專利名稱：一種提高轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)效率的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及動(dòng)物轉(zhuǎn)基因技術(shù)領(lǐng)域中一種提高轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)效率的方法。
背景技術(shù)：
動(dòng)物轉(zhuǎn)基因研究是生物技術(shù)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，它的應(yīng)用范圍已經(jīng)滲透到基礎(chǔ)研究、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥等諸多領(lǐng)域。動(dòng)物轉(zhuǎn)基因研究是指借助各種實(shí)驗(yàn)手段，使按照特定目的構(gòu)建的外源基因結(jié)構(gòu)整合到宿主動(dòng)物的基因組中，在動(dòng)物的發(fā)育過程中表達(dá)，并通過生殖細(xì)胞傳給后代的過程。這種在基因組中穩(wěn)定地整合有人工導(dǎo)入的外源基因的動(dòng)物稱轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。
自從首例轉(zhuǎn)基因動(dòng)物于1980年成功誕生以來，雖然有多種生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法問世，但應(yīng)用最廣泛的仍然是最早建立的原核顯微注射法。它首先應(yīng)用于生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因小鼠，之后也用于生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因的家畜?？墒窃摲椒▍s存在著效率低下(1％-5％)、成本昂貴、后代嵌合體比例高等缺陷，特別是對于生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因大家畜而言，情況尤為嚴(yán)重。首先，要獲得大量的原核期受精胚胎，無論是通過超排后的外科手術(shù)，還是超排后的直接屠宰，代價(jià)都十分昂貴；其次，外源基因整合效率的嚴(yán)重低下致使成功培育一頭轉(zhuǎn)基因大家畜需要耗費(fèi)數(shù)量眾多的代孕母畜；再次，由于大家畜的生產(chǎn)周期都比較長，從獲得原代轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(founder)到形成具有生產(chǎn)能力的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物群系的時(shí)間將使生產(chǎn)成本再次攀升。正是由于相對于生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因小鼠而言，生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因大家畜的效率更為低下，成本極為高昂，所以許多動(dòng)物轉(zhuǎn)基因研究僅限于小鼠，而不敢涉足大家畜。
與外源基因的隨機(jī)整合相比，對動(dòng)物基因組特定位點(diǎn)的定點(diǎn)修飾，包括基因的定點(diǎn)插入和定點(diǎn)敲除(knock-in或knock-out)，則有以下優(yōu)勢1)對特定目標(biāo)基因的定點(diǎn)修飾可更為精確地研究特定基因的表達(dá)調(diào)控；2)可避免外源基因的隨機(jī)插入導(dǎo)致宿主內(nèi)源功能基因的失活；3)可克服外源基因隨機(jī)整合時(shí)整合位點(diǎn)的位置效應(yīng)對外源基因表達(dá)的影響。利用胚胎干細(xì)胞技術(shù)進(jìn)行基因的定點(diǎn)修飾在小鼠上已經(jīng)廣泛應(yīng)用。雖然目前胚胎干細(xì)胞技術(shù)在小鼠上較為成熟，但在大家畜上胚胎干細(xì)胞還未能得到成功分離，以致還不能利用該技術(shù)對大家畜進(jìn)行基因的定點(diǎn)修飾。
