專(zhuān)利名稱(chēng)：用遺傳修飾的谷氨酸棒桿菌生產(chǎn)l-賴(lài)氨酸的制作方法
現(xiàn)有技術(shù)化合物，尤其L-氨基酸、維生素、核苷和核苷酸以及D-氨基酸，用于人用藥、用于制藥業(yè)、用于化妝品、用于食品業(yè)及用于動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)。
眾多的這些化合物是從棒狀細(xì)菌尤其谷氨棒桿菌菌株中發(fā)酵制備的。由于其及其重要性，已持續(xù)進(jìn)行改良生產(chǎn)方法的嘗試。生產(chǎn)方法的改良可涉及發(fā)酵措施。如攪拌和供氧，或營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基的組分如發(fā)酵期間的糖濃度，或例如通過(guò)離子交換層析對(duì)產(chǎn)物形式的加工，或微生物本身的固有生產(chǎn)性質(zhì)。
為改良這些微生物的生產(chǎn)性質(zhì)，可使用誘變、選擇及突變體選擇等方法，以此方法可獲得對(duì)抗代謝物有抗性或有調(diào)節(jié)重要性的代謝物是營(yíng)養(yǎng)缺陷的并產(chǎn)生氨基酸的菌株。
一些年以來(lái)，重組DNA技術(shù)的方法也已經(jīng)用于棒桿菌菌株的改良，其通過(guò)擴(kuò)增各個(gè)氨基酸生物合成基因，并研究對(duì)氨基酸生產(chǎn)的作用而進(jìn)行改良。
一種通用的方法包括通過(guò)附加型復(fù)制質(zhì)粒擴(kuò)增特定微生物中某些生物合成基因。這種方法的缺點(diǎn)是在發(fā)酵期間(在工業(yè)過(guò)程中發(fā)酵通常進(jìn)行許多代)，所述質(zhì)粒自發(fā)喪失(分離不穩(wěn)定性)。
另一種方法包括利用在特定微生物中不復(fù)制的質(zhì)粒倍增一些生物合成基因。在這種方法中，將包括克隆的生物合成基因的質(zhì)粒整合進(jìn)該微生物的染色體生物合成基因中(Reinscheid等，應(yīng)用和環(huán)境微生物學(xué)60(1)，126-132(1994)；Jetten等，應(yīng)用微生物學(xué)和生物技術(shù)學(xué)43(1)76-82(1995))。這種方法的缺點(diǎn)是質(zhì)粒的核苷酸序列及選擇所必需的抗生素抗性基因的核苷酸序列保留在微生物中，這例如對(duì)生物量的處理和利用是一個(gè)不利因素。另外，專(zhuān)家預(yù)期這種菌株由于在相應(yīng)于工業(yè)發(fā)酵中常用的代次中通過(guò)“坎貝爾典型交換(Campbell typecross over)”的去整合(disintegration)而不穩(wěn)定。
發(fā)明目的本發(fā)明人提供了改良使用棒狀細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)化合物的新措施。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了生產(chǎn)化合物的棒狀細(xì)菌，特征在于這些細(xì)菌除了在天然位點(diǎn)(基因座)存在編碼蛋白質(zhì)或RNA合成的開(kāi)放讀框(ORF)、基因或等位基因的至少一個(gè)拷貝之外，在第二個(gè)、任選地第三個(gè)或第四個(gè)位點(diǎn)還具有整合進(jìn)染色體形式的這種開(kāi)放讀框(ORF)、基因或等位基因的第二個(gè)、任選地第三個(gè)或第四個(gè)拷貝，在該特定的第二個(gè)、任選地第三個(gè)或第四個(gè)位點(diǎn)沒(méi)有能/使得能在微生物中附加型復(fù)制或轉(zhuǎn)座(is capable of/enables episomal replication or transposition)的核苷酸序列，及沒(méi)有授予抗生素抗性的核苷酸序列，該第二個(gè)、任選地第三個(gè)或第四個(gè)位點(diǎn)與細(xì)菌生長(zhǎng)和所希望的化合物生產(chǎn)必需的開(kāi)放讀框(ORF)、基因或等位基因不相關(guān)。
