重減輕物質(zhì)。
數(shù)據(jù)表明C-75及其α-亞甲基-γ-丁內(nèi)酯家族直接與CPT-1相互作用，導(dǎo)致CPT-1酶活性和脂肪酸氧化的增加。美國專利5,981,575公開了C75的化學(xué)結(jié)構(gòu)和眾多的類似物，以及合成這些類似物的方法，此專利在此引用為參考文獻(xiàn)。C75的刺激作用與飽和碳側(cè)鏈的長度有關(guān)，其最佳長度為6至18個碳原子。關(guān)于本發(fā)明的討論，C75是刺激CPT-1的原型物質(zhì)；下文中提及的C75包括其它刺激CPT-1活性的適宜物質(zhì)，除了上下文另作說明。
除了直接作用于CPT-1外，C-75還消除了丙二酸單酰輔酶A對CPT-1活性的抑制作用。盡管C75顯示出與純化FAS(1)的慢結(jié)合抑制劑的動力學(xué)特征，但它與CPT-1的相互作用卻是快速而有競爭性的。因此，C75對脂肪酸氧化的刺激作用或是由于其對CPT-1活性的直接刺激作用，其對丙二酸單酰輔酶A抑制CPT-1的干擾，或是由于兩者。令人感興趣的是，C75的作用并不限于鼠CPT-1，它對人CPT-1也有類似的作用。作為脂肪酸氧化增加的結(jié)果，C75也提高了人和鼠細(xì)胞中ATP的水平。
C75對體內(nèi)脂肪酸代謝的作用反映為細(xì)胞水平上可見的變化。盡管C75引起體內(nèi)高水平丙二酸單酰輔酶A的產(chǎn)生，但C7 對瘦鼠的處理導(dǎo)致脂肪酸氧化極度而快速的增加。因此，C75及其α-亞甲基-γ-丁內(nèi)酯家族似乎充當(dāng)了CPT-1的競爭性激動劑。C75的這種激動劑活性似乎克服了丙二酸單酰輔酶A對同一種酶的抑制作用。C75所致脂肪酸氧化的增加是C75治療小鼠過程中肥胖顯著減輕的一個重要機(jī)理。
總之，本發(fā)明描述了一種開發(fā)治療方法的方法，此治療方法通過藥理學(xué)刺激CPT-1活性，選擇性地增加脂肪酸的氧化，增加能量的產(chǎn)生，并減輕肥胖，同時保持瘦肉質(zhì)量。
含有C75和/或刺激CPT-1的其它物質(zhì)的治療組合物的制劑，以及應(yīng)用這些物質(zhì)的方法是在本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)，特別考慮到美國專利5,981,575的說明書，此專利文本在此引用為參考文獻(xiàn)。
通過在給予脂肪酸或含有脂肪酸殘基的化合物的同時給予CPT-1刺激劑，而使用CPT-1刺激劑增加能量的產(chǎn)生也在本領(lǐng)域的技術(shù)范圍內(nèi)，特別考慮到美國專利4,434,160中公開的營養(yǎng)組合物，此專利文本在此引用為參考文獻(xiàn)。
實施例為了使本發(fā)明得到更充分的理解，下面提供了一些實施例。但是，并不是將本發(fā)明的范圍限制在這些實施例中的特殊實施方式中，它們僅是用來進(jìn)行舉例說明。
實施例1脂肪酸合酶抑制劑的反常作用淺藍(lán)菌素是一種FAS抑制劑，它增加MCF-7細(xì)胞中丙二酸單酰輔酶A的量(3)。丙二酸單酰輔酶A的大量增加，結(jié)果通過丙二酸單酰輔酶A對CPT-1的抑制作用，使淺藍(lán)菌素引起脂肪酸氧化的抑制(Thupari，et al.(2001)Biochem.Biophys.Res.Comm.，285217-223)。在前面已經(jīng)表明，C75處理MCF-7細(xì)胞，通過C75對脂肪酸合酶(FAS)的抑制，導(dǎo)致丙二酸單酰輔酶A5倍以上的增加(3)。C75對脂肪酸氧化的作用試驗如下。
