專利名稱：紅白鏈霉菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種具有抗植物病作用的微生物。
背景技術(shù)：
稻瘟病是由Pyricularia oryzae引起的水稻病害；瓜白粉病是由Sphaerothariafuliginea引起的病害，很多農(nóng)作物都有發(fā)生。引起這些農(nóng)作物病害的致病菌都是真菌。有效的抑制這些真菌是亟待研究的課題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種其發(fā)酵液具有抗致病真菌作用的微生物—紅白鏈霉菌。
其發(fā)酵液還對藤黃微球菌有較強(qiáng)抗菌活性。
本發(fā)明所述的紅白鏈霉菌命名為紅白鏈霉菌Streptomyces roseoalbus YIM31634，保藏編號為CCTCC NOM203016。
本發(fā)明所述的紅白鏈霉菌系從我國云南省永勝縣采集的土壤樣品中分離得到?，F(xiàn)保藏在國家知識產(chǎn)權(quán)局指定的保藏單位保藏，保藏單位名稱中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期為2003年2月14日，保藏編號為CCTCCNOM203016。
本發(fā)明所述的紅白鏈霉菌在大多數(shù)培養(yǎng)基上生長良好，氣生菌絲呈粉紅白至黃白色，基內(nèi)菌絲淺橙黃至褐黃色?；z分枝不斷裂；氣絲發(fā)育良好，直或波曲，長孢子鏈；孢子表面光滑。明膠液化、牛奶凝固、胨化、硝酸還原、淀粉水解呈陽性，產(chǎn)生硫化氫，形成黑色素，纖維素上不生長。能利用葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖、木糖、核糖、甘露醇、甘氨酸、組氨酸、甲硫氨酸；不利用乳糖、棉子糖、肌醇、山梨醇。細(xì)胞壁含有L-DAP和甘氨酸，全細(xì)胞水解物不含特征性糖。
培養(yǎng)條件(一)斜面培養(yǎng)條件培養(yǎng)基葡萄糖4g；酵母膏4g；麥芽膏5g；復(fù)合維生素3.75mg/L；瓊脂15g；蒸餾水水1000ml，pH7.2；培養(yǎng)溫度為28℃，培養(yǎng)時(shí)間為1周。
(二)種子培養(yǎng)條件從斜面挑取部分菌絲體接入種子液中，搖瓶培養(yǎng)36小時(shí)。種子培養(yǎng)基；糊精120g；大豆粉40g；酵母膏2g；色氨酸0.5g；β-丙氨酸5g；硫酸鎂0.5g；磷酸銨0.2g；蒸餾水1000ml，pH7.2，培養(yǎng)溫度為28℃。
(三)發(fā)酵培養(yǎng)條件按10％的接種量接到種子培養(yǎng)基中，搖瓶培養(yǎng)6天。培養(yǎng)基大豆粉10g；葡萄糖10g；蛋白胨3g；氯化鈉2.5g；碳酸鈣2g；蒸餾水1000ml，pH7.2，培養(yǎng)溫度為28℃。得到發(fā)酵液。
本發(fā)酵液的抗病試驗(yàn)(一)、黃瓜白粉病盆栽生物測定法(上海農(nóng)藥研究所協(xié)助測定)試驗(yàn)用藥前一天選擇一張真葉2/3大小，長勢一致瓜苗，用油性記號筆寫上標(biāo)簽編號、插入盆栽稻苗盆內(nèi)，按序排放，供試驗(yàn)用。或者選擇子葉長足后期，即將長真葉時(shí)長勢一致瓜苗，同法排號。用噴霧法將藥劑(本發(fā)酵液的乙醇抽提物)噴灑于瓜苗葉片上。噴好藥后將試劑在噴藥廊或溫室中晾三小時(shí)左右。選擇合適的接種時(shí)間，接種誘發(fā)。白粉病菌分生孢子培養(yǎng)參見“白粉病菌培養(yǎng)管理標(biāo)準(zhǔn)”。用加有少量表面活性劑(如吐溫80等)的純凈水，洗取長滿白粉菌黃瓜葉片上的新鮮孢子，用雙層紗布過濾，制成孢子懸浮液，用血球計(jì)數(shù)板鏡檢計(jì)數(shù)，控制孢子濃度10萬個(gè)/ml左右，備用。用細(xì)霧手噴槍及WM-4型無油氣體壓縮機(jī)控制壓力0.1MP(1kgf/cm2)，在排列整齊的瓜苗真葉表面均勻噴霧接種孢子懸浮液，每盤(80-90盆苗)噴菌液40ml左右，后仍置噴藥廊中，自然風(fēng)干，然后移至恒溫室(26-28℃)中，7-8天后調(diào)查。按有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及分析。
(二)水稻稻瘟病盆栽生物測定法(上海農(nóng)藥研究所協(xié)助測定)試驗(yàn)用藥前一天選擇二葉一心或三葉一心、長勢一致盆栽稻苗，按序排放，供試驗(yàn)用。參見“藥劑噴灑標(biāo)準(zhǔn)”進(jìn)行噴霧，噴好藥(本發(fā)酵液的乙醇抽提物)后將試材在噴藥廊或溫室中晾干(3小時(shí)左右)?；蛘呤褂霉喔?，按每畝用有效量50g、100g、200g三種劑量，分別根據(jù)所用盆栽用盆大小，按量均勻施于有淺水層的各盆稻苗中。
接種誘發(fā)選擇合適的接種時(shí)間接種誘發(fā)。孢子培養(yǎng)參見“稻瘟病菌培養(yǎng)管理標(biāo)準(zhǔn)”。在已長滿孢子的培養(yǎng)基皿中，加入純凈水，用不銹鋼平勺輕輕刮取表面孢子，盡量注意不要弄碎表面菌絲層，用雙層紗布過濾，制成孢子懸浮液，取0.1ml孢子懸浮液，從血球計(jì)數(shù)板蓋玻片邊緣加入計(jì)數(shù)板中，在顯微鏡下用計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)，控制孢子濃度在20-30萬個(gè)/ml，備用。用細(xì)霧手噴槍及WM-4型無油氣體壓縮機(jī)控制壓力0.1MP(1kgf/cm2)，在稻苗上均勻噴霧接種孢子懸浮液每盤(80-90盆小苗)噴菌液40ml左右，立即小心移至恒溫室(26-28℃)中下層保濕箱中保濕，保濕(RH100％)誘發(fā)，24小時(shí)后再將稻苗從中下層移至頂層有燈光照射(2000勒克司光照強(qiáng)度)的保濕箱中，逐漸打開保濕箱通氣孔，使箱內(nèi)濕度維持80-90％，不使稻苗過濕發(fā)黃，并每天觀察稻苗生長有無異常，五天左右空白對照病斑穩(wěn)定后即可根據(jù)病斑多少進(jìn)行分級調(diào)查。