1997年，首例體細(xì)胞克隆綿羊“Dolly”誕生的報(bào)道引起了社會(huì)各界的強(qiáng)烈關(guān)注，同時(shí)也標(biāo)志著生物領(lǐng)域的一種新的技術(shù)—哺乳動(dòng)物體細(xì)胞核移植技術(shù)的成功建立。但是，在動(dòng)物轉(zhuǎn)基因研究領(lǐng)域，同年報(bào)道的首例利用體細(xì)胞核移植技術(shù)培育出的轉(zhuǎn)基因綿羊“Polly”的誕生才是真正的里程碑，它掀開了體細(xì)胞核移植技術(shù)用于生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因大家畜的新篇章。隨后的幾年間，利用體細(xì)胞核移植技術(shù)培育的轉(zhuǎn)基因牛、山羊乃至定點(diǎn)整合有外源基因的綿羊相繼誕生。近2年來，科學(xué)家又相繼培育出定點(diǎn)敲除單拷貝(單敲除)和雙拷貝(雙敲除)α-1，3半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶基因的克隆豬，將該技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域不斷擴(kuò)展。
體細(xì)胞核移植技術(shù)與體細(xì)胞基因轉(zhuǎn)移技術(shù)相結(jié)合為生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物開辟了一條有效途徑。該技術(shù)路線的最大特點(diǎn)主要體現(xiàn)在將基因轉(zhuǎn)移步驟提前到體細(xì)胞培養(yǎng)階段。細(xì)胞基因轉(zhuǎn)移是指通過電穿孔，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)化，磷酸鈣沉淀以及顯微注射等方法，使外源目標(biāo)基因整合進(jìn)細(xì)胞基因組內(nèi)，并利用特定的篩選標(biāo)記，大量擴(kuò)增、富集轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，從而獲得轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株。直接利用這種已確定的整合有目的基因的體細(xì)胞為核供體所培育出的克隆動(dòng)物必定全部為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。通過體細(xì)胞核移植技術(shù)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因家畜的優(yōu)勢非常明顯首先，該方法取材簡便。卵母細(xì)胞可從屠宰場獲取，動(dòng)物體細(xì)胞來源更是豐富。其次，由于所產(chǎn)動(dòng)物就大部分為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，從而大幅度地壓縮了代孕母畜的數(shù)量，降低了生產(chǎn)成本；再次，如果轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的各種表型性狀得到確認(rèn)后，可利用相同的供體細(xì)胞為核供體進(jìn)行大規(guī)模地復(fù)制，從而縮短原代轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的獲得到形成具有生產(chǎn)能力的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物群系的時(shí)間；更可貴的是，利用該技術(shù)還可以獲得基因定點(diǎn)修飾的大家畜。在當(dāng)前條件下，這是其它轉(zhuǎn)基因方法所無法達(dá)到的。
盡管應(yīng)用體細(xì)胞核移植技術(shù)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因家畜的優(yōu)勢非常明顯，并且在綿羊、牛、山羊和豬等家畜的轉(zhuǎn)基因生產(chǎn)中取得了成功，但是該技術(shù)體系也存在局限因素。如前所述，該技術(shù)路線的優(yōu)勢主要體現(xiàn)在將基因轉(zhuǎn)移步驟提前到體細(xì)胞培養(yǎng)階段，直接利用已確定的整合有目的基因的體細(xì)胞為核供體進(jìn)行體細(xì)胞核移植，這樣所培育出的克隆動(dòng)物必定全部為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物?？墒窍嚓P(guān)研究表明，由于許多非轉(zhuǎn)基因細(xì)胞得到周圍轉(zhuǎn)基因細(xì)胞所產(chǎn)生的抗藥性物質(zhì)的保護(hù)而存活，導(dǎo)致經(jīng)過藥物篩選所獲得的具有抗藥性細(xì)胞并非全部都整合有外源基因，利用這些抗藥性細(xì)胞培育出的克隆動(dòng)物也并非全部都是轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。
發(fā)明創(chuàng)造內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種能有效提高轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)效率的方法，該方法的應(yīng)用將大大提高轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的可靠性。
