專利名稱：亞硫酸氫鹽處理的改進(jìn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請(qǐng)涉及一種通過亞硫酸氫鹽反應(yīng)來確定核酸即甲基化或非甲基化的胞嘧啶中甲基化位點(diǎn)的方法，其中在亞硫酸氫鹽反應(yīng)的去氨基和/或去磺化步驟中，核酸被與固相結(jié)合。固相優(yōu)選地為含有玻璃或硅石的材料，更優(yōu)選的是玻璃棉(glass fleece)、玻璃膜或者磁性玻璃顆粒。更進(jìn)一步地，公開了固相在亞硫酸氫鹽反應(yīng)的去氨基和/或去磺化步驟中用于結(jié)合核酸的用途，以及一種含有亞硫酸氫鹽試劑和固相的試劑盒。
背景技術(shù)：
基因僅構(gòu)成了全部哺乳動(dòng)物基因組的一小部分，且在非編碼脫氧核糖核酸(DNA)的大量存在下其表達(dá)的精確調(diào)控對(duì)它們的調(diào)控而言表現(xiàn)為一個(gè)重要的問題。非編碼的DNA，包括內(nèi)含子、重復(fù)元件以及潛在的活性可易位的元件需要有效的機(jī)制來使之長(zhǎng)期的沉默。為了有助于這種沉默，哺乳動(dòng)物通過胞嘧啶甲基化給予的可能性來提供一種可遺傳的改變DNA-蛋白間相互作用的機(jī)制。DNA的甲基化是哺乳動(dòng)物發(fā)育所必需的，且在老化和癌變中發(fā)揮潛在的作用。甲基化在基因表達(dá)中的涉入以及作為后生修飾標(biāo)記基因已被完全的確定。在哺乳動(dòng)物中，甲基化僅發(fā)生在胞嘧啶殘基上，而且更特定的僅發(fā)生在與鳥嘌呤相鄰的胞嘧啶上，即CG序列。DNA甲基化位點(diǎn)的檢測(cè)和圖譜定位是了解顯示給出的序列是否是甲基化的分子信號(hào)的必要步驟。
目前，F(xiàn)ormmer M，等，Proc Natl Acad Sci USA 89(1992)1827-31描述的通過所謂亞硫酸氫鹽法檢測(cè)5-甲基-胞嘧啶已被完成。對(duì)5-甲基胞嘧啶作圖的亞硫酸氫鹽方法是利用亞硫酸氫鈉和胞嘧啶的反應(yīng)的作用，而不與或者僅僅是較少的與5-甲基-胞嘧啶反應(yīng)。胞嘧啶與亞硫酸氫鹽反應(yīng)產(chǎn)生磺化的胞嘧啶反應(yīng)中間體，它易于去氨基而產(chǎn)生磺化的尿嘧啶，后者在堿性條件下能被去磺化而生成尿嘧啶。眾所周知，尿嘧啶具有胸腺嘧啶的堿基配對(duì)行為，有別于胞嘧啶的離析物，而5-甲基胞嘧啶具有胞嘧啶的堿基配對(duì)行為。這就可能通過例如亞硫酸氫鹽基因組測(cè)序(Grigg，G.和Clark，S，Bioessays 16(1994)431-6；Grigg，G..W，DNA Seq 6(1996)189-98)或者US5786146公開的甲基化特異性PCR(MSP)區(qū)別甲基化或非甲基化的胞嘧啶。
各種不同的文獻(xiàn)描述了關(guān)于亞硫酸氫鹽反應(yīng)的特殊方面(Benyajati，C，等，Nucleic Acids Res 8(1980)5649-67)，它們總體上研究了亞硫酸氫鹽修飾5-甲基-脫氧胞嘧啶和脫氧胞嘧啶(Olek，A，等，Nucleic Acids Res 24(1996)5064-6)，公開了一種用于亞硫酸氫鹽堿基測(cè)序的方法，由此在瓊脂糖珠包埋的材料上進(jìn)行亞硫酸氫鹽處理和后續(xù)的PCR步驟。如Clark，S.J，等，NucleicAcids Res 22(1994)2990-7公開的方法中，樣品在去氨基后脫鹽。
Raizis，A.M，等，在Anal Biochem 226(1995)161-6公開了模板降解最小化的5-甲基胞嘧啶圖譜定位的亞硫酸氫鹽方法。他們研究了pH、溫度和反應(yīng)時(shí)間的影響。Grunau，C，等，Nucleic Acids Res 29(2001)E65-5或Wamecke，P.M，等，Methods 27(2002)101-7也做了同樣的研究。WO01/98528或Paulin，R，等，Nucleic Acids Res26(1998)5009-10中公開了在亞硫酸氫鹽混合物中的其它不同的成分。WO02/31186公開了在亞硫酸氫鹽處理和PCR后的其它亞硫酸氫鹽步驟。Komiyama，M.和Oshima，S，Tetrahedron Letters 35(1994)8185-8188研究了亞硫酸氫鹽誘導(dǎo)的在寡聚脫氧核苷酸中的胞嘧啶的去氨基的催化作用。
用于進(jìn)行亞硫酸氫鹽處理的試劑盒是可從Intergen商業(yè)獲得的，由Serologicals Corporation，Norcross，GA，USA，提供，例如CpGenomeTM DNA修飾試劑盒。
Feil，R，等，Nucleic Acids Res 22(1994)695-6公開了亞硫酸氫鹽基因組測(cè)序的變換方法，其中基因組DNA在去氨基后是結(jié)合在玻璃珠上的，然后洗滌。洗脫后核酸再去磺化。已知核酸能夠利用其與玻璃表面的結(jié)合特性，例如被硅膠或硅藻土吸收，在離液序列高的條件下被磁性玻璃顆粒(MGPs)或有機(jī)硅烷顆粒吸收而被分離。利用固相的提取通常包含步驟在允許目的物質(zhì)與固相結(jié)合的條件下，將核酸溶液加到固相上，從結(jié)合固相的核酸上除去殘液以及隨后將核酸從固相上釋放到洗出液中(有時(shí)稱作洗脫)。這些方法的產(chǎn)物通常是含有溶解狀態(tài)的目的物的溶液。
所有現(xiàn)有技術(shù)的亞硫酸氫鹽處理的方法都有缺陷。因此，本申請(qǐng)解決的問題是提供一種克服現(xiàn)有技術(shù)方法缺陷的方法。

發(fā)明內(nèi)容
上述討論的問題的解決是通過提供一種用于將核酸中的胞嘧啶堿基轉(zhuǎn)化為尿嘧啶堿基的方法而解決的，優(yōu)選的是將多個(gè)胞嘧啶堿基轉(zhuǎn)化為多個(gè)尿嘧啶堿基，由此優(yōu)選的是5-甲基-胞嘧啶不會(huì)顯著轉(zhuǎn)化(“亞硫酸氫鹽反應(yīng)”或“亞硫酸氫鹽處理”)，在亞硫酸氫鹽反應(yīng)的去氨基和/或去磺化步驟中，核酸是與固相結(jié)合的。優(yōu)選的，該固相是玻璃棉，玻璃膜或者磁性玻璃顆粒。本發(fā)明進(jìn)一步地公開了亞硫酸氫鹽反應(yīng)中去氨基和/或去磺化步驟中固相的用途，以及含有固相和用于進(jìn)行亞硫酸氫鹽反應(yīng)的試劑的試劑盒。
固相在亞硫酸氫鹽反應(yīng)的去氨基和/或去磺化步驟中，優(yōu)選在去磺化步驟中的應(yīng)用，具有操作簡(jiǎn)單和/或易于自動(dòng)控制的優(yōu)點(diǎn)。例如，在去氨基和/和去磺化步驟中使用玻璃棉時(shí)，不需要進(jìn)行耗時(shí)的DNA沉淀反應(yīng)；通過離心可易于實(shí)現(xiàn)無結(jié)合分離，玻璃棉損失的體積可以忽略不計(jì)，因此洗滌步驟就非常有效。當(dāng)亞硫酸氫鹽處理的DNA用于潛在的抑制因子可顯著地降低靈敏度的PCR時(shí)，這是一個(gè)優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明所述的方法易于手工操作，而且適用于沒有常規(guī)分析儀器的較小的實(shí)驗(yàn)室。對(duì)于具有較大流通量的實(shí)驗(yàn)室，可通過常規(guī)分析儀器處理的固相特別是磁性玻璃顆粒的使用是非常有利的。在常規(guī)的亞硫酸氫鹽反應(yīng)中，采用變性條件，因?yàn)閬喠蛩釟潲}僅和不會(huì)參與堿基配對(duì)的嘧啶反應(yīng)。由于核酸通過不同的相互作用與固相表面結(jié)合，這種結(jié)合可能影響亞硫酸氫鹽反應(yīng)的成功，因此出人意料的，本發(fā)明的方法可以使亞硫酸氫鹽反應(yīng)成功而且到達(dá)令人滿意的程度。
根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“亞硫酸氫鹽反應(yīng)”，“亞硫酸氫鹽處理”或“亞硫酸氫鹽方法”應(yīng)該是指在核酸中的一個(gè)胞嘧啶堿基特別是多個(gè)胞嘧啶堿基轉(zhuǎn)化為一個(gè)尿嘧啶堿基或者多個(gè)胞嘧啶堿基的反應(yīng)，優(yōu)選的在亞硫酸氫鹽離子存在的條件下，由此5-甲基-胞嘧啶優(yōu)選不被顯著的轉(zhuǎn)化。Frommer等，同上以及Grigg和Clark，同上詳細(xì)描述了甲基化胞嘧啶的檢測(cè)反應(yīng)。亞硫酸氫鹽反應(yīng)包括一個(gè)去氨基步驟和一個(gè)去磺化步驟，這兩步可以分開或同時(shí)操作(見附

圖1；Grigg和Clark，同上)。所述5-甲基-胞嘧啶沒有被顯著的轉(zhuǎn)化應(yīng)當(dāng)僅是考慮到不排除小比例的5-甲基-胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，盡管這僅僅意欲轉(zhuǎn)化為(非-甲基化)的胞嘧啶堿基(Frommer等，同上)。