本發(fā)明還提供了制備一或多種化合物的方法，其中進(jìn)行以下步驟a)發(fā)酵這樣的棒狀細(xì)菌，a1)這些細(xì)菌除了在天然位點(diǎn)(基因座)存在編碼蛋白質(zhì)或RNA合成的開(kāi)放讀框(ORF)、基因或等位基因的至少一個(gè)拷貝之外，在第二個(gè)、任選地第三個(gè)或第四個(gè)位點(diǎn)具有整合進(jìn)染色體形式的這種開(kāi)放讀框(ORF)、基因或等位基因的第二個(gè)、任選地第三個(gè)或第四個(gè)拷貝，在該特定的第二個(gè)、任選地第三個(gè)或第四個(gè)位點(diǎn)沒(méi)有能/使得能在微生物中附加型復(fù)制或轉(zhuǎn)座的核苷酸序列，及沒(méi)有授予抗生素抗性的核苷酸序列，該第二個(gè)、任選地第三個(gè)或第四個(gè)位點(diǎn)與細(xì)菌生長(zhǎng)和所希望的化合物生產(chǎn)必需的開(kāi)放讀框(ORF)、基因或等位基因不相關(guān)，a2)所述細(xì)菌中相應(yīng)蛋白質(zhì)的胞內(nèi)活性提高，尤其是編碼這種蛋白質(zhì)的核苷酸序列被過(guò)表達(dá)，b)濃縮發(fā)酵肉湯和/或細(xì)菌細(xì)胞中的化合物，c)分離所述化合物，任選地d)伴有＞(大于)0-100wt％的發(fā)酵肉湯的組分和/或生物量。
本發(fā)明還提供了制備一或多種化合物的方法，包括以下步驟a)在使所述開(kāi)放讀框(ORF)、基因或等位基因表達(dá)的條件下，發(fā)酵棒狀細(xì)菌，特別是棒桿菌菌屬，這些細(xì)菌除了在天然位點(diǎn)(基因座)存在編碼蛋白質(zhì)或RNA合成的開(kāi)放讀框(ORF)、基因或等位基因的至少一個(gè)拷貝之外，在每種情況下，在每種情況下第二個(gè)、任選地第三個(gè)或第四個(gè)位點(diǎn)還具有整合形式的這種開(kāi)放讀框(ORF)、基因或等位基因的第二個(gè)、任選地第三個(gè)或第四個(gè)拷貝，在該特定的第二個(gè)、任選地第三個(gè)或第四個(gè)位點(diǎn)沒(méi)有能/使得能在微生物中附加型復(fù)制或轉(zhuǎn)座的核苷酸序列，及沒(méi)有授予抗生素抗性的核苷酸序列，b)濃縮發(fā)酵肉湯和/或細(xì)菌細(xì)胞中的化合物，c)分離所述化合物，任選地d)伴有＞(大于)0-100wt％的發(fā)酵肉湯的組分和/或生物量。
發(fā)明詳述應(yīng)理解所述化合物特別是指氨基酸，維生素，核苷和核苷酸?，F(xiàn)有技術(shù)已知并可獲得這些化合物的生物合成途徑。
氨基酸優(yōu)選是指L-氨基酸，尤其是蛋白原性L-氨基酸，選自L-天冬氨酸，L-天冬酰胺，L-蘇氨酸，L-絲氨酸，L-谷氨酸，L-谷氨酰胺，甘氨酸，L-丙氨酸，L-半胱氨酸，L-纈氨酸，L-甲硫氨酸，L-異亮氨酸，L-亮氨酸，L-酪氨酸，L-苯丙氨酸，L-組氨酸，L-賴(lài)氨酸，L-色氨酸，L-脯氨酸和L-精氨酸，及它們的鹽，特別是L-賴(lài)氨酸，L-甲硫氨酸和L-蘇氨酸。特別優(yōu)選L-賴(lài)氨酸。
蛋白原性氨基酸應(yīng)理解為在天然蛋白質(zhì)中存在的氨基酸，天然蛋白質(zhì)即微生物、植物、動(dòng)物和人的蛋白質(zhì)。
維生素特別是指維生素B1(硫胺素)，維生素B2(核黃素)，維生素B5(泛酸)，維生素B6(吡哆醇)，維生素B12(氰鈷胺素)，煙酸/煙酰胺，維生素M(葉酸)和維生素E(生育酚)及它們的鹽，優(yōu)選泛酸。
核苷及核苷酸特別是指S-腺苷甲硫氨酸，肌苷-5′-單磷酸及鳥(niǎo)苷-5′-單磷酸及它們的鹽。
棒狀細(xì)菌特別是棒桿菌屬那些細(xì)菌。在棒桿菌屬中優(yōu)選谷氨酸棒桿菌，產(chǎn)氨棒桿菌(Corynebacterium ammoniagenes)和嗜熱產(chǎn)氨棒桿菌(Corynebacterium thermoaminogenes)。這組細(xì)菌菌株的分類(lèi)信息見(jiàn)于Kampfer和Kroppenstedt(加拿大微生物學(xué)雜志42，989-1005(1996))及US-A-5,250,434所述。
谷氨酸棒桿菌菌種的合適菌株特別是那些已知的野生型菌株Corynebacterium glutamicum ATCC13032Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870Corynebacterium lilium ATCC15990Corynebacterium melassecola ATCC17965Corynebacterium herculis ATCC13868Arthrobacter sp.ATCC243Brevibacterium chang-fua ATCC14017Brevibacterium flavum ATCC14067Brevibacterium lactofermentum ATCC13869Brevibacterium divaricatum ATCC14020