普篩時(shí)2級以下方可進(jìn)入再篩。按有關(guān)規(guī)定進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及分析。
(三)菌株YIM 31634的篩選結(jié)果見附圖7。
本菌株具有抗真菌作用，其發(fā)酵液對稻瘟病(Pyricularia oryzae)、瓜白粉病(Sphaerotharia fuliginea)等的抗菌作用強(qiáng)，而且藥效持久、穩(wěn)定、無毒，其發(fā)酵液還對藤黃微球菌有較強(qiáng)抗菌活性。具有從中開發(fā)出新型、高效、無毒的天然農(nóng)藥的巨大潛力。
本發(fā)明所述的紅白鏈霉菌已于2003年2月14日在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏單位簡稱CCTCC，保藏編號為M203016，保藏單位地址武漢，珞珈山，武漢大學(xué)內(nèi)，郵政編碼430072。


圖1為本發(fā)明所述的紅白鏈霉菌在酵母膏-麥芽膏培養(yǎng)基上的電鏡照片。
圖2為本發(fā)明所述的紅白鏈霉菌的培養(yǎng)特征。
圖3為本發(fā)明所述的紅白鏈霉菌的生理生化特征。
圖4為本發(fā)明所述的紅白鏈霉菌的碳氮源利用情況。
圖5為本發(fā)明所述的紅白鏈霉菌和部分相關(guān)菌在GenBank數(shù)據(jù)庫的16SrDNA序列及登錄號。
圖6為本發(fā)明所述的紅白鏈霉菌及部分相關(guān)菌株依據(jù)16S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹。
圖7為本發(fā)明所述的紅白鏈霉菌菌株YIM3 1634的篩選結(jié)果。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例從我國云南省永勝縣采集的土壤樣品，在實(shí)驗(yàn)室中按下列條件培養(yǎng)，即可獲得本發(fā)明所述的紅白鏈霉菌。
(一)菌株培養(yǎng)條件1.斜面培養(yǎng)條件培養(yǎng)基葡萄糖4g；酵母膏4g；麥芽膏5g；復(fù)合維生素3.75mg/L；瓊脂15g；蒸餾水水1000ml，pH7.2；培養(yǎng)溫度為28℃，培養(yǎng)時(shí)間為1周。
2.種子培養(yǎng)條件從斜面挑取部分菌絲體接入種子液中，搖瓶培養(yǎng)36小時(shí)。種子培養(yǎng)基糊精120g；大豆粉40g；酵母膏2g；色氨酸0.5g；β-丙氨酸5g；硫酸鎂0.5g；磷酸銨0.2g；蒸餾水1000ml，pH7.2，培養(yǎng)溫度為28℃。
按以下發(fā)酵培養(yǎng)條件培養(yǎng)，即可獲得發(fā)酵液按10％的接種量接到種子培養(yǎng)基中，搖瓶培養(yǎng)6天。培養(yǎng)基大豆粉10g；葡萄糖10g；蛋白胨3g；氯化鈉2.5g；碳酸鈣2g；蒸餾水1000ml，pH7.2，培養(yǎng)溫度為28℃。
本發(fā)明所述的鏈霉菌是依據(jù)其形態(tài)學(xué)特征、細(xì)胞壁化學(xué)組分及16S rDNA序列的系統(tǒng)進(jìn)化分析。該菌的16S rDNA全序列如下GCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAACGATGAANCCCTTCNGGGTGGATTANTGGCGAACGGGTGAGTAACACNTGGGCAATCTGCCCTGCACTCTGGGACAAGCCCTGGAAACGGGGTCTAATACCGGATGACACTTTCTCTCGCATGGGAGAAGGTTGAAAGCTCCGGCGGTGCACGATGAGCCCGCGGNCTATCAGCTAGTTGGTGAGGNAGAAGCTCACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCANACTCCTACNGGAGGCANCAGTGGGGAATATTNCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGAAGAAGCGCAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGCTTGTCACGTCGGTTGTGAAAGCCCGGGGCTTAACCCCGGGTCTGCAGTCGATACGGGCAGGCTAGAGTGTGGT
AGGGGAGATCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGATCTCTGGGCCATTACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGGAACTAGGTGTTGGCGACATTCCACGTCGTCGGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGTTCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCAGCGGAGCATGTGGCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATATACCGGAAAGCATCAGAGATGGTGCCCCCCTTGTGGTCGGTATACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACNAGCGCAACCCTTGTTTTGTGTTGCCAGCATGCCCTTCGGGGTGATGGGGACTCACAGNAGACTGCCGGGGTCAACTCGNAGNAAGGTGGGGACGANGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCNGCACACGTGNTNCAATGGCAGGTNCAATNAGNTGCGAANCCGTAAGGNGGAGCGAATCTCAAAAAGCCTGTNTCAGTTNGGATTGGGGTNTGCAACTCGNCCCCATGAAGTNGGAGTTGCTAGTAATCGCAGATCAGCATTGNTGCGGTGAATANGTTCC CGGNCC TTGTACACNCCGCCNGTCANGTCACGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCCANCCCCTTGTGGGAGGGAGCTGTCGAAGGTGCATCTCTGTAGTCAGCTCGNGTCGTGANATGTTGNG