本發(fā)明的方法能夠在幾種亞硫酸氫鹽反應(yīng)排列和固定步驟中進(jìn)行。在第一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)核酸與固相結(jié)合時(shí)，進(jìn)行去氨基和去磺化步驟。因此在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，公開了將核酸中的一個(gè)胞嘧啶堿基轉(zhuǎn)化為一個(gè)尿嘧啶堿基，優(yōu)選的是將多個(gè)胞嘧啶堿基轉(zhuǎn)化為多個(gè)尿嘧啶堿基(“亞硫酸氫鹽反應(yīng)”)，由此5-甲基-胞嘧啶堿基優(yōu)選沒有被顯著的轉(zhuǎn)化的方法，包括步驟a)將核酸與固相結(jié)合，b)在亞硫酸鹽離子存在的條件下，溫育固相結(jié)合的核酸，從而使核酸去氨基，c)可選擇地洗滌去氨基的固相結(jié)合的核酸，d)在堿性條件下，溫育去氨基的固相結(jié)合的核酸，從而使去氨基的核酸去磺化，e)可選擇地洗滌去氨基和去磺化的固相結(jié)合的核酸，和f)可選擇地將去氨基和去磺化的核酸從固相上洗脫下來。
本發(fā)明的第二個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)核酸與固相結(jié)合時(shí)去磺化。因此，本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案公開了一種將核酸中的一個(gè)胞嘧啶堿基轉(zhuǎn)化為一個(gè)尿嘧啶堿基，優(yōu)選地將多個(gè)胞嘧啶堿基轉(zhuǎn)化為多個(gè)尿嘧啶堿基，由此5-甲基-胞嘧啶堿基優(yōu)選沒有被顯著的轉(zhuǎn)化(“亞硫酸氫鹽反應(yīng)”)的方法，包括步驟a)在亞硫酸鹽離子存在的條件下，溫育核酸使核酸去氨基，b)將去氨基的核酸與固相結(jié)合，c)可選擇地洗滌去氨基的固相結(jié)合的核酸，d)在堿性條件下，溫育去氨基的固相結(jié)合的核酸，從而使去氨基的核酸去磺化，e)可選擇地洗滌去氨基和去磺化的固相結(jié)合的核酸，和f)可選擇地將去氨基和去磺化的核酸從固相上洗脫下來。
在本發(fā)明的第三個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)核酸與固相結(jié)合時(shí)去氨基。因此，在本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，公開了一種將核酸中的一個(gè)胞嘧啶堿基轉(zhuǎn)化為一個(gè)尿嘧啶堿基，優(yōu)選地將多個(gè)胞嘧啶堿基轉(zhuǎn)化為多個(gè)尿嘧啶堿基，由此5-甲基-胞嘧啶堿基優(yōu)選沒有被顯著的轉(zhuǎn)化(“亞硫酸氫鹽反應(yīng)”)的方法，包括步驟a)將核酸與固相結(jié)合，b)在亞硫酸鹽離子存在的條件下，溫育固相結(jié)合的核酸，從而使核酸去氨基，
c)可選擇地洗滌固相結(jié)合的核酸，d)將去氨基的核酸從固相上洗脫下來，e)在堿性條件下溫育去氨基的核酸，從而使去氨基的核酸去磺化。
本領(lǐng)域熟練的技術(shù)人員可通過參考例如Frommer等，同上，或Grigg和Clark，同上，公開的亞硫酸氫鹽反應(yīng)的主要參數(shù)知道如何進(jìn)行亞硫酸氫鹽反應(yīng)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員從Grunau等，同上文的文獻(xiàn)中可知亞硫酸氫鹽反應(yīng)的何種改變是可能的。溫育時(shí)間和溫度對(duì)去氨基效率的影響，以及影響DNA降解的參數(shù)都是公開的。總而言之，在去氨基步驟中，含有亞硫酸氫鹽離子的緩沖液，使用了可選擇的離液劑和可選擇的其它試劑例如乙醇或者穩(wěn)定劑例如氫醌，而且pH在酸性范圍內(nèi)。亞硫酸氫鹽的濃度是0.1到6M，優(yōu)選地是1M到5.5M，離液劑的濃度是1到8M，優(yōu)選地使用胍鹽，pH是在酸性范圍，優(yōu)選地是4.5到6.5，溫度是0℃到90℃，優(yōu)選地是在室溫(25℃)到90℃，而且反應(yīng)時(shí)間是30分鐘到24小時(shí)或48小時(shí)或更長(zhǎng)，但是優(yōu)選地是1小時(shí)到24小時(shí)。去磺化步驟是通過添加堿性溶液或緩沖劑，例如僅含氫氧化物，如氫氧化鈉的溶液，或者是含有乙醇，氯化鈉和氫氧化鈉的溶液(例如38％EtOH，100mM NaCl，200mM NaOH)來進(jìn)行的，而且是在室溫或者稍高一些的溫度溫育幾分鐘，優(yōu)選地是5到60分鐘。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，核酸是脫氧核糖核酸(DNA)，特別是基因組DNA或者核酸，即DNA或者已在生物體基因組中發(fā)現(xiàn)的且作為生存必需的信息傳遞給后代的核酸。這些用語是用來區(qū)別其它類型的DNA，比如質(zhì)粒中發(fā)現(xiàn)的DNA。核酸的來源可以是真核生物或者原核生物，優(yōu)選地是脊椎動(dòng)物，特別是來自哺乳動(dòng)物，最優(yōu)選的是來自動(dòng)物或者人類。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，核酸被結(jié)合到未修飾的固相上，即核酸直接與固相結(jié)合，而沒有任何介導(dǎo)與固相結(jié)合的化合物。核酸結(jié)合到固相的未修飾的表面，由此與表面的結(jié)合也應(yīng)該考慮到固相可能含有的孔道以及核酸可能在固相的孔道中與其表面結(jié)合。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，固相可以是一種離子交換劑(可商業(yè)獲得的，例如來自Amersham Biosciences Europe，F(xiàn)reiburg，Germany)，在特殊條件下它能與核酸結(jié)合，羥磷灰石(可商業(yè)獲得的，來自Sigma，Taufkirchen，Germany)，玻璃或硅石，或者含有玻璃或硅石的材料，優(yōu)選地具有未修飾的表面。在另一個(gè)實(shí)施方案中，固相可以是已修飾的，即固相通過介導(dǎo)與固相結(jié)合的化合物與核酸間接結(jié)合，比如利用核酸與已連接到表面的寡聚核苷酸的序列特異性結(jié)合，或者是鏈親和素(已結(jié)合到固相表面)與已生物素標(biāo)記的DNA結(jié)合。適用的顆粒是可商業(yè)獲得的，來自DYNAL，Oslo，Norway以及在WO90/06045中描述過的。
術(shù)語“未修飾的”應(yīng)該是指沒有更進(jìn)一步的化學(xué)修飾，即沒有其它的化學(xué)基團(tuán)共價(jià)或非共價(jià)地連接。術(shù)語“未修飾的表面”，“未修飾的硅石表面”或“未修飾的玻璃表面”應(yīng)該是指沒有其它的化學(xué)基團(tuán)共價(jià)或非共價(jià)地結(jié)合，這些化學(xué)基團(tuán)用作核酸結(jié)合的中間物質(zhì)，而且核酸與中間物質(zhì)而非硅石表面本身結(jié)合。因此，核酸優(yōu)選地通過氫鍵和其它的原子力直接地與“未修飾的表面”結(jié)合。一個(gè)修飾的表面的例子是硅石表面，以序列特異性方式結(jié)合核酸分子的寡核苷酸的連接在上面。另一個(gè)修飾的硅石表面的例子是以鏈親和素包被的硅石表面，鏈親和素與已生物素化的DNA分子結(jié)合。
在本發(fā)明的一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，固相是含有玻璃或硅石的材料，優(yōu)選具有未修飾(玻璃或硅石)表面，例如玻璃纖維或，硅藻土，玻璃珠或顆粒，玻璃膜或磁性玻璃顆?；蚱渌母灿形葱揎棽Ａ娴奈镔|(zhì)。特別優(yōu)選的是玻璃羊毛或玻璃膜或磁性玻璃顆粒。這些固相被公開在EP0389063或US5234809中。
DNA或核酸與玻璃或硅石表面結(jié)合的條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員的基本常識(shí)。這些方法被詳細(xì)描述在.各種文獻(xiàn)中。例如，在Vogelstein，B.和Gillespie，D，Proc Natl Acad USA76(1979)615-9中，建議了一種在碘化鈉存在的條件下，核酸從瓊脂糖凝膠結(jié)合到磨碎的燧石玻璃上的方法。Marko，M.A，等，AnalBiochem 121(1982)382-7中描述了在高氯酸鈉存在的條件下，在玻璃粉塵上從細(xì)菌中純化質(zhì)粒DNA。在DE-A37 34 442中，描述了利用乙酸使噬菌體顆粒沉淀，用高氯酸鹽溶解噬菌體顆粒，在玻璃棉過濾器上分離單鏈的M13噬菌體DNA。洗滌結(jié)合到玻璃棉過濾器上的核酸，隨后用含甲醇的Tris/EDTA緩沖液洗脫。Jakobi，R，等，Anal Biochem 175(1988)196-201描述了一個(gè)相似的從λ噬菌體中純化DNA的方法。該方法需要在離液鹽溶液中選擇性結(jié)合核酸與玻璃表面，而且要將核酸從瓊脂糖，蛋白或細(xì)胞殘余物等污染物中分離出來。為了從污染物中分離玻璃顆粒，顆?？梢员浑x心或液體抽吸通過玻璃棉過濾器。但是，這是一種限制步驟，它使得這一程序不能用于處理大量的樣品。在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過添加鹽和乙醇，磁性玻璃顆粒沉淀后用于結(jié)合核酸，正如Alderton，R.P，等，Anal Biochem201(1992)166-9和PCTGB91/00212中所描述的。
