專(zhuān)利名稱(chēng)：抗人腱生蛋白單克隆抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗人腱生蛋白單克隆抗體，用于獲得它們的方法和材料，所述抗體在制備分別用于診斷和治療表達(dá)腱生蛋白的腫瘤的診斷工具和藥物中的用途，和適用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的包含所述抗體的材料。
背景技術(shù)：
腫瘤治療的特異性常常是確定治療成功的限制步驟。事實(shí)上，某些抗癌劑的毒性作用的發(fā)生和耐受性降低限制了其應(yīng)用和患者的生活質(zhì)量。
毒性的降低與對(duì)癌細(xì)胞的治療的選擇性直接關(guān)聯(lián)。單克隆抗體代表了特異性靶向腫瘤的理想方式，并且當(dāng)與抗生物素蛋白/生物素?cái)U(kuò)增系統(tǒng)聯(lián)合時(shí)，構(gòu)成極其強(qiáng)有力和選擇性的途徑在腫瘤部位遞送活性部分。
腱生蛋白是一種胞外基質(zhì)蛋白，其顯示出在胚胎發(fā)生期間的位點(diǎn)限制性表達(dá)，并且在傷口愈合和腫瘤發(fā)生期間可在成人組織中以及新形成的腫瘤血管中發(fā)現(xiàn)。腱生蛋白在正常成人組織中缺失，但在多種實(shí)體腫瘤的基質(zhì)中表達(dá)，如神經(jīng)膠質(zhì)瘤(Burdon等人，Cancer Res.432796-2805，1983)，乳腺(Chiquet-Ehrismann等人，1986)，肺癌(Natali等人，Intl.J.Cancer 5456-68，1989)，纖維肉瘤和鱗狀細(xì)胞癌(Ramos D.M.等人，Int.J.Cancer 75680-687，1998)。腱生蛋白見(jiàn)于神經(jīng)膠質(zhì)瘤中，但在正常腦組織中未發(fā)現(xiàn)。有關(guān)腱生蛋白的討論，可參見(jiàn)WO 92/04464，Wistar和相關(guān)的參考文獻(xiàn)。
基于EP 0 496 074的教導(dǎo)，G.Paganelli等人開(kāi)發(fā)了一種用于全身性和局部區(qū)域性治療腫瘤的三步預(yù)靶向方法(Cremonesi M.等人，Eur.J.Nucl.Med.26(2)110-120，1999；Paganelli G.等人，Eur.J.Nucl.Med.26(4)348-357，1999；Paganelli G.等人，Cancer Biother.&Radiopharm.16(3)227-235，2001)。
有關(guān)三步預(yù)靶向方法的其它參考文獻(xiàn)有WO 94/04702和US5,578,287。
三步預(yù)靶向治療是基于靜脈內(nèi)序貫施用生物素化抗腱生蛋白單克隆抗體、鏈霉抗生物素和90Y標(biāo)記的生物素，分別在鏈霉抗生物素和90Y標(biāo)記的生物素之前兩次追加施用抗生物素蛋白和生物素化白蛋白，以降低非特異性本底。Paganelli的三步預(yù)靶向方法的選擇性有賴(lài)于使用抗腱生蛋白單克隆抗體。與靶向腫瘤細(xì)胞抗原相比，靶向胞外基質(zhì)表現(xiàn)出不受腫瘤細(xì)胞抗原調(diào)變作用的影響，從而代表一種抗腫瘤治療的理想靶標(biāo)。
三步預(yù)靶向治療的給藥劑量和時(shí)間安排已固定以達(dá)到最佳的腫瘤/非腫瘤分布比。從包括在Paganelli的研究中的48名成膠質(zhì)細(xì)胞瘤(GBM)或多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤(AA)患者獲得的數(shù)據(jù)顯示其實(shí)質(zhì)上無(wú)毒性，除外對(duì)鏈霉抗生物素的一些過(guò)敏反應(yīng)(這可通過(guò)使用抗生物素蛋白來(lái)克服)，并且初步表明了治療效力。實(shí)際上，在治療結(jié)束后2個(gè)月，25％的患者顯示出腫瘤體積減小(完全反應(yīng)(腫瘤減小＞50％)＝6％)；部分反應(yīng)(腫瘤減小＜50％)＝11％；較小反應(yīng)(腫瘤減?。?5％)＝8％)，52％的患者未進(jìn)展，總體反應(yīng)率超過(guò)77％。在這些患者中有一些，其預(yù)期壽命小于6個(gè)月，而實(shí)際上治療反應(yīng)持續(xù)一年以上(Paganelli等，1999)。
生物素化抗腱生蛋白抗體的作用是將生物素定位在腫瘤部位并使其介導(dǎo)隨后的抗生物素蛋白和90-Y-生物素積聚。
抗腱生蛋白抗體公開(kāi)于例如Duke University的US 5,624,659，Rikagaku的JP 2219590和上面提及的WO 92/04464。
一種抗腱生蛋白公開(kāi)在Siri A.等，Nucl.Acid Res.19(3)525-531，1991；Balza E.等，F(xiàn)EBS 33239-43，1993，其用于治療目的的用途公開(kāi)在上面提及的Cremonesi M.等，Eur.J.Nucl.Med.26(2)110-120，1999；Paganelli G.等，Eur.J.Nucl.Med.26(4)348-357，1999；Paganelli G.等，Cancer Biother. & Radiopharm.16(3)227-235，2001。已知在本領(lǐng)域中用于生成所述抗腱生蛋白抗體的克隆是BC4。
本申請(qǐng)發(fā)現(xiàn)BC4克隆不適于工業(yè)開(kāi)發(fā)和調(diào)控目的，因?yàn)槠洚a(chǎn)生額外的非功能性輕鏈(很可能來(lái)源于親本骨髓瘤)，其表達(dá)水平在培養(yǎng)規(guī)模升級(jí)的壓力下增加，從而妨礙大規(guī)?？贵w純化。
發(fā)明概述現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，一種抗人腱生蛋白單克隆抗體解決了上述問(wèn)題，即可以產(chǎn)生一種缺乏非功能性輕鏈表達(dá)的單克隆抗體。
