專(zhuān)利名稱(chēng)：母系遺傳耳聾線粒體基因1555位a→g突變的檢測(cè)方法及其試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體是涉及母系遺傳耳聾線粒體基因1555位A→G突變的檢測(cè)方法。本發(fā)明還涉及制備根據(jù)該方法的體外檢測(cè)母系遺傳耳聾線粒體基因1555位A→G突變的試劑盒，以及該試劑盒在檢測(cè)所說(shuō)的A→G突變中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
氨基糖甙類(lèi)抗生素(鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、妥布霉素及小諾霉素等)因其廣譜高效的抗菌作用以及低廉的價(jià)格在臨床上被廣泛用于控制革蘭氏陰性和陽(yáng)性菌感染，但此類(lèi)抗生素具有嚴(yán)重的耳毒性副作用，可使患者發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)的聽(tīng)力損失。近十年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，部分氨基糖甙類(lèi)抗生素致聾患者有母系遺傳家族史，并與線粒體DNA12SrRNA基因(以下簡(jiǎn)稱(chēng)為線粒體基因，或mtDNA)第1555位A→G均質(zhì)性點(diǎn)突變有關(guān)(PrezantTR等，Nat Genet,1993，4289-294；袁慧軍等，中華耳鼻咽喉科雜志，1998，3367-70)。單次劑量的氨基糖甙類(lèi)藥物應(yīng)用即可導(dǎo)致攜帶此突變個(gè)體的重度聽(tīng)力損失。根據(jù)目前己有的研究結(jié)果可知，幾乎攜帶此突變的個(gè)體在應(yīng)用不同劑量的氨基糖甙類(lèi)抗生素后均發(fā)生嚴(yán)重或較嚴(yán)重的聽(tīng)力損失，是后天性獲得性耳聾發(fā)生的重要原因。鑒于這一耳聾的有明確的基因變化和誘發(fā)因素，使得這種耳聾成為一種可以預(yù)防的疾病。
在中國(guó)己報(bào)道的線粒體基因1555A→G(mtDNA1555A→G)突變母系遺傳耳聾家系己超過(guò)50個(gè)，各家系發(fā)病人數(shù)從2-50人不等，考慮到尚有很多同類(lèi)家系尚未被發(fā)現(xiàn)報(bào)道，以及此突變?cè)谏l(fā)性耳聾的致病機(jī)制中占有一定的比例，對(duì)這種耳聾的預(yù)防變得更為重要。其預(yù)防的關(guān)鍵環(huán)節(jié)在于通過(guò)篩查，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)攜帶mtDNA1555A→G突變的個(gè)體，絕對(duì)禁止此類(lèi)個(gè)體接觸氨基糖甙類(lèi)抗生素，從而避免嚴(yán)重的耳毒性反應(yīng)發(fā)生。
自1993年以耒，對(duì)此突變的檢測(cè)除了直接測(cè)序外，最常用的篩選方法為BsmA1(Alw261)酶切法(Fische1-Ghodsian等，AmJOtolaryngol，1993，14399-403；Fischel-Ghodsian等，AmJOtolaryngol，1997b，18173-178；袁慧軍等，中華耳鼻咽喉科雜志，1998，3367-70)。在國(guó)內(nèi)外，普遍應(yīng)用限制性酶BsmAI(Alw26I)酶切配合序列分析鑒定有無(wú)mtDNA1555A→G突變，酶切鑒定方便快捷，結(jié)果可靠，但不足的是BsmAI(Alw26I)價(jià)格較貴，與常用的限制性酶相比，價(jià)格差異達(dá)50-100倍，因此，迫切需要一種簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確而且成本低的檢測(cè)方法，以滿(mǎn)足對(duì)mtDNA1555A→G突變進(jìn)行廣泛篩查的需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)目前檢測(cè)mtDNA1555A→G突變的方法所存在的缺點(diǎn)，提供一種簡(jiǎn)單、快速、成本低的檢測(cè)母系遺傳性耳聾mtDNA1555A→G突變的方法；本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供檢測(cè)母系遺傳性耳聾mtDNA1555A→G突變的試劑盒；本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供本發(fā)明的試劑盒在預(yù)防母系遺傳性耳聾中的應(yīng)用。
