專利名稱：Her3活性抑制劑的制作方法
發(fā)明描述本發(fā)明涉及包含HER3活性抑制劑、特別是抗HER3抗體為活性劑的藥物組合物。本發(fā)明進(jìn)一步公開了該組合物在診斷、預(yù)防或治療過度增殖性疾病、特別是腫瘤疾病中的用途。
已知蛋白質(zhì)酪氨酸激酶是介導(dǎo)可調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和分化的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程的酶。受體蛋白質(zhì)酪氨酸激酶通過配體刺激的底物酪氨酸磷酸化而起作用。HER3(也稱為ErbB3)是受體蛋白質(zhì)酪氨酸激酶表皮生長因子受體(EGFR)亞家族的成員(Plowman等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87(1990)，4905-4909；Kraus等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86(1989)，9193-9197以及Kraus等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90(1993)，2900-2904)。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)HER3在若干癌癥類型、例如乳腺、胃腸道和胰腺癌中過表達(dá)。若HER3與受體蛋白質(zhì)酪氨酸激酶EGFR亞家族的另一成員HER2共表達(dá)，則形成活性異二聚體信號(hào)復(fù)合物。
針對(duì)HER3的單克隆抗體(Rajkumar等人，Br.J.Cancer 70(1994)，459-456)對(duì)表達(dá)HER3的細(xì)胞系的無貼壁依賴性生長具有激動(dòng)效應(yīng)。另一方面，據(jù)報(bào)道美國專利5,968,511(對(duì)應(yīng)于WO 97/35885)所述抗HER3抗體可降低Heregulin誘導(dǎo)的HER2/HER3異二聚體形成。然而，只是對(duì)提高Heregulin與HER3結(jié)合的抗體證明了這種活性。因此，尚不清楚哪種類型的抗HER3抗體-如果存在的話-具有供治療性應(yīng)用的潛能。
Vadlamudi等人(Oncogenes 18(1999)，305-314)描述了通過HER2受體調(diào)節(jié)環(huán)加氧酶(COX-2)途徑。發(fā)現(xiàn)COX-2的特異性抑制劑能夠抑制結(jié)腸直腸癌細(xì)胞的促有絲分裂及侵襲作用。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，與單克隆抗HER3抗體溫育可致HER2/HER3異二聚體水平下降，但是只部分降低COX-2表達(dá)。
WO 00/31048公開了可用作受體酪氨酸激酶(例如EGFR、HER2和HER4)抑制劑的喹唑啉(quinazoline)衍生物。但未公開HER3的抑制。
WO 00/78347公開了阻止或抑制細(xì)胞生長的方法，其中包含防止或降低ErbB-2/ErbB-3異二聚體形成。例如，該藥劑可以是抗HER2胞外域抗體與抗HER3抗體(例如購自Neomarkers的HER3抗體H3.105.5)的組合。然而尚不清楚需要何種類型的抗HER3抗體，以獲得所需治療效果。
美國專利5,804,396描述了用于治療增殖性疾病的藥劑的鑒定方法，其中包含對(duì)一種潛在的藥劑通過HER2/HER3或HER2/HER4或HER3/HER4異二聚體抑制信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的活性進(jìn)行分析的步驟。并未公開特異性的HER3抑制劑。
在表達(dá)不同HER2∶HER3比例的侵襲性乳癌細(xì)胞系MCR-7(DKFZHeidelberg)、MDA-MB-468(ATCC HTB-132)和MDA-MB231(ATCCHTB-26)中，我們比較了一種激動(dòng)性的抗HER2單克隆抗體Herceptin與抗HER3抗體的生物學(xué)特性，即(i)小鼠單克隆抗體IgG1，α-HER3-ECD，Upstate Biotechnology，目錄號(hào)#05-471，針對(duì)HER3的Heregulin結(jié)合位點(diǎn)，(ii)我們實(shí)驗(yàn)室的抗體1B4C3以及(iii)同樣來自我們實(shí)驗(yàn)室的抗體2D102。我們提供了證據(jù)，證明利用抗HER3抗體在α/β-Heregulin(α/β-HRG)刺激之前預(yù)處理乳癌細(xì)胞系，與Herceptin相比，可減少HER2/HER3酪氨酸磷酸化程度。此外，抗HER3抗體取消了HER2/HER3的異二聚體化，還降低了PI3-激酶的p85亞基和連接(adaptor)蛋白質(zhì)SHC與HER3的復(fù)合物形成，分別導(dǎo)致PI3-激酶和c-jun-末端激酶活性(JNK)下降。與Herceptin相比，抗HER3抗體也能夠在α/β-HRG刺激之后下調(diào)細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)的激酶2(ERK2)。此外我們證明，在利用抗HER3抗體預(yù)處理之后，乳癌細(xì)胞系的遷移和增殖特性顯著下降。我們的數(shù)據(jù)清楚表明，在HRG刺激之后，抗HER3抗體比Herceptin更有效降低信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。此外，在特定癌癥類型例如黑色素瘤中，抗HER3抗體可有效降低遷移和增殖特性，而抗HER2抗體根本沒有任何顯著作用。這些數(shù)據(jù)證明，抗HER3抗體或其它HER3抑制劑具有治療乳癌及其它以通過HER3及其異二聚體化配偶體的超級(jí)信號(hào)為特征的惡性腫瘤的巨大潛能。