本發(fā)明所提供的提高轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)效率的方法，是利用包括基因轉(zhuǎn)移步驟在內(nèi)的體細(xì)胞核移植技術(shù)進(jìn)行生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，所述基因轉(zhuǎn)移是利用能夠同時(shí)表達(dá)增強(qiáng)綠色熒光蛋白基因和新霉素抗性基因的雙標(biāo)記選擇載體實(shí)現(xiàn)的。
其中，新霉素抗性基因用于轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的篩選和富集；增強(qiáng)綠色熒光蛋白基因用于有效地篩選出轉(zhuǎn)基因囊胚用于胚胎移植，以確保培育出的克隆動(dòng)物全為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。
本方法中的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可為轉(zhuǎn)基因家畜和轉(zhuǎn)基因鼠等哺乳動(dòng)物。其中，轉(zhuǎn)基因家畜可為轉(zhuǎn)基因兔、轉(zhuǎn)基因牛、轉(zhuǎn)基因羊、轉(zhuǎn)基因豬等，尤其是轉(zhuǎn)基因牛，意義重大。
上述雙標(biāo)記選擇載體可包括細(xì)胞巨化病毒IE增強(qiáng)子、人延伸因子1α啟動(dòng)子pEF321、EGFP-IRES-NEO以及SV40的加尾信號和多克隆位點(diǎn)；其核苷酸序列可為序列表中序列1。序列1中自5｀端1位-24位堿基為多克隆位點(diǎn)。所述雙標(biāo)記選擇載體可通過電穿孔法導(dǎo)入受體細(xì)胞。電穿孔法導(dǎo)入受體細(xì)胞的條件可以是電場強(qiáng)度為1-1.4kV/cm、脈沖時(shí)間為0.8-1.2ms優(yōu)選為電場強(qiáng)度為1.2kV/cm、脈沖時(shí)間為1ms。
本發(fā)明構(gòu)建了一個(gè)能夠同時(shí)用于轉(zhuǎn)基因細(xì)胞富集和轉(zhuǎn)基因囊胚篩選的雙標(biāo)記選擇載體；優(yōu)化了電穿孔介導(dǎo)的動(dòng)物體細(xì)胞基因轉(zhuǎn)化方法的條件；并借助綠色熒光蛋白這一標(biāo)記基因，有效地篩選出轉(zhuǎn)基因囊胚用于胚胎移植，確保培育出的克隆動(dòng)物100％為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，從而建立一套能夠有效提高體細(xì)胞克隆介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因家畜的生產(chǎn)效率的方法，克服了體細(xì)胞克隆技術(shù)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中存在的所培育出的克隆動(dòng)物并非全部都是轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的缺點(diǎn)。
本發(fā)明建立了一套能夠有效提高體細(xì)胞克隆介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物特別是轉(zhuǎn)基因家畜生產(chǎn)效率的方法，為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物特別是轉(zhuǎn)基因家畜在藥用蛋白、營養(yǎng)蛋白和工業(yè)蛋白的生產(chǎn)，異種器官移植，牛乳的人乳化以及動(dòng)物疾病模型的建立等方面的廣泛應(yīng)用提供了一個(gè)重要的技術(shù)基礎(chǔ)，具有重要的理論意義和實(shí)際意義。


圖1為雙標(biāo)記選擇載體質(zhì)粒pCE-EGFP-IRES-NEO的物理圖譜圖2為體細(xì)胞克隆介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因牛的高效生產(chǎn)流程示意3為脈沖時(shí)間為0.8ms時(shí)不同電場強(qiáng)度的轉(zhuǎn)化效率曲線圖4為電場強(qiáng)度為1.2kV cm-1時(shí)不同脈沖時(shí)間的轉(zhuǎn)化效率曲線圖5A為三頭轉(zhuǎn)基因克隆牛的PCR鑒定電泳圖譜圖5B為三頭轉(zhuǎn)基因克隆牛的Southern Blot鑒定電泳圖譜圖6A1為綠色熒光蛋白基因在牛轉(zhuǎn)基因輸卵管上皮細(xì)胞中表達(dá)情況的明視野照片圖6A2為綠色熒光蛋白基因在牛轉(zhuǎn)基因輸卵管上皮細(xì)胞中表達(dá)情況的暗視野照片圖6B1為綠色熒光蛋白基因在轉(zhuǎn)基因克隆囊胚中表達(dá)情況的明視野照片圖6B2為綠色熒光蛋白基因在轉(zhuǎn)基因克隆囊胚中表達(dá)情況的暗視野照片圖6C1為綠色熒光蛋白基因在轉(zhuǎn)基因克隆牛的皮膚組織樣中表達(dá)情況的明視野照片圖6C2為綠色熒光蛋白基因在轉(zhuǎn)基因克隆牛的皮膚組織樣中表達(dá)情況的暗視野照片圖6D1為綠色熒光蛋白基因在從樂娃皮膚組織塊衍生出的成纖維細(xì)胞中表達(dá)情況的明視野照片圖6D2為綠色熒光蛋白基因在從樂娃皮膚組織塊衍生出的成纖維細(xì)胞中表達(dá)情況的暗視野照片具體實(shí)施方式