在本發(fā)明的一個(gè)非常優(yōu)選的實(shí)施方案中，固相是磁性玻璃顆粒，優(yōu)選地是未修飾的玻璃表面。磁性玻璃顆粒是一種小磁性核心在玻璃中的固體分散體，即它們是玻璃小滴，其中分散著非常小的磁性物體。那些提到的磁性物體是接近磁鐵的，例如鐵或鐵磁的或超順磁性的材料。順磁性的物質(zhì)是沒有用的，因?yàn)樗鼈儍H僅是非常微弱地接近有磁性，對(duì)于本發(fā)明的方法，其磁性是不夠的。優(yōu)選的是鐵或鐵磁材料，特別是還未預(yù)磁化的。上下文中的預(yù)磁化被理解為是指與磁鐵接觸，它可以提高剩磁。優(yōu)選的磁性材料是鐵或氧化鐵，正如磁鐵礦(Fe3O4)或Fe2O3，優(yōu)選地是γ-Fe2O3。大體上，亞鐵酸鋇，鎳，鈷，Al-Ni-Fe-Co合金或其它的鐵或鐵磁材料都能用。本發(fā)明特別優(yōu)選的是WO96/41811，WO00/32762和WO01/37291中描述的磁性玻璃顆粒。
在本發(fā)明的一個(gè)非常優(yōu)選的實(shí)施方案中，磁性玻璃顆粒含有很少的鐵的濾灰，因?yàn)閷?duì)于后續(xù)的擴(kuò)增反應(yīng)，鐵是一種抑制劑，即鐵是一種酶抑制劑。因此，這是磁性玻璃顆粒一個(gè)重要的特性。優(yōu)選地，水或1M HCl中的鐵的濾灰低于40ppm，更優(yōu)選的是低于20ppm，最優(yōu)選的是低于10ppm。在本發(fā)明最優(yōu)選的實(shí)施方案中，磁性玻璃顆粒是被描述在國(guó)際申請(qǐng)WO01/37291中，其也可從MagNA Pure LC DNA分離試劑盒I(Roche，Mannheim，Germany)中公開獲得。根據(jù)本發(fā)明這些顆粒沉淀緩慢而且在自動(dòng)控制的方法中便于使用。這種產(chǎn)品被概述在下面。
磁性玻璃顆?；臼乔蛐蔚亩揖哂泻苄〉闹睆?，含有至少一個(gè)具有5到500nm的直徑的磁性物體。它具有驚人的沉淀動(dòng)力學(xué)效果，通過半衰期值t1/2定量，半衰期是從特定的體積單元沉淀50％的顆粒的時(shí)間跨度。根據(jù)本發(fā)明，在異丙醇中3mg/ml重量/體積具有未修飾玻璃表面的MGPs懸浮液的沉淀的半衰期大于3分鐘，優(yōu)選4分鐘，更優(yōu)選6分鐘。但是半衰期最優(yōu)選值是大于10分鐘或者甚至大于20分鐘。例如，最優(yōu)選的MGPs磁性物體可以是磁性色素。磁性物體的大小是在納米范圍內(nèi)，也就是5到500nm，優(yōu)選10到200nm，最優(yōu)選是15到50nm。適用的磁性色素是由CERAC公司生產(chǎn)的，其具有平均直徑23nm而且由γ-Fe2O3組成(BET-表面50m2/g，CERACP.O.Box 1178，Milwaukee，Wisconsin 53201-1178 USA；Artiele-No.I-2012)。本發(fā)明最優(yōu)選的磁性玻璃顆粒更進(jìn)一步的特征是MGPs具有用高分辨率的掃描電子顯微鏡測(cè)定為0.5μm到5μm的顆粒直徑，優(yōu)選1μm到2μm，因此，磁性物體的直徑如上描述是5到500nm，優(yōu)選10到200nm，最優(yōu)選是在15到50nm范圍內(nèi)。因此，MGPs的特征進(jìn)一步在于當(dāng)用高分辨率的掃描電鏡測(cè)定時(shí)，磁性色素核與磁性玻璃顆粒的直徑比例小于1到10。最優(yōu)選的MGPs是多微孔的，但是被高度結(jié)構(gòu)化的，因此具有超過6m2/g的相對(duì)大的表面。優(yōu)選地，磁性玻璃顆粒表面積為5到100m2/g，優(yōu)選5到90m2/g，更優(yōu)選的是10到50m2/g，最優(yōu)選的的是15到30m2/g?？梢岳靡环N自動(dòng)化的商業(yè)設(shè)備通過Braunauer-Emett-Teller-方法來測(cè)定。對(duì)于這種被谷稱為BET的方法討論參見Braunauer“TheAdsorption ofGases and Vapors”(1943)，普林斯頓大學(xué)出版社。
正如WO01/37291所描述的，本發(fā)明使用的磁性玻璃顆?；旧峡梢杂刹煌闹苿﹣硖峁?。磁性玻璃顆粒可能以片劑形式，作為粉末或者優(yōu)選作為懸浮物提供。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，這些懸浮物含有5到60mg/ml的磁性玻璃顆粒(MGPs)。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，含硅石的材料是懸浮在水性的緩沖溶液中的，緩沖溶液中可選擇的含有濃度為2到8mol/l的離液劑，優(yōu)選是4到6mol/l。離液鹽是碘化鈉，高氯酸鈉，硫氰酸胍鹽，異硫氰酸胍鹽或氫氯化胍鹽。本發(fā)明的離液劑是任意一種這樣的化學(xué)物質(zhì)，當(dāng)該試劑存在于含DNA或RNA的溶液中時(shí)，它可以擾亂液態(tài)水的有序結(jié)構(gòu)并影響DNA或RNA與本發(fā)明的MPGs的結(jié)合。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的其它物質(zhì)也是可能的。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，磁性玻璃顆粒是用WO01/37291，WO00/37291和WO96/41811描述的溶膠-凝膠方法制備的，這里的溶膠-凝膠方法特定地含有以下步驟—將磁性物體懸浮于溶膠中，—將溶膠水解從而用凝膠覆蓋磁性物體，—在雙噴嘴噴霧干燥器中將被凝膠覆蓋的磁性物體噴霧干燥，—燒結(jié)噴霧干燥的粉末以便由覆蓋磁性物體的凝膠形成玻璃。
本發(fā)明的優(yōu)選的MGPs是根據(jù)WO00/32762的實(shí)施例8制備的含有作為磁性色素的微米無光黑的磁性玻璃顆粒。本發(fā)明最優(yōu)選的MGPs是依據(jù)國(guó)際申請(qǐng)WO01/37291制備的，也可是獲自MagNA Pure LC DNA分離試劑盒I(Roche，Mannheim，Germany)。它們也可以用國(guó)際申請(qǐng)WO01/37291描述的溶膠-凝膠方法，利用直徑大約23nm的磁性物體和色素(由CERAC制造，由γ-Fe2O3組成；CERACP.O.Box1178，Milwaukee，Wisconsin 53201-1178 USA；Article-No.I-2012)來制備。磁性物體覆蓋上凝膠后，通過雙流噴嘴將漿液噴霧制成粉末。合適的噴霧干燥系統(tǒng)由Nubilosa Molekularzerstaubung，Ladisch GmbH&Co.KG，Konstanz，Germany，例如“Labor-Zerstubungstrochkner(Typ LTK)”或由Büchi AG，Uster，Switzerland制造，例如微型噴霧干燥器(B-191型)。由于磁性核與玻璃外殼的直徑比例是小于1到10，優(yōu)選的是1∶10和1∶1000，除了制備條件，特別是噴霧干燥過程中的條件，幾何學(xué)以及摻入的磁性核或它們的惰性載體的數(shù)量并不決定顆粒的形狀和大小。換句話說，噴霧干燥程序中，壓力，入口的溫度，出口的溫度以及流速的選擇是自由度，它決定了尺寸分布和玻璃滴的形狀，由此修飾MGPs。因此，噴霧干燥系統(tǒng)的噴嘴是加熱的。入口的溫度是120℃到500℃，優(yōu)選170℃到230℃或150℃到230℃，最優(yōu)選是150℃到200℃或190℃到210℃或者在200℃或稍低。出口的溫度是依據(jù)溶膠的沸點(diǎn)，并因此依據(jù)溶劑，可以大約，等于或稍低于溶劑沸點(diǎn)，也就是說低于溶劑沸點(diǎn)10℃。當(dāng)用乙醇作溶劑時(shí)，是50℃到300℃，優(yōu)選70℃到150℃，最優(yōu)選的是80℃到110℃。最佳的溫度是90℃到100℃。噴嘴的壓力大于3bar，優(yōu)選的是在4到6bar間調(diào)節(jié)。操作人員可以理解精確的參數(shù)依賴于所使用的噴霧干燥系統(tǒng)。但是，他可以將本發(fā)明的教導(dǎo)用于任何其它噴霧干燥系統(tǒng)，并通過考慮本發(fā)明公開的內(nèi)容獲得這些參數(shù)。依據(jù)“噴霧干燥手冊(cè)”(1991)，JohnWiley & Sons，New York上的公式可使其找出適用與其它設(shè)備的參數(shù)。優(yōu)選地，他可以查詢噴霧干燥系統(tǒng)的手冊(cè)或者與噴霧干燥系統(tǒng)的制造商聯(lián)系求得技術(shù)服務(wù)。為使產(chǎn)量最大化，稠化或燒結(jié)的溫度應(yīng)盡可能高，也就是說，稍低于熔化的范圍。精確的溫度依據(jù)玻璃的成分，但是可以在400℃到1200℃之間。WO01/37291中描述的EJ玻璃成分的例子中，燒結(jié)溫度是720℃到770℃，優(yōu)選的是750℃左右?？紤]本發(fā)明的教導(dǎo)時(shí)，技術(shù)人員可在其技藝范圍內(nèi)找出各種玻璃成分的溫度。然后粉末被加熱1小時(shí)到200℃，可選擇地冷卻到室溫，再在氮?dú)庵幸约訜崴俾?K/min加熱到750℃(稠化或燒結(jié)溫度)并在此溫度保持1小時(shí)。然后，熔爐冷卻到150℃并再次在空氣中加熱到200℃保持1小時(shí)。冷卻到室溫后，將粉末移到篩網(wǎng)(50μm)上并篩30分鐘。篩后的樣品瓶裝后200℃滅菌4小時(shí)，隨后冷卻到80℃。然后該玻璃容器從烤爐中取出，覆蓋無菌箔封存。