因此，本發(fā)明涉及包含HER3活性的特定類型抑制劑為活性劑以及藥物可接受的載體、稀釋劑和/或助劑的藥物組合物。本發(fā)明的HER3抑制劑的特征在于，該抑制劑與HER3的結(jié)合可降低HER3介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過下調(diào)HER3引起HER3分子至少部分從細(xì)胞表面消失，從而導(dǎo)致HER3介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)下降。在本發(fā)明另一實(shí)施方案中，通過使細(xì)胞表面的HER3分子穩(wěn)定于基本失活的形式，即比非穩(wěn)定形式顯示較低的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的形式，從而導(dǎo)致HER3介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)下降。
本發(fā)明的抑制劑可能影響Heregulin與HER3的結(jié)合，特別是降低Heregulin與HER3的結(jié)合。但在另一實(shí)施方案中，該抑制劑可能并不競(jìng)爭(zhēng)Heregulin與HER3的結(jié)合。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，該抑制劑是抗HER3抗體。優(yōu)選地，該抗體針對(duì)HER3的胞外域。然而應(yīng)當(dāng)注意，也可能使用其它HER3抑制劑，特別是低分子量抑制劑，例如肽或有機(jī)化合物。
根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語”抗體”包括單克隆抗體、多克隆抗體、由至少兩種抗體形成的多特異性抗體(例如雙特異性抗體)以及抗體片段，只要其具有所需活性即可。
該抗體可以是利用Khler等人(Nature 256(1975)，495)所述雜交瘤方法或重組DNA方法(例如參見美國專利4,816,567)獲得的單克隆抗體。也可以利用Clackson等人(Nature 352(1991)，624-628)以及Marks等人(J.Mol.Biol.222(1991)，581-597)所述技術(shù)，從噬菌體抗體文庫中分離單克隆抗體。該抗體可以是IgM、IgG，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
抗體片段包含抗體的一部分，一般是完整抗體的抗原結(jié)合區(qū)或可變區(qū)?？贵w片段的例子包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段、雙功能抗體(Diabody)、單鏈抗體分子以及多特異性抗體片段。
特別而言，該抗體可以是重組抗體或抗體片段，更特別而言，選自嵌合抗體或其片段(Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81(1984)，6851-6855)、人源化抗體(Jones等人，Nature 321(1986)，522-525；Riechmann等人，Nature 332(1988)，323-329以及Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2(1992)，593-596)、單鏈Fv抗體(Plücktuhn在ThePharmacology of Monoclonal Antibodies 113，Rosenburg和Moore，EDS，Springer Verlag，N.Y.(1994)，pp.269-315)以及雙功能抗體(Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90(1993)，6444-6448)。
在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，該抗體選自雜交瘤細(xì)胞系DSM ACC2527或DSM ACC 2517產(chǎn)生的抗體1B4C3(IgG2a)和2D1D12(IgG1)、其片段或其重組衍生物。1B4C3是導(dǎo)致HER3內(nèi)在化的抗體，2D1D12是導(dǎo)致HER3穩(wěn)定化的抗體。進(jìn)一步優(yōu)選與保藏的雜交瘤細(xì)胞系所產(chǎn)生的抗體具有基本相同的生物學(xué)活性(例如實(shí)施例所述)、例如結(jié)合到HER3的相同表位的抗體，例如嵌合或人源化抗體或其片段。按照BudapestTreaty for the Deposit of Microorganisms，雜交瘤細(xì)胞系DSM ACC 2517于2001年7月24日保藏在Deutsche Sammlung von Mikroorganismenund Zellkulturen GmbH(DSMZ)，Mascheroder Weg 1b，38124Braunschweig，Germany。產(chǎn)生抗體1B4C3的雜交瘤細(xì)胞系DSM ACC2527于2001年8月7日保藏在DSMZ。
