專利名稱：一種施氏假單胞菌菌株的制備及其在對含硫有機化合物脫硫中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種施氏假單胞菌菌株的制備及其在對含硫有機化合物脫硫中的應用，該菌株為Pseudomonas stutzeri UP-1，于2003年6月31日保藏于“中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物保藏中心”，其保藏號CGMCC NO.0974；它主要來源于含硫較高的油田污水、油田污泥以及被油污染的土壤中，該菌株可通過特定的培養(yǎng)、分離和制備手段得到，它的培養(yǎng)基液體細胞、靜息細胞和固定化細胞均能通過Kodama路線作用于含硫有機化合物，生成溶于水的含硫有機物。
現(xiàn)有技術21世紀是環(huán)保世紀，世界煉油工業(yè)在環(huán)保和工藝方面都面臨許多挑戰(zhàn)和機遇。原油中含有硫醇、二硫化物、砜、硫醚、噻吩和其它結構更復雜的有機硫化物。盡管在煉油過程采取了多種方法脫硫，但在汽油、柴油等成品油中仍然會含有一定的硫化物。在汽油、柴油等石油產(chǎn)品的使用過程中，硫會以各種方式排入環(huán)境，造成嚴重污染，破壞生態(tài)平衡。所以當今世界各國對石油產(chǎn)品的含硫量限制日愈嚴格(徐承恩.煉油設計，2000，31(3)1-4)。例如，美國從2000年1月1日開始實施新配方汽油第二階段規(guī)格，汽油含硫量從原來的340×10-6g/g降低到200×10-6g/g以下；2000年歐盟也規(guī)定汽油含硫量要降低到150×10-6g/g，2005年要進一步降低到50×10-6g/g。然而在對成品油含硫量限制越來越高的同時，目前世界開采出石油的含硫量也越來越高。而且煉油廠在脫硫的同時也同時污染了環(huán)境，因此，探索和研究經(jīng)濟有效并且對環(huán)境友好的石油脫硫技術的綠色工藝已成為21世紀石油化工最為緊迫的任務之一。
近年來，國外正在開發(fā)一種新的脫硫技術——生物催化脫硫(BDS)(Daniel J.Monticello.Chemtech，1998，28(7)38-45)。該技術是建立在生物工程基礎上的嶄新技術，被譽為21世紀的石油脫硫技術。石油生物催化脫硫技術是利用生物體內(nèi)的酶催化氧化石油中含硫組分，使其轉化成為水溶性的化合物(如石油磺酸鹽或硫酸鹽)，通過油水分離后即可實現(xiàn)石油脫硫的目的。石油的總硫含量在0.03％～7.89％之間，除元素硫、硫化物外，還有硫醇、噻吩、苯并噻吩、二苯并噻吩類及更復雜的含硫有機化合約200種。在實驗中為了考察機理的方便常以二苯并噻吩(DBT)作為模型化合物來研究各種微生物脫除有機硫的性能。
早在1935年就有人進行生物脫硫方面的研究，并且在1948年第一項石油生物脫硫技術的專利在美國發(fā)表，但是這些技術一直沒能實現(xiàn)工業(yè)化，主要原因是這些微生物在脫除有機硫的同時還消耗掉大量的烷烴，生物催化劑缺少最基本的作用底物專一性條件。直到1988年美國氣體技術研究院(IGT)在生物催化脫硫方面取得了重大的突破，分離了兩種特殊的菌種，可以選擇性地從二苯并噻吩(DBT)中脫除硫，并于1992年獲得美國專利(USA5002888和USA5104801)。但是，該技術的缺點是脫硫比活性較低，其生長細胞對模型化合物二苯并噻吩(DBT)的降解率為80％(DBT含量500ppm)，靜息細胞的活性更低，同時其使用微生物菌株的活細胞，造成反應體系后續(xù)分離困難，微生物易流失和難以回收。