本發(fā)明的目的通過(guò)下述的方案實(shí)現(xiàn)使用GenetoolLite程序(美國(guó)Biotools公司提供的軟件)協(xié)助設(shè)計(jì)引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增，在被測(cè)樣本的PCR擴(kuò)增片段上產(chǎn)生定點(diǎn)突變，從而在該基因的1555位鄰近引入一個(gè)包括1555位在內(nèi)的新的限制性酶切位點(diǎn)，然后用相應(yīng)的限制性酶消化，檢測(cè)該突變的存在。其中所設(shè)計(jì)的引物中，正向引物是線粒體DNA的核苷酸1463-1482，其序列為序列表中的SEQIDNO1；反向引物是線粒體DNA的核苷酸1575-1556，其中1557位的A置換為C，其序列為序列表中的SEQIDNO2；引入的新的限制酶位點(diǎn)為HaeIII，其識(shí)別序列位于線粒體DNA的核苷酸1554-1557。本發(fā)明人還利用本發(fā)明的方法和設(shè)計(jì)的引物提供用于體外檢測(cè)母系遺傳耳聾線粒體基因1555位A→G突變的試劑盒，用于體外檢測(cè)母系遺傳耳聾線粒體基因1555位A→G突變，該試劑盒含有1.提取血樣DNA的試劑；2.PCR擴(kuò)增反應(yīng)試劑，包括dNTP、10XPCR緩沖液、Mg++、三蒸水、Taq酶；3.等比例混合的權(quán)利要求2所述的正向引物和反向引物；4.限制性酶HaeIII及其配套的緩沖液；5.陽(yáng)性標(biāo)本對(duì)照、陰性標(biāo)本對(duì)照，以及6.使用說(shuō)明書(shū)。
在本發(fā)明的實(shí)施方案中，引物設(shè)計(jì)的指導(dǎo)思想是在1555位點(diǎn)鄰近的2-4個(gè)堿基引入一個(gè)堿基替換，造成可能的能夠鑒別mtDNA1555野生型(A)和突變型(G)的新的限制性酶切位點(diǎn)。使用GenetoolLite程序協(xié)助設(shè)計(jì)引物，設(shè)計(jì)原則為根據(jù)己知的線粒體基因的序列，使正向引物的3’末端位于1554位，反向引物在1555位的下游約120bp處，或使反向引物的3’末端位于1556位，正向引物在1555位的上游約120bp處，從而使PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物包含1555位核苷酸(參照?qǐng)D1)；同時(shí)分別在1552、1553和1557、1558位引入可能的堿基置換，使形成的新的限制酶識(shí)別序列中包含1555位核苷酸，然后用enetoolLite程序檢索出能鑒別線粒體基因1555野生型(A)和1555突變型(G)的新的限制性酶位點(diǎn)。
應(yīng)用GenetoolLite程序?qū)?553、1552位點(diǎn)分別進(jìn)行所有可能的堿基替換，未發(fā)現(xiàn)能夠鑒別1555A→G突變型和野生型的新增限制性酶切位點(diǎn)；將1557、1558位點(diǎn)分別進(jìn)行所有可能的堿基替換時(shí)，GenetoolLite程序發(fā)現(xiàn)將1557位點(diǎn)的A替換為C時(shí)，在mtDNA1555A→G突變型分子中造成限制性酶HaeIII的識(shí)別序列(GGCC)，其切點(diǎn)在1555和1556之間，而在mtDNA1555野生型分子中無(wú)此序列(其相應(yīng)的序列為GACC)。由此設(shè)計(jì)出反向引物R1為nt1575-nt1556，其中3’端第二個(gè)堿基(1557)為異配堿基(T-G)；正向引物F1為nt1463-1482。F1R1擴(kuò)增子長(zhǎng)113bp。