本發(fā)明的抗體可以偶聯(lián)標(biāo)記基團(tuán)，特別用于診斷性應(yīng)用。合適的標(biāo)記基團(tuán)的例子，例如放射性基團(tuán)、熒光基團(tuán)或其它標(biāo)記基團(tuán)為本領(lǐng)域已知。此外，特別對(duì)治療性應(yīng)用而言，該抗體可能偶聯(lián)效應(yīng)基團(tuán)，例如細(xì)胞毒性基團(tuán)，如放射性基團(tuán)、毒素或本領(lǐng)域已知的其它效應(yīng)基團(tuán)。
在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，該抑制劑可能選自非抗體來源的結(jié)合蛋白質(zhì)，例如纖連蛋白III型結(jié)構(gòu)域或anticalins(Skerra，″Engineeredprotein scaffolds for molecular recognition″，J.Mol Recog.13(2000)，167-187以及在此引用的文獻(xiàn))此外，本申請(qǐng)涉及HER3活性抑制劑的用途，用于制備藥劑，供診斷、預(yù)防和/或治療過度增殖性疾病，特別是腫瘤疾病，例如乳癌、胃腸癌、胰腺癌、前列腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、黑色素瘤或其它HER3表達(dá)或過表達(dá)的癌癥或腫瘤轉(zhuǎn)移形成，其中所述抑制劑結(jié)合到HER3可降低HER3介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。該疾病可能與增強(qiáng)的HER3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)，并可能與相伴的HER2表達(dá)或缺少HER2表達(dá)有關(guān)。特別而言，該疾病與增強(qiáng)的HER3磷酸化、和/或增強(qiáng)的HER2/HER3異二聚體化、和/或增強(qiáng)的PI3激酶活性、和/或增強(qiáng)的c-jun末端激酶活性和/或AKT活性、和/或增強(qiáng)的ERK2活性和/或PYK2活性有關(guān)。
令人吃驚的是，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的HER3抑制劑，特別是抗HER3抗體，在降低信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程方面比HER2抑制劑、例如Herceptin更為顯著高效。特別而言，在黑色素瘤細(xì)胞中，抗HER3抗體有效，雖然黑色素瘤細(xì)胞表達(dá)HER2，但Herceptin沒有顯著效果。
優(yōu)選地，本發(fā)明的HER3抑制劑具有至少一種下列特征-降低Heregulin(p85)與反式激活的HER3的結(jié)合，優(yōu)選基本上完全抑制p85與HER3的結(jié)合，-抑制GRB2結(jié)合到HER2、HER2結(jié)合到HER3和/或GRB2結(jié)合SHC，-抑制受體酪氨酸磷酸化，-抑制AKT磷酸化，-降低腫瘤侵襲性，特別是乳癌和黑色素瘤，-抑制PYK2酪氨酸磷酸化以及-抑制ERK2磷酸化。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及診斷、預(yù)防或治療過度增殖性疾病、特別是腫瘤疾病的方法，其包含給予所需受試者(例如人)有效劑量的HER3活性抑制劑，其中所述抑制劑結(jié)合到HER3可降低HER3介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。
通過活性劑與生理上可接受的載體、稀釋劑和/或助劑混合，將該HER3抑制劑、特別是抗HER3抗體配制成例如凍干劑型、含水溶液、懸浮液或固體制劑，例如片劑、糖錠劑或膠囊劑，如Remington′sPharmaceutical Sciences所述。
該劑型可能包含多于一種的活性化合物，例如其它受體蛋白質(zhì)酪氨酸激酶、例如EGFR、HER2、HER4或血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的抑制劑?；蛘呋蛄硗?，該組合物可能包含細(xì)胞毒性劑例如阿霉素(doxorubicin)、順鉑(cisplatin)或卡鉑(carboplatin)、或細(xì)胞因子。
本發(fā)明的抑制劑還適于診斷性應(yīng)用，例如以便確定HER3的表達(dá)和/或?qū)Π屑?xì)胞的活性。這種診斷性應(yīng)用可按照已知方法實(shí)現(xiàn)。
根據(jù)待治療疾病的類型及嚴(yán)重性，可給予人類患者約1μg/kg-15mg/kg的抗體，例如通過一次或多次分別給予或連續(xù)輸注。典型的每日劑量可根據(jù)上述因素為約1μg/kg至約100mg/kg或更多。對(duì)于幾天或更長時(shí)間的重復(fù)給藥而言，根據(jù)所治療的疾病持續(xù)進(jìn)行治療，直至對(duì)疾病癥狀產(chǎn)生所需要的抑制為止。
本發(fā)明進(jìn)一步由以下附圖及實(shí)施例進(jìn)行說明。
實(shí)施例1.單克隆抗體α-HER3ECD降低HER3和HER2的受體酪氨酸磷酸化根據(jù)其不同的HER2∶HER3比值及其固有的遷移特性選擇乳癌細(xì)胞系MCF-7(DKFZ-Heidelberg)、MDA-MB-468(ATCC HTB-132)和MDA-MB-231(ATCC HTB-26)，MDA-MB-231是最具侵襲性的細(xì)胞系。為了與trastuzumab(Herceptin)比較α-HER3ECD(Upstate Biotechnology，Cat.#05-471)的功能性作用，我們?cè)贖eregulin(HRG)刺激之前，分別利用α-HERECD和HC預(yù)處理細(xì)胞，進(jìn)行受體免疫沉淀實(shí)驗(yàn)，并利用抗磷酸酪氨酸抗體(PY)進(jìn)行探測(cè)(