下面詳細(xì)描述將核酸結(jié)合于未修飾的玻璃或硅石表面(優(yōu)選磁性玻璃顆粒)的實(shí)驗(yàn)室方法。優(yōu)選在離液鹽存在的條件下進(jìn)行，濃度為1到8mol/l，優(yōu)選2到6mol/l。離液鹽可以是碘化鈉，高氯酸鈉，硫氰酸胍鹽，異硫氰酸胍鹽或氫氯化胍鹽。本發(fā)明的離液劑是任何一種這樣的化學(xué)物質(zhì)，當(dāng)該介質(zhì)存在于含DNA(或RNA)的溶液中時(shí)，它可以擾亂液態(tài)水的有序結(jié)構(gòu)并影響DNA(或RNA)與磁性玻璃顆粒的結(jié)合。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的其它生物物質(zhì)也在范圍內(nèi)。其它的物質(zhì)也依然可能。為與核酸混合物和可選擇的其它的生物成分結(jié)合，具有未修飾玻璃表面的玻璃珠要添加到混合物中，而且要溫育一段足夠的時(shí)間以使結(jié)合發(fā)生。技術(shù)人員通常都熟悉溫育步驟的持續(xù)時(shí)間。這一步驟可以通過測(cè)定在不同的時(shí)間點(diǎn)，表面的固定化的核酸的量使之最優(yōu)化。對(duì)于核酸來說溫育時(shí)間在10秒到30分鐘都是適合的。然后加入進(jìn)行亞硫酸氫鹽反應(yīng)不同步驟的試劑(或者甚至可以在溫育之前加入)。溫育或洗滌之后，核酸可以從液體中分離出來。大體上可以通過重力，或者在核酸與磁性玻璃顆粒結(jié)合的有利情況下，通過利用磁場(chǎng)將與磁性玻璃顆粒結(jié)合的核酸分離來完成。例如，在溫育反應(yīng)的容器中磁性顆?？梢员晃饺萜鞅谏稀亩梢匀コ袥]有與磁性顆粒結(jié)合的生物成分或反應(yīng)成分的液體。用來去除的方法依賴于溫育反應(yīng)所用的容器的類型。適用的步驟包括通過吸取或氣吸方式排除液體。隨后結(jié)合核酸的材料可至少被洗滌一次，優(yōu)選用70體積的乙醇30體積的水(70％乙醇)的混合液或者在WO99/40098描述的酸性洗滌溶液中。使用的洗滌溶液不會(huì)引起核酸或目的核酸從材料表面釋放下來，但能使不希望的污染物盡可能地被洗掉。洗滌步驟優(yōu)選用通過用結(jié)合核酸溫育玻璃或硅石來完成。步驟中材料優(yōu)選再懸浮。正如上述的結(jié)合步驟，被污染的洗滌溶液優(yōu)選被去除。最后的洗滌步驟后，材料可以在真空中簡(jiǎn)單地干燥，或者將流體蒸干。利用丙酮的預(yù)處理步驟可以被進(jìn)行。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，利用本發(fā)明的固相和本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法從生物樣品中得到核酸。生物樣品包括來自多細(xì)胞生物的細(xì)胞，比如人類和動(dòng)物細(xì)胞，如白細(xì)胞，以及免疫活性的低或高分子化學(xué)成分，諸如半抗原、抗原、抗體和核酸、血漿、腦流體、痰、糞便、活組織標(biāo)本、骨髓、口漱物、血清、組織、尿或其混合物。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，生物樣品是來自人體或動(dòng)物體的流液。優(yōu)選的生物樣品是血液，血漿，血清或尿。血漿優(yōu)選的是EDTA+，肝素或檸檬酸鹽處理過的血漿。含有核酸的生物樣品細(xì)胞被溶解產(chǎn)生混合的含有核酸和其它成分的生物混合物。生物樣品的裂解方法是技術(shù)人員熟知的，基本上可以是化學(xué)的、酶的或物理的方式。使用這些方法的組合也是可以使用的。例如，可以用超聲波，高壓，剪切力，堿，去垢劑或離液鹽溶液進(jìn)行裂解。對(duì)于裂解獲得核酸，Sambrook等分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，紐約以及Ausubel等Current Protocls inMolecular Biology，1987，J.Wiley和Sons，紐約給出了特定的參考。然后用本發(fā)明的方法和固相將核酸從裂解混合物中分離出來，隨后可以進(jìn)行本發(fā)明的方法，也就是說本發(fā)明的亞硫酸氫鹽處理。離液劑也用來裂解細(xì)胞以準(zhǔn)備核酸和其它生物物質(zhì)的混合物(參見例如Sambrool等(1989)或EP 0389063)。然后加入含有玻璃或硅石的材料，純化的效果產(chǎn)生于在這樣一些條件下，即存在一定濃度的離液劑，較高濃度的有機(jī)溶劑或酸性條件下，與具有玻璃表面的材料結(jié)合的DNA或RNA的狀態(tài)。因此，本發(fā)明也考慮到了裂解步驟與亞硫酸氫鹽反應(yīng)的組合，亦即從核酸與其它生物物質(zhì)混合中分離出的核酸直接進(jìn)行亞硫酸氫鹽處理，由此核酸在去氨基和/或去磺化步驟中與固相結(jié)合。更具體地，為將核酸中的胞嘧啶堿基，優(yōu)選多個(gè)胞嘧啶堿基轉(zhuǎn)化為尿嘧啶堿基優(yōu)選多個(gè)尿嘧啶堿基提供了一種方法，由此5-甲基-胞嘧啶堿基優(yōu)選沒有被顯著的轉(zhuǎn)化(“亞硫酸氫鹽反應(yīng)”或“亞硫酸氫鹽處理”)，通過與固相，優(yōu)選含有玻璃或硅石的材料相結(jié)合，使核酸從含核酸和其它生物成分的混合物中被分離出來，而且在亞硫酸氫鹽反應(yīng)的去氨基和/或去磺化步驟中仍保持與固相的結(jié)合。再進(jìn)一步具體的，提供了一種方法，該方法中核酸被從核酸與其它生物成分的混合物中分離出來，而且在亞硫酸氫鹽反應(yīng)的去氨基和去磺化步驟中與固相結(jié)合，亦即提供了一種將核酸中的一個(gè)胞嘧啶堿基，優(yōu)選多個(gè)胞嘧啶堿基轉(zhuǎn)化為一個(gè)尿嘧啶堿基，優(yōu)選多個(gè)尿嘧啶堿基，由此5-甲基-胞嘧啶堿基優(yōu)選沒有顯著轉(zhuǎn)化(“亞硫酸氫鹽反應(yīng)”或“亞硫酸氫鹽處理”)的方法，包括步驟a)提供核酸與其它生物成分的混合物b)將核酸與固相結(jié)合，可選擇地去除其它生物成分，并可選擇地洗滌固相結(jié)合的核酸，
c)在亞硫酸鹽離子存在的條件下溫育結(jié)合固相的核酸，由此核酸被去氨基，d)可選擇地洗滌結(jié)合去氨基的固相結(jié)合的核酸，e)在堿性條件下溫育去氨基的固相結(jié)合的核酸，由此去氨基的核酸被去磺化，f)可選擇地洗滌去氨基和去磺化的固相結(jié)合的核酸，和g)從固相上可選擇地洗脫去氨基和去磺化的核酸。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種方法，該方法中，核酸從核酸與其它生物成分的混合物中被分離，而且在亞硫酸氫鹽反應(yīng)的去磺化步驟中與固相結(jié)合，亦即提供了一種將核酸中的一個(gè)胞嘧啶堿基，優(yōu)選多個(gè)胞嘧啶堿基轉(zhuǎn)化為一個(gè)尿嘧啶堿基，優(yōu)選多個(gè)尿嘧啶堿基，由此5-甲基-胞嘧啶堿基優(yōu)選沒有顯著轉(zhuǎn)化(“亞硫酸氫鹽反應(yīng)”或“亞硫酸氫鹽處理”)的方法，包括步驟a)提供核酸和其它生物成分的混合物b)將核酸與固相結(jié)合，可選擇地去除其它生物成分，可選擇地洗滌固相結(jié)合的核酸，并將核酸從固相上洗脫下來，c)在亞硫酸鹽離子存在的條件下溫育被洗脫的核酸，由此核酸被去氨基，d)將去氨基的核酸與固相結(jié)合，e)可選擇地洗滌去氨基的固相結(jié)合的核酸，f)在堿性條件下，溫育去氨基的固相結(jié)合的核酸，由此將去氨基的核酸去磺化，g)可選擇地洗滌去氨基和去磺化的固相結(jié)合的核酸，并且h)從固相上可選擇地洗脫去氨基和去磺化的核酸。
在發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種方法，該方法中，核酸從核酸與其它生物成分的混合物中分離，而且在亞硫酸氫鹽反應(yīng)的去氨基步驟中與固相結(jié)合，亦即提供了一種將核酸中的一個(gè)胞嘧啶堿基，優(yōu)選多個(gè)胞嘧啶堿基轉(zhuǎn)化為一個(gè)尿嘧啶堿基，優(yōu)選多個(gè)尿嘧啶堿基，由此5-甲基-胞嘧啶堿基優(yōu)選沒有顯著轉(zhuǎn)化(“亞硫酸氫鹽反應(yīng)”或“亞硫酸氫鹽處理”)的方法，包括步驟a)提供核酸與其它生物成分的混合物b)將核酸與固相結(jié)合，可選擇地去除其它生物成分和可選擇地洗滌固相結(jié)合的核酸，c)在亞硫酸鹽離子存在的條件下，溫育固相結(jié)合的核酸，由此核酸被去氨基，d)可選擇地洗滌固相結(jié)合的核酸，e)將去氨基的核酸從固相上洗脫下來，
f)在堿性條件下溫育去氨基的核酸，由此去氨基的核酸去磺化。