目前，對于DBT的降解，基本搞清楚了它們作用于DBT的代謝過程中的中間代謝物，其代謝途徑有以下幾種(1)DBT的碳骨架被專一氧化而C-S鍵依然保留。(2)DBT被徹底地降解為二氧化碳、水和無機硫。(3)專一地切斷DBT的C-S鍵生成聯(lián)苯途徑。然而，三種途徑各有優(yōu)缺點，本發(fā)明涉及菌株屬于第一種代謝途徑，能降低碳值的損失，縮短反應時間，提高代謝副產(chǎn)物的經(jīng)濟價值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就在于避免上述現(xiàn)有技術的不足之處而提供了一種施氏假單胞菌菌株的制備及其在對含硫有機化合物脫硫中的應用技術。它主要是通過在含硫較高的油田污水、油田污泥以及被油污染的土壤中篩選具有降解有機硫化物能力的天然菌種，在此基礎上進行誘變，得到高效穩(wěn)定的催化氧化有機硫化物的生物催化劑，并開發(fā)出了其固定化細胞和復合酶體系在脫除化石燃料中有機硫的應用。其技術特點是含硫較高的油田污水、油田污泥以及被油污染的土壤中，并通過特定的培養(yǎng)和分離技術得到菌株，而該菌株適宜在弱堿性培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度31℃；其細菌學特征菌落形態(tài)為乳黃色；革蘭氏染色陰性、不抗酸；細胞呈現(xiàn)直或彎曲桿狀，但不是螺旋狀，不成鏈；大小0.6～0.8×1.4～2.0μm；有極生鞭毛，能運動；不形成芽孢，無鞘或突起物；未觀察到聚-β羥丁酸顆粒；不產(chǎn)生熒光色素；該菌株為Pseudomonas stutzeri UP-1，于2003年6月31日保藏于“中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物保藏中心”，其保藏號CGMCC NO.0974。它的培養(yǎng)、分離和篩選步驟如下1.樣品的采集從油田污水、油田污泥以及被油污染的土壤中采集樣品；2.富集液的制備取樣品5克或5ml放入加有50mgDBT的50ml基本鹽溶液(在每升蒸餾水中加入4g Na2HPO4，2g(NH4)2SO4.0.2g MgSO4.7H2O，0.001g CaCl2，0.001g FeSO4.7H2O，PH為7.0，20分鐘121℃高壓滅菌)中，在31℃、200r/min的條件下培養(yǎng)10天，然后轉入含有50mgDBT的NBYE培養(yǎng)基(基本鹽溶液中再加入0.8％的牛肉浸膏、和0.5％的酵母浸膏)中在同樣的條件下培養(yǎng)4天，取5ml的上述培養(yǎng)物接入同樣的培養(yǎng)基中再培養(yǎng)4天，連續(xù)4次這種操作得到最后的培養(yǎng)物富集液；3.菌落的制備把得到的富集培養(yǎng)物稀釋到1012，然后取1μL涂布在盛有固體桑塔斯培養(yǎng)基(蛋白胨10g，葡萄糖10g，酶水解干酪素2g，酵母浸粉2g，NaCl 6g，蒸餾水1000ml，pH7.5)的培養(yǎng)皿中，然后放入生化培養(yǎng)箱中31℃條件下培養(yǎng)4天，待平板上的菌落長出后在凈化工作臺里在平板培養(yǎng)基上的菌落噴上一層DBT，然后在31℃條件下的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2天，然后分別在可見光和熒光下觀察顏色的變化，挑選能使二苯并噻吩的顏色發(fā)生變化的菌落；4.菌落的分離將得到的菌落采用平板劃線的方法純化，具體操作將接種環(huán)或接種針在酒精燈上灼燒，然后從待純化的菌落或待分離的斜面菌種中沾取少量菌樣，在相應的培養(yǎng)基平板中劃線分離，劃線的方法主要有連續(xù)劃線法和分區(qū)劃線法，重復此步驟的操作，直到獲得單一菌落為止，此時即可得到一種對二苯并噻吩具有專一脫硫效果的施氏假單胞菌Pseudomonas Stutzeri UP-1。
將采用上述方法分離制備的施氏假單胞菌菌株可以作用生物脫硫催化劑而應用于含硫有機化合物的脫硫過程中，其方法是將該Pseudomonas Stutzeri UP-1菌株按照Kodama路線作用于含硫有機化合物，生成溶于水的含硫有機化合物，通過后續(xù)分離達到脫硫的目的，主要有以下幾種方式1.將Pseudomonas stutzeri UP-1菌株的生長細胞培養(yǎng)液通過Kodama路線作用于含硫有機化合物，生成溶于水的含硫有機物。