由American Type Culture Collection獲得人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7。將1×106MCF-7細(xì)胞鋪在T-25瓶中，一式三份，并在37℃孵育過夜。然后按照所示加入物質(zhì)，從5mg/ml含原料的DMSO稀釋。2小時后，除去含藥物的培養(yǎng)基，用1.5ml下面的緩沖液將細(xì)胞預(yù)孵育30分鐘114mM NaCl、4.7mM KCl、1.2mM KH2PO4、1.2mM MgSO4、葡萄糖11mM。預(yù)孵育后，加入200μl分析緩沖液，它含有114mM NaCl、4.7mM KCl、1.2mM KH2PO4、1.2mM MgSO4、葡萄糖11mM、2.5mM與白蛋白結(jié)合的棕櫚酸鹽(含有10μCi[1-14C]棕櫚酸鹽)、0.8mM L-肉堿，并在37℃將細(xì)胞孵育2小時。孵育后，將400μl芐索氯銨加入中心孔中，以收集釋放的14CO2。即刻，將500μl 7％高氯酸加入細(xì)胞中，使反應(yīng)停止。然后在37℃下將此帶孔的燒瓶孵育2小時，隨后除去芐索氯銨，并計算14C。空白的制備是在用分析緩沖液孵育2小時前，將500μl 7％高氯酸加入這些細(xì)胞中而獲得。
用C75處理細(xì)胞2小時，然后測定脂肪酸氧化，與對照組相比，C75處理導(dǎo)致脂肪酸氧化156％的增加(見附圖1；p＝0.0012，雙尾(two-tailed)t檢驗，Prism 3.0)。乙莫克舍是一種已知的脂肪酸氧化抑制劑和CPT-1非競爭性抑制劑，相反，它將脂肪酸氧化降低至對照組的32％(p＝0.0006，雙尾t檢驗，Prism 3.0)。在劑量為5-20μg/ml情況下，C75對MCF-7細(xì)胞的處理重復(fù)引起脂肪酸氧化的增加。
反常的是，盡管丙二酸單酰輔酶A的增加與淺藍(lán)菌素引起的增加相似，但C75卻增加了MCF-7細(xì)胞中脂肪酸的氧化，而不是降低了脂肪酸的氧化。這種情況提示C75對肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶-1(CPT-1)具有直接作用。
實施例2 C75刺激人CPT-1的活性通過下面步驟測定MCF-7細(xì)胞中CPT-1活性在24孔平板上，將106MCF-7細(xì)胞平鋪在含10％胎牛血清的DMEM中，一式三份。在37℃孵育過夜后，除去此培養(yǎng)基，并用700μl分析培養(yǎng)基代替，分析培養(yǎng)基由下列組成50mM咪唑、70mM KCl、80mM蔗糖、1mM EGTA、2mM MgCl2、1mM DTT、1mM KCN、1mM ATP、0.1％脂肪酸游離牛血清白蛋白、70μM棕櫚酰-CoA、0.25μCi[甲基-14C]L-肉堿、40μg洋地黃皂甙，含或不含20μM丙二酸單酰輔酶A。在37℃孵育6分鐘后，通過加入500μl冰凍4M高氯酸而停止反應(yīng)。然后收獲細(xì)胞，以13,000×g離心5分鐘。用500μl冰凍2mM高氯酸沖洗粒狀沉淀，然后再次離心。將所得粒狀沉淀再懸浮在800μl dH2O中，并用150μl丁醇提取。通過液體閃爍計數(shù)法對此丁醇相計數(shù)，此丁醇相代表?；鈮A衍生物。
用10或20μg/mL的C75處理MCF-7細(xì)胞1小時，然后測定CPT-1活性。用C75和標(biāo)示的丙二酸單酰輔酶A濃度(“M”表示20uM的丙二酸單酰輔酶A)進(jìn)行此分析。單獨(dú)的丙二酸單酰輔酶A處理導(dǎo)致CPT-1活性46％的下降，這與前面實驗相似(見附圖2；p＝0.02，雙尾t檢驗，Prism 3.0)。丙二酸單酰輔酶A對CPT-1活性的抑制水平與MCF-7細(xì)胞中CPT-1的肝臟同工型的活性一致。對于CPT-1的肝臟同工型，丙二酸單酰輔酶A的Ki約為7μM，而對于CPT-1的肌肉同工型，其Ki為0.07μM。因此，MCF-7細(xì)胞主要表達(dá)CPT-1的肝臟同工型(這與免疫印染法一致)。