因此，該抗體是本發(fā)明的目的，本發(fā)明的目的還有獲得所述抗體的方法，其在治療中的應(yīng)用，特別是制備用于治療特征在于腱生蛋白表達(dá)的疾病如腫瘤的藥物。
發(fā)明描述本發(fā)明提供了抗體和抗體片段，其還可含有額外的標(biāo)志和診斷劑；包含這些抗體和抗體片段的組合物；以及含有它們的診斷和治療組合物；它們?cè)谥委熀驮\斷中的應(yīng)用和制備這些抗體和抗體片段的方法。
本發(fā)明還涉及編碼抗體和片段的DNA、含有DNA的載體、含有載體的宿主細(xì)胞、編碼SEQ ID NO1和2的蛋白的DNA編碼的蛋白；編碼蛋白和片段的DNA；特異性CDR和包含或含有CDR的蛋白。
根據(jù)本發(fā)明，所述抗體在一個(gè)實(shí)施方案中特征在于輕鏈和重鏈可變區(qū)序列分別是SEQ ID NO1和SEQ ID NO2。這些序列顯示于

圖10和11。為了簡(jiǎn)潔，本發(fā)明的優(yōu)選抗體將命名為ST2146。盡管本發(fā)明集中于ST2146作為本發(fā)明的一個(gè)示例，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，一旦給予本發(fā)明的公開(kāi)內(nèi)容，可以產(chǎn)生其它類(lèi)似的抗體和ST2146的抗體片段以及這些類(lèi)似抗體的抗體片段，并在本發(fā)明范圍之內(nèi)使用它們。這些類(lèi)似的抗體可由本領(lǐng)域技術(shù)人員通過(guò)合理數(shù)量的試驗(yàn)來(lái)產(chǎn)生。
本發(fā)明因此提供了特異性結(jié)合腱生蛋白的抗體或抗體片段或抗體嵌合體(例如小鼠-人嵌合體)或免疫球蛋白分子。本發(fā)明提供了抗體或抗體片段或抗體嵌合體或免疫球蛋白分子，其包含ST2146可變輕鏈CDR和/或ST2146可變重鏈CDR中的至少之一。本發(fā)明的抗體或抗體片段或抗體嵌合體或免疫球蛋白分子可以是抗體、Fv片段、Fab片段、F(ab)2片段、單鏈抗體或者多聚抗體。本發(fā)明的抗體或抗體片段或抗體嵌合體或免疫球蛋白分子可以是IgM、IgD、IgG、IgA或IgE分子。
本發(fā)明提供了抗體或抗體片段或抗體嵌合體或免疫球蛋白分子，其包含SEQ ID NO1、2、9、11、13、15、17或19中的至少之一。
本發(fā)明還提供了核酸序列，其編碼本發(fā)明的氨基酸序列，如SEQID NO1、2、9、11、13、15、17或19的序列。本發(fā)明因此提供了編碼本發(fā)明的抗體或抗體片段或抗體嵌合體或免疫球蛋白分子的DNA序列。這種DNA序列包括選自SEQ ID NO3、4、10、21、14、16、18或20的至少一種DNA序列或亞序列。
另一個(gè)實(shí)施方案涉及編碼本發(fā)明的抗體或抗體片段或抗體嵌合體或免疫球蛋白分子產(chǎn)物的純化的核酸分子。編碼本發(fā)明的免疫球蛋白產(chǎn)物的核酸分子可以使用常規(guī)技術(shù)制備。例如，可以使用寡核苷酸合成儀合成寡核苷酸并將其連接在一起形成功能性可讀框，其編碼本發(fā)明的免疫球蛋白產(chǎn)物。所述核酸分子，一旦合成，可以克隆到核酸載體中。核酸載體如質(zhì)粒、粘粒、噬菌粒、酵母質(zhì)粒、噬菌體載體、TI質(zhì)粒等在本領(lǐng)域中是已知的。載體可以是表達(dá)載體。表達(dá)載體和表達(dá)體系可從供應(yīng)商如Stratagene(La Jolla，Calif)購(gòu)得。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及包含本發(fā)明的核酸的細(xì)胞。細(xì)胞可以通過(guò)轉(zhuǎn)染制備。轉(zhuǎn)染方法是已知的，并且用于原核細(xì)胞和真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染的試劑盒可從商業(yè)來(lái)源(例如Stratagent，La Jolla，Calif)購(gòu)買(mǎi)。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及本發(fā)明的抗體、抗體片段、抗體嵌合體或免疫球蛋白產(chǎn)物用于檢測(cè)或診斷疾病的方法的用途，包括以下步驟使來(lái)自受試者的組織樣本與其在允許在所述抗體、抗體片段、抗體片段、抗體嵌合體或免疫球蛋白產(chǎn)物與腱生蛋白之間形成復(fù)合體的條件下相接觸，以及測(cè)定所述復(fù)合體的形成。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及本發(fā)明的抗體、抗體片段、抗體嵌合體或免疫球蛋白產(chǎn)物或者本發(fā)明的核酸用于制備治療表達(dá)腱生蛋白的疾病特別是腫瘤的藥物的用途。癌癥免疫治療方法是已知的。參見(jiàn)例如Old，L.J.Immunotherapy for Cancer，Scientific American，September 1996。
另一個(gè)實(shí)施方案涉及包含本發(fā)明的抗體、抗體片段、抗體嵌合體或免疫球蛋白產(chǎn)物的治療組合物。本發(fā)明的免疫球蛋白產(chǎn)物可以以包含所述抗體、抗體片段、抗體嵌合體或免疫球蛋白產(chǎn)物以及藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑的組合物的形式提供。該治療組合物可以用于治療哺乳動(dòng)物如人的疾病。所述藥物應(yīng)以本發(fā)明的抗體、抗體片段、抗體嵌合體或免疫球蛋白產(chǎn)物的治療有效量施用于哺乳動(dòng)物。