用以上設(shè)計(jì)的引物F1R1，以被測(cè)樣本的DNA為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增后能夠獲得明亮清晰的略大于100bp條帶，證明反向引物3’端第二個(gè)堿基與模板異配并沒(méi)有影響PCR的效率。F1R1PCR產(chǎn)物包含mtDNA1555位點(diǎn)，若模板為1555A→G突變型分子，則113bp的PCR產(chǎn)物存在HaeOII酶切位點(diǎn)，HaeOII酶切后獲得93bp和20bp兩個(gè)條帶；若模板為mtDNA野生型分子，則113bp的PCR產(chǎn)物不存在HaeOII酶切位點(diǎn)，不能被HaeOII切開(kāi)，酶切后仍是113bp一個(gè)條帶。利用此區(qū)別，可以對(duì)1555A→G突變型分子進(jìn)行簡(jiǎn)單、快速的測(cè)定。
本發(fā)明者還根據(jù)本發(fā)明中設(shè)計(jì)的引物序列，通過(guò)人工合成(通過(guò)給定序列由自動(dòng)化核酸合成儀合成)獲得引物，并與提取血樣DNA的試劑；PCR擴(kuò)增反應(yīng)試劑，包括dNTP、10×PCR緩沖液、Mg++、三蒸水、Taq酶；限制性酶HaeOII及其配套的緩沖液；陽(yáng)性標(biāo)本對(duì)照、陰性標(biāo)本對(duì)照，以及使用說(shuō)明書(shū)組合起來(lái)，提供了用于體外檢測(cè)母系遺傳耳聾線粒體基因1555位A→G突變的試劑盒，其主要功能在于將所有試劑集成在一個(gè)小盒內(nèi)，使得DNA提取、核酸片段擴(kuò)增、酶切鑒定可以在試劑盒提供的試劑基礎(chǔ)上順序完成。根據(jù)取血方式或被測(cè)樣本形式的不同，本發(fā)明的試劑盒有三種類(lèi)型可供選用，三種類(lèi)型中除了提取血樣DNA的試劑外，其余組分都相同。一型試劑盒的提取血樣DNA的試劑為用作DNA裂解液的溶液1，其主要成分是Chelex(ABI公司產(chǎn)品)，適用于足跟血血片被測(cè)樣本；二型試劑盒的提取血樣DNA的試劑為外周血DNA試劑盒(選用市售產(chǎn)品配套使用)，適用于外周血被測(cè)樣本；三型試劑盒不含提取血樣DNA的試劑，適用于直接提供DNA的被測(cè)樣本。
用本發(fā)明的方法檢測(cè)母系遺傳耳聾線粒體基因1555位A→G突變與現(xiàn)有技術(shù)BsmAI酶切鑒定方法相比有以下優(yōu)點(diǎn)1.本發(fā)明的HaeIII酶切法的操作步驟及所需時(shí)間與BsmAI酶切鑒定方法基本相同，但BsmAI酶需要從國(guó)外購(gòu)買(mǎi)，供應(yīng)不及時(shí)，而且價(jià)格昂貴，而HaeOII限制性酶國(guó)內(nèi)供應(yīng)源豐富，成本極低，其價(jià)格僅為BsmAI的1/50-1/100，這些特點(diǎn)為在全國(guó)范圍內(nèi)實(shí)行mtDNA1555A→G突變的篩查和抗生素應(yīng)用前預(yù)防性檢測(cè)提供了便利的條件，從而從根本上減少對(duì)氨基糖甙類(lèi)抗生素敏感的個(gè)體發(fā)生藥物性耳聾的機(jī)會(huì)。
2.本發(fā)明的方法用HaeOII酶切突變型分子，A→G突變型分子能被HaeIII切開(kāi)，酶切陽(yáng)性直接表示mtDNA1555A→G突變的存在；而B(niǎo)smAI切的是野生型分子，A→G突變型分子不能被BsmAI切開(kāi)，在這種情況下，被測(cè)樣本除了A→G突變的可能外，不排除其他突變的可能，因此，本發(fā)明的方法更直接、可靠。


圖1是本發(fā)明的引物設(shè)計(jì)方案示意圖。
A正向引物的3’末端位于1554位，反向引物在1555位的下游約120bp處；B反向引物的3’末端位于1556位，正向引物在1555位的上游約120bp處；圖1中，1表示mtDNA；2表示正向引物；3表示反向引物；O表示核苷酸位置。
圖2是母系遺傳耳聾家系13的系譜圖。圖中□代表男性個(gè)體；O代表女性個(gè)體；黑色圖標(biāo)代表發(fā)病個(gè)體； 代表先證者；/代表已死亡的個(gè)體。