C75或C75和丙二酸單酰輔酶A處理細(xì)胞之間CPT-1活性的差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(附圖2)。因此，在C75存在情況下，丙二酸單酰輔酶A喪失了其對CPT-1的抑制作用；相反，不管丙二酸單酰輔酶A存在與否，C75都產(chǎn)生對CPT-1的刺激作用。因此，在C75存在情況下，丙二酸單酰輔酶A正常的抑制活性喪失了。丙二酸單酰輔酶A對CPT-1活性的抑制表明，C75及相關(guān)的化合物是激活了CPT-1活性，而不是CPT-2活性，丙二酸單酰輔酶A不能抑制CPT-2活性。
在隨后的實驗中(數(shù)據(jù)見附圖3)，在測定CPT-1活性前，不處理MCF-7細(xì)胞(左側(cè)柱圖)或者用20μg/mL C75處理MCF-7細(xì)胞1小時(中間和右側(cè)柱圖)。在測定CPT-1的6分鐘過程中，將C75從分析緩沖液中除去，并用緩沖液代替(中間柱圖)，或者加入20μM丙二酸單酰輔酶A(左側(cè)和右側(cè)柱圖)。在分析過程中，單獨(dú)丙二酸單酰輔酶A處理導(dǎo)致CPT-1活性大約70％抑制(左側(cè)柱圖)(p＝0.0045，雙尾t檢驗，Prism 3.0)。前面分析緩沖液中不含C75的C75處理導(dǎo)致CPT-1活性為對照組的158％(p＝0.028，雙尾t檢驗，Prism 3.0)，這與C75在分析緩沖液中時的結(jié)果相似(見上面實驗)。但是，當(dāng)從反應(yīng)緩沖液中除去C75，并用丙二酸單酰輔酶A代替時，C75的刺激活性就喪失了(右側(cè)柱圖)。因此，C75沒有與CPT-1存在可檢測的共價結(jié)合，而且C75可能是丙二酸單酰輔酶A的競爭性拮抗劑。這些數(shù)據(jù)也提示，C75在丙二酸單酰輔酶A的結(jié)合位點(diǎn)上與CPT-1相互作用。
實施例3有效的CPT-1刺激物的結(jié)構(gòu)按照美國專利5,981,575所述的方法制備僅在飽和碳“尾部”長度上不同的α-亞甲基-γ-丁內(nèi)酯類似物，此專利在此引用為參考文獻(xiàn)。C75具有一個8碳尾部，C12和C16的尾部分別具有12個和16個碳。在測定CPT-1活性前，用20μg/ml的C75和C75類似物處理細(xì)胞1小時。因為整個細(xì)胞對丙二酸單酰輔酶A是不滲透的，所以丙二酸單酰輔酶A僅被加入反應(yīng)緩沖液中。C75在20μg/ml下將CPT-1活性刺激到對照組的166％(見附圖4；p＝0.0092，雙尾t檢驗，Prism 3.0)。C12類似物將CPT-1活性刺激到對照組的186％(p＝0.0099，雙尾t檢驗，Prism 3.0)，而C16類似物將CPT-1活性刺激到對照組的138％(p＝0.055，雙尾t檢驗，Prism 3.0)。丙二酸單酰輔酶A是CPT-1的細(xì)胞內(nèi)競爭性抑制劑，它在20μM下將CPT-1活性降低到對照組的64％(p＝0.023，雙尾t檢驗，Prism 3.0)。對于CPT-1活化，最佳的碳鏈長度在6和16碳之間。
實施例4 CPT-1刺激引起的脂肪酸氧化的增加產(chǎn)生ATPC75處理后，脂肪酸氧化的增加導(dǎo)致MCF-7細(xì)胞中ATP升高。將1×105MCF-7細(xì)胞平鋪在96孔平板上。用C75或賦形劑處理細(xì)胞。2小時后，采用ATP Bioluminescence Kit CLS II(Roche)，按照廠商的方案應(yīng)用蟲熒光素酶測定法測定ATP。通過Perkin Elmer Wallac Victor21420發(fā)光計讀這些平板。10μg/ml和20μg/ml的C75處理均導(dǎo)致細(xì)胞ATP總量的明顯升高(見附圖5；p＝0.0001；與對照組相比p＜0.0001，雙尾t檢驗，Prism 3.0)。用C75孵育1小時后，也獲得相似的結(jié)果。因此，C75使脂肪酸氧化增加導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生能量的增加。