化學(xué)試劑與實(shí)驗(yàn)材料細(xì)胞和胚胎的培養(yǎng)器皿購自Costar或Nunc公司；DMEM/F12，Trypsin購自Gibco公司，F(xiàn)BS購自Hyclone公司，其他藥品除特殊注明外均購自Sigma公司荷斯坦奶牛的胎兒取自北京市奶牛中心，黃牛卵巢來自北京周邊地區(qū)屠宰場。
實(shí)施例1、體細(xì)胞克隆介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因牛的高效生產(chǎn)體細(xì)胞克隆介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因牛的高效生產(chǎn)流程如圖2所示，具體包括以下步驟1、雙標(biāo)記選擇載體的構(gòu)建和質(zhì)粒DNA的制備以EcoRI、XbaI雙酶切質(zhì)粒pCE321-FL(購自Clontech公司)和質(zhì)粒pCMV-EGFP-IRES-NEO(購自Clontech公司)，將質(zhì)粒pCMV-EGFP-IRES-NEO中細(xì)胞巨化病毒(CMV)啟動(dòng)子后的增強(qiáng)綠色熒光蛋白基因(EGFP)和內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)攜帶的新霉素抗性基因(Neor)插入到質(zhì)粒pCE321-FL中由細(xì)胞巨化病毒增強(qiáng)子(CMV-IE Enhancer)和人延伸因子1α啟動(dòng)子(pEF321)組成的5’調(diào)控區(qū)pCE321后，以pCE321替代CMV啟動(dòng)子。去除位于DNA片段EGFP-IRES-NEO間的NotI位點(diǎn)和BamHI位點(diǎn)形成中間質(zhì)粒pCE-EGFP-IRES-NEO-dNdB。去除NotI位點(diǎn)是為在雙標(biāo)記選擇載體旁端插入多克隆位點(diǎn)作準(zhǔn)備，去除BamHI位點(diǎn)是為將雙標(biāo)記選擇載體從質(zhì)粒上完整切下。然后，在中間質(zhì)粒pCE-EGFP-IRES-NEO-dNdB的基因構(gòu)件CE-EGFP-IRES-NEOD的5’調(diào)控區(qū)端插入多克隆位點(diǎn)形成雙標(biāo)記選擇載體pCE-EGFP-IRES-NEO，插入的多克隆位點(diǎn)為其他目標(biāo)基因的插入做好了準(zhǔn)備。經(jīng)過酶切鑒定，表明構(gòu)建好的雙標(biāo)記選擇載體pCE-EGFP-IRES-NEO與試驗(yàn)設(shè)計(jì)完全符合。
本實(shí)施例構(gòu)建的能夠同時(shí)表達(dá)增強(qiáng)綠色熒光蛋白基因(EGFP)和新霉素抗性基因(Neor)兩個(gè)標(biāo)記基因的雙標(biāo)記選擇載體pCE-EGFP-IRES-NEO的物理圖譜如圖1所示，圖中MCS為多克隆位點(diǎn)；CMV-IE Enhancer為細(xì)胞巨化病毒增強(qiáng)子；pEF321為人延伸因子1α啟動(dòng)子；EGFP為增強(qiáng)綠色熒光蛋白基因；IVS為人工內(nèi)含子；IRES為內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)；Neor為新霉素抗性基因；polyA為SV40的加尾信號；Ampr為氨芐青霉素抗性基因；Ori為pBR322復(fù)制原點(diǎn)。其全序列如序列表中序列1所示，自5｀端1位-24位堿基為多克隆位點(diǎn)；自5｀端25位-385位堿基為細(xì)胞巨化病毒增強(qiáng)子序列；自5｀端386位-1575位堿基為人延伸因子1α啟動(dòng)子序列；自5｀端1624位-2343位堿基為增強(qiáng)綠色熒光蛋白基因序列；自5｀端2360位-2655位堿基為人工內(nèi)含子序列；自5｀端2681位-3266位堿基為內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)序列；自5｀端3292位-4095位堿基為新霉素抗性基因序列；自5｀端4176位-4310位堿基為SV40的加尾信號序列；自5｀端4325位-10217位堿基為pHC79粘粒載體序列；自5｀端4557位-5416位堿基為氨芐青霉素抗性基因序列；自5｀端5587位-5710位堿基為pBR322復(fù)制原點(diǎn)序列。