圖3是HaeOII酶切法鑒定mtDNA1555A→G突變的2％瓊脂糖凝膠電泳圖。
泳道1-3、5-7mtDNA1555A-G突變患者；泳道4、8正常個(gè)體；泳道9分子量標(biāo)志(100bp間隔)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例一母系遺傳耳聾家系線粒體基1555A→G突變的檢測(cè)1.檢測(cè)樣本選擇以母系遺傳為傳遞特征的耳聾家系14個(gè)，總?cè)藬?shù)為301人，其中耳聾患者共84人，受檢者中，耳聾患者為33人，與耳聾家系無(wú)關(guān)的正常聽(tīng)力個(gè)體11人，從被檢個(gè)體提取外周全血DNA(袁慧軍等，中華耳鼻咽喉科雜志，1998，33(2)67-70；李為民等，臨床耳鼻咽喉科雜志，2001，15(增刊)53-58)，作為檢測(cè)樣本。14個(gè)家系綜合情況見(jiàn)表1，其中家系13的系譜圖見(jiàn)圖2。其余家系的疾病傳遞方式均與家系13類(lèi)似，每個(gè)家系均有患者應(yīng)用過(guò)氨基糖甙類(lèi)抗生素，特點(diǎn)為女性患者若應(yīng)用過(guò)AmAn均發(fā)病早、耳聾程度重，若未用過(guò)AmAn則聽(tīng)力正?；蚨@發(fā)病晚，程度輕。
2.引物設(shè)計(jì)使用GenetoolLite程序協(xié)助設(shè)計(jì)改良引物，根據(jù)己公開(kāi)的線粒體基因劍橋序列(CambridgeSequence)，引物的設(shè)計(jì)方案有2種(1)使正向引物的3’末端位于1554位，反向引物在1555位的下游約120bp處(參照?qǐng)D1，A)；(2)使反向引物的3’末端位于1556位，正向引物在1555位的上游約120bp處(參照?qǐng)D1，B)，從而使PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物包含1555位核苷酸。同時(shí)分別在1552、1553和1557、1558位引入可能的堿基置換，使形成的新的限制酶識(shí)別序列中包含1555位核苷酸，然后用GenetoolLite程序檢索出能鑒別線粒體基因1555野生型(A)和1555突變型(G)的新的限制酶位點(diǎn)。應(yīng)用GenetoolLite程序?qū)?553、1552位點(diǎn)分別進(jìn)行所有可能的堿基替換，未發(fā)現(xiàn)能夠鑒別1555A→G突變型和野生型的新增酶切位點(diǎn)；將1557、1558位點(diǎn)分別進(jìn)行所有可能的堿基替換，GenetoolLite程序發(fā)現(xiàn)將1557位點(diǎn)的A替換為C時(shí)，在mtDNA1555A→G突變型分子中造成限制性酶HaeOII的識(shí)別序列(GGCC)，其切點(diǎn)在1555和1556之間，而在mtDNA1555野生型分子中無(wú)此序列(其相應(yīng)的序列為GACC)。由此設(shè)計(jì)出反向引物R1為mtDNAnt1575-nt1556，即5′-ACTTACCATGTTACGACTGG-3′，其中3’端第二個(gè)堿基(1557)為異配堿基(T-G)，該序列設(shè)定為SEQIDNO2；另外，設(shè)計(jì)正向引物F1為mtDNAnt1463-1482，即5′-GGCCCTGAAGCGCGTACACA-3′，該序列設(shè)定為SEQIDNO1，F(xiàn)1R1擴(kuò)增子長(zhǎng)113bp。
3.PCR擴(kuò)增反應(yīng)根據(jù)上述設(shè)計(jì)的引物序列SEQIDNO1和SEQIDNO2，通過(guò)人工合成(通過(guò)給定序列由自動(dòng)化核酸合成儀合成)得到正向引物F1和反向引物R1，并以上述提取的被測(cè)樣本周邊血DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)反應(yīng)體系模板50ng引物F1，R1 各50ng10×dNTP5μl10×Buffer 5μlMg++終濃度1.5mmol/LTaq酶 1.0u加三蒸水至50μl體積。