圖1)。我們的數(shù)據(jù)表明，利用α-HER3ECD預(yù)處理基本上降低α-HRG刺激后MCF-7(圖1a)和MDA-MB-231(圖1c)中HER3和HER2的酪氨酸磷酸化程度，但反而提高M(jìn)DA-MB-468中HER3的酪氨酸磷酸化(圖1b)。α-HER3ECD甚至增強(qiáng)了HER2與HER3的結(jié)合，盡管酪氨酰磷酸化受體的含量顯著下降(圖1a、b中上圖泳道4和8)。相比之下，所有細(xì)胞系在HRG存在與否的情況下，HC上調(diào)受體酪氨酰磷酸化并促進(jìn)HER3與HER2的結(jié)合(圖1a、b、c上圖泳道3、7、11和15)。至于對(duì)α-HRG不敏感的MDA-MB-486細(xì)胞，使用β-HRG作為刺激物。
2.α-HER3ECD取消SHC和PI3-K與HER3以及GRB2與HER2的結(jié)合我們隨后探詢?chǔ)?HER3ECD是否作用于HER3的已知底物，即分別引起MAPK級(jí)聯(lián)活化以及脂質(zhì)信號(hào)的效應(yīng)蛋白質(zhì)SHC和磷脂酰-3-OH-激酶(PI3-K)。因此，我們?cè)谏鲜鰧?shí)驗(yàn)條件下免疫沉淀SHC和PI3-K，評(píng)估這些效應(yīng)物的酪氨酸磷酸化。如圖2所示，α-HER3ECD顯著降低MCF-7和MDA-MB-486細(xì)胞系中SHC的酪氨酸磷酸化(圖2a、b泳道13和16比較)。引人注意的是，在MCF-7細(xì)胞中SHC的結(jié)合衰減，而在MDA-MB-486中，α-HER3ECD引起HER3與SHC的結(jié)合提高。PI3-K調(diào)節(jié)亞基的免疫沉淀產(chǎn)生基本相似的結(jié)果。酪氨酸磷酸化的HER3與PI3-K的結(jié)合在MCF-7中消失，在MDA-MB-486中則觀察到提高(圖1b、2b)。然而，利用α-HER3ECD預(yù)處理MDA-MB-486細(xì)胞，導(dǎo)致SHC和PI3-K與HER3的結(jié)合提高，而HC再次在所有細(xì)胞系中顯示交聯(lián)特性。由于SHC在HRG刺激之后與連接分子GRB2結(jié)合，我們通過測(cè)定GRB2結(jié)合研究了SHC降低的酪氨酸磷酸化的作用(圖2c)。為此我們按前述相同的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，使用GST-GRB2融合子在MCF-7細(xì)胞中進(jìn)行GST下拉(GST-pulldown)分析。降低的SHC酪氨酰磷酸化確實(shí)導(dǎo)致GRB2與SHC的結(jié)合劇烈下降(圖2c下圖，比較泳道5和8)，并完全抑制其結(jié)合HER2(圖2c中圖，比較泳道5和8)。這些數(shù)據(jù)清楚表明，α-HER3ECD在MCF-7中抑制SHC和PI3-K結(jié)合HER3，在MDA-MB-486中則不然，兩種蛋白質(zhì)都結(jié)合HER3，而與HER3的磷酸化狀態(tài)無關(guān)。
3.α-HER3ECD下調(diào)JNK1和PI3-K活性連接蛋白質(zhì)SHC介導(dǎo)生長因子受體下游的MAPK信號(hào)途徑，分別活化ERK2和JNK。為研究α-HER3ECD對(duì)ERK2和JNK的作用，我們?cè)贛CF-7和MB-468中于相同實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行MAPK激酶分析(圖3)。我們?cè)谒屑?xì)胞系中觀察到JNK活性劇烈下降，但只在MCF-7中檢測(cè)到HC對(duì)JNK的等效作用(圖3a)。ERK2活性通過α-HER3ECD僅僅略微但顯著下降，而HC對(duì)ERK2活性沒有作用(數(shù)據(jù)略)。由于最近證明PI3-K與癌侵襲有關(guān)，我們研究了α-HER3ECD對(duì)PI3-K活性的抑制特性，并進(jìn)行了PI3-K分析(圖3)。在MCF-7和MDA-MB-486中，與HRG處理的細(xì)胞相比，PI3-K活性劇烈下降(圖3a、b)。在MDA-MB-486中，HC對(duì)PI3-K活性的作用甚至強(qiáng)于α-HER3ECD。這些數(shù)據(jù)提示，α-HER3ECD在MCF-7和MDA-MB-486細(xì)胞中分別下調(diào)JNK和PI3-K活性。
4.α-HER3ECD增強(qiáng)HER3的內(nèi)吞下調(diào)在HRG刺激之后，HER2和HER3被內(nèi)吞并再循環(huán)。我們感興趣確定α-HER3ECD介導(dǎo)的抑制HER3酪氨酸磷酸化是否起源于加速的內(nèi)吞作用。為進(jìn)一步理解，我們利用MCF-7細(xì)胞，分別在α-HER3ECD或HRG存在與否的情況下，繼之以HRG刺激，進(jìn)行時(shí)間過程分析(圖4)。然后在膜蛋白質(zhì)生物素化之后，對(duì)HER3進(jìn)行免疫沉淀。我們觀察到利用α-HER3ECD預(yù)處理之后，HER3被快速內(nèi)吞(圖4b上圖)。給予細(xì)胞HRG具有相同作用，差別在于，HER3于2小時(shí)以后回輸?shù)侥ぃ?小時(shí)以后再次被內(nèi)吞。利用PY探測(cè)全細(xì)胞裂解物(WCL)，作為對(duì)照(圖4b下圖)。與3小時(shí)后酪氨酰磷酸化蛋白質(zhì)含量降低的HRG處理的細(xì)胞相比，利用α-HER3ECD預(yù)處理1小時(shí)后發(fā)生HER3的加速內(nèi)吞作用。為比較α-HER3ECD和HC，我們利用HC和免疫沉淀的HER2進(jìn)行相同實(shí)驗(yàn)(圖4a上圖)。驚人的是，利用HC預(yù)處理之后，HER2在任何時(shí)間點(diǎn)均未被內(nèi)吞，而HRG則引起快速內(nèi)吞作用。比較利用抗磷酸化酪氨酸(PY)探測(cè)的內(nèi)吞受體及全細(xì)胞裂解物，清楚顯示利用α-HER3ECD則磷酸化酪氨酸含量下降，利用HC則不然(圖4b下圖)。我們的數(shù)據(jù)表明，α-HER3ECD通過加速的內(nèi)吞作用快速下調(diào)HER3，從而致使細(xì)胞對(duì)HRG刺激不敏感。