在其用作治療劑的用途中，本發(fā)明的抗體、抗體片段、抗體嵌合體或免疫球蛋白產(chǎn)物可以連接到一種活性劑上。連接可以通過(guò)共價(jià)鍵或通過(guò)抗體表位鍵。例如，抗體、抗體片段、抗體嵌合體或免疫球蛋白產(chǎn)物可以與二抗交聯(lián)，其中所述二抗可具有對(duì)所述活性劑的親和性。所述活性劑可以是細(xì)胞毒性劑。這里所用的術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞毒性劑”指抑制或阻止細(xì)胞功能和/或引起細(xì)胞破壞的物質(zhì)。該術(shù)語(yǔ)旨在包括放射性同位素(例如I，Y，Pr)、化療劑和毒素如細(xì)菌、真菌、植物或動(dòng)物來(lái)源的酶活性毒素或其片段。所述活性劑可以是化療劑。化療劑是用于治療癌癥的化合物?；焺┑膶?shí)例包括阿霉素、羥柔紅霉素、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷(“Ara-C”)、環(huán)磷酰胺、噻替哌、白消安、cytoxin、紫杉醇、氨甲蝶呤、順鉑、馬法蘭、長(zhǎng)春堿、博來(lái)霉素、依托泊甙、異環(huán)磷酰胺、絲裂霉素C、米托蒽醌、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春瑞賓、卡鉑、替尼泊甙、柔紅霉素、洋紅霉素、氨基蝶呤、放線(xiàn)菌素、絲裂霉素、esperamicin(參見(jiàn)U.S.Pat.No.4,675,187)、美法侖以及其它相關(guān)的氮芥類(lèi)。所述活性劑可以是細(xì)胞因子。術(shù)語(yǔ)細(xì)胞因子是對(duì)由一個(gè)細(xì)胞群釋放的作為細(xì)胞間介質(zhì)作用于另一個(gè)細(xì)胞的蛋白質(zhì)的通稱(chēng)。這種細(xì)胞因子的實(shí)例是淋巴因子、單核因子和傳統(tǒng)的多肽激素。包括在細(xì)胞因子中的有生長(zhǎng)激素如人生長(zhǎng)激素、N-甲硫氨酰人生長(zhǎng)激素和牛生長(zhǎng)激素；甲狀旁腺激素；甲狀腺素；胰島素；胰島素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素如卵泡刺激激素(FSH)、甲狀腺刺激激素(TSH)和促黃體生成素(LH)；肝生長(zhǎng)因子；成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子；催乳素；胎盤(pán)催乳素；腫瘤壞死因子；米勒抑制物質(zhì)；小鼠促性腺激素相關(guān)肽；抑制素；活化素；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；整聯(lián)蛋白；血小板生成素(TPO)；神經(jīng)生長(zhǎng)因子如NGF；血小板生長(zhǎng)因子；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)；胰島素樣生長(zhǎng)因子-I和-II；促紅細(xì)胞生成素(EPO)；骨誘導(dǎo)因子；干擾素如干擾素-α，-β和-γ；集落刺激因子(CSF)；粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞CSF(GM-CSF)；和粒細(xì)胞-CSF(G-CSF)；白介素(IL)如IL-1，IL-1α，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-11，IL-12；腫瘤壞死因子；和其它多肽因子包括LIF和試劑盒配體(KL)。這里所用的術(shù)語(yǔ)細(xì)胞因子包括來(lái)自天然來(lái)源或來(lái)自重組細(xì)胞培養(yǎng)的蛋白以及天然序列細(xì)胞因子的生物學(xué)活性等同物。
為了進(jìn)行診斷，可以將本發(fā)明的抗體、抗體片段、抗體嵌合體或免疫球蛋白產(chǎn)物連到標(biāo)記上，如連到可檢測(cè)的化合物或組合物上，其直接或間接綴合到所述抗體。所述標(biāo)記可以自身是可檢測(cè)的(例如放射性同位素標(biāo)記或熒光標(biāo)記)，或者在酶標(biāo)記的情況下，可以催化可檢測(cè)的底物化合物或組合物的化學(xué)改變。
本發(fā)明還預(yù)期生成所公開(kāi)的CDR的突變體，通過(guò)突變CDR序列中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸。已知適宜地定位于CDR中的單一氨基酸替換可足以升高親和性。研究人員已采用定點(diǎn)誘變使某些免疫球蛋白產(chǎn)物的親和性增加約10倍。這種通過(guò)突變CDR而增加或降低抗體親和性的方法是公知常識(shí)(參見(jiàn)例如Paul，W.E.，F(xiàn)undamentalImmunology，Raven Press，NY，N.Y.1993，第23章)。因此，對(duì)本發(fā)明CDR的氨基酸替換、缺失或添加以增加或降低結(jié)合親和性或特異性也在本發(fā)明預(yù)期之中。
本發(fā)明的另一方面是提供用于治療患有腫瘤的個(gè)體的藥物，所述腫瘤諸如囊性腦腫瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、乳腺腫瘤、肺癌、纖維肉瘤或鱗狀細(xì)胞癌，包括向患有腫瘤如囊性腦腫瘤(例如表達(dá)腱生蛋白的腫瘤)的人類(lèi)對(duì)象施用治療有效量的結(jié)合腱生蛋白的本發(fā)明的抗體、抗體片段、抗體嵌合體或免疫球蛋白產(chǎn)物。給藥步驟可以通過(guò)將抗體沉積在腫瘤腔中而實(shí)現(xiàn)。