反應(yīng)條件95變性5分鐘后，接著94℃變性30秒，50℃退火30秒，72℃延伸30秒，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后在72℃下再延伸7分鐘。
用2％瓊脂糖凝膠電泳檢查產(chǎn)物。PCR擴(kuò)增后F1R1能夠獲得明亮清晰的略大于100bp條帶，證明反向引物3’端第二個(gè)堿基與模板異配并沒(méi)有影響PCR的效率，F(xiàn)1R1PCR產(chǎn)物包含mtDNA1555位點(diǎn)，若模板為1555A→G突變型分子，則113bp的PCR產(chǎn)物存在HaeIII酶切位點(diǎn)，HaeIII酶切后獲得93bp和20bp兩個(gè)條帶；若模板為mtDNA野生型分子，則113bp的PCR產(chǎn)物不存在HaeIII酶切位點(diǎn)，不能被HaeIII切開(kāi)，酶切后仍是113bp一個(gè)條帶。
4.HaeIII酶切檢測(cè)被測(cè)樣本的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物按下述條件檢測(cè)1555A→G突變。酶切反應(yīng)體系PCR產(chǎn)物 12-18μl10x緩沖液 3μlHaeIII限制性酶5-10uBSA 0.3μl三蒸水補(bǔ)足體積至30μl，35℃溫育1小時(shí)。酶切反應(yīng)物用2％瓊脂糖凝膠檢查。
5.結(jié)果如表1所示，在總共14個(gè)家系中，13個(gè)家系的33個(gè)耳聾患者的F1R1擴(kuò)增產(chǎn)物(113bp)可以被HaeIII切成93bp和20bp兩條帶，表明其存在mtDNA1555A-G突變(參見(jiàn)圖2的泳道1-3、5-7)。另一個(gè)家系內(nèi)的一個(gè)耳聾患者的F1R1擴(kuò)增產(chǎn)物不能被HaeIII切開(kāi)，表明此家系內(nèi)不存在mtDNA1555A-G突變(表1中的家系3)，11名與患者無(wú)血緣關(guān)系的家系內(nèi)個(gè)體以及正常對(duì)照個(gè)體的F1R1擴(kuò)增產(chǎn)物均不能被HaeIII切開(kāi)(參見(jiàn)圖2的泳道4、8)，表明其不存在mtDNA1555A→G突變。
6.HaeIII酶切法可靠性的檢驗(yàn)所有被檢測(cè)個(gè)體的1555位點(diǎn)均經(jīng)過(guò)BamAI(Alw261)酶切檢驗(yàn)(袁慧軍等，中華耳鼻咽喉科雜志，1998，33(2)67-70；李為民等，臨床耳鼻咽喉科雜志，2001，15(增刊)53-58)，如表1所示，其結(jié)果證明根據(jù)HaeIII酶切表明其攜帶1555A→G突變的33個(gè)耳聾患者，其含有1555位點(diǎn)的擴(kuò)增產(chǎn)物均不能被BamAI切開(kāi)；而HaeIII酶切表明不攜帶1555A→G突變的11個(gè)正常個(gè)體，其含有1555位點(diǎn)的擴(kuò)增產(chǎn)物均能被BamAI切開(kāi)。家系3亦表現(xiàn)為母系遺傳性氨基糖甙類(lèi)敏感的耳聾家系，此家系的一個(gè)女性受檢者HaeOII酶切表明其不攜帶1555A-G突變，經(jīng)BamAI(Alw26I)酶切法進(jìn)一步檢測(cè)，此患者及其兩個(gè)妹表1母系遺傳家系情況及線粒體1555位點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果

1AmAn氨基糖甙類(lèi)抗生素妹、及她們的三個(gè)子女均表明無(wú)1555A-G突變。兩種酶切方法的吻合率為100％，說(shuō)明使用本發(fā)明方法檢測(cè)1555A→G突變的可靠性和穩(wěn)定性。
此外，每個(gè)家系均選取至少1例患者經(jīng)酶切檢測(cè)表明具有1555A→G突變的DNA標(biāo)本進(jìn)行1555位點(diǎn)的直接測(cè)序檢查，結(jié)果除家系3外，測(cè)序結(jié)果均顯示mtDNA1555位點(diǎn)發(fā)生A→G的替換，與HaeIII酶切法的結(jié)果完全一致。