5.a-HER3ECD抑制乳癌細(xì)胞系的遷移和增殖特性為評(píng)價(jià)α-HER3ECD對(duì)乳癌細(xì)胞系遷移及增殖特性的生物學(xué)功能，我們?cè)讦?HER3ECD存在與否的情況下繼之以HRG刺激，進(jìn)行BrdU摻入分析。利用α-HER3ECD預(yù)處理使MCF-7和MDA-MB-486的增殖分別降低28.7％±6.18％和21.1％±7.62％。觀察到的增殖抑制與ERK2分析有關(guān)，而HC在這些細(xì)胞系中沒有作用(數(shù)據(jù)略)。此外，為研究α-HER3ECD對(duì)乳癌細(xì)胞遷移特性的作用，我們?cè)讦?HER3ECD存在與否的情況下，利用MCF-7和MDA-MB-486進(jìn)行趨化(chemotaxis)實(shí)驗(yàn)。我們觀察到MCF-7和MDA-MB-486的遷移率分別劇烈下降59.1％(P＝0.018)和55.4％(P＝0.00005)。另外，MDA-MB231的遷移也被抑制35％，但顯著性略低(P＝0.06)。我們的數(shù)據(jù)清楚表明α-HER3ECD對(duì)MCF-7和MDA-468增殖和遷移的抑制作用。
6.產(chǎn)生抗HER3的單克隆抗體我們?nèi)缓罄肏ER3胞外部分和His-Tag C末端的重組人融合蛋白質(zhì)(HER3-6xHis-CT)免疫Balb/c小鼠，產(chǎn)生抗HER3胞外域的小鼠單克隆抗體。通過在HEK293細(xì)胞中轉(zhuǎn)染、G418選擇以及穩(wěn)定表達(dá)構(gòu)建體，獲得免疫原，收集最高表達(dá)水平克隆的細(xì)胞培養(yǎng)上清，于硫酸銨沉淀、透析以及隨后的金屬離子親和層析(Ni-NTA)之后純化蛋白質(zhì)。利用Western印跡進(jìn)行質(zhì)量保證(數(shù)據(jù)略)。按照廠家規(guī)程(Qiagen ImmunEasyMouse Adjuvant)腹膜內(nèi)注射22μg HER3-6xHis-CT進(jìn)行免疫。使用標(biāo)準(zhǔn)方法得到產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系。
7.抗HER3的單克隆抗體優(yōu)先結(jié)合其蛋白質(zhì)主鏈，并對(duì)HER3的內(nèi)吞過程具有不同作用我們利用FACS分析鑒定了可特異性識(shí)別MCF-7細(xì)胞表面的天然HER3的3株單克隆抗體(數(shù)據(jù)略)。1B4C2和1B4C3是IgG2a同型抗體，而2D1D12是IgG1同型抗體。未檢測(cè)到與EGFR家族其它成員有交叉反應(yīng)性(數(shù)據(jù)略)。然后我們?cè)噲D確定該抗體結(jié)合HER3的糖基化結(jié)構(gòu)還是結(jié)合HER3的蛋白質(zhì)主鏈，及其對(duì)受體內(nèi)吞調(diào)節(jié)的影響。為此，我們利用已知可防止細(xì)胞表面蛋白質(zhì)N-連接糖基化的抗生素Tunicamycin，在其存在與否的情況下預(yù)處理MCF-7細(xì)胞16小時(shí)。裂解細(xì)胞之后，我們利用單克隆抗體2F1 2(針對(duì)HER3的胞內(nèi)部分)、α-HER3ECD(HER3的胞外部分)、1B4C2、1B4C3和2D1D12免疫沉淀HER3。我們的數(shù)據(jù)表明，α-HER3ECD、1B4C3和2D1D12均優(yōu)先結(jié)合HER3的蛋白質(zhì)主鏈，而1B4C3對(duì)HER3的糖基化形式也具有親和性(圖6A)。
為研究1B4C3和2D1D12對(duì)HER3內(nèi)吞過程的作用，我們分別利用1B4C3或2D1D12溫育MCF-7細(xì)胞不同時(shí)間，進(jìn)行時(shí)間過程實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞表面蛋白質(zhì)生物素化，利用抗HER3胞內(nèi)域的抗體沉淀，利用鏈親和素檢測(cè)。我們觀察到1B4C3類似于α-HER3ECD加速HER3的內(nèi)吞作用，2D1D12則有穩(wěn)定作用，從而在細(xì)胞表面積聚HER3(圖6B)。
8.單克隆抗體1B4C3和2D1D12抑制HER3和HER2的下游信號(hào)然后我們探詢1B4C3和2D1D12是否可以抑制HER2和HER3底物SHC的酪氨酸磷酸化。由于GRB2與HRG刺激的HER2結(jié)合，并按與SHC相同的方式傳遞促分裂信號(hào)到MAPK途徑，我們?cè)谖刺幚砘蚪?jīng)抗體預(yù)處理并隨后經(jīng)HRG刺激的MCF-7細(xì)胞中免疫沉淀SHC，同時(shí)進(jìn)行GST-GRB2下拉分析(圖6C)。該實(shí)驗(yàn)表明，兩種抗體均抑制SHC的酪氨酸磷酸化以及GRB2與SHC的結(jié)合。此外，該抗體抑制SHC和HER3的結(jié)合以及HER2和HER3的異二聚體化。這些數(shù)據(jù)表明，下游信號(hào)受1B4C3和2D1D12抑制，雖然2D1D12比1B4C3的抑制作用更強(qiáng)。