其中，新霉素抗性基因用于轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的篩選和富集；增強(qiáng)綠色熒光蛋白基因用于有效地篩選出轉(zhuǎn)基因囊胚用于胚胎移植，以確保培育出的克隆動(dòng)物全為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物IRES(微小RNA病毒的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn))保證EGFP和Neor能同時(shí)表達(dá)。
質(zhì)粒pCE-EGFP-IRES-NEO經(jīng)SalI和AscI雙酶切后獲得線性雙標(biāo)記選擇載體，經(jīng)QIAGEN公司的QIAEX II試劑盒純化回收，溶于滅菌超純水中，-20℃保存。
2、牛胎兒輸卵管上皮細(xì)胞系的建立一頭5月齡荷斯坦奶牛胎兒取自北京市奶牛中心，將整個(gè)子宮運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，取出胎兒，以PBS和70％酒精清洗數(shù)遍后從胎兒輸卵管取出組織樣，剪碎成1mm3左右的小塊，DMEM/F 12清洗2遍后分批植塊于含1mL DMEM/F12+10％FBS的25cm2的培養(yǎng)瓶中，待組織塊貼壁牢固后再補(bǔ)加DMEM/F12+10％FBS至6mL，于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)6-7d，每2d換液1次，待細(xì)胞生長匯合后，以0.25％胰蛋白酶(trypsin)消化傳代2-3次，分批以DMEM/F12+20％FBS+10％DMSO凍存。經(jīng)原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)、冷凍等體外培養(yǎng)操作，建立了牛胎兒輸卵管上皮細(xì)胞系。
3、電穿孔介導(dǎo)的細(xì)胞基因轉(zhuǎn)移方法的優(yōu)化以雙標(biāo)記選擇載體質(zhì)粒pCE-EGFP-IRES-NEO經(jīng)SalI和AscI雙酶切后的CE-EGFP-IRES-NEO為目標(biāo)基因，通過比較不同電場強(qiáng)度(E)、不同脈沖時(shí)間(t)在細(xì)胞密度為5×106個(gè)細(xì)胞/mL、DNA濃度為20μg/mL的條件下對轉(zhuǎn)化效率的影響，對電擊介導(dǎo)的牛胎兒輸卵管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)基因方法的效率進(jìn)行優(yōu)化，同時(shí)驗(yàn)證雙標(biāo)記選擇載體pCE-EGFP-IRES-NEO的有效性。通過牛胎兒輸卵管上皮細(xì)胞對不同濃度G418毒性的敏感性試驗(yàn)確定G418的篩選濃度。
結(jié)果表明，200-800μg/mL G418對牛胎兒輸卵管上皮細(xì)胞有明顯毒害作用，在培養(yǎng)后5-21d內(nèi)可殺死全部細(xì)胞。細(xì)胞對G418的毒性敏感性隨G418濃度升高而增加，其中800μg/mL G418可在8d內(nèi)殺死全部細(xì)胞，300μg/mL G418在15d內(nèi)殺死全部細(xì)胞。
結(jié)果如圖3和圖4所示，表明在細(xì)胞密度為5×106個(gè)細(xì)胞/mL，DNA濃度為20μg/mL的條件下，當(dāng)電場強(qiáng)度為1.2kV/cm，脈沖時(shí)間為1ms時(shí)可獲得最佳轉(zhuǎn)化效率。每105個(gè)細(xì)胞中可以獲得約50個(gè)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞克隆，優(yōu)于其他處理組。
4、不同類型的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株的獲得收集對數(shù)期細(xì)胞，電擊液HeBS(140mmol/L NaCl、5mmol/L KCl、0.75mmol/LNa2HP04、6mmol/L葡萄糖、25mmol/L Hepes)重懸細(xì)胞至5×106個(gè)/mL，在DNA濃度為20μg/mL、電場強(qiáng)度為1.2kV/cm、脈沖時(shí)間為1ms的條件下進(jìn)行電擊，48h后加入800μg/mL G418篩選，每2-3d換液1次，篩選14d后以0.25％胰蛋白酶(trypsin)消化收集克隆點(diǎn)細(xì)胞并繼續(xù)以300μg/mL G418篩選4-5代，待生長匯合并血清饑餓2-4d后用于體細(xì)胞核移植。