本發(fā)明的優(yōu)選方法進(jìn)一步包含了將結(jié)合的核酸從固相上洗脫下來的步驟。然后所述的核酸例如可以被擴(kuò)增。為了進(jìn)行洗脫，含玻璃或硅石(具有未修飾的硅石表面)的材料在溶液中要再懸浮，溶液中不含和僅有少量的離液劑和/或有機(jī)溶劑?？梢赃x擇地，懸浮液用不含或僅有少量的離液劑和/或有機(jī)溶劑稀釋。這種性質(zhì)的緩沖液可以從DE3724442和Jakobi等，同上文中獲知。具有低鹽濃度的洗脫緩沖液是一種特別的、鹽濃度低于0.2mol/l的緩沖液。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，為緩沖目的，洗脫緩沖液含有Tris物質(zhì)，特別是pH在7左右或高于7的Tris緩沖液。在另一個(gè)特定的實(shí)施方案中，洗脫緩沖液是軟化水?，F(xiàn)在含有核酸的溶液在去除固相后，準(zhǔn)備用于擴(kuò)增。因此，核酸被轉(zhuǎn)入一個(gè)新的含有所有擴(kuò)增必需試劑的反應(yīng)管中?？蛇x擇地，含有所有擴(kuò)增必需試劑的溶液加到固相和已釋放的核酸的懸浮液中。在另一個(gè)實(shí)施方案中，含有所有擴(kuò)增必需的試劑的溶液是被加到固相與結(jié)合的核酸懸浮液中，而不經(jīng)洗脫步驟，由此核酸的擴(kuò)增是在固相上進(jìn)行的。
本發(fā)明中對(duì)于洗滌和結(jié)合步驟優(yōu)先使用適于分子生物學(xué)過程，特別是脫氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)純化過程的液相，這些過程利用這些物質(zhì)在一定條件下與固相，特別是硅石或玻璃表面，更特別是磁性玻璃顆粒的結(jié)合。優(yōu)選的液相包含醇和/或酮或其與水的混合物。本發(fā)明的醇優(yōu)選包括通式R-OH的伯醇，仲醇和叔醇，這里R代表通式-(CH2)n-CH3和n＞＝0。但是其它的適用于分子生物學(xué)目的的醇也能用，正如丙三醇。特別合適的醇是異丙醇，乙醇或其與水的混合物，優(yōu)選的是80體積的異丙醇和20體積的水的混合物。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中液相含有酮，比如丙酮。進(jìn)一步的，利用合適的含水緩沖溶液。適用于分子生物學(xué)目的的緩沖系統(tǒng)可查詢例如Sambrook，J，等，在“分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)”(1989)，Eds.J.Sambrook，E.F.Fritsch和T.Maniatis，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，紐約。優(yōu)選的緩沖物質(zhì)是Tris-羥甲基胺(TRIS)，磷酸鹽，N-(2-羥基-乙基)哌嗪-N’-(2-乙烷磺酸)(HEPES)，其鹽或其它適用的物質(zhì)。此外可使用能改變?nèi)芤弘x子強(qiáng)度的物質(zhì)，比如NaCl，KCl或CaCl2，或金屬陽離子絡(luò)合劑，例如乙二胺四乙酸(EDTA)或其鹽。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR；EP0201184，EP-A-0200362，US4683202)擴(kuò)增核酸。擴(kuò)增方法也可是連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR，Wu，D.Y.和Wallace，R.B.Genomics 4(1989)570-9和Barany，F(xiàn)，Proc Nail Acad SciUSA88(1991)189-93；聚合酶連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Barany，F(xiàn)，PCRMethods Appl 1(1991)5-16)；Gap LCR(PCT專利公告No.WO90/01069)；修復(fù)鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(歐洲專利公告No.EP439，182 A2)，3SR(Kwoh，D.Y，等，Proc Nail Acad SciUSA86(1989)1173-7；Guatelli，J.C.等，Proc Nail Acad Sci USA 87(1990)1874-8；PCT專利公告No.WO92/0880 A)，和NASBA(US專利No.US5,130,238)。還有鏈置換擴(kuò)增(SDA)，轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增(TMA)，和Qβ-擴(kuò)增(綜述參見Whelen，A.C.和Persing，D.H，Annu Rev Microbiol 50(1996)349-73；Abramson，R.D.和Myers，TW，Curr Opin Biotechnol 4(1993)41-7)。本發(fā)明的特別優(yōu)選的擴(kuò)增方法是US5,786,146公開的甲基化特異性PCR方法(MSP)，它結(jié)合了亞硫酸氫鹽處理與等位基因特異性PCR(參見US 5,137,806，US 5,595,890，US 5,639,611)。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，其方法中進(jìn)一步包含了擴(kuò)增核酸的檢測(cè)步驟。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以通過標(biāo)準(zhǔn)的分析方法測(cè)定或檢測(cè)擴(kuò)增核酸，在Sambrook，等，分子克隆，Cold Spring Harbor University Press(1989)，Lottspeich和Zorbas，“Bioanalytik”(1989)，Eds.L.a.Zorbas，Spektrum Akademischer Verlag，Heidelberg，Berlin，Germany，或Ausubel，F(xiàn)，等，“Current protocols in molecularBiology”(1994)，Eds.F.Ausubel，R.Brent和K.R.E，Wiley & Sons Verlag，NewYork.等的文獻(xiàn)中有所描述。在目的核酸檢測(cè)之前也要進(jìn)一步進(jìn)行純化步驟，比如沉淀步驟。檢測(cè)的方法可以包含在雙鏈DNA上結(jié)合或間插特異的染料，比如溴化乙啶，它能間插至雙鏈DNA并改變DNA的熒光性，但該方法也不局限于此。純化的核酸也可在限制酶消化后通過電泳的方法可選擇地被分離，并隨后顯現(xiàn)出來。也可以使用基于探針的測(cè)定方法，該方法是使用寡核苷酸與特異序列雜交，然后檢測(cè)雜交物。隨后也可能用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的步驟對(duì)目標(biāo)核酸進(jìn)一步測(cè)序。其它的方法是將核酸序列的多態(tài)性應(yīng)用于結(jié)合特異探針的硅片，當(dāng)結(jié)合互補(bǔ)序列時(shí)產(chǎn)生信號(hào)。
在本發(fā)明一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，在擴(kuò)增過程中利用測(cè)量熒光的強(qiáng)度來檢測(cè)核酸。這種方法可以監(jiān)控實(shí)時(shí)熒光。WO92/02638以及相應(yīng)的美國(guó)專利US 5,210,015，US 5,804,375，US 5,487,972公開了一個(gè)特定優(yōu)選的，用于同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增和通過測(cè)量熒光強(qiáng)度來檢測(cè)的方法。該方法利用聚合酶的外切核酸酶的活性來產(chǎn)生信號(hào)。具體的，核酸檢測(cè)方法包括用含有與目標(biāo)核酸區(qū)域互補(bǔ)的序列的寡核苷酸和含有和同一目標(biāo)核酸鏈第二個(gè)區(qū)域互補(bǔ)的序列的已標(biāo)記的寡核苷酸與樣品接觸，但不包括被第一種寡核苷酸確定的核酸序列，在雜交條件下產(chǎn)生雙鏈體的混合物，其中雙鏈體包含了與第一條寡核苷酸和標(biāo)記寡核苷酸退火的目標(biāo)核酸，這樣第一條寡核苷酸的3’端與標(biāo)記寡核苷酸的5’端相鄰。然后該混合物用具有5’到3’核酸酶活性的、模板依賴性的核酸聚合酶處理，處理?xiàng)l件是足夠允許聚合酶的5’到3’核酸酶活性切斷退火的、被標(biāo)記的寡核苷酸并釋放標(biāo)記片段。通過標(biāo)記寡核苷酸水解產(chǎn)生的信號(hào)可以被檢測(cè)和/或被測(cè)量。TaqMan技術(shù)消除了形成固相反應(yīng)混合物的必要性，而且可以被檢測(cè)。在更普通的條件下，本發(fā)明的擴(kuò)增和/或檢測(cè)反應(yīng)的方法是均一的液相測(cè)定。更進(jìn)一步優(yōu)選的方法是LightCycler設(shè)備上應(yīng)用的形式(例如參見US 6,174,670)。特別優(yōu)選的是亞硫酸氫鹽處理，在甲基化特異性探針存在的條件下用或不用甲基化特異性引物擴(kuò)增，以及實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)的應(yīng)用，如US6331393中的描述。