實(shí)施例二體外檢測(cè)母系遺傳耳聾線粒體基因1555位A→G突變的一型試劑盒及其應(yīng)用1.適用于足跟血片的一型試劑盒(100人份)包含以下組分(1)溶液I(主要成份為5％Chelex)25ml；(2)PCR試劑(包括8mM dNTP 150μl、10×PCR緩沖液1ml、25mM Mg++溶液1ml、三蒸水1ml×4管、5u/μl Taq酶25μl)；(3)正向引物mtDNAnt1463-1482；反向引物mtDNAnt1575-1556，其中mtDNAnt1557位堿基A突變?yōu)镚，正反向引物按等比例混合(濃度均為10μM)，共150μl；(4)限制性酶HaeOII，20u/μl，110μl及配套的10x緩沖液1ml；(5)陽(yáng)性對(duì)照標(biāo)本125μl、陰性對(duì)照標(biāo)本125μl；(6)使用說(shuō)明書(shū)。
2.檢測(cè)對(duì)象選擇家系13(見(jiàn)表1)為被測(cè)家系，該家系共有4代25個(gè)成員，共有8名耳聾患者，發(fā)病前均有氨基糖甙類(lèi)抗生素用藥史。本實(shí)施例選擇其中4名耳聾患者為受檢對(duì)象。
3.檢測(cè)方法及結(jié)果按照本試劑盒的使用說(shuō)明書(shū)，用溶液I(主要成份為5％Chelex)提取受檢者的足根血血片DNA，并取50ng作為模板，加入引物混合物100ng、10×dNTP 5μl、10x緩沖液5μl、Mg++終濃度為1.5mmol/L，加三蒸水至50μl后，加1.0u Taq酶，95℃變性5分鐘后，接著94℃變性30秒，50℃退火30秒，72℃延伸30秒，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后在72℃下再延伸7分鐘。按同樣的PCR反應(yīng)條件，用試劑盒內(nèi)提供的1555A→G陽(yáng)性模板和陰性模板同時(shí)作陽(yáng)性和陰性對(duì)照PCR反應(yīng)，并設(shè)立無(wú)模板PCR空白對(duì)照管，反應(yīng)后用2％瓊脂糖凝膠電泳檢查擴(kuò)增產(chǎn)物，結(jié)果，無(wú)模板對(duì)照物未見(jiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物，4名患者及陽(yáng)性、陰性對(duì)照標(biāo)本的PCR產(chǎn)物均為113bp。PCR產(chǎn)物用HaeIII酶切檢測(cè)，酶切反應(yīng)體系為30μl，包括10x緩沖液3μl100×BSA 0.3μlHaeIII 20uPCR產(chǎn)物 12-18μl以三蒸水補(bǔ)足體積，30℃溫育1小時(shí)。酶切反應(yīng)物用2％瓊脂糖凝膠電泳檢查，4名耳聾患者及陽(yáng)性對(duì)照的PCR產(chǎn)物可見(jiàn)93bp和20bp條帶，表明mtDNA1555A→G突變陽(yáng)性；陰性對(duì)照僅見(jiàn)113bp條帶，表明無(wú)mtDNA1555A→G突變。進(jìn)一步用Alw26酶切和測(cè)序證實(shí)此4名患者均攜帶mtDNA1555A→G突變。
實(shí)施例三體外檢測(cè)母系遺傳耳聾線粒體基因1555位A→G突變的二型試劑盒及其應(yīng)用本實(shí)施例選擇家系2(參見(jiàn)表1)的6名耳聾患者中的3名為受檢對(duì)象。除了受檢樣本為周邊血，以及試劑盒中的血樣DNA提取劑為市售的周邊DNA提取試劑盒，并用該試劑盒提取周邊血DNA以外，試劑盒中其他組分和檢測(cè)方法與實(shí)施例二相同。檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。
實(shí)施例四體外檢測(cè)母系遺傳耳聾線粒體基因1555位A→G突變的三型試劑盒及其應(yīng)用本實(shí)施例選擇家系11(參見(jiàn)表1)的6名耳聾患者中的3名為受檢對(duì)象。除了受檢樣本為從血樣提取的DNA，以及試劑盒中不含血樣DNA提取劑以外，試劑盒中其他組分和檢測(cè)方法與實(shí)施例二相同。檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。
本發(fā)明用于體外檢測(cè)母系遺傳耳聾線粒體基因1555位A→G的突變。