2.將Pseudomonas stutzeri UP-1菌株的靜息細胞通過Kodama路線作用于含硫有機化合物，生成溶于水的含硫有機物。
3.將Pseudomonas stutzeri UP-1菌株的固定化細胞通過Kodama路線作用于含硫有機化合物，生成溶于水的含硫有機物。
4.將Pseudomonas stutzeri UP-1菌株的復合酶體系通過Kodama路線作用于含硫有機化合物，生成溶于水的含硫有機物。


圖1菌株UP-1的透射電鏡照片；
圖2菌株UP-1降解DBT路線；圖3菌株UP-1降解DBT曲線；圖4固定化UP-1降解DBT曲線其中，■——為DBT加入量500ppm；●——為DBT加入量625ppm；▲——為DBT加入量750ppm。
具體實施例方式
下面將結合附圖及實施例進一步描述本發(fā)明的技術特點實施例1本發(fā)明所述的Pseudomonas stutzeri UP-1菌株的篩選1.從勝利油田孤島油區(qū)的油田污水、油田污泥以及油井附近被油污染的土壤中采集樣品，來做進一步分離和篩選用。取樣品5克(或5ml)放入加有50mgDBT的50ml基本鹽溶液(組成在每升蒸餾水中加入4g Na2HPO4，2g(NH4)2SO4.0.2g MgSO4.7H2O，0.001gCaCl2，0.001g FeSO4.7H2O，PH為7.0，20分鐘121℃高壓滅菌)中，在31℃、200r/min的條件下培養(yǎng)10天，然后轉入含有50mgDBT的NBYE培養(yǎng)基(基本鹽溶液中再加入0.8％的牛肉浸膏、和0.5％的酵母浸膏)中在同樣的條件下培養(yǎng)4天，取5ml的上述培養(yǎng)物接入同樣的培養(yǎng)基中再培養(yǎng)4天，連續(xù)4次這種操作得到最后的培養(yǎng)物富集液；2.把得到的富集培養(yǎng)物稀釋到1012，然后取1μL涂布在盛有固體桑塔斯培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，然后放入生化培養(yǎng)箱中31℃條件下培養(yǎng)4天。根據(jù)文獻報道，假單胞菌屬的某些菌種能把二苯并噻吩降解為在可見光下為黃色或褐色的代謝物；紅球菌屬的某些菌種能把二苯并噻吩降解為在紫外線的波長下發(fā)出紅色熒光的物質，因此根據(jù)這個特點來篩選菌種，待平板上的菌落長出后在凈化工作臺里在平板培養(yǎng)基上的菌落噴上一層DBT，然后在31℃條件下的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2天，然后分別在可見光和熒光下觀察顏色的變化，挑選能使二苯并噻吩的顏色發(fā)生變化的菌落做進一步的研究；3.將得到的菌落采用平板劃線的方法純化。具體操作將接種環(huán)或接種針在酒精燈上灼燒，然后從待純化的菌落或待分離的斜面菌種中沾取少量菌樣，在相應的培養(yǎng)基平板中劃線分離，劃線的方法主要有連續(xù)劃線法和分區(qū)劃線法，其目的是獲得單個菌落。此步驟可重復操作，直到獲得單一菌落為止。結果，選擇到一種對二苯并噻吩具有專一脫硫效果的施氏假單胞菌Pseudomonas Stutzeri UP-1。
該Pseudomonas Stutzeri UP-1菌株適宜在弱堿性培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度31℃。
它的細菌學特征革蘭氏染色陰性、不抗酸；細胞呈現(xiàn)直或彎曲桿狀，但不是螺旋狀，不成鏈；大小0.6～0.8×1.4～2.0μm；有極生鞭毛，能運動；不形成芽孢，無鞘或突起物；未觀察到聚-β羥丁酸顆粒；不產(chǎn)生熒光色素。
它的培養(yǎng)特征酵母膏蛋白胨瓊脂，營養(yǎng)瓊脂和桑特斯瓊脂培養(yǎng)基上31℃培養(yǎng)1-3天后觀察菌落形態(tài)和顏色；結果表1。