在此還公開(kāi)了治療實(shí)體腫瘤的方法，其包括首先從患病人類(lèi)對(duì)象的實(shí)體組織器官(例如腦)除去實(shí)體腫瘤(例如表達(dá)腱生蛋白的腫瘤)；然后在去除所述實(shí)體腫瘤的位置在對(duì)象的器官中形成密閉的切除腔；然后向該對(duì)象施用治療有效量的抗腫瘤劑如本發(fā)明的抗體、抗體片段、抗體嵌合體或免疫球蛋白產(chǎn)物(例如結(jié)合腱生蛋白的抗體)，其對(duì)所述實(shí)體腫瘤的細(xì)胞具有選擇性毒性。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，給藥步驟通過(guò)將抗腫瘤劑沉積在切除腔中而實(shí)現(xiàn)。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是所述抗體的蛋白水解片段，其與人腱生蛋白C的EGF樣重復(fù)之中的抗原性表位結(jié)合。在本發(fā)明描述過(guò)程中，抗體片段旨在表示那些與人腱生蛋白C的EGF樣重復(fù)之中的抗原性表位結(jié)合的片段。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體及其片段可進(jìn)一步含有額外的標(biāo)志和/或診斷劑。所述標(biāo)志和/或診斷劑對(duì)于本發(fā)明所涉及領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是熟知的。
根據(jù)本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，所述抗體或其蛋白水解片段是生物素化的。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是雜交瘤細(xì)胞系，在此稱(chēng)為cST2146，其產(chǎn)生所述抗體。
所述雜交瘤細(xì)胞系已根據(jù)布達(dá)佩斯條約的規(guī)定于2002年1月29日保藏于Advanced Biotechnology Center，L.go Rosanna Benzi，1016132 GENOVA-Italy，指定的保藏號(hào)為N°PD02003。
本發(fā)明還包括編碼所述抗體或其片段的DNA、特異性CDR和包含或含有CDR的蛋白、含有所述DNA的載體和含有所述載體的宿主細(xì)胞。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是所述抗體的重組衍生物。具體而言，優(yōu)選的重組衍生物是其中鼠恒定區(qū)被人對(duì)應(yīng)物所替換的那些(Ferrer C.等，J.Biotechnol.5251-60，1996)或其中鼠恒定區(qū)被生物活性部分所替換的那些，所述生物活性部分如抗生物素蛋白家族的成員(Manuel L.等，J.Immunol.，1634421-4426，1999)，用于刺激定向腫瘤的免疫學(xué)效應(yīng)物的生長(zhǎng)因子(如G-CSF，GM-CSF)，或者其中鼠恒定區(qū)被藥理學(xué)活性部分所替換的那些，所述藥理學(xué)活性部分如毒素、超抗原、細(xì)胞因子或用于增強(qiáng)抗腫瘤治療效力的任何其它蛋白(Di Massimo A.M.等，British J.Cancer 75(6)822-828，1997；Parente D.等，AnticancerResearch 17(6A)4073-4074，1997)。
獲得所述重組衍生物的方法是本領(lǐng)域公知的。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是所述抗體的綴合衍生物。
具體而言，優(yōu)選的綴合衍生物是其中生物活性部分通過(guò)常規(guī)方法連接到所述抗體的那些。生物活性部分的實(shí)例是抗生物素蛋白家族的成員，用于刺激定向腫瘤的免疫學(xué)效應(yīng)物的生長(zhǎng)因子(如G-CSF，GM-CSF)，藥理學(xué)活性部分如毒素、超抗原、細(xì)胞因子或用于增強(qiáng)抗腫瘤治療效力的任何其它蛋白質(zhì)，抗腫瘤藥物，放射性同位素。
根據(jù)本發(fā)明，單克隆抗人腱生蛋白抗體或其片段的重組衍生物或綴合物也表示為“衍生物”。
在本發(fā)明一個(gè)最特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，除了抗體和片段之外，其衍生物也是生物素化的。
本發(fā)明的又一個(gè)目的是產(chǎn)生如上定義的抗體的雜交瘤細(xì)胞系。所述雜交瘤已根據(jù)布達(dá)佩斯條約的規(guī)定在2002年1月29日保藏于Advanced Biotechnology Center，保藏號(hào)為PD02003。
作為本發(fā)明的另一個(gè)目的，提供了用于制備所述單克隆抗體的方法，所述方法包括培養(yǎng)以上雜交瘤細(xì)胞系和分離所述抗體。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是所述抗人腱生蛋白單克隆抗體用于制備治療表達(dá)腱生蛋白的疾病特別是腫瘤的藥物的用途。
表達(dá)腱生蛋白的腫瘤的非限定性示例性列舉為神經(jīng)膠質(zhì)瘤、乳腺腫瘤、肺癌、纖維肉瘤和鱗狀細(xì)胞癌。
本發(fā)明的又一方面是用于腫瘤的放射免疫治療的藥物，其施用于患有表達(dá)腱生蛋白的腫瘤的對(duì)象，并包含所述單克隆抗體或其蛋白水解片段或衍生物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述單克隆抗體或其蛋白水解片段或衍生物是生物素化的，在更特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述藥物適于放射免疫治療，特別是用于實(shí)施三步預(yù)靶向方法，如現(xiàn)有技術(shù)中所描述的，例如EP 0 496 074，European Journal of NuclearMedicine Vol.26，No 4；April 1999；348-357和US 5,968,405。在這后一方面，本發(fā)明的藥物應(yīng)為試劑盒的形式，所述試劑盒由5個(gè)小瓶組成，其第一個(gè)小瓶裝有生物素化抗體或其片段或衍生物；第二個(gè)小瓶裝有抗生物素蛋白；第三個(gè)小瓶裝有生物素化白蛋白；第四個(gè)小瓶裝有鏈霉抗生物素；第五個(gè)小瓶裝有放射性標(biāo)記的生物素或生物素衍生物。這一種類(lèi)的試劑盒在European Journal of Nuclear Medicine Vol.26，No 4；April 1999；348-357中提供?？股锼氐鞍装股锼氐鞍?、鏈霉抗生物素、PEG-抗生物素蛋白或PEG-鏈霉抗生物素、二-或多-抗生物素蛋白或者二-或多-鏈霉抗生物素。放射性標(biāo)記的生物素含有放射性核素，如在EP 0 496 074中公開(kāi)的，優(yōu)選90Y。生物素衍生物公開(kāi)于例如WO 02/066075。這一種類(lèi)的試劑盒公開(kāi)于EuropeanJournal of Nuclear Medicine Vol.26，No 4；April 1999；348-357。優(yōu)選所述小瓶適于人類(lèi)注射。