權(quán)利要求
1.一種紅白鏈霉菌，其特征在于命名為紅白鏈霉菌Streptomyces roseoalbusYIM 31634，在國家知識產(chǎn)權(quán)局指定的保藏單位保藏，保藏日期為2003年2月14日，保藏單位名稱中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號CCTCC NOM203016。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的紅白鏈霉菌，其特征在于該菌種的16S rDNA全序列分析為GCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAACGATGAANCCCTTCNGGGTGGATTANTGGCGAACGGGTGAGTAACACNTGGGCAATCTGCCCTGCACTCTGGGACAAGCCCTGGAAACGGGGTCTAATACCGGATGACACTTTCTCTCGCATGGGAGAAGGTTGAAAGCTCCGGCGGTGCACGATGAGCCCGCGGNCTATCAGCTAGTTGGTGAGGNAGAAGCTCACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCANACTCCTACNGGAGGCANCAGTGGGGAATATTNCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGAAGAAGCGCAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGCTTGTCACGTCGGTTGTGAAAGCCCGGGGCTTAACCCCGGGTCTGCAGTCGATACGGGCAGGCTAGAGTGTGGTAGGGGAGATCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGATCTCTGGGCCATTACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGGAACTAGGTGTTGGCGACATTCCACGTCGTCGGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGTTCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCAGCGGAGCATGTGGCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATATACCGGAAAGCATCAGAGATGGTGCCCCCCTTGTGGTCGGTATACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACNAGCGCAACCCTTGTTTTGTGTTGCCAGCATGCCCTTCGGGGTGATGGGGACTCACAGNAGACTGCCGGGGTCAACTCGNAGNAAGGTGGGGACGANGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCNGCACACGTGNTNCAATGGCAGGTNCAATNAGNTGCGAANCCGTAAGGNGGAGCGAATCTCAAAAAGCCTGTNTCAGTTNGGATTGGGGTNTGCAACTCGNCCCCATGAAGTNGGAGTTGCTAGTAATCGCAGATCAGCATTGNTGCGGTGAATANGTTCCCGGNCCTTGTACACNCCGCCNGTCANGTCACGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCCANCCCCTTGTGGGAGGGAGCTGTCGAAGGTGCATCTCTGTAGTCAGCTCGNGTCGTGANATGTTGNG
全文摘要
本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域，特別是涉及一種具有抗稻瘟病(Pyricularia oryzae)、瓜白粉病(Sphaerotharia fuliginea)等作用的微生物，本發(fā)明命名為紅白鏈霉菌(Streptomyces raseoalbus)，現(xiàn)保存在國家知識產(chǎn)權(quán)局指定的保藏單位保藏，保藏日期為2003年2月14日，保藏單位名稱中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號CCTCC NOM203016。本發(fā)明菌株的發(fā)酵液具有抗稻瘟病(Pyriculariaoryzae)、瓜白粉病(Sphaerotharia fuliginea)的作用，效果穩(wěn)定而持久，具有從中開發(fā)出新型、高效、無毒天然農(nóng)藥的巨大潛力。
文檔編號C12N15/31GK1542129SQ03124239
公開日2004年11月3日 申請日期2003年4月29日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月29日
發(fā)明者徐麗華, 姜怡, 李文均, 文孟良, 李銘剛, 姜成林 申請人:云南省微生物研究所