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，方法是自動(dòng)操作的，也就是說，正如WO99/16781所描述的可用自動(dòng)過程來進(jìn)行?？勺詣?dòng)化過程是指過程中的步驟可適用儀器或機(jī)器來完成，它們能在很少或沒有外部的控制或人為的影響的條件下操作。自動(dòng)化方法是指可自動(dòng)化的方法中的步驟是利用儀器或機(jī)器來完成，它們能在很少或沒有外部的控制或人為的影響的條件下操作。只有方法中的制備步驟可能必需手工操作時(shí)，例如必需填裝儲(chǔ)存容器和放入地點(diǎn)，才必須人工選擇樣品和本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的其它步驟，如操作控制的計(jì)算機(jī)。例如，儀器或機(jī)器可以自動(dòng)添加液體，混合樣品或在特定的溫度下進(jìn)行溫育步驟。典型的，這種機(jī)器或儀器是通過計(jì)算機(jī)來控制的機(jī)器人，計(jì)算機(jī)執(zhí)行指定了單個(gè)步驟和命令的程序。本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，方法是高通量形式，也就是說，自動(dòng)化方法是以高通量的形式進(jìn)行的，就是意味著對(duì)于高通量的樣品，在短時(shí)間內(nèi)使方法和利用的機(jī)器或儀器最優(yōu)化。
本發(fā)明優(yōu)選的是將方法用于診斷，用于診斷分析，或生物分析，或用于篩選來自人體甚至動(dòng)物體的組織或流體中一定的甲基化模式的存在。更進(jìn)一步地，本發(fā)明的方法可用于提高核酸中甲基化位點(diǎn)檢測(cè)的速度，精確性或敏感性。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及固相在反應(yīng)的去氨基和/或去磺化步驟中的用途，其中在亞硫酸氫鹽離子的存在下，核酸中一個(gè)胞嘧啶堿基，優(yōu)選多個(gè)胞嘧啶堿基，被轉(zhuǎn)化為尿嘧啶堿基，優(yōu)選多個(gè)尿嘧啶堿基，從而5-甲基-胞嘧啶堿基優(yōu)選沒有顯著的轉(zhuǎn)化(“亞硫酸氫鹽反應(yīng)”)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及固相在反應(yīng)的去氨基和/或去磺化步驟中的用途，其中在亞硫酸氫鹽離子的存在下，核酸中一個(gè)胞嘧啶堿基，優(yōu)選多個(gè)胞嘧啶堿基，被轉(zhuǎn)化為一個(gè)尿嘧啶堿基，優(yōu)選多個(gè)尿嘧啶堿基，從而5-甲基-胞嘧啶堿基優(yōu)選沒有顯著的轉(zhuǎn)化。更特定地，該方法意味著在亞硫酸氫鹽反應(yīng)的去氨基和/或去磺化步驟中，固相用于與核酸結(jié)合，也就是說核酸在亞硫酸氫鹽反應(yīng)的去氨基和/或去磺化步驟中用于與固相結(jié)合。優(yōu)選地，固相是含有硅石或玻璃的材料。更優(yōu)選的是，固相是玻璃棉或玻璃膜。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，固相是磁性玻璃顆粒。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種進(jìn)行亞硫酸氫鹽反應(yīng)的試劑盒，其中包含含有亞硫酸氫鹽離子的溶液和固相。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，固相是含有硅石或玻璃的材料。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，固相是玻璃棉或玻璃膜。在發(fā)明最優(yōu)選的實(shí)施方案中，固相是磁性玻璃顆粒。在發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了各部分的試劑盒，其含有一個(gè)本發(fā)明的含有磁性玻璃顆粒或懸浮液的儲(chǔ)存容器。本領(lǐng)域公知這種試劑盒還含塑料器皿，可使用在亞硫酸氫鹽方法中，例如96或384孔形式的微量滴定板或例如由Eppendorf，Hamburg，Germany制造的反應(yīng)管。試劑盒可進(jìn)一步含有洗滌溶液，適用于固相，特別是玻璃棉或膜或磁性玻璃顆粒的洗滌步驟。洗滌溶液經(jīng)常是以母液形式提供，在使用前要稀釋。試劑盒可以進(jìn)一步含有洗脫液，亦即溶液或緩沖液(例如TE.10mM Tris，1mM EDTA，pH8.0)或者純水，用以洗脫與固相結(jié)合的DNA或RNA。此外，其它的試劑可被使用，包括適用于本發(fā)明的緩沖液。優(yōu)選地，本發(fā)明的試劑盒用于以下反應(yīng)，其中在亞硫酸氫鹽離子的存在下，核酸中的一個(gè)胞嘧啶堿基優(yōu)選多個(gè)胞嘧啶堿基被轉(zhuǎn)化為一個(gè)尿嘧啶堿基，優(yōu)選多個(gè)尿嘧啶堿基，由此5-甲基-胞嘧啶堿基優(yōu)選沒有被顯著地轉(zhuǎn)化。
下面的實(shí)施例、參考文獻(xiàn)和附圖被提供來有助于本發(fā)明的理解，其實(shí)際的保護(hù)范圍被描述在所附的權(quán)利要求書中?？梢岳斫猓贿`背本發(fā)明精神的條件下可以對(duì)所述方法進(jìn)行改變。
具體實(shí)施例方式
1.1實(shí)施例1.實(shí)施例1對(duì)亞硫酸氫鹽處理的DNA特異的LC-PCR的確定1.1概要事實(shí)上亞硫酸氫鹽反應(yīng)以及非甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶可以通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)來證明，利用對(duì)核酸序列區(qū)域有特異的引物，其中非甲基化的胞嘧啶被轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，也就是說引物上的堿基腺嘌呤與非甲基化的胞嘧啶的亞硫酸氫鹽反應(yīng)產(chǎn)物尿嘧啶相對(duì)。在轉(zhuǎn)化不完全的情況下，引物就不能與這個(gè)區(qū)域雜交，因?yàn)榘奏げ荒芘c引物上的腺嘌呤匹配。這樣就不能得到PCR產(chǎn)物。
US 6,174,670公開了一種利用LightCycler設(shè)備(Roche，Mannheim，Germany)進(jìn)行快速聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的改進(jìn)的方法。在該方法中，以擴(kuò)增依賴性方式使兩個(gè)標(biāo)記的探針緊密鄰近，這樣兩個(gè)標(biāo)記可以產(chǎn)生熒光能量轉(zhuǎn)移(FRET)。由此，擴(kuò)增的量就與一定波長(zhǎng)的放射光強(qiáng)度相關(guān)。因而特異性PCR方法可用來分析非甲基化的胞嘧啶是否達(dá)到完全的轉(zhuǎn)化，例如利用合適的探針和引物分析谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶π基因的啟動(dòng)子區(qū)(參見例如該基因全長(zhǎng)的SEQ ID NO1以及啟動(dòng)子，US 5,552,277，Genbank登記號(hào)M24485和Morrow等(1989)Gene 75，3-11)。但是本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員知道用于評(píng)價(jià)的其它方法同樣可以被采用。通過除以起始的熒光測(cè)量值也就是說在反應(yīng)循環(huán)早期，當(dāng)循環(huán)間的熒光測(cè)量值相對(duì)恒定期間得到的背景熒光而對(duì)熒光測(cè)量值標(biāo)準(zhǔn)化。起始熒光測(cè)量值選擇的循環(huán)數(shù)與所有相應(yīng)的反應(yīng)是一樣的，這樣所有測(cè)量值代表相對(duì)于同一反應(yīng)循環(huán)的增加。在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增早期的循環(huán)中，目標(biāo)分子的數(shù)目由幾何等式Ni＝N0x(1+E)i描述，其中N0＝反應(yīng)開始的目標(biāo)分子的數(shù)目，Ni＝在第I個(gè)循環(huán)完成后目標(biāo)分子的數(shù)目，E＝擴(kuò)增的效率(0＝＜E＝＜1)。在擴(kuò)增的幾何增長(zhǎng)期中，到達(dá)特定閾值所需的循環(huán)數(shù)(CT值或交叉點(diǎn))是與(1+E)的對(duì)數(shù)成反比的。因此，CT值代表反應(yīng)效率的測(cè)量值，它提供反應(yīng)之間的比較。CT值降低，意味著在更少的循環(huán)中反應(yīng)達(dá)到了閾值，顯示了反應(yīng)效率的增高。當(dāng)通過測(cè)量反應(yīng)熒光的增加來監(jiān)控?cái)U(kuò)增產(chǎn)物增加時(shí)，這里CT定義為進(jìn)行的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)，直到熒光超出了一個(gè)任意的熒光水平(AFL)。AEL的選擇接近熒光水平的基線，但是超出被測(cè)量的熒光的隨機(jī)波動(dòng)的范圍，因此，在擴(kuò)增的幾何增長(zhǎng)期中的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)被測(cè)量。在后面的循環(huán)中，擴(kuò)增產(chǎn)物的聚積抑制反應(yīng)，而且最后導(dǎo)致反應(yīng)平臺(tái)期。所有的反應(yīng)選擇1.5的AFL。因?yàn)镻CR擴(kuò)增由不連續(xù)的循環(huán)組成，而且熒光測(cè)量每個(gè)循環(huán)進(jìn)行一次，在單個(gè)周期中，被測(cè)量的熒光代表性地從低于AFL增長(zhǎng)到高于AFL。為了改進(jìn)測(cè)量精度，通過在循環(huán)間插入熒光測(cè)量來計(jì)算達(dá)到AFL隨機(jī)的“精確的”循環(huán)數(shù)，這里是指如CT值或交叉點(diǎn)。