9.單克隆抗體2D1D12抑制乳癌細(xì)胞系MDA-MB-435S、ZR-75-1和黑色素瘤細(xì)胞系Mel Gerlach的增殖我們?nèi)缓笾盅芯?B4C3和2D1D12在兩株乳癌細(xì)胞系MDA-MB-435S(ATCC HTB-129)、ZR-75-1(ATCC CRL-1500)以及黑色素瘤細(xì)胞系Mel Gerlach(Klinikum Groβ hadern，Munich)中的生物學(xué)活性。我們因其在裸鼠中的致瘤性及其HER3高表達(dá)水平而選擇這些細(xì)胞系。應(yīng)當(dāng)注意，黑色素瘤細(xì)胞過表達(dá)HER3，因?yàn)镠ER3在黑色素細(xì)胞(melanocytes)以及少突膠質(zhì)細(xì)胞(oligodendrocytes)的發(fā)育過程中是非常關(guān)鍵的。為了檢驗(yàn)我們有關(guān)1B4C3和2D1D12取消促細(xì)胞分裂信號(hào)、因而取消癌細(xì)胞的增殖特性的假說，我們?cè)诳贵w存在與否的情況下進(jìn)行BrdU摻入分析(圖7)。2D1D12極大降低所有細(xì)胞系的增殖，而1B4C3只在Mel Gerlach中具有抑制作用?？傊?，我們的數(shù)據(jù)構(gòu)成了第一個(gè)證據(jù)，證明抗HER3單克隆抗體可潛在視作抗癌的新治療武器。
產(chǎn)生抗體1B4C3和2D1D12的雜交瘤細(xì)胞系分別于2001年8月7日和2001年7月24日保藏在DSMZ。
10.HER3抗體對(duì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用10.1.方法MDA-MB-435S得自ATCC(HTB-129)，Mel-Juso得自Cell LinesServive(CLS)(0282-HU)。GST-p85(a.a 333-430)得自Santa Cruz。GST-GRB2如前所述純化。Phospho-AKT(P-Ser 473)來自New EnglandBiolabs(NEB)。HER2抗體按所述純化自雜交瘤培養(yǎng)上清(ATCCCRL-10463)。GST下拉分析中使用1.25μg誘餌(bait)蛋白質(zhì)。如前所述進(jìn)行BrdU摻入及侵襲分析。所有實(shí)驗(yàn)至少進(jìn)行兩次。
10.2.結(jié)果與討論為了檢測(cè)HER2和HER3受體在MDA-MB-435S和Mel-Juso中的表面表達(dá)，我們另外利用FACS分析測(cè)定其表達(dá)水平(圖8A、B)。我們觀察了HER2和HER3在這些細(xì)胞系中的表達(dá)，繼而仔細(xì)分析HER3抗體作用于Heregulin(HRG)介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子機(jī)制。為此，我們?cè)谌巳榘┘?xì)胞系MDA-MB-435S和黑色素瘤細(xì)胞系Mel-Juso中進(jìn)行GST下拉分析(圖8)。休眠細(xì)胞經(jīng)HER3抗體1B4C3，2D1D12、對(duì)照抗HER2抗體以及PI(3)K抑制劑LY294002預(yù)處理，然后經(jīng)β-HRG刺激。細(xì)胞裂解以后，歸一化蛋白質(zhì)水平，由于HER3具有6個(gè)潛在的p85結(jié)合位點(diǎn)，利用GST-p85(a.a.333-430)為誘餌進(jìn)行GST下拉分析。針對(duì)磷酸酪氨酸(PY)的Western印跡表明，抗HER2和1B4C3同樣降低p85與反式活化的HER3的結(jié)合，而LY294002(陰性對(duì)照)對(duì)MDA-MB-435S中p85的結(jié)合沒有抑制作用(圖8C)。然而，2D1D12幾乎完全取消MDA-MB-435S中p85與HER3的結(jié)合(圖8C)在人黑色素瘤細(xì)胞系Mel-Juso中，1B4C3和2D1D12同樣降低p85與HER3的結(jié)合，而抗HER2顯示更顯著降低p85的受體結(jié)合(圖8D)。LY294002再次顯示對(duì)p85的結(jié)合沒有抑制作用(圖8D)。此外，我們?cè)诹姿崂野彼嵊≯E中觀察到某些顯著的酪氨酸磷酸化條帶，在MDA-MD-435S中為125kDa和66kDA，而在Mel-Juso中只有125kDA的一條主帶。已知PI(3)K物理上結(jié)合粘著斑激酶(FAK)，因而我們利用FAK抗體重新探測(cè)該印跡(圖8C、D下圖)。我們的數(shù)據(jù)表明，在兩株細(xì)胞系中，只有2D1D12和PI(3)K抑制劑LY294002可取消FAK與p85的結(jié)合。利用HER2和HER3抗體重新探測(cè)該印跡，確認(rèn)捕獲的HER3的量減少，其與HER2的異二聚體化降低(圖8C、D中圖)。總之，我們的數(shù)據(jù)表明，雖然HER3和HER2抗體降低受體酪氨酸磷酸化水平，但它們能夠在受體結(jié)合效應(yīng)蛋白質(zhì)的次級(jí)水平調(diào)節(jié)不同的應(yīng)答。