表1

它的的生理生化特征參照《Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology》Vol.III和《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》的相關內(nèi)容進行生理生化測定；結果見表2。
表2

注“+”表示陽性反應 “-”表示陰性反應它的16SrDNA分析所得的脫氧核糖核酸的序列如下所示＞3.1(全序列)GCCTAACACATGCAAGTCGAGCGGATGAGTGGAGCTTGCTCCATGATTCAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAATCTGCCTGGTAGTGGGGGACAACGTTTCGAAA
GGAACGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGTGGGGGATCTTCGGACCTCACGCTATCAGATGAGCCTAGGTCGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAAAGGCTCACCAAGGCGACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACTTTAAGTTGGGAGGAAGGGCAGTAAGTTAATACCTTGCTGTTTTGACGTTACCGACAGAATAAGCACCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAG3GTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTCGTTAAGTTGGATGTGAAAGCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATCCAAAACTGGCGAGCTAGAGTATGGCAGAGGGTGGTGGAATTTCCTGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATAGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACCACCTGGGCTAATACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAG表3

根據(jù)該菌株的16srDNA序列與GenBank中的相關序列Blast比較的結果見表3，與目前已發(fā)表的相關菌株相比，該菌株與施氏假單胞菌CCUG的序列同源性最高，為100％，可見該菌株屬于假單胞菌進化分枝。再根據(jù)該菌株的細胞革蘭氏陰性、不抗酸，細胞呈桿狀，極生鞭毛，不形成芽孢，無鞘或突起物，屬于假單胞菌屬(Pseudomonas)。根據(jù)多項分類原則，綜合考慮培養(yǎng)特征、生理生化特征和16SrDNA序列分析結果表明該菌株的特征與施氏假單胞菌CCUG不同，故將該菌株定名為Pseudomonas Stutzeri UP-1。
該菌株可以在桑特斯培養(yǎng)基中培養(yǎng)，也可在含硫源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，菌株在31℃下，進行弱堿性好氧培養(yǎng)。
實施例2該Pseudomonas stutzeri UP-1菌株的碳源利用實驗表4是碳源利用實驗結果，它充分表明了該菌株不能以十二烷、十四烷、十六烷、液體石蠟、萘為唯一碳源生長，這說明該菌株不能以油品中占主要成分的飽和份和芳香份作為唯一的碳源，而實驗結果已證明該菌株對模型化合物二苯并噻吩有良好的降解作用，綜合以上實驗結果，該菌株具有工業(yè)上生物催化脫硫用菌的潛力。