1.2基本的方法下面的實(shí)驗(yàn)證明了在LightCycler儀器上描述過的PCR可被用作評(píng)價(jià)亞硫酸氫鹽處理DNA的工具。其顯示設(shè)計(jì)的引物/探針組合僅用亞硫酸氫鹽反應(yīng)后的DNA才給出陽性結(jié)果。亞硫酸氫鹽處理過的DNA(在這個(gè)例子中亞硫酸氫鹽DNA依據(jù)實(shí)施例2描述的方案來處理)和未經(jīng)處理的DNA利用同樣的模板濃度平行擴(kuò)增(每次PCR20ng和1ng)。
1.3在LightCycler儀器上進(jìn)行的PCR分析1.3.1主混合物成分LC快速起始DNA主雜交探針1×，2mM MgCl2，正向引物0.5μM，反向引物0.5μM，供體探針250nM，受體探針250nM，模板10μl，PCR總體積20μl。
1.3.2 PCR-條件變性10分鐘/95℃55個(gè)循環(huán)95℃/10秒65℃/10秒-信號(hào)獲得72℃/10秒Ramp時(shí)間20℃/秒1.4結(jié)果


該結(jié)果表明只有亞硫酸氫鹽處理過的DNA才有交叉點(diǎn)。因此PCR適用于評(píng)價(jià)亞硫酸氫鹽方法。如果保證引物/探針組合在亞硫酸鹽處理以前不與DNA反應(yīng)，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言，任意的PCR都可被用作評(píng)價(jià)手段。
2.實(shí)施例2使用磁性玻璃顆粒(MGPs)的亞硫酸氫鹽反應(yīng)2.1.1 DNA的變性100μl的甲基化DNA(Intergen，由Serologicals Corporation，Norcross，GA，USA提供；Cat S 7821)稀釋液(30ng和6ng/在1000ng hDNA背景中摻入的測(cè)定Roche Cat.1691112；每濃度10個(gè)重復(fù))，并且混入12μl 2MNaOH，37℃溫育15分鐘。
2.1.2 DNA的去氨基112μl的變性DNA與200μl亞硫酸氫鹽試劑(2.5M亞硫酸氫鈉，125mM氫醌，pH5.0)混合，并且50℃溫育16小時(shí)。
2.2利用MGPs的程序312μl的去氨基的DNA與600μl的結(jié)合緩沖液(MagNAPure DNA分離試劑盒I，Roche Cat.Nr.3 003 990)和75μl磁性玻璃顆粒溶液(MagNAPure DNA分離試劑盒I)混合，并在連續(xù)攪拌中室溫溫育15分鐘。隨后，用1ml 70％的乙醇洗滌磁性玻璃材料3次。在磁性分離器(Roche Cat.1641794)中進(jìn)行無結(jié)合的分離。其后將250μl 90％EtOH/20mM NaOH加到與MGPs結(jié)合的DNA中進(jìn)行去磺化作用。在混合中，混合物在室溫下溫育10分鐘。接著用90％的乙醇洗滌MGPs兩次。為了除去MGPs中殘余的乙醇，用熱電攪拌器將MGPs敞口加熱到60℃15分鐘。然后用50μl 10mM Tris/0.1mM EDTA Ph7.5洗脫DNA(60℃15分鐘)。10μl洗脫的DNA用于后續(xù)的PCR分析。
2.3利用Intergen試劑盒進(jìn)行亞硫酸鹽處理30ng和6ng的甲基化DNA(Intergen，由Serologicals公司Norcross，GA，USA；Cat.S7821提供)依據(jù)Intergen CpGenome DNA修飾試劑盒(Intergen，由Serologicals公司，Norcross，GA，USA；Cat.S7820提供)的包裝插頁中描述的方法來處理。10μl的洗脫DNA用于后續(xù)的PCR分析。
2.4利用在LightCycler(hyprobe-形式)上的特異性PCR測(cè)定亞硫酸氫鹽處理的DNA2.4.1主混合物的組成LightCycler快速起始DNA主雜交探針1×(Roche2239272)，2mM MgCl2，正向引物0.5μM，反向引物0.5μM，供體探針250nM，受體探針250nM，模板10μl，PCR總體積20μl。
2.4.2 PCR-條件變性10分鐘/95℃55個(gè)循環(huán)95C/10秒65C/10秒-信號(hào)獲得72℃/10秒Ramp時(shí)間20℃/秒來自MGP亞硫酸氫鹽處理的和Intergen亞硫酸氫鹽處理的樣品在LightCycler儀器上同樣的平行操作。
2.4.3結(jié)果


在實(shí)時(shí)PCR中計(jì)算的CT-值或交叉點(diǎn)對(duì)使用兩種亞硫酸氫鹽方法幾乎是一樣的，亦即方法的效果是一樣的。
3實(shí)施例3利用MGPs的自動(dòng)亞硫酸氫鹽反應(yīng)3.1亞硫酸氫鹽反應(yīng)的進(jìn)行3.1.1 DNA的變性20μl的甲基化DNA(Intergen，由Serologicals公司，Norcross，GA，USA提供；Cat.S7821)稀釋液(50ng/測(cè)定)，4μl的聚(da)溶液(濃度250ng/μl)與2.6μl 2MNaOH混合并37℃溫育10分鐘。
3.1.2DNA去氨基26μl的變性DNA與220μl亞硫酸氫鹽試劑(2.5M亞硫酸氫鈉，125mM氫醌，pH5.0)混合并50℃溫育4小時(shí)。
3.1.3利用MagnaPure LC-儀器的自動(dòng)化過程250μl的去氨基DNA與600μl結(jié)合緩沖液(MagNAPure DNA分離試劑盒I，Roche，Mannheim，Germany)和75μl磁性玻璃顆粒混合，并在不斷攪拌中室溫溫育15分鐘。隨后用1ml 70％乙醇洗滌磁性玻璃顆粒3次。然后加入250μl 90％的EtOH/20mMNaOH到與MGPs結(jié)合的DNA中進(jìn)行去磺化；在混合中室溫溫育混合物10分鐘。接著用90％的乙醇洗滌MGPs兩次并用50μl 10mMTris/0.1mMEDTApH7.5洗脫(7分鐘/80℃)。
3.1.4利用在LightCycler(hyprobe-形式)上的特異性PCR測(cè)定亞硫酸氫鹽處理的DNA3.1.4.1主混合物的組成LightCycler快速起始DNA主雜交探針1×，2mM MgCl2，正向引物0.5μM，反向引物0.5μM，供體探針250nM，受體探針250nM，模板5μl，PCR總體積20μl。
3.1.4.2PCR條件變性10分鐘/95℃55個(gè)循環(huán)95℃/10秒65℃/10秒-信號(hào)獲得72℃/10秒Ramp時(shí)間20℃/秒3.1.4.3結(jié)果

結(jié)果顯示每個(gè)使用濃度的交叉點(diǎn)。這意味著自動(dòng)化亞硫酸氫鹽處理是成功的。
4.實(shí)施例4利用玻璃棉進(jìn)行的亞硫酸氫鹽反應(yīng)4.1 DNA的變性100μl甲基化DNA(Intergen，由Serological公司Norcross，GA，USA提供；Cat.S7821)稀釋液(30ng和6ng/測(cè)定，每個(gè)濃度10個(gè)重復(fù))與12μl 2MNaOH混合，并在37℃溫育15分鐘。
4.2DNA的去氨基112μl變性的DNA與200μl亞硫酸氫鹽試劑(2.5M亞硫酸氫鈉，125mM對(duì)氫醌，pH5.0)在連續(xù)混合中溫育16小時(shí)/50℃。
4.3利用高純PCR模板制備試劑盒(Roche Cat.1796828)的去氨基DNA的過程●312μl去氨基DNA與試劑盒中的200μl結(jié)合緩沖液，100μl異丙醇混合，并用移液管移到含玻璃棉的柱上。然后在Eppendorf平頂離心管中離心柱(1分鐘/8000rpm)。
●隨后用500μl的80％乙醇洗滌柱3次(離心10秒/12000rpm)●將250μl試劑(38％乙醇/100mM NaCl/200mM NaOH)加到柱中以去磺化。室溫溫育5分鐘后離心1分鐘/800rpm。
●然后用500μl 80％乙醇洗滌柱2次(離心10秒/12000rpm)●最后結(jié)合DNA通過加入50μl預(yù)熱的(70℃)洗脫緩沖液(10mM Tris/0.1mM EDTA pH7.5)洗脫，并離心1分鐘/800rpm。