由于GRB2只直接結(jié)合HER2，并通過SHC間接結(jié)合HER3，我們?cè)谙嗤膶?shí)驗(yàn)條件下利用GST-GRB2為誘餌以及上述人腫瘤細(xì)胞系進(jìn)行另外的GST下拉實(shí)驗(yàn)(圖9A，B)。我們觀察到1B4C3和2D1D12減少160和185kDa之間的受體酪氨酸磷酸化，而LY294002沒有抑制作用(圖9A、B上圖)。然而，利用抗HER2抗體預(yù)處理細(xì)胞導(dǎo)致受體酪氨酸磷酸化提高，這可由β-HRG進(jìn)一步加強(qiáng)。利用HER2、HER3和SHC抗體重新探測(cè)表明，1B4C3和2D1D12基本上抑制GRB2結(jié)合HER2及其間接結(jié)合HER3(圖9A、B中圖)，及其在兩株細(xì)胞系中與SHC的結(jié)合(圖9A、B下圖)。另一方面，抗HER2抗體提高GRB2與HER2和SHC的結(jié)合。
為更加了解抗體介導(dǎo)的下游信號(hào)，我們還分析了上述實(shí)驗(yàn)的全細(xì)胞裂解物(WCL)(圖10)。當(dāng)我們關(guān)注總細(xì)胞蛋白質(zhì)的磷酸蛋白質(zhì)含量時(shí)，我們觀察到在兩株細(xì)胞系中，抗HER2組成型活化受體，而1B4C3和2D1D12抑制受體酪氨酸磷酸化(圖10A上圖)。LY294002仍沒有作用。
已經(jīng)非常確定，HRG可活化促細(xì)胞分裂劑活化的蛋白質(zhì)激酶(MAPK)途徑，引起細(xì)胞增殖、細(xì)胞存活并增強(qiáng)各種基因的轉(zhuǎn)錄。為檢測(cè)HER2和HER3抗體對(duì)HRG誘導(dǎo)的MAPK活化的作用，利用phospho-ERK(T202/Y204)抗體探測(cè)MDA-MB435S和Mel-Juso全細(xì)胞提取物的免疫印跡(圖10)。MAPK ERK1/2(p44/p42)的磷酸化表明，雖然活化受體，但抗HER2輕微降低ERK1磷酸化，而1B4C3和2D1D12對(duì)ERK1磷酸化沒有抑制作用(圖10A中圖)。進(jìn)一步重新探測(cè)該印跡，確認(rèn)上樣了等量蛋白質(zhì)(圖10A下圖)。
另外，我們研究了AKT的活化狀態(tài)，AKT是PI(3)K的下游靶分子，在細(xì)胞存活中具有重要作用。我們觀察到抗HER2、1B4C3和2D1D12顯著抑制Mel-Juso黑色素瘤細(xì)胞中AKT的磷酸化(圖10B上圖)。在MDA-MB-435S乳癌細(xì)胞中，HER2和HER3抗體均顯著降低AKT磷酸化(圖10C)。LY294002作為陽性對(duì)照。此觀察結(jié)果極為重要，因?yàn)榛罨腁KT表達(dá)顯著提高的乳癌患者更易復(fù)發(fā)遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移，而致臨床結(jié)果較差(Perez-Tenorio G等人British Journal of Cancer，86，540-545(2002)。
單克隆抗體1B4C3和2D1D12抑制乳癌細(xì)胞系MDA-MB-435S和黑色素瘤細(xì)胞系Mel-Juso的增殖和遷移為評(píng)價(jià)1B4C3和2D1D12對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)程及腫瘤侵襲的抑制功能，我們進(jìn)行了BrdU摻入及侵襲分析(圖11)。
我們發(fā)現(xiàn)在2D1D12預(yù)處理的MDA-MB-435S和Mel-Juso細(xì)胞中，β-HRG刺激的BrdU摻入劇烈下降(圖11A)。侵襲分析顯示，抗HER3抗體2D1D12和1B4C3基本降低MDA-MB-435S乳癌和Mel-Juso黑色素瘤細(xì)胞的侵襲力。令人驚訝的是，HER2抗體4D5只在MDA-MB-435S中顯示抑制作用，在黑色素瘤細(xì)胞系Mel-Juso中則不然，盡管在細(xì)胞表面表達(dá)受體(圖11B、C及圖8A、B)。我們的結(jié)果提示，可以使用抗HER3抗體治療乳癌和黑色素瘤。
單克隆抗體2D1d12抑制Heregulin刺激的PYK2磷酸化我們先前證明，胞內(nèi)酪氨酸激酶PYK2可結(jié)合HER3并由HER3磷酸化，提示PYK2具有HER3活性介導(dǎo)劑的功能。與此相一致，顯性失活的(dominant-negative)PYK2可抑制HRG介導(dǎo)的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲。為此，我們?cè)噲D研究抗HER3抗體對(duì)HRG誘導(dǎo)的PYK2酪氨酸磷酸化的作用。我們利用抗HER2、1B4C3和2D1D12預(yù)處理休眠的SF767人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞，然后利用α-HRG刺激細(xì)胞。裂解后按相同蛋白質(zhì)數(shù)量歸一化，我們免疫沉淀了PYK2，并針對(duì)磷酸酪氨酸(PY)進(jìn)行印跡。我們觀察到抗HER2和1B4C3對(duì)PYK2的酪氨酸磷酸化沒有抑制作用，而2D1D12顯著降低PYK2的酪氨酸磷酸化(圖12A)。因此，抗HER3抗體可有效抑制HRG誘導(dǎo)的PYK2酪氨酸磷酸化。
通過利用phospho-ERK抗體探測(cè)WCL的免疫印跡，我們觀察到利用抗HER2、1B4C3和2D1D12預(yù)處理細(xì)胞可抑制α-HRG活化的ERK2磷酸化(圖12B中圖)。利用ERK抗體重新探測(cè)，確認(rèn)上樣了等量蛋白質(zhì)(圖12B下圖)。我們的數(shù)據(jù)再次顯示，HER3抗體可下調(diào)MDA-MB-435S、Mel-Juso和SF767中HRG介導(dǎo)的信號(hào)事件。另外，我們的分析提示，針對(duì)HER2和HER3胞外域的抗體可調(diào)節(jié)不同的信號(hào)，引起下游效應(yīng)蛋白質(zhì)的不同響應(yīng)。
權(quán)利要求