本發(fā)明抗體的重組衍生物以及其綴合物也可便利地用于腫瘤治療。盡管本發(fā)明的抗體以及其片段、衍生物和綴合物合適地用于治療腱生蛋白相關(guān)腫瘤，特別是通過(guò)免疫治療，放射免疫治療是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案。
包含生物素化形式的抗體或其片段的具體容器，優(yōu)選為適于注射的小瓶的形式，是本發(fā)明的另一個(gè)目的。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，在治療試劑盒中，生物素化抗體與優(yōu)先針對(duì)A-D片段的其它腱生蛋白特異性抗體相組合?；蛘?，生物素化抗體與其它腫瘤特異性抗體相組合。有關(guān)所述種類(lèi)的試劑盒的一般教導(dǎo)在EP 0 496 074，European Journal of Nuclear Medicine Vol.26，No 4；April 1999；348-357和US 5,968,405中提供。
具體而言，本發(fā)明還包括一種容器，其任選包括多個(gè)隔室，其中包含生物素化抗體或其片段或衍生物、緩沖液和適用于三步預(yù)靶向方法的治療試劑盒中的試劑。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是所述單克隆抗體或其片段或重組衍生物或綴合物或其生物素化衍生物用于制備診斷工具的用途，所述診斷工具用于檢測(cè)表達(dá)腱生蛋白的疾病，特別是用于腫瘤的體內(nèi)顯像。
在本發(fā)明一個(gè)特定實(shí)施方案中，所述單克隆抗體或其片段或衍生物與第二種腱生蛋白特異性抗體聯(lián)合用于三明治測(cè)定中，用于制備診斷試劑盒，以測(cè)定循環(huán)腱生蛋白的水平。三明治測(cè)定是例如一種ELISA體外測(cè)定，其條件為所述第二種抗體與腱生蛋白的第二種抗原性表位結(jié)合，所述體外ELISA測(cè)定用于測(cè)定循環(huán)腱生蛋白的水平。
包含所述抗體或其片段或衍生物的診斷或治療試劑盒是本發(fā)明的又一目的。
本發(fā)明的這些目的和其它目的在以下描述中還通過(guò)實(shí)施例和附圖的方式進(jìn)行了具體公開(kāi)。
附圖簡(jiǎn)述圖1顯示了人腱生蛋白-C、相關(guān)的重組抗原性片段和試劑、以及用于生成BC-4樣抗體的策略的圖解。
圖2顯示了通過(guò)用唾液酸酶消化抗體，對(duì)ST2146重鏈可變性的糖苷性質(zhì)的證實(shí)。
圖3顯示了ST2146相對(duì)于BC4的總體同質(zhì)性。
圖4顯示了與BC4的抗原性表位相比，ST2146結(jié)合人腱生蛋白表位的蛋白質(zhì)印跡(泳道D空白)。
圖5顯示了競(jìng)爭(zhēng)性ELISA，其中ST2146與BC4強(qiáng)烈競(jìng)爭(zhēng)與人腱生蛋白的結(jié)合，而ST2077顯示出僅僅部分競(jìng)爭(zhēng)。ST2077是在生成ST2146的操作中獲得的腱生蛋白特異性單克隆抗體。ST2077顯示出類(lèi)似ST2146的特異性(人腱生蛋白的EGF樣重復(fù)區(qū))但其針對(duì)的抗原性表位僅僅部分干擾BC4/ST2146表位。
圖6顯示了與BC4的完全活性峰相比，由ELISA確定的ST2146的免疫反應(yīng)性。
圖7顯示了ST2146的生物分布研究的方案。
圖8顯示了ST2146的生物分布，與BC4相比(biot＝生物素化的；IR＝免疫反應(yīng)性，表示為在ELISA中獲得1.0O.D.的抗體量)。
圖9顯示了ST2146的腫瘤/非腫瘤比，與BC4相比。
圖10顯示了ST2146可變輕鏈(VL)的序列(SEQ ID NO1(全長(zhǎng)氨基酸)，3(編碼氨基酸的DNA)，9(CDR1的輕鏈氨基酸)，10(CDR1的輕鏈DNA)，11(CDR2的輕鏈氨基酸)，12(CDR2的輕鏈DNA)，13(CDR3的輕鏈氨基酸)，14(CDR3的輕鏈DNA)和21(全長(zhǎng)DNA))。
圖11顯示了ST2146可變重鏈(VH)的序列(SEQ ID NO2(全長(zhǎng)氨基酸)，4(編碼氨基酸的DNA)，15(CDR1的重鏈氨基酸)，16(CDR1的重鏈DNA)，17(CDR2的重鏈氨基酸)，18(CDR2的重鏈DNA)，19(CDR3的重鏈氨基酸)，和20(CDR3的重鏈DNA)以及22(全長(zhǎng)DNA))。
發(fā)明詳述ST2146獲自相應(yīng)的雜交瘤細(xì)胞克隆cST2146，在以下實(shí)施例中詳細(xì)給出。
就本發(fā)明的工業(yè)方面而言，在此公開(kāi)的抗體應(yīng)適宜地配制成藥物組合物或診斷試劑盒，正如本技術(shù)領(lǐng)域中通常所作的那樣。
藥物組合物在本領(lǐng)域中是常規(guī)的，并可由本領(lǐng)域技術(shù)人員基于公知常識(shí)而制備。藥物組合物的實(shí)例在本發(fā)明中提及的參考文獻(xiàn)中給出。這同樣適用于診斷試劑盒。特別優(yōu)選的是用于腫瘤放射免疫治療的試劑盒，如在上面提及的Paganelli等的論文和EP 0 496 074中所公開(kāi)的。
包含所述抗體和/或其片段和/或重組衍生物和/或綴合物與至少一種藥學(xué)上可接受的賦形劑和/或載體相混合的藥物組合物包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
以下實(shí)施例進(jìn)一步例示本發(fā)明。