Brevibacterium taipei ATCC13744和Microbacterium ammoniaphilum ATCC21645及從中產(chǎn)生的生產(chǎn)化合物的突變體或菌株，如本領(lǐng)域已知的那些突變體或菌株。
產(chǎn)氨棒桿菌(C.ammoniagenes)菌種的合適菌株特別是已知的野生型菌株Brevibacterium ammoniagenes ATCC6871Brevibacterium ammoniagenes ATCC15137和Corynebacterium sp.ATCC21084及從中產(chǎn)生的生產(chǎn)化合物的突變體或菌株，如本領(lǐng)域已知的那些突變體或菌株。
嗜熱產(chǎn)氨棒桿菌(C.thermoaminogenes)菌種的合適菌株特別是已知的野生型菌株Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1540Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1541和Corynebacterium thermoaminogenesFERM BP-1542及從中產(chǎn)生的生產(chǎn)化合物的突變體或菌株，如本領(lǐng)域已知的那些突變體或菌株。
具有ATCC標(biāo)號(hào)的菌株可得自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(Manassas，VA，美國(guó))。具有FERM標(biāo)號(hào)的菌株可得自國(guó)立產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所(National Institute of Advanced Industrial Science andTechnology，AIST Tsukuba Central 6，1-1-1 Higashi，Tsukuba Ibaraki，日本)。提及的嗜熱產(chǎn)氨棒桿菌菌株(FERM BP-1539，F(xiàn)ERM BP-1540，F(xiàn)ERM BP-1541和FERM BP-1542)在US-A 5,250,434中描述。
開(kāi)放讀框(ORF)描述了一段編碼或可編碼一種蛋白質(zhì)或多肽或核糖核酸的核苷酸序列，現(xiàn)有技術(shù)中沒(méi)有對(duì)其功能的描述。
在將一種功能指定給提及的核苷酸序列節(jié)段后，其一般稱(chēng)為基因。
等位基因一般是指給定基因的另外的形式。該形式通過(guò)核苷酸序列中的不同加以區(qū)別。
在本發(fā)明中，優(yōu)選使用內(nèi)源的即物種特征性開(kāi)放讀框、基因或等位基因。這些應(yīng)理解為存在于物種群體例如谷氨酸棒桿菌中的開(kāi)放讀框、基因或等位基因或其核苷酸序列。
本發(fā)明文中“在天然位點(diǎn)(基因座)存在的開(kāi)放讀框(ORF)、基因或等位基因的一個(gè)拷貝”是指ORF或基因或等位基因相對(duì)于相鄰的ORF或基因或等位基因的位置和情況如存在于相應(yīng)野生型或相應(yīng)親代生物體或起始生物體中一樣。
因此，例如lysC基因或編碼谷氨酸棒桿菌的反饋抗性天冬氨酸激酶的lysCFBR等位基因的天然位點(diǎn)是lysC位點(diǎn)或lysC基因座或lysC基因位點(diǎn)，其一側(cè)是直接相鄰的基因或開(kāi)放讀框orfX和leuA，另一側(cè)是asd基因。
反饋抗性天冬氨酸激酶是指，與野生形式相比，對(duì)賴(lài)氨酸和蘇氨酸的混合物或者AEC(氨基乙基半胱氨酸)和蘇氨酸的混合物或者賴(lài)氨酸自身或者AEC自身的抑制具有較低敏感性的天冬氨酸激酶。生產(chǎn)L-賴(lài)氨酸的菌株典型含有這種反饋抗性或脫敏的天冬氨酸激酶。
已知谷氨酸棒桿菌染色體的核苷酸序列，并可見(jiàn)于專(zhuān)利申請(qǐng)EP-A-1108790及歐洲分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室(EMBL，Heidelberg，德國(guó)和Cambridge，英國(guó))的核苷酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)登錄號(hào)AX114121。orfX的核苷酸序列，leuA基因和asd基因的登錄號(hào)為AX120364(orfX)，AX123517(leuA)和AX123519(asd)。