4.4利用在LightCycler(hyprobe-形式)上的特異性PCR測(cè)定亞硫酸氫鹽處理的DNA4.4.1主混合物組成LightCycler快速起始DNA主雜交探針1×(Roche2239272)，2mM MgCl2，正向引物0.5μM，反向引物0.5μM，供體探針250nM，受體探針250nM，模板10μl，PCR總體積20μl。
4.4.2 PCR條件變性10分鐘/95℃55個(gè)循環(huán)95℃/10秒65℃/10秒-信號(hào)獲得72℃/10秒Ramp時(shí)間20℃/秒4.4.3結(jié)果

結(jié)果顯示每個(gè)使用濃度的交叉點(diǎn)。這意味著利用玻璃棉的亞硫酸氫鹽反應(yīng)是成功的。
5.實(shí)施例5在玻璃棉固相上進(jìn)行的亞硫酸氫鹽反應(yīng)5.1 DNA與玻璃棉的結(jié)合100μl DNA(1μl hDNA(Roche)和100ng的甲基化DNA(Intergen，由Serological公司Norcross，GA，USA提供；Cat.S7821的混合物)與200μl結(jié)合緩沖液(高純PCR模板制備試劑盒，Roche Cat.1796828)和100μl的異丙醇混合?；旌衔镉靡埔汗芗拥皆噭┖械闹?。然后在平頂Eppendorf離心管中離心柱(1分鐘/8000rpm)。用試劑盒中的緩沖液洗滌玻璃棉2次(500μl每洗滌步驟)。
5.2與玻璃棉結(jié)合的DNA的變性用移液管吸取200μl的38％的EtOH/100mM NaOH/200mM NaCl加到玻璃棉上，并在室溫下溫育10分鐘變性。然后用試劑盒中的洗滌緩沖液500μl洗滌玻璃棉一次。
5.3與玻璃棉結(jié)合的DNA的去氨基
200μl的去氨基溶液(6.25M 脲/2M亞硫酸氫鈉/pH5.0)用移液管加到含DNA的玻璃棉上，隨后50℃水浴中溫育16小時(shí)。
然后去除去氨基試劑，并用試劑盒中的洗滌緩沖液洗滌玻璃棉2次，每次500μl。
5.4與玻璃棉結(jié)合的去氨基DNA的去磺化250μl試劑(90％乙醇/20mM NaOH)加到柱上以去磺化。室溫溫育15分鐘后，柱離心1分鐘/8000rpm。隨后用500μl 80％乙醇洗滌柱兩次(離心10秒/12000rpm)。
5.5洗脫DNA最后通過加入50μl預(yù)熱(70℃)的洗脫緩沖液(10mM Tris/0.1mM EDTAPh7.5)洗脫被結(jié)合的DNA，并離心1分鐘/8000rpm。
5.6利用在LightCycler(hyprobe-形式)上的特異性PCR測(cè)定亞硫酸氫鹽處理的DNALightCycler快速起始DNA主雜交探針1×(Roche2239272)，2mM MgCl2，正向引物0.5μM，反向引物0.5μM，供體探針250nM，受體探針250nM，模板10μl，PCR總體積20μl。
5.6.2 PCR條件變性10分鐘/95℃55個(gè)循環(huán)95℃/10秒65℃/10秒-信號(hào)獲得72℃/10秒Ramp時(shí)間20℃/秒5.6.3結(jié)果

每個(gè)反應(yīng)中測(cè)定增長(zhǎng)曲線并計(jì)算交叉點(diǎn)。結(jié)果表明在玻璃棉固相上進(jìn)行去氨基和去磺化是可行的。
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<221>GC_信號(hào)<222>(1169)..(1174)<220>
<221>GC_信號(hào)<222>(1179)..(1184)<220>
<221>TATA_信號(hào)<222>(1194)..(1198)<220>
<221>外顯子<222>(1225)..(1254)<220>
<221>聚腺苷酸_信號(hào)<222>(4041)..(4046)<300>
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1.一種將核酸中胞嘧啶堿基轉(zhuǎn)化為尿嘧啶堿基的方法，其特征在于核酸在去氨基和/或去磺化步驟中被與固相結(jié)合。
2.一種如權(quán)利要求1所述的將核酸中胞嘧啶堿基轉(zhuǎn)化為尿嘧啶堿基的方法，包含以下步驟a)將核酸與固相結(jié)合，b)在亞硫酸鹽離子存在的條件下，溫育固相結(jié)合的核酸，從而使核酸去氨基，c)可選擇地洗滌去氨基的固相結(jié)合的核酸，d)在堿性條件下，溫育去氨基的固相結(jié)合的核酸，從而使去氨基的核酸去磺化，e)可選擇地洗滌去氨基和去磺化的固相結(jié)合的核酸，和f)可選擇地將去氨基和去磺化的核酸從固相上洗脫下來。
3.一種如權(quán)利要求1所述的將核酸中胞嘧啶堿基轉(zhuǎn)化為尿嘧啶堿基的方法，包含步驟a)在亞硫酸鹽離子存在的條件下，溫育核酸使核酸去氨基，b)將去氨基的核酸與固相結(jié)合，c)可選擇地洗滌去氨基的固相結(jié)合的核酸，d)在堿性條件下，溫育去氨基的固相結(jié)合的核酸，從而使去氨基的核酸去磺化，e)可選擇地洗滌去氨基和去磺化的固相結(jié)合的核酸，和f)可選擇地將去氨基和去磺化的核酸從固相上洗脫下來。
4.一種如權(quán)利要求1所述的將核酸中胞嘧啶堿基轉(zhuǎn)化為尿嘧啶堿基的方法，包含步驟a)將核酸與固相結(jié)合，b)在亞硫酸鹽離子存在的條件下，溫育固相結(jié)合的核酸，從而使核酸去氨基，c)可選擇地洗滌固相結(jié)合的核酸，d)將去氨基的核酸從固相上洗脫下來，e)在堿性條件下溫育去氨基的核酸，從而使去氨基的核酸去磺化。
5.根據(jù)權(quán)利要求1到4的任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于固相是含有硅或者玻璃的材料。
6.根據(jù)權(quán)利要求1到5的任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于固相是玻璃棉或者玻璃膜。
7.根據(jù)權(quán)利要求1到5的任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于固相是磁性玻璃顆粒。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于磁性玻璃顆粒的平均直徑為0.5μm到5μm。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的方法，其特征在于磁性玻璃顆粒含有直徑為5到500nm的磁性物體。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于磁性玻璃顆粒含有平均直徑為23nm的磁性物體。
11.根據(jù)權(quán)利要求7到10的任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于磁性玻璃顆粒是用溶膠-凝膠方法制備的。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述的溶膠-凝膠方法包括以下步驟a)將磁性物體懸浮于溶膠中，b)將溶膠水解從而用凝膠覆蓋磁性物體，c)在雙噴嘴噴霧干燥器中將被凝膠覆蓋的磁性物體噴霧干燥，d)燒結(jié)噴霧干燥的粉末以便由覆蓋磁性物體的凝膠形成玻璃。
13.固相在亞硫酸氫鹽離子存在的條件下將核酸中的胞嘧啶堿基轉(zhuǎn)化為尿嘧啶堿基的反應(yīng)的去氨基和/或去磺化步驟中的用途。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的用途，其中固相是含有硅或者玻璃的材料。
15.根據(jù)權(quán)利要求13或14的任意一項(xiàng)所述的用途，其中固相是玻璃棉或者玻璃膜。
16.根據(jù)權(quán)利要求13或14的任意一項(xiàng)所述的用途，其中固相是磁性玻璃顆粒。
17.一種用于進(jìn)行亞硫酸氫鹽反應(yīng)的試劑盒，含有包含亞硫酸氫鹽離子的溶液和固相。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的試劑盒，其中固相是含有硅或者玻璃的材料。
19.根據(jù)權(quán)利要求17到18的任意一項(xiàng)所述的試劑盒，其中固相是玻璃棉或者玻璃膜。
20.根據(jù)權(quán)利要求17到19的任意一項(xiàng)所述的試劑盒，其中固相是磁性玻璃顆粒。
21.權(quán)利要求17到20的任意一項(xiàng)所述的試劑盒在亞硫酸氫鹽離子存在的條件下將核酸上的胞嘧啶堿基轉(zhuǎn)化為尿嘧啶堿基的反應(yīng)中的用途。
全文摘要
本申請(qǐng)涉及一種進(jìn)行亞硫酸氫鹽反應(yīng)從而在核酸即甲基化或非甲基化的胞嘧啶中確定甲基化位點(diǎn)的方法，其中在亞硫酸氫鹽反應(yīng)的去氨基和/或去磺化步驟中，核酸被結(jié)合于固相。固相優(yōu)選地是含有玻璃或硅石的材料，更優(yōu)選的是玻璃棉、玻璃膜或者是磁性的玻璃顆粒。更進(jìn)一步地，公開了固相在亞硫酸氫鹽反應(yīng)的去氨基和/或去磺化步驟中用于結(jié)合核酸的用途，以及一種含有亞硫酸氫鹽試劑和固相的試劑盒。
文檔編號(hào)C12N15/09GK1495192SQ0316028
公開日2004年5月12日 申請(qǐng)日期2003年8月28日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月29日
發(fā)明者C·馬克特-哈恩, D·布洛克, C 馬克特-哈恩, 蹇 申請(qǐng)人:霍夫曼-拉羅奇有限公司