實(shí)施例1為了生成具有BC4的特異性但不表達(dá)非功能性輕鏈的新雜交瘤細(xì)胞克隆，用pTn28大腸桿菌噬菌體溶菌產(chǎn)物免疫Balb/c小鼠。pTn28是λgt11重組克隆，編碼人腱生蛋白的EGF樣重復(fù)的一個(gè)片段，先前顯示出其包含BC4表位(Balza E.等，1993)。人腱生蛋白-C、相關(guān)的重組抗原性片段和試劑、以及用于生成BC-4樣抗體的策略的圖解在圖1中給出。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法將pTn28免疫的脾細(xì)胞與Sp2/0Ag14非生產(chǎn)(non producing)骨髓瘤細(xì)胞融合(Cianfriglia M.等，MethodsEnzymol.121193210，1986)，并通過(guò)ELISA對(duì)SK-MEL-28(人黑素瘤細(xì)胞系)純化腱生蛋白篩選雜交瘤群體。腱生蛋白特異性雜交瘤通過(guò)在含F(xiàn)CS的培養(yǎng)基(2次)和無(wú)蛋白的培養(yǎng)基(3次)(無(wú)動(dòng)物衍生組分的培養(yǎng)基HyClone，HyQRPerbio)中有限稀釋而克隆。最終選擇cST2146/D3d/F6e亞克隆，產(chǎn)生cST2146 Master Cell Bank(MCB)和Working Cell Bank(WCB)。
ST2146參照材料的產(chǎn)生是通過(guò)將cST2146雜交瘤細(xì)胞在2L生物反應(yīng)器中培養(yǎng)而完成的，并通過(guò)FACS分析和通過(guò)有限稀釋證實(shí)cST2146 Post Production Cell Bank(PPCB)的穩(wěn)定性。
ST2146是IgG2b/k同種型的小鼠免疫球蛋白。
證實(shí)ST2146的輕鏈組成是同質(zhì)的，如還原性SDS-PAGE分析所顯示，其還顯示出重鏈的某種程度的異質(zhì)性。這一觀(guān)察結(jié)果與先前對(duì)鼠IgG2b同種型所報(bào)道的O-連接的糖基化的可變性一致(Kim H.等，J.Biol.Chem.269(16)12345-12350，1994)。在獲自含F(xiàn)CS的培養(yǎng)基或無(wú)蛋白培養(yǎng)基的三個(gè)不同批次中觀(guān)察到ST2146重鏈條帶模式的一致性。對(duì)ST2146重鏈可變性的糖苷性質(zhì)的證實(shí)是通過(guò)用唾液酸酶消化抗體。用HiTrap脫鹽柱(Amersham-Pharmacia)對(duì)ST2146進(jìn)行緩沖液交換至含150mM NaCl、pH6.4的10mM磷酸鈉緩沖液。將Mab在centricons 100,000 MWCO(Millipore)上濃縮至大約1mg/ml的終濃度，并用1.5U/ml唾液酸酶(Sigma)于37℃消化24消失。將樣本在12％聚丙烯酰胺凝膠板上進(jìn)行電泳。凝膠染色通過(guò)考馬斯亮藍(lán)進(jìn)行。如預(yù)期的那樣，該消化導(dǎo)致較高分子量條帶的消除(圖2)。ST2146的總體同質(zhì)性還通過(guò)羥磷灰石色譜證實(shí)，其顯示ST2146的單一峰，相對(duì)于對(duì)BC4所觀(guān)察到的3個(gè)峰(圖3，其中對(duì)于BC4，完全功能對(duì)應(yīng)于峰3)。
ST2146結(jié)合人腱生蛋白的表位與BC4的抗原性表位嚴(yán)格相關(guān)(如果不完全相同)，如蛋白質(zhì)印跡(圖4)和競(jìng)爭(zhēng)性ELISA(圖5)所顯示。在圖5中，生物素化BC4與增加濃度的BC4、ST2077或ST2146(作為競(jìng)爭(zhēng)劑)混合，并鋪在包被腱生蛋白的平板上。在加入HRP-鏈霉抗生物素和相關(guān)的顯色底物后測(cè)量結(jié)合。ST2077是識(shí)別在EGF樣重復(fù)之中的腱生蛋白表位的抗體，該表位與BC4表位部分共享。
通過(guò)ELISA評(píng)價(jià)ST2146的免疫反應(yīng)性，與BC4的完全活性峰(峰3)比較。圖6顯示在最佳抗原濃度ELISA中獲得1.0OD的ST2146的量(圖A)比BC4的完全反應(yīng)性峰3的量小大約30倍，比BC4小大約100倍。這一差異在如圖B中抗原限制的條件下顯著擴(kuò)大，其中僅僅ST2146維持好的免疫反應(yīng)性。
ST2146的親和性通過(guò)BIAcore評(píng)價(jià)。所得的ST2146的KD為1.4×10-9(Ka 3.0×105；kd 4.1×10-4)。將ST2146親和性數(shù)據(jù)與BC4比較，BC4顯示出KD為4.9×10-9(Ka 1.9×105；kd 9.3×10-4)。
經(jīng)生物素化后維持免疫反應(yīng)性是待用于預(yù)靶向的單克隆抗體的一個(gè)基本特征。為了評(píng)價(jià)生物素化ST2146的行為，研究了不同的抗體生物素比，并將通過(guò)ELISA測(cè)定的生物素化抗體的免疫反應(yīng)性與BC4和ST1897比較，后者是親和性較低的腱生蛋白特異性單克隆抗體。表1中的結(jié)果顯示，低生物素化(2-3生物素/摩爾)輕微影響單克隆抗體的免疫反應(yīng)性，與其親和性無(wú)關(guān)。更高的生物素化，高達(dá)20生物素/摩爾，與免疫反應(yīng)性下降相關(guān)。抗體親和性越低，這一下降越高。
表1對(duì)ST2146的生物素化研究
％免疫反應(yīng)性是2-3次獨(dú)立試驗(yàn)的平均值+/-標(biāo)準(zhǔn)偏差。
生物素化ST2146的親和性通過(guò)BIAcore測(cè)定，并且無(wú)論連接的生物素的數(shù)目為何基本上維持。
對(duì)不同腫瘤(乳腺、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、結(jié)腸)的免疫組化分析顯示BC4和ST2146類(lèi)似的選擇性。