表4 實施例3制備Pseudomonas stutzeri UP-1菌株細胞的液體培養(yǎng)液1.桑特斯培養(yǎng)基葡萄糖10g，酵母浸粉2g，酶水解干酪素2g，大豆蛋白胨10g，氯化鈉6g，水1000ml(固體桑特斯培養(yǎng)基的加2％瓊脂)，PH值為7.2(用NaOH調(diào)節(jié))。
2.用接種針從固體桑特斯培養(yǎng)基斜面接Pseudomonas Stutzeri UP-1菌株到250ml的錐形瓶中，錐形瓶中盛有滅過菌的100ml液體桑特斯培養(yǎng)基，于31℃，200轉/分下在恒溫搖床中培養(yǎng)20-24小時，制得Pseudomonas Stutzeri UP-1菌株細胞的液體培養(yǎng)液。
實施例4制備Pseudomonas stutzeri UP-1菌株靜息細胞液將通過實施例3的方法所獲得的菌株UP-1的液體培養(yǎng)液離心分離(10000轉/分，4℃)15分鐘，倒掉上層清液，得到聚集的菌株細胞。用磷酸鹽緩沖液洗滌離心沉淀4次，洗去殘余的培養(yǎng)基養(yǎng)分，將得到的離心沉淀細胞懸浮于磷酸鹽緩沖液中，冷凍保藏在冰箱中備用，即得到Pseudomonas stutzeri UP-1菌株靜息細胞液。
實施例5制備Pseudomonas stutzeri UP-1菌株的固定化細胞(包埋法制備固定化細胞)1.聚乙烯醇包埋通過實施例3的方法所獲得的菌株UP-1；稱取細胞濕重1克，懸浮于20毫升生理鹽水(0.9％)；制備0.1克/毫升的聚乙烯醇溶液，加熱攪拌溶解，室溫下靜置冷卻；將細菌加入20毫升聚乙烯醇溶液，用注射器滴加到飽和的硼酸溶液，使其形成直徑3～5毫米的小球，并浸泡24小時；用生理鹽水洗滌3次備用。
2.瓊脂包埋通過實施例3的方法所獲得的菌株UP-1，稱取濕重5克，加入200加熱溶解的2％瓊脂溶液，倒入平板冷卻凝膠，然后切成小片備用。
3.海藻酸鈉包埋通過實施例3的方法所獲得的菌株UP-1；稱取1克，懸浮于20毫升生理鹽水，加入到20毫升4％的海藻酸鈉膠液中，混合均勻，用注射器滴入2％的氯化鈣溶液中，4℃交聯(lián)成球，小球直徑3～5毫米，交聯(lián)24小時，移入冰箱保藏備用。
實施例6本發(fā)明的液體培養(yǎng)液在降解二苯并噻吩中有機硫的應用1.將已滅菌的DBT配成DBT-N，N-二甲基甲酰胺(DMF)儲液；2.將儲液加入50毫升實施例3培養(yǎng)的細胞液體培養(yǎng)液中，使DBT的濃度為2.7mM；3.將含有DBT的細胞液體培養(yǎng)液移入250毫升錐形瓶，放入恒溫搖床，31℃，200轉/分下反應；4.反應24小時后，在培養(yǎng)液中加入2M的HCL使培養(yǎng)液的PH＝2，然后再加入0.8體積的乙酸乙酯，充分震蕩后，離心混合液、二苯并噻吩及其氧化代謝產(chǎn)物被萃取在上面的乙酸乙酯相中，取1μl進行GC-MS分析，再結合薄層色譜分析得到其降解路線如圖2所示。
實施例7本發(fā)明的靜息細胞在降解二苯并噻吩中有機硫的應用1.將實施例4制得的靜息細胞1克懸浮于盛有50毫升磷酸鹽緩沖液的250毫升錐形瓶，再加入DBT，使其濃度為780ppm；2.按照(1)制得8個同樣的樣品，同時放入恒溫搖床，31℃，200轉/分下反應；每隔一段時間，取出一個樣品測定，得到其降解曲線(如圖3)，由圖可見反應時間為24小時時，降解率不再增加，達到最大值；3.反應24小時，調(diào)節(jié)PH值為2，用正己烷萃取剩余DBT，其濃度為87ppm，降解率為88.8％。
實施例8本發(fā)明的固定化細胞在降解二苯并噻吩中有機硫的應用將實施例5制得的固定化細胞10g和0.02mg加入盛有50毫升水的250毫升錐形瓶，然后放入恒溫搖床，31℃，200轉/分下反應，反應6天后，用正己烷萃取剩余DBT，DBT初始濃度為780ppm，剩余270ppm，降解率為65.4％。圖4是UP-1降解DBT曲線。
