專利名稱：多形鏈霉菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種具有乙酰膽堿酶抑制作用的微生物。
背景技術(shù)：
神經(jīng)生理學(xué)研究揭示，乙酰膽堿酯酶(Acetylcholinesterase，AchE)水解中樞神經(jīng)系統(tǒng)和副交感神經(jīng)節(jié)后纖維和主神經(jīng)節(jié)前纖維沖動時所釋放的乙酰膽堿(Ach)以保證神經(jīng)興奮與抑制的協(xié)調(diào)統(tǒng)一。Ach是記憶形成的必需神經(jīng)遞質(zhì)和長期記憶的生理基礎(chǔ)。Ach通過腦干網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)上行激動系統(tǒng)維持大腦覺醒狀態(tài)，增加Ach合成或減少Ach的分解，可影響學(xué)習(xí)記憶功能。人類隨年齡增加而記憶功能退變，與中樞膽堿系統(tǒng)功能下降平行。抑制乙酰膽堿酯酶的活性，可改善人的記憶。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種其發(fā)酵液具有抑制乙酰膽堿酯酶作用的微生物——多形鏈霉菌。
本發(fā)明所述的多形鏈霉菌命名為多形鏈霉菌Streptomyces pleomrphus YIM32065，現(xiàn)保藏在國家知識產(chǎn)權(quán)局指定的保藏單位保藏，保藏編號為CCTCC NOM203018。
本發(fā)明所述的多形鏈霉菌系從我國云南麗江玉龍雪山采集的土壤樣品中分離得到?，F(xiàn)保藏在國家知識產(chǎn)權(quán)局指定的保藏單位保藏，保藏單位名稱中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期為2003年2月14日，保藏編號為M203018。
本發(fā)明所述的鏈霉菌在大多數(shù)培養(yǎng)基上生長良好，氣生菌絲呈黃白至粉紅灰色，基內(nèi)菌絲黃白至黃褐色。孢子鏈波曲，或穗狀。孢子短桿狀，孢子表面光滑或不規(guī)則形狀，表面粗糙。明膠液化、淀粉水解、硝酸還原呈陽性，牛奶凝固、胨化呈陰性，不產(chǎn)生硫化氫，不形成黑色素。能利用葡萄糖、甘露糖、木糖、核糖、肌醇、甘露醇、甘氨酸、組氨酸、甲硫氨酸。細胞壁含有L-DAP和甘氨酸，全細胞水解物含有半乳糖和木糖。
培養(yǎng)條件(一)斜面培養(yǎng)條件培養(yǎng)基葡萄糖4g；酵母膏4g；麥芽膏5g；復(fù)合維生素3.75mg/L；瓊脂15g；蒸餾水水1000ml，pH7.2；培養(yǎng)溫度為28℃，培養(yǎng)時間為1周。
(二)種子培養(yǎng)條件從斜面挑取部分菌絲體接入種子液中，搖瓶培養(yǎng)36小時。種子培養(yǎng)基糊精120g；大豆粉40g；酵母膏2g；色氨酸0.5g；β-丙氨酸5g；硫酸鎂0.5g；磷酸銨0.2g；蒸餾水1000ml，pH7.2，培養(yǎng)溫度為28℃。
(三)發(fā)酵培養(yǎng)條件按10％的接種量接到種子培養(yǎng)基中，搖瓶培養(yǎng)6天。培養(yǎng)基大豆粉10g葡萄糖10g；蛋白胨3g氯化鈉2.5g；碳酸鈣2g蒸餾水1000ml，pH7.2，培養(yǎng)溫度為28℃。即得到發(fā)酵液。
本發(fā)酵液對乙酰膽堿酯酶抑制試驗1.原理血液中膽堿脂酶(acetylcholinesterase)催化乙酰膽堿水解。一定溫度和一定pH的條件下作用一定時間，水解的乙酰膽堿量與酶的活性有關(guān)，加入一定量的乙酰膽堿后，測定剩余的乙酰膽堿量即可計算出水解的乙酰膽堿量，從而得知膽堿脂酶活性。
2.測定方法
a)試劑I.磷酸鹽緩沖液取磷酸氫二鈉(3級品)16.72g和磷酸二氫鉀(3級)2.72g，加蒸餾水溶解，稀釋至1000ml，其pH為7.2，室外溫較高時可保存于冰箱內(nèi)。
II.基質(zhì)稱取1.2716g氯化乙酰膽堿，加蒸餾水至100ml，配成0.07mol/L乙酰膽堿貯備液，保存于冰箱內(nèi)，臨用前再將此溶液稀釋至0.007mol/L。
III.1mol/L鹽酸羥胺(NH2OH·HCl)溶液稱取鹽酸羥胺13.9g，加蒸餾水稀釋至200ml，室溫過高時(30℃以上)可保存于冰箱內(nèi)。
IV.3.5mol/L氫氧化鈉溶液稱取氫氧化鈉(3級)14.0g，加蒸餾水稀釋至100ml。
V.1∶2鹽醛溶液量取比重為1.18的濃鹽酸(3級)100ml，加蒸餾水200ml。
VI.10％三氯化鐵溶液稱取三氯化鐵(3級)10.0g，加蒸餾水10ml左右，然后加濃鹽酸0.84ml，在加溫溶解后，再加蒸餾水至100ml。
b)操作步驟*樣品管I.取0.98ml磷酸鹽緩沖液和0.02ml全血于試管內(nèi)，置37℃水浴中預(yù)熱3-5min。
II.按加入本發(fā)酵液的乙醇抽提物樣品編號次序迅速正確地加入1.0ml0.007mol/L乙酰膽堿溶液，置37℃溫水浴中。
III反應(yīng)30min后立即按同樣次序迅速加入堿性羥胺溶液(由1mol/L羥胺溶液與3.5mol/L氫氧化鈉溶液在臨用前20min等體積混合而成)4.0ml，并充分振蕩2min。
IV繼續(xù)加入1∶2鹽酸溶液2.0ml，充分振蕩約2min后，再加入10％三氯化鐵溶液2.0ml，充分振蕩。
V用普通濾紙將上述溶液(共10ml)過濾，濾去蛋白的濾液盛入比色杯中用綠色濾光片(530nm波長)。以蒸餾水調(diào)零進行比色。
*對照管I對照管1反應(yīng)液由1.0ml緩沖液與1.0ml蒸餾水代替。其它操作與樣品管相同，該管為無血無乙酰膽堿的試劑空白對照。