研究生物素化ST2146的藥理學(xué)行為以確立其定位到腫瘤塊的能力。根據(jù)圖7中的方案，在移植表達(dá)腱生蛋白的人腫瘤的裸鼠中進(jìn)行125I-標(biāo)記的ST2146和BC4生物素化抗體的生物分布研究。小鼠皮下接受在0.1ml無(wú)菌溶液中的4×106HT29人結(jié)腸癌細(xì)胞。15天后，當(dāng)腫瘤質(zhì)量約100mg時(shí)，每組5只小鼠的試驗(yàn)組靜脈內(nèi)接受125I-標(biāo)記的BC4、ST2146或正常小鼠免疫球蛋白(nMIg)，劑量為在0.1ml無(wú)菌PBS中的10、2、0.5或0.1μg/小鼠。所有抗體都是生物素化的(7-10生物素/摩爾)，ST2146和BC4生物素化Mab均顯示出約80％的免疫反應(yīng)性。每只動(dòng)物接受以下量的CPM
圖8中的結(jié)果顯示，BC4和ST2146均特異性定位到腫瘤塊。兩種抗體在腫瘤部位的量(表示為％注射劑量/克組織)是劑量依賴(lài)性的，趨勢(shì)是ST2146積聚更高。而且，與BC4相比，ST2146顯示更好的腫瘤/非腫瘤比，如圖9所示。
如M.Sassano等，Nucl.Ac.Res.(1994)22，1768-1769所述，使用退火至抗體恒定區(qū)的一對(duì)引物(5’-TGTCAAGAGCTTCAACAGGA)(SEQ ID NO5)，5’-AAGATGGATACAGTTGGTGC(SEQ IDNO6))，從環(huán)化cDNA擴(kuò)增κ輕鏈可變區(qū)。
如M.Sassano等，Nucl.Ac.Res.(1994)22，1768-1769所述，使用退火至抗體恒定區(qū)的下列引物寡小鼠γ2bCH1GTCACTGACTCAGGGAAGTAGCC(SEQ ID NO7)；寡小鼠γ2bCH3 GCAACGTGAGACACGAGGGTCTG(SEQ ID NO8)，從環(huán)化cDNA擴(kuò)增γ重鏈可變區(qū)。
使用以下條件進(jìn)行PCR94℃ 1分鐘，60℃ 1.5分鐘，72℃ 2分鐘，30個(gè)循環(huán)。
將擴(kuò)增的片段直接克隆到SmaI切割的質(zhì)粒pUC18中。對(duì)含κ輕鏈的2個(gè)克隆和含γ重鏈可變區(qū)的4個(gè)克隆進(jìn)行測(cè)序。
測(cè)序在MWG Biotech，Germany完成。對(duì)兩條鏈均進(jìn)行測(cè)序。沒(méi)有發(fā)現(xiàn)模糊不定之處。
圖10顯示ST2146可變輕鏈(VL)的序列。
圖11顯示ST2146可變重鏈(VH)的序列。
ST2146與BC4的總體對(duì)比表征顯示，ST2146具有下列特征-就表位特異性而言，是BC4樣單克隆抗體；-就重鏈和輕鏈組成而言，是同質(zhì)的；-就重鏈糖基化而言，是異質(zhì)的；-就免疫反應(yīng)性而言，優(yōu)于BC4，如基于BC4異質(zhì)性所預(yù)期的；-就親和性而言，優(yōu)于BC4約3倍；-就經(jīng)生物素化后維持免疫反應(yīng)性而言，優(yōu)于BC4；-對(duì)于在免疫組化中的選擇性，類(lèi)似于BC4；-就腫瘤靶向而言，優(yōu)于BC4。
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<223>人工序列的描述合成的ST2146輕鏈可變區(qū)蛋白質(zhì)序列<400>1Met Arg Cys Leu Ala Glu Phe Leu Gly Leu Leu Val Leu Trp Ile Pro1 5 10 15Gly Ala Ile Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Pro Ser Val Pro20 25 30Val Thr Pro Gly Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser35 40 45Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg50 55 60Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala65 70 75 80Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe85 90 95Thr Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr100 105 110Cys Met Gln His Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys115 120 125Leu Glu Leu Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile130 135 140
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<223>人工序列的描述合成的ST2146重鏈可變區(qū)CDR3肽序列<400>19Gly Gly Gly Ser Ile Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr1 5 10<210>20<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
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權(quán)利要求
1.抗人腱生蛋白單克隆抗體，其輕鏈和重鏈可變區(qū)序列分別為SEQ ID NO1和SEQ ID NO2，以及結(jié)合在人腱生蛋白C的EGF樣重復(fù)之中的抗原性表位的其蛋白水解片段。
2.權(quán)利要求1的抗體及其片段，進(jìn)一步含有額外的標(biāo)志和/或診斷劑。
3.權(quán)利要求1或2的抗體及其片段的重組衍生物。
4.權(quán)利要求3的重組衍生物，其中鼠恒定區(qū)被人對(duì)應(yīng)物或者生物學(xué)或藥理學(xué)活性部分所替換。