5、卵母細(xì)胞的成熟培養(yǎng)從屠宰廠收集成年牛的卵巢，置于30℃的生理鹽水在4h內(nèi)送到實(shí)驗(yàn)室，37℃的PBS液中清洗三遍后，以直徑為0.7mm針頭抽取直徑為2-8mm的卵泡，回收形態(tài)均勻、結(jié)構(gòu)致密的卵丘-卵母細(xì)胞-復(fù)合體(COCs)，以成熟液(M199+10％FBS+0.01U/mL bFSH+0.01U/mL bLH+1μg/mL雌二醇)洗滌兩遍，然后將卵丘-卵母細(xì)胞-復(fù)合體以50-60枚/孔放入含成熟液的四孔板，在38.5℃、5％CO2培養(yǎng)箱中成熟培養(yǎng)18-20h后，將成熟的卵母細(xì)胞放入0.1％透明質(zhì)酸酶的管內(nèi)振蕩2-3min后，再用玻璃管輕輕吹打，使卵丘細(xì)胞與卵母細(xì)胞完全脫離，選擇形態(tài)完整，細(xì)胞質(zhì)均勻并排出第一極體的卵母細(xì)胞為胞質(zhì)受體。
6、核移植程序和克隆胚胎的體外培養(yǎng)將帶有第一極體的卵母細(xì)胞移入含M199+10％FBS+7.5μg/mL細(xì)胞松馳素B的操作液中，在200倍顯微鏡下用一玻璃針于極體上方將透明帶切一小口，再用內(nèi)徑為20μm的玻璃管將第一極體以及其下方的卵母細(xì)胞內(nèi)的染色體一并吸除，再放入M199+20％FBS的溶液中洗三遍后，置于培養(yǎng)箱中備用。
將血清饑餓2-4d的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞用0.25％胰蛋白酶(trypsin)消化2-4min，選擇直徑為10-12μm的胎兒輸卵管上皮細(xì)胞用20μm直徑玻璃管將其移入去了核的卵母細(xì)胞透明帶內(nèi)，然后將其放入0.3M甘露醇(Mannitol)，0.15mmol/L Ca2+，0.15mmol/L Mg2+液中3-5min后放入融合槽內(nèi)，轉(zhuǎn)動(dòng)卵細(xì)胞使供體細(xì)胞與卵母細(xì)胞接觸面與電場垂直，同時(shí)在直流脈沖的場強(qiáng)為2.5kV/cm、脈沖時(shí)間為10μs、脈沖次數(shù)為2次、脈沖間隔為1s的條件下融合(融合儀為BTX公司的ECM-2001)后，迅速將重構(gòu)胚移入M199+10％FBS液中，放置0.5h后觀察融合率，挑選融合胚進(jìn)行下一步激活處理。
將重構(gòu)胚放入5μmol/L離子霉素(Ionomycin，Sigma)液中，4min后換到1.9mmol/L 6-DMAP液中，4h后再移入CR1aa+5％FBS液中，在38.5℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別在2d和7d后觀察6FP的表達(dá)情況和胚胎的發(fā)育狀況。
7、胚胎移植與妊娠檢測將形態(tài)優(yōu)良的第7d的GFP克隆囊胚移入已同期的受體牛的子宮角內(nèi)。在移植后的第30d對受體母牛進(jìn)行B超檢測以確定受胎情況，并分別在移植后的第60d和第90d進(jìn)行直腸檢測以確定妊娠率。
共移植受體牛17頭，移植后的第60d的直腸檢測表明其中5頭懷孕。有3頭轉(zhuǎn)基因克隆牛出生，產(chǎn)犢率為17.6％。
8、轉(zhuǎn)基因克隆牛的分子生物學(xué)鑒定采集轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因克隆牛耳部組織樣，按常規(guī)方法提取基因組DNA。
(1)PCR鑒定用一對PCR引物(上游5’-TGC AGT GCT TCA GCC GCT AC-3’下游5’-CTC AGG TAG TGG TTG TCG GG-3’)對轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因克隆?；蚪MDNA樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以普通荷斯坦奶牛基因組DNA作為陰性對照，以雙標(biāo)記載體質(zhì)粒pCE-EGFP-IRES-NEO作為陽性對照。PCR條件94℃ 5min；94℃ 30sec，62℃ 30sec，72℃ 30sec，30循環(huán)；72℃ 7min。擴(kuò)增產(chǎn)物全長為約384bp的DNA片段。結(jié)果如圖5A所示，表明3頭轉(zhuǎn)基因克隆牛擴(kuò)增出陽性帶，而非轉(zhuǎn)基因克隆牛和普通荷斯坦奶牛未能擴(kuò)出陽性帶。圖5A中，M為1kb ladder，1為轉(zhuǎn)基因克隆?！皹吠蕖?，2為轉(zhuǎn)基因克隆?！熬琶谩?，3為轉(zhuǎn)基因克隆?！?C2”，4為非轉(zhuǎn)基因克隆?！皾G娃”，5為普通荷斯坦奶牛，6為陽性質(zhì)粒，7為滅菌蒸餾水。
(2)Southern鑒定取大約10μg基因組DNA，用BglII內(nèi)切酶消化，30V低壓電泳，轉(zhuǎn)膜后，進(jìn)行Southern雜交，雜交所用探針為α-P32dCTP同位素標(biāo)記的雙標(biāo)記載體質(zhì)粒BglII酶切回收產(chǎn)物。以普通荷斯坦奶?；蚪MDNA作為陰性對照，以雙標(biāo)記載體pCE-EGFP-IRES-NEO作為陽性對照，雜交陽性信號為1.6kb片段。