II對照管2反應(yīng)液由0.98ml緩沖液、0.02ml全血及1.0ml蒸餾水代替。其它操作與樣品管相同，該管為血與試劑的空白對照。
III對照管3反應(yīng)液由1.0ml緩沖液及1.0ml緩沖液及1.0ml 0.007mol/L乙酰膽堿液配成。其它操作與樣品管相同，該管為未水解的全量乙酰膽堿的對照。
上述三種對照管在每批試驗時都應(yīng)與樣品管同時配制(做一管或二管即可)c)計算I.酶活性單位的計算全血膽堿酯酶活性值以水解μmol/L乙酰膽堿/0.02m1血·30min表示。
II.酶活性值百分數(shù)的計算 本菌株具有抑制乙酰膽堿酯酶的作用，其發(fā)酵液對乙酰膽堿酯酶的抑制率達100％，抑制率89.47％，IC50＝2.63×10-6μg/ml，而且藥效持久、穩(wěn)定、無毒，具有從中開發(fā)出新型、高效、無毒的天然藥物的巨大潛力。
本發(fā)明所述的鏈霉菌命名為多形鏈霉菌已于2003年2月14日在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏單位簡稱CCTCC，保藏編號為M203018，保藏單位地址武漢，珞珈山，武漢大學(xué)內(nèi)，郵政編碼430072。


圖1為本發(fā)明所述的多形鏈霉菌在酵母膏-麥芽膏培養(yǎng)基上的電鏡照片。
圖2為本發(fā)明所述的多形鏈霉菌的培養(yǎng)特征。
圖3為本發(fā)明所述的多形鏈霉菌的生理生化特征。
圖4為本發(fā)明所述的多形鏈霉菌的碳氮源利用情況。
圖5為本發(fā)明所述的多形鏈霉菌和部分相關(guān)菌在GenBank數(shù)據(jù)庫的16SrDNA序列及登錄號。
圖6為本發(fā)明所述的多形鏈霉菌及部分相關(guān)菌株依據(jù)16S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹。
具體實施例方式
實施例從我國云南省麗江玉龍雪山采集的土壤樣品，在實驗室中按下列條件培養(yǎng)，即可獲得本發(fā)明所述的多形鏈霉菌。
(一)菌株培養(yǎng)條件1.斜面培養(yǎng)條件；培養(yǎng)基；葡萄糖4g；酵母膏4g；麥芽膏5g；復(fù)合維生素3.75mg/L；瓊脂15g；蒸餾水水1000ml，pH7.2；培養(yǎng)溫度為28℃，培養(yǎng)時間為1周。
2.種子培養(yǎng)條件從斜面挑取部分菌絲體接入種子液中，搖瓶培養(yǎng)36小時。種子培養(yǎng)基糊精120g；大豆粉40g；酵母膏2g；色氨酸0.5g；β-丙氨酸5g；硫酸鎂0.5g；磷酸銨0.2g；蒸餾水1000ml，PH7.2，培養(yǎng)溫度為28℃。
按以下發(fā)酵培養(yǎng)條件培養(yǎng)，即可獲得發(fā)酵液按10％的接種量接到種子培養(yǎng)基中，搖瓶培養(yǎng)6天。培養(yǎng)基大豆粉10g；葡萄糖10g；蛋白胨3g；氯化鈉2.5g；碳酸鈣2g；蒸餾水1000ml，pH7.2，培養(yǎng)溫度為28℃。
本發(fā)明所述的鏈霉菌的16S rDNA部分序列如下GCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAACGATGAACCATTTCGGTGGGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCCTGCACTCTGGGACAAGCCCTGGAAACGGGGTCTAATACCGGATATGAGCCTCCATCGCATGGTGGGGGCTGTAAAGCTCCGGCGGTGCAGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGAGGTAGTGGCTCACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGAAGAAGCGAGAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCGAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGCTTGTCACGTCGGTTGTGAAAGCCCGGGGCTTAACCCCGGGTCTGCAGTCGATACGGGCAGGCTAGAGTTCGGTAGGGGAGATCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGATCTCTGGGCCGATACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGGCACTAGGTGTGGGCAACATTCCACGTTGTCCGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGTGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTGGCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATACACCGGAAACGGCCGGAGACGGTCGCCCCCTTGTGGTCGGTGTACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCCGTGTTGCCAGCAACTCTTCGGAGGTTGGGGACTCACGGGAGACCGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTGCACACGTGCTACAATGGCCGGTACAATGAGCTGCGATACCGTGAGGTGGAGCGAATCTCAAAAAGCCGGTCTCAGTTCG(ATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCATTGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCACGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCCAACCCCCTTGTGGGGAGGGAGCTGTCGAAGGTGGGACTGGCGATTGGGACGAAGTCGTAACAAGGTAGC