5.權(quán)利要求4的重組衍生物，其中所述生物學(xué)活性部分選自抗生物素蛋白家族的成員、用于刺激定向腫瘤的免疫學(xué)效應(yīng)物的生長(zhǎng)因子。
6.權(quán)利要求4的重組衍生物，其中所述藥理學(xué)活性部分選自毒素、超抗原、細(xì)胞因子或用于增強(qiáng)抗腫瘤治療效力的任何其它蛋白質(zhì)。
7.權(quán)利要求1或2的抗體及其片段的綴合衍生物。
8.權(quán)利要求7的綴合衍生物，其中生物學(xué)或藥理學(xué)活性部分連接到所述抗體或其片段。
9.權(quán)利要求8的綴合衍生物，其中所述生物學(xué)活性部分選自用于刺激定向腫瘤的免疫學(xué)效應(yīng)物的生長(zhǎng)因子，或者所述藥理學(xué)活性部分選自毒素、超抗原、細(xì)胞因子或用于增強(qiáng)抗腫瘤治療效力的任何其它蛋白質(zhì)、抗腫瘤藥物、放射性同位素。
10.特異性結(jié)合腱生蛋白的免疫球蛋白分子。
11.權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)的抗體或其片段或重組衍生物或綴合物或免疫球蛋白的生物素化衍生物。
12.產(chǎn)生權(quán)利要求1的抗體的雜交瘤細(xì)胞系，根據(jù)布達(dá)佩斯條約的規(guī)定在2002年1月29日保藏于Advanced Biotechnology Center，保藏號(hào)為PD02003。
13.制備權(quán)利要求1的抗體的方法，包括培養(yǎng)權(quán)利要求12的雜交瘤和分離所述抗體。
14.權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)的抗體或其片段或重組衍生物或綴合物或免疫球蛋白分子或權(quán)利要求11的生物素化衍生物用于診斷工具以檢測(cè)表達(dá)腱生蛋白的疾病的用途。
15.權(quán)利要求14的用途，其中所述疾病是腫瘤。
16.權(quán)利要求15的用途，其中所述腫瘤選自神經(jīng)膠質(zhì)瘤、乳腺腫瘤、肺癌、纖維肉瘤和鱗狀細(xì)胞癌。
17.權(quán)利要求14-16任一項(xiàng)的用途，其中所述診斷工具用于體內(nèi)顯像技術(shù)中。
18.權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)的抗體或其片段或重組衍生物或綴合物或權(quán)利要求11的生物素化衍生物用于制備治療表達(dá)腱生蛋白的疾病的藥物的用途。
19.權(quán)利要求18的用途，其中所述疾病是腫瘤。
20.權(quán)利要求19的用途，其中所述腫瘤選自囊性腦腫瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、乳腺腫瘤、肺癌、纖維肉瘤和鱗狀細(xì)胞癌。
21.權(quán)利要求18-20任一項(xiàng)的用途，其中所述藥物為適于實(shí)施三步預(yù)靶向方法的試劑盒的形式。
22.治療試劑盒，其由5個(gè)小瓶組成，其第一個(gè)小瓶裝有權(quán)利要求11的生物素化衍生物；第二個(gè)小瓶裝有抗生物素蛋白；第三個(gè)小瓶裝有生物素化白蛋白；第四個(gè)小瓶裝有鏈霉抗生物素；第五個(gè)小瓶裝有放射性標(biāo)記的生物素或生物素衍生物。
23.權(quán)利要求22的治療試劑盒，其中所述小瓶適于人類(lèi)注射。
24.編碼權(quán)利要求1的抗體或其片段或者權(quán)利要求3或4的重組衍生物或者權(quán)利要求10的免疫球蛋白的DNA。
25.特異性CDR和包含或含有CDR的蛋白質(zhì)。
26.含有權(quán)利要求24的DNA的載體。
27.含有權(quán)利要求26的載體的宿主細(xì)胞。
28.權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)的抗體或其片段或重組衍生物或綴合物與第二種腱生蛋白特異性抗體在三明治測(cè)定中相聯(lián)合用于制備測(cè)定循環(huán)腱生蛋白水平的診斷試劑盒的用途。
29.診斷試劑盒，包含權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)的抗體或其片段或重組衍生物或綴合物或免疫球蛋白。
30.容器，任選包括多個(gè)隔室，包含權(quán)利要求11的生物素化抗體或其片段或免疫球蛋白，適用于三步預(yù)靶向方法用治療試劑盒中的緩沖液和試劑。
31.權(quán)利要求30的容器，還包含優(yōu)先針對(duì)A-D片段的單獨(dú)的腱生蛋白特異性抗體。
32.權(quán)利要求30的容器，還包含單獨(dú)的腫瘤特異性抗體。
33.權(quán)利要求1或2的抗體與第二種腱生蛋白特異性抗體相聯(lián)合在三明治ELISA體外測(cè)定中，條件為所述第二種抗體與腱生蛋白的第二種抗原性表位結(jié)合，所述體外ELISA測(cè)定用于測(cè)定循環(huán)腱生蛋白的水平。
34.藥物組合物，包含權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)的抗體和/或其片段和/或重組衍生物和/或綴合物和/或免疫球蛋白，與至少一種藥學(xué)上可接受的賦形劑和/或載體相混合。
全文摘要
本發(fā)明描述了一種新的抗人腱生蛋白ST2146單克隆抗體，其被賦予與天然抗原的高親和性和高腫瘤選擇性。cST2146雜交瘤在高密度培養(yǎng)條件下穩(wěn)定產(chǎn)生所述抗體，并適于工業(yè)開(kāi)發(fā)基于ST2146的產(chǎn)品。ST2146表現(xiàn)出治療和診斷應(yīng)用均可開(kāi)發(fā)利用的特性。
文檔編號(hào)C12P21/08GK1639192SQ03804634
公開(kāi)日2005年7月13日 申請(qǐng)日期2003年2月20日 優(yōu)先權(quán)日2002年2月26日
發(fā)明者R·德圣緹斯, A·M·安納斯塔斯 申請(qǐng)人:希格馬托制藥工業(yè)公司