實施例9本發(fā)明在脫除模擬燃油體系中二苯并噻吩硫的應用1.要處理的模擬油體系由十四烷加DBT構成；2.將模擬油體系40毫升移入250毫升錐形瓶，121℃消毒滅菌20分鐘；3.將實施例4制得的靜息細胞1克懸浮于10毫升水中，把制得細胞懸浮溶液加入2步驟的錐形瓶中，使DBT濃度為0.27mM，然后放入恒溫搖床，31℃，200轉/分下反應，反應結束后，調(diào)節(jié)PH值為2，用正己烷萃取剩余DBT，用色譜測定其濃度，DBT初始濃度500ppm，降解后模擬油體系剩余DBT濃度270ppm降解率為46％。
實施例10本發(fā)明在脫除加氫脫硫柴油中的有機硫的應用將實施例9中的模擬油體系換成滅菌后的加氫脫硫柴油，其它操作步驟和方法不變，經(jīng)本發(fā)明生物催化脫硫后，柴油的硫含量從231降到176，脫硫率為23.8％。
發(fā)明效果由于本發(fā)明是建立在生物工程基礎上的嶄新技術，主要是利用生物體內(nèi)的酶催化氧化石油中含硫組分，使其轉化成為水溶性的化合物(如石油磺酸鹽或硫酸鹽)，通過油水分離后即可實現(xiàn)石油脫硫的目的。該生物催化脫硫與現(xiàn)有技術的加氫脫硫(HDS)相比具有許多優(yōu)點1.它是在低溫(20～60℃)、常壓下進行反應和不需要氫，從而可以省去制氫裝置。
2.BDS脫出的硫以水溶性化合物形式存在，從而增加經(jīng)濟效益，同時很少有廢液排放，對環(huán)保極為有利。
3.它能有效地除去HDS難以除去的二苯并噻吩(DBT)。
4.對于通常處理困難的物料，如FCC汽油、原油及渣油，BDS都能進行脫硫，能使得FCC汽油不致因加氫后氫飽和而出現(xiàn)辛烷值損失。據(jù)估計，設備投資BDS比HDS低50％，操作費用降低15％。因此BDS是極有前途的石油脫硫新技術。
本發(fā)明提供的Pseudomonas stutzeri UP-1菌株可作為脫硫生物催化劑選擇性氧化含硫有機物，生成3-羥基-2甲醛基-苯并噻吩從而達到脫硫目的；該發(fā)明尤其適用于石油及其產(chǎn)品中有機硫的脫除，該Pseudomonas stutzeri UP-1菌株按照Kodama路線作用于含硫有機化合物，生成溶于水的含硫有機化合物，對二苯并噻吩具有良好的降解能力，有望解決目前石油加氫脫硫工藝不易脫除噻吩類雜環(huán)硫化物的不足；該菌株廣泛存在于高含硫油田的污水和土壤中，來源廣泛，遺傳性能穩(wěn)定，降解產(chǎn)物易于分離。
權利要求
1.一種施氏假單胞菌菌株，它主要來源于含硫較高的油田污水、油田污泥以及被油污染的土壤中，并通過特定的培養(yǎng)和分離技術得到，其特征在于該菌株適宜在弱堿性培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度31℃；其細菌學特征菌落形態(tài)為乳黃色；革蘭氏染色陰性、不抗酸；細胞呈現(xiàn)直或彎曲桿狀，但不是螺旋狀，不成鏈；大小0.6～0.8×1.4～2.0μm；有極生鞭毛，能運動；不形成芽孢，無鞘或突起物；未觀察到聚-β羥丁酸顆粒；不產(chǎn)生熒光色素；該菌株為Pseudomonas stutzeri UP-1，于2003年6月31日保藏于“中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物保藏中心”，其保藏號CGMCC NO.0974。