權(quán)利要求
1.一種多形鏈霉菌，其特征在于命名為多形鏈霉菌Streptomycespleomorphus YIM 32065，現(xiàn)保存在國家知識產(chǎn)權(quán)局指定的保藏單位保藏，保藏日期為2003年2月14日，保藏單位名稱；中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號CCTCC NOM203018。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多形鏈霉菌，其特征在于該菌種的16S rDNA部分序列如下GCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAACGATGAACCATTTCGGTGGGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCCTGCACTCTGGGACAAGCCCTGGAAACGGGGTCTAATACCGGATATGAGCCTCCATCGCATGGTGGGGGCTGTAAAGCTCCGGCGGTGCAGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGAGGTAGTGGCTCACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGAAGAAGCGAGAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCGAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGCTTGTCACGTCGGTTGTGAAAGCCCGGGGCTTAACCCCGGGTCTGCAGTCGATACGGGCAGGCTAGAGTTCGGTAGGGGAGATCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGATCTCTGGGCCGATACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGGCACTAGGTGTGGGCAACATTCCACGTTGTCCGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGTGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTGGCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATACACCGGAAACGGCCGGAGACGGTCGCCCCCTTGTGGTCGGTGTACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCCGTGTTGCCAGCAACTCTTCGGAGGTTGGGGACTCACGGGAGACCGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTGCACACGTGCTACAATGGCCGGTACAATGAGCTGCGATACCGTGAGGTGGAGCGAATCTCAAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCATTGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCACGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCCAACCCCCTTGTGGGGAGGGAGCTGTCGAAGGTGGGACTGGCGATTGGGACGAAGTCGTAACAAGGTAGC
全文摘要
本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域，特別是涉及一種具有乙酰膽堿酯酶抑制作用的微生物，本發(fā)明特征在于命名為多形鏈霉菌Streptomyces pleomorphus YIM 32065，現(xiàn)保存在國家知識產(chǎn)權(quán)局指定的保藏單位保藏，保藏日期為2003年2月14日，保藏單位名稱中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號CCTCC NOM203018。本發(fā)明具有抑制乙酰膽堿酯酶的活性，其發(fā)酵液對乙酰膽堿酶的抑制率在100％，IC
文檔編號C12N15/31GK1542128SQ03124238
公開日2004年11月3日 申請日期2003年4月29日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月29日
發(fā)明者姜成林, 姜怡, 李文均, 文孟良, 李銘剛, 徐麗華 申請人:云南省微生物研究所