母系遺傳耳聾線粒體基因.ST25SEQUENCE LISTING<110>戴，樸<120>母系遺傳耳聾線粒體基因A-G突變的檢測(cè)方法及其試劑盒<130>Patentln3.1<160>2<170>Patentlnversion3.1<210>1<211>20<212>DNA<213>Homo sapiens<400>1ggccctgaag cgcgtacaca 20<210>2<211>20<212>DNA<213>Homo sapiens<400>2acttaccatg ttacgactgg 20
權(quán)利要求
1.一種母系遺傳耳聾線粒體基因1555位A→G突變的檢測(cè)方法，其特征在于該方法使用Genetool Lite程序協(xié)助設(shè)計(jì)引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增，在被測(cè)樣本的PCR擴(kuò)增片段上產(chǎn)生定點(diǎn)突變，從而在該基因的1555位鄰近引入一個(gè)包括1555位在內(nèi)的新的限制性酶位點(diǎn)，然后用相應(yīng)的限制性酶消化，檢測(cè)該突變的存在。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于其中所設(shè)計(jì)引物中，正向引物是線粒體DNA的核苷酸1463-1482，其序列為序列表中的SEQIDNO1；反向引物是線粒體DNA的核苷酸1575-1556，其中1557位的A置換為C，其序列為序列表中的SEQIDNO2。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于其中PCR擴(kuò)增后引入的新的限制性酶位點(diǎn)為HaeIII。
4.制備根據(jù)權(quán)利要求2所述方法的體外檢測(cè)母系遺傳耳聾線粒體基因1555位A→G突變的試劑盒，其特征在于該試劑盒含有(1)提取血樣DNA的試劑；(2)PCR擴(kuò)增反應(yīng)試劑，包括dNTP、10×PCR緩沖液、Mg++、三蒸水、Taq酶；(3)等比例混合的權(quán)利要求2所述的正向引物和反向引物；(4)限制性酶HaeIII及其配套的緩沖液；(5)陽(yáng)性標(biāo)本對(duì)照、陰性標(biāo)本對(duì)照；(6)使用說(shuō)明書(shū)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于其中所說(shuō)的提取血樣DNA的試劑為提取足根血DNA的溶液I，其主要成分為Chelex。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于其中所說(shuō)的提取血樣DNA的試劑為外周血DNA提取試劑盒。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于其中包含除所說(shuō)的提取血樣DNA的試劑以外的其他組成和使用說(shuō)明書(shū)。
全文摘要
本發(fā)明涉及母系遺傳耳聾線粒體基因1555位A→G突變的檢測(cè)方法。該方使用GenetoolLite程序協(xié)助設(shè)計(jì)改良引物，通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)引入新的限制酶位點(diǎn)HaeIII，再用相應(yīng)的酶切反應(yīng)檢測(cè)A→G突變。本發(fā)明還涉及制備根據(jù)該方法的體外檢測(cè)母系遺傳耳聾線粒體基因1555位A→G突變的試劑盒，以及該試劑盒在檢測(cè)所說(shuō)的A→G突變中的應(yīng)用。該方法簡(jiǎn)單、成本低，檢測(cè)結(jié)果直接、可靠，適用于對(duì)母系遺傳耳聾線粒體基因1555位A→G突變的大規(guī)模的篩查或預(yù)防性檢查。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1490415SQ0315676
公開(kāi)日2004年4月21日 申請(qǐng)日期2003年9月10日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月10日
發(fā)明者戴樸, 袁慧軍, 李為民, 曹菊陽(yáng), 戴 樸 申請(qǐng)人:戴樸, 戴 樸