結(jié)果如圖5B所示，表明3頭轉(zhuǎn)基因克隆牛基因組內(nèi)整合有外源目標(biāo)基因CE-EGFP-IRES-NEO，轉(zhuǎn)基因陽性率為100％。Southern Blot結(jié)果和PCR結(jié)果完全一致。圖5B中，1為轉(zhuǎn)基因克隆?！皹吠蕖保?為轉(zhuǎn)基因克隆?！熬琶谩?，3為轉(zhuǎn)基因克隆牛“8C2”，4為非轉(zhuǎn)基因克隆?！皾G娃”，5為普通荷斯坦奶牛，6為1拷貝陽性質(zhì)粒，7為5拷貝陽性質(zhì)粒，8為10拷貝陽性質(zhì)粒。
9、綠色熒光蛋白基因在供體細(xì)胞、轉(zhuǎn)基因克隆胚胎和轉(zhuǎn)基因克隆牛中表達(dá)的檢測將作為核供體的牛轉(zhuǎn)基因輸卵管上皮細(xì)胞在轉(zhuǎn)化后1天后加入G418，經(jīng)G418篩選14d后均有陽性細(xì)胞克隆點(diǎn)出現(xiàn)，并于熒光顯微鏡的藍(lán)光下觀察，以檢測GFP的表達(dá)情況。結(jié)果如圖6A1和圖6A2所示，表明輸卵管上皮細(xì)胞被轉(zhuǎn)化后發(fā)現(xiàn)綠色熒光蛋白(GFP)的表達(dá)。
在克隆胚胎體外發(fā)育到囊胚階段，取部分囊胚于熒光顯微鏡的藍(lán)光下觀察，以檢測GFP的表達(dá)情況。結(jié)果如圖6B1和圖6B2所示，表明轉(zhuǎn)基因克隆囊胚表達(dá)綠色熒光蛋白。
將轉(zhuǎn)基因克隆牛的耳部皮膚組織剪碎后置于藍(lán)光下激發(fā)，結(jié)果如圖6C1和圖6C2所示，表明在組織中有綠色熒光蛋白的表達(dá)。
從轉(zhuǎn)基因克隆?！皹吠蕖倍肯戮壂@取組織樣，剪碎成1mm3左右的小塊，DMEM/F12清洗2遍后分批植塊于含1mL DMEM/F12+10％FBS的25cm2的培養(yǎng)瓶中，待組織塊貼壁牢固后再補(bǔ)加DMEM/F12+10％FBS至6 Ml，于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)6-7天，每2天換液1次，待細(xì)胞從皮膚組織分離后，觀察GFP在細(xì)胞中的表達(dá)情況。結(jié)果如圖6D1和圖6D2所示，表明細(xì)胞中有綠色熒光蛋白的表達(dá)。
序列表<160>1<210>1<211>10237<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>1gcggccgcga tattaagctt ccgacattga ttattgacta gttattaata gtaatcaatt60acggggtcat tagttcatag cccatatatg gagttccgcg ttacataact tacggtaaat120ggcccgcctg gctgaccgcc caacgacccc cgcccattga cgtcaataat gacgtatgtt180cccatagtaa cgccaatagg gactttccat tgacgtcaat gggtggagta tttacggtaa240actgcccact tggcagtaca tcaagtgtat catatgccaa gtacgccccc tattggcgtc300aatgacggta aatggcccgc ctggcattat gcccagtaca tgaccttatg ggactttcct360acttggcagt acatctacgt attagtcatc gctattaccc ggcatgcgtg aggctccggt420gcccgtcagt gggcagagcg cacatcgccc acagtccccg agaagttggg gggaggggtc480ggcaattgaa ccggtgccta gagaaggtgg cgcggggtaa actgggaaag tgatgtcgtg540tactggctcc gcctttttcc cgagggtggg ggagaaccgt atataagtgc agtagtcgcc600gtgaacgttc tttttcgcaa cgggtttgcc gccagaacac aggtaagtgc cgtgtgtggt660tcccgcgggc ctggcctctt tacgggttat ggcccttgcg tgccttgaat tacttccacg720cccctggctg cagtacgtga ttcttgatcc cgagcttcgg gttggaagtg ggtgggagag780ttcgaggcct tgcgcttaag gagccccttc gcctcgtgct tgagttgagg cctggcctgg840gcgctggggc cgccgcgtgc gaatctggtg gcaccttcgc gcctgtctcg ctgctttcga900taagtctcta gccatttaaa atttttgatg acctgctgcg acgctttttt tctggcaaga960tagtcttgta aatgcgggcc aagatctgca cactggtatt tcggtttttg gggccgcggg1020cggcgacggg gcccgtgcgt cccagcgcac atgttcggcg aggcggggcc tgcgagcgcg1080gccaccgaga atcggacggg ggtagtctca agctggccgg cctgctctgg tgcctggcct1140cgcgccgccg tgtatcgccc cgccctgggc ggcaaggctg gcccggtcgg caccagttgc1200