實施例5 C75刺激肌肉型CPT-1的活性為了將C75對脂肪酸代謝作用的研究超出癌細(xì)胞系，并擴(kuò)展到正常脂肪細(xì)胞上，在應(yīng)用MCF-7細(xì)胞類似的分析中使用分化的(非轉(zhuǎn)化的)鼠NIH 3T3-L1脂肪細(xì)胞。從American Type Culture Collection處獲得3T3-L1細(xì)胞，并在含高葡萄糖(4.5g/l)(Gibco 12100-046)的DMEM中，用10％胎牛血清和0.008g/L Biotin(Sigma B-4639)培養(yǎng)這些細(xì)胞。這些細(xì)胞融合后3天引發(fā)分化，同時用分化培養(yǎng)基取代標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基。分化培養(yǎng)基包括標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基，為獲得最終的濃度，其中加入了下列物質(zhì)甲基異丁基黃嘌呤(MIX)0.5mM、地塞米松(DEX)1μM和胰島素10μg/ml。48小時后，用后分化培養(yǎng)基取代分化培養(yǎng)基，后分化培養(yǎng)基包含上述濃度的胰島素，不含MIX和DEX。在7至10天中這些分化細(xì)胞可以用于實驗。
C75增強(qiáng)了分化為脂肪細(xì)胞的NIH 3T3-L1細(xì)胞中CPT-1活性和脂肪酸代謝。后分化1周，或用對照賦形劑，或用C75處理細(xì)胞2小時，所用劑量如下。按照實施例2、1和4中所述的方法測定CPT-1活性、脂肪酸氧化和細(xì)胞ATP總量。用C75處理3T3-L1脂肪細(xì)胞導(dǎo)致CPT-1活性的增加為對照組的377％(p＜0.0001，雙尾t檢驗，Prism 3.0)。劑量為20μg/ml或以上的C75引起CPT-1活性的增加，結(jié)果導(dǎo)致脂肪酸氧化的顯著增加(見附圖6；20μg/ml，p＝0.007；＜20μg/ml，p＜0.0001；雙尾t檢驗，Prism 3.0)。而且，在C75的劑量為20μg/ml或以上時，脂肪酸氧化的增加導(dǎo)致ATP水平的顯著增加(見附圖7；20μg/ml，p＝0.05；30μg/ml，p＜0.01；40μg/ml，p＜0.0001；雙尾t檢驗，Prism3.0)。C75導(dǎo)致的脂肪酸氧化的增加可能引起C75給藥時發(fā)現(xiàn)的體內(nèi)脂肪組織質(zhì)量明顯減少。
實施例6 CPT-1的體內(nèi)刺激將代謝轉(zhuǎn)變?yōu)橹舅嵫趸cC75對人和鼠CPT-1和脂肪酸代謝的作用相一致，C75顯著而快速的刺激體內(nèi)脂肪酸氧化。將小鼠保持在Oxymax量熱器中(OxymaxEqual Flow System，Columbus Instrument s，Columbus，OH)。使用間接量熱器同時測定至多4個小鼠氧的消耗和CO2的產(chǎn)生。在整個實驗過程中，每15分鐘記錄一次測定值。通過版本5.9的Oxymax軟件計算呼吸交換率(RER)。RER的定義是任意給定時間的CO2與O2的比率，不管平衡是否達(dá)到。保持小鼠可以自由獲得水和鼠糧。在對照小鼠中(附圖8A)，觀察RER晝間變化以顯示這些動物的進(jìn)食和休息周期。RER為1，與碳水化合物的氧化一致，而0.7顯示脂肪酸的氧化。用C75處理小鼠，并將它們保持在Oxymax量熱器中，這樣顯示呼吸交換率(RER)快速下降到大約0.7(附圖8B)。30mg/kg的C75處理破壞了對照小鼠晝間方式，表現(xiàn)為在約2小時內(nèi)RER的快速下降以完成脂肪酸氧化。類似的，以20mg/kg的C75處理，RER顯示出相似的下降速率，但沒有延長的作用(附圖8C)。重要的是，RER的下降速率與禁食動物中觀察到的(數(shù)據(jù)未顯示)相似。