1.藥物組合物，其包含HER3活性抑制劑為活性劑以及藥物可接受的載體、稀釋劑和/或助劑，其中所述抑制劑與HER3的結(jié)合可降低HER3介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。
2.權(quán)利要求1的組合物，其中通過下調(diào)HER3導(dǎo)致所述信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)降低。
3.權(quán)利要求1的組合物，其中通過使HER3穩(wěn)定于基本失活的形式而導(dǎo)致所述信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)降低。
4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的組合物，其中該抑制劑并不競(jìng)爭(zhēng)Heregulin與HER3的結(jié)合。
5.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的組合物，其中所述抑制劑是抗HER3抗體。
6.權(quán)利要求5的組合物，其中所述抗體是單克隆抗體或其片段。
7.權(quán)利要求5的組合物，其中所述抗體是重組抗體或抗體片段。
8.權(quán)利要求7的組合物，其中所述重組抗體或抗體片段選自嵌合抗體、人源化抗體、單鏈抗體及其片段。
9.權(quán)利要求5-8的組合物，其中所述抗體偶聯(lián)標(biāo)記基團(tuán)或效應(yīng)基團(tuán)。
10.權(quán)利要求5-9的組合物，其中該抗體選自雜交瘤細(xì)胞系DSMACC 2527或DSM ACC 2517產(chǎn)生的抗體1B4C3和2D1 D12、其片段或其重組衍生物。
11.權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的組合物，其包含另一活性劑。
12.權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)的組合物，其用于診斷性應(yīng)用。
13.權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)的組合物，其用于治療性應(yīng)用。
14.權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)定義的HER3活性抑制劑的用途，用于制備供診斷、預(yù)防或治療過度增殖性疾病、特別是腫瘤疾病的藥劑。
15.權(quán)利要求14的用途，其中所述抑制劑是抗HER3抗體。
16.權(quán)利要求15的用途，其中該抗體選自雜交瘤細(xì)胞系DSM ACC2527或DSM ACC 2517產(chǎn)生的抗體1B4C3和2D1 D12、其片段或其重組衍生物。
17.權(quán)利要求14-16中任一項(xiàng)的用途，用于診斷、預(yù)防或治療乳癌、胃腸癌、胰腺癌、前列腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、黑色素瘤或腫瘤轉(zhuǎn)移形成。
18.權(quán)利要求14-17中任一項(xiàng)的用途，其中所述疾病與HER3的磷酸化提高有關(guān)。
19.權(quán)利要求14-18中任一項(xiàng)的用途，其中所述疾病與HER2/HER3的異二聚體化提高有關(guān)。
20.權(quán)利要求14-19中任一項(xiàng)的用途，其中所述疾病與PI3激酶、c-jun末端激酶、AKT、ERK2和/或PYK2的活性提高有關(guān)。
21.診斷、預(yù)防或治療過度增殖性疾病、特別是腫瘤疾病的方法，其包含給予有此需要的受試者有效量的權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)定義的HER3活性抑制劑。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述抑制劑是抗HER3抗體。
23.權(quán)利要求22的方法，其中該抗體選自雜交瘤細(xì)胞系DSM ACC2527或DSM ACC 2517產(chǎn)生的抗體1B4C3和2D1 D12、其片段或其重組衍生物。
24.權(quán)利要求21-23中任一項(xiàng)的方法，其中所述受試者是人。
25.用于診斷、預(yù)防或治療過度增殖性疾病、特別是腫瘤疾病的新型藥劑的鑒定方法，其包含分析候選化合物是否能夠抑制HER3活性，其中所述抑制劑與HER3的結(jié)合可降低HER3介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。
26.權(quán)利要求25的方法，其中將HER3抑制劑或其衍生化合物配制成藥物組合物。
27.雜交瘤細(xì)胞系DSM ACC 2517以及其衍生的細(xì)胞系。
28.雜交瘤細(xì)胞系DSM ACC 2527以及其衍生的細(xì)胞系。
29.權(quán)利要求27或28的細(xì)胞系產(chǎn)生的抗體。
全文摘要
本發(fā)明涉及包含HER3活性抑制劑、特別是抗HER3抗體為活性劑的藥物組合物。本發(fā)明進(jìn)一步公開了該組合物在診斷、預(yù)防或治療過度增殖性疾病、特別是腫瘤疾病中的用途。
文檔編號(hào)C12P21/08GK1541109SQ02815615
公開日2004年10月27日 申請(qǐng)日期2002年8月9日 優(yōu)先權(quán)日2001年8月9日
發(fā)明者A·烏爾里克, A 烏爾里克, E·赫頓-范德霍斯特, 范德霍斯特 申請(qǐng)人:馬普科技促進(jìn)協(xié)會(huì)