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1.一種提高轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)效率的方法，是利用包括基因轉(zhuǎn)移步驟在內(nèi)的體細(xì)胞核移植技術(shù)進(jìn)行生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，其特征在于所述基因轉(zhuǎn)移是利用能夠同時(shí)表達(dá)增強(qiáng)綠色熒光蛋白基因和新霉素抗性基因的雙標(biāo)記選擇載體實(shí)現(xiàn)的。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述轉(zhuǎn)基因動(dòng)物為轉(zhuǎn)基因家畜。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述轉(zhuǎn)基因家畜為轉(zhuǎn)基因牛、轉(zhuǎn)基因羊、轉(zhuǎn)基因豬或轉(zhuǎn)基因兔。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述雙標(biāo)記選擇載體包括細(xì)胞巨化病毒IE增強(qiáng)子、人延伸因子1α啟動(dòng)子pEF321、EGFP-IRES-NEO以及SV40的加尾信號和多克隆位點(diǎn)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述雙標(biāo)記選擇載體的核苷酸序列是序列表中序列1。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述序列1中自5`端1位-24位堿基為多克隆位點(diǎn)。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述雙標(biāo)記選擇載體通過電穿孔法導(dǎo)入受體細(xì)胞。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述電穿孔法導(dǎo)入受體細(xì)胞的條件是電場強(qiáng)度為1-1.4kV/cm、脈沖時(shí)間為0.8-1.2ms。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述電穿孔法導(dǎo)入受體細(xì)胞的條件是電場強(qiáng)度為1.2kV/cm、脈沖時(shí)間為1ms。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種提高轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)效率的方法。本發(fā)明所提供的提高轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)效率的方法，是利用包括基因轉(zhuǎn)移步驟在內(nèi)的體細(xì)胞核移植技術(shù)進(jìn)行生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，其優(yōu)勢在于利用能夠同時(shí)表達(dá)增強(qiáng)綠色熒光蛋白基因和新霉素抗性基因的雙標(biāo)記選擇載體實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因克隆胚胎的有效篩選。本發(fā)明建立了一套能夠有效提高體細(xì)胞克隆介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物特別是轉(zhuǎn)基因家畜生產(chǎn)效率的方法，為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物特別是轉(zhuǎn)基因家畜在藥用蛋白、營養(yǎng)蛋白和工業(yè)蛋白的生產(chǎn)，異種器官移植，牛乳的人乳化以及動(dòng)物疾病模型的建立等方面的廣泛應(yīng)用提供了一個(gè)重要的技術(shù)基礎(chǔ)，具有重要的理論意義和實(shí)際意義。
文檔編號C12N15/12GK1600851SQ0316003
公開日2005年3月30日 申請日期2003年9月23日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月23日
發(fā)明者龔國春, 戴蘊(yùn)平, 樊寶良, 李寧 申請人:李寧