盡管C75引起體內(nèi)丙二酸單酰輔酶A水平提高，但如RER的測定所示，C75處理導(dǎo)致脂肪酸氧化快速而顯著的增加。因此，盡管在體內(nèi)FAS抑制過程中產(chǎn)生高水平的丙二酸單酰輔酶A，通過使脂肪酸氧化發(fā)生，C75處理的動物可明顯減少脂肪質(zhì)量并可逆轉(zhuǎn)脂肪肝。
盡管為了清晰理解本發(fā)明，前面通過例證和實施例對本發(fā)明某些細(xì)節(jié)進(jìn)行了描述，但顯而易見，在附加的權(quán)利要求范圍內(nèi)可對本發(fā)明進(jìn)行某些改變和修改。對于醫(yī)療、免疫學(xué)、雜交瘤技術(shù)、藥理學(xué)和/或相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員，為實現(xiàn)本發(fā)明而對上述方式進(jìn)行的修改應(yīng)當(dāng)在下面權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
本發(fā)明書中提及的所有出版物和專利申請是用來表示本發(fā)明所屬領(lǐng)域中技術(shù)人員的技術(shù)水平。所有這些出版物和專利申請在此均同等地收錄為參考文獻(xiàn)，好象每個單個出版物或?qū)＠暾埦匾夂蛦为?dú)地指明被引用為參考文獻(xiàn)。
權(quán)利要求
1.引起體重減輕的方法，其包括給予一種刺激肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶-1(CPT-1)活性的物質(zhì)。
2.穩(wěn)定體重的方法，其包括以不明顯抑制FAS的量長期給予一種刺激CPT-1活性的物質(zhì)。
3.篩選引起體重減輕的物質(zhì)的方法，其包括確定候選的體重減輕物質(zhì)是否刺激CPT-1活性，以及篩選刺激CPT-1活性的物質(zhì)。
4.治療組合物，其包括一種刺激CPT-1活性的物質(zhì)和L-肉堿。
5.營養(yǎng)組合物，其包括營養(yǎng)上足夠量的脂肪、碳水化合物和氨基酸，所述組合物還包括L-肉堿和一種丙二酸單酰輔酶A抑制CPT-1的拮抗劑。
全文摘要
本發(fā)明提供引起體重減輕和保持最佳體重的方法和組合物，它們包括將一種刺激肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶－1(CPT－1)活性的物質(zhì)給予需要治療的患者，包括人類患者。這些方法不需要抑制脂肪酸的合成。特別是，本發(fā)明提供的方法是用于開發(fā)治療方法，此治療方法通過藥理學(xué)刺激CPT－1活性，選擇性地增加脂肪酸氧化，增加能量產(chǎn)生和減輕肥胖，同時保持瘦肉質(zhì)量。在一個優(yōu)選實施方式中，以足以增加脂肪酸氧化的量給予此物質(zhì)。在另一個優(yōu)選實施方式中，以足以對抗丙二酸單酰輔酶A對CPT－1的抑制的量給予此物質(zhì)。在再一個優(yōu)選實施方式中，以足以提高丙二酸單酰輔酶A水平的量給予此物質(zhì)。
文檔編號C12Q1/48GK1638758SQ03805014
公開日2005年7月13日 申請日期2003年2月10日 優(yōu)先權(quán)日2002年2月8日
發(fā)明者J·N·圖帕里, L·E·蘭德里, G·龍尼特, F·P·庫哈伊達(dá) 申請人:約翰斯霍普金斯大學(xué)醫(yī)學(xué)院