2.根據(jù)權利要求1所述的施氏假單胞菌菌株，其特征在于該施氏假單胞菌菌株的培養(yǎng)、分離和篩選步驟如下①樣品的采集從油田污水、油田污泥以及被油污染的土壤中采集樣品；②富集液的制備取樣品5克或5ml放入加有50mg二苯并噻吩的50ml基本鹽溶液中，在31℃、200r/min的條件下培養(yǎng)10天，然后轉入含有50mgDBT的NBYE培養(yǎng)基中在同樣的條件下培養(yǎng)4天，取5ml的上述培養(yǎng)物接入同樣的培養(yǎng)基中再培養(yǎng)4天，連續(xù)4次這種操作得到最后的培養(yǎng)物富集液；③菌落的制備把得到的富集培養(yǎng)物稀釋到1012，然后取1μL涂布在盛有固體桑塔斯培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，然后放入生化培養(yǎng)箱中31℃條件下培養(yǎng)4天，待平板上的菌落長出后在凈化工作臺里在平板培養(yǎng)基上的菌落噴上一層二苯并噻吩，然后在31℃條件下的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2天，然后分別在可見光和熒光下觀察顏色的變化，挑選能使二苯并噻吩的顏色發(fā)生變化的菌落；④菌落的分離將得到的菌落采用平板劃線的方法純化，具體操作將接種環(huán)或接種針在酒精燈上灼燒，然后從待純化的菌落或待分離的斜面菌種中沾取少量菌樣，在相應的培養(yǎng)基平板中劃線分離，劃線的方法主要有連續(xù)劃線法和分區(qū)劃線法，重復此步驟的操作，直到獲得單一菌落為止，此時即可得到一種對二苯并噻吩具有專一脫硫效果的施氏假單胞菌Peudomonas stutzeri UP-1。
3.根據(jù)權利要求2所述的施氏假單胞菌菌株，其特征在于所述的基本鹽溶液的組成為在每升蒸餾水中加入4g Na2HPO4，2g(NH4)2SO4，0.2g MgSO4.7H2O，0.001g CaCl2，0.001gFeSO4.7H2O，PH為7.0，20分鐘121℃高壓滅菌；NBYE培養(yǎng)基為基本鹽溶液中再加入0.8％的牛肉浸膏、和0.5％的酵母浸膏。
4.一種施氏假單胞菌菌株在脫除含硫有機化合物中硫的應用，其特征在于將該Pseudomonas stutzeri UP-1菌株按照Kodama路線作用于含硫有機化合物，生成溶于水的含硫有機化合物，通過后續(xù)分離達到脫硫的目的，
5.根據(jù)權利要求4所述的一種施氏假單胞菌菌株在脫除含硫有機化合物中硫的應用，其特征在于將Pseudomonas stutzeri UP-1菌株的生長細胞培養(yǎng)液通過Kodama路線作用于含硫有機化合物，生成溶于水的含硫有機物。
6.根據(jù)權利要求4所述的一種施氏假單胞菌菌株在脫除含硫有機化合物中硫的應用，其特征在于將Pseudomonas stutzeri UP-1菌株的靜息細胞通過Kodama路線作用于含硫有機化合物，生成溶于水的含硫有機物。
7.根據(jù)權利要求4所述的一種施氏假單胞菌菌株在脫除含硫有機化合物中硫的應用，其特征在于將Pseudomonas stutzeri UP-1菌株的固定化細胞通過Kodama路線作用于含硫有機化合物，生成溶于水的含硫有機物。
8.根據(jù)權利要求4所述的一種施氏假單胞菌菌株在脫除含硫有機化合物中硫的應用，其特征在于將Pseudomonas stutzeri UP-1菌株的復合酶體系通過Kodama路線作用于含硫有機化合物，生成溶于水的含硫有機物。
全文摘要
一種施氏假單胞菌菌株的制備及其在對含硫有機化合物脫硫中的應用技術，該菌株為Pseudomonas stutzeri UP－1，于2003年6月31日保藏于“中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物保藏中心”，其保藏號CGMCC NO.0974；它主要來源于含硫較高的油田污水、油田污泥以及被油污染的土壤中，該菌株可通過特定的培養(yǎng)、分離和制備手段得到，它的培養(yǎng)基液體細胞、靜息細胞和固定化細胞均能通過Kodama路線作用于含硫有機化合物，生成溶于水的含硫有機物。
文檔編號C12N1/20GK1594549SQ03156758
公開日2005年3月16日 申請日期2003年9月10日 優(yōu)先權日2003年9月10日
發(fā)明者孫瑛, 侯影飛, 楊金榮, 史德青, 王云芳, 趙金生 申請人:中國石油天然氣集團公司, 石油大學(華東)