另外，也可以使用其它數(shù)據(jù)庫(kù)例如國(guó)立生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫(kù)(NCBI，Bethesda，MD，美國(guó))或者瑞士生物信息學(xué)研究所數(shù)據(jù)庫(kù)(Swissprot，Geneva，Switzerland)或者蛋白質(zhì)信息資源數(shù)據(jù)庫(kù)(PIR，Washington，DC，美國(guó))。
“在每種情況下第二個(gè)、任選地第三個(gè)或第四個(gè)位點(diǎn)”是指與天然位點(diǎn)不同的一個(gè)位點(diǎn)。在下文也稱(chēng)為“靶位點(diǎn)”或“靶序列”。其也可以稱(chēng)為“整合位點(diǎn)”或“轉(zhuǎn)化位點(diǎn)”。這種第二個(gè)、任選地第三個(gè)或第四個(gè)位點(diǎn)，或者存在于這些相應(yīng)位點(diǎn)的核苷酸序列，優(yōu)選在染色體內(nèi)，而且一般對(duì)生長(zhǎng)及所希望的化合物的產(chǎn)生是非必需的。
為產(chǎn)生本發(fā)明的棒狀細(xì)菌，分離任選地包括表達(dá)和/或調(diào)節(jié)信號(hào)的所希望的ORF、基因或等位基因的核苷酸序列，在其末端提供靶位點(diǎn)的核苷酸序列，然后優(yōu)選借助于在棒狀細(xì)菌中不復(fù)制或只有限復(fù)制的載體將這些序列轉(zhuǎn)移進(jìn)所希望的棒狀細(xì)菌中，分離所希望的ORF、基因或等位基因摻入靶位點(diǎn)的那些細(xì)菌，在該靶位點(diǎn)沒(méi)有能/使得能在微生物中附加型復(fù)制的核苷酸序列，沒(méi)有能轉(zhuǎn)座/使得發(fā)生轉(zhuǎn)座的核苷酸序列，及沒(méi)有授予抗生素抗性的核苷酸序列。
本發(fā)明還提供了一種生產(chǎn)棒狀細(xì)菌的方法，所述細(xì)菌產(chǎn)生一或多種化合物，所述方法包括a)分離至少一種所希望的ORF、基因或等位基因的核苷酸序列，其任選地包括表達(dá)和/或調(diào)節(jié)信號(hào)，b)將靶位點(diǎn)核苷酸序列提供給所述ORF、基因或等位基因的5’和3’末端，c)優(yōu)選地將具有靶位點(diǎn)核苷酸序列的所希望的ORF、基因或等位基因的核苷酸序列摻入一個(gè)載體中，所述載體在棒狀細(xì)菌中不復(fù)制或僅有限程度復(fù)制，d)將b)或c)的核苷酸序列轉(zhuǎn)移進(jìn)棒狀細(xì)菌中，e)分離這樣的棒狀細(xì)菌，所述棒狀細(xì)菌中a)的核苷酸序列摻入在靶位點(diǎn)，在該靶位點(diǎn)沒(méi)有能/使得能在微生物中附加型復(fù)制的核苷酸序列，沒(méi)有能轉(zhuǎn)座/使得發(fā)生轉(zhuǎn)座的核苷酸序列，及沒(méi)有授予抗生素抗性的核苷酸序列。
優(yōu)選地，在所述的靶位點(diǎn)沒(méi)有所用載體的序列或者物種外源DNA的殘余，例如限制切割位點(diǎn)。任選地，在該靶位點(diǎn)保留摻入的ORF、基因或等位基因上游或下游的這種DNA的最多24個(gè)，優(yōu)選最多12個(gè)，特別優(yōu)選最多6個(gè)核苷酸。
通過(guò)本發(fā)明的措施，棒狀細(xì)菌或者制備化合物的發(fā)酵方法的產(chǎn)率在選自以下一組的一或多個(gè)方面得以改良至少0.5-1.0％或者至少1.0-1.5％或者至少1.5-2.0％濃度(形成的化合物，基于單位體積)，產(chǎn)量(形成的化合物，基于消耗的碳源)，產(chǎn)物形成速率(形成的化合物，基于時(shí)間)。
關(guān)于常規(guī)的遺傳工程方法的指導(dǎo)，例如分離染色體DNA，質(zhì)粒DNA，操作限制酶等，見(jiàn)于Sambrook等(分子克隆實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)(1989)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社)。關(guān)于在棒狀細(xì)菌中轉(zhuǎn)化和接合的指導(dǎo)見(jiàn)于Thierbach等(應(yīng)用微生物學(xué)和生物技術(shù)29，356-362(1988))，Schafer等(細(xì)菌學(xué)雜志172，1663-1666(1990)及基因145，69-73(1994))，及Schwarzer和Puhler(生物/技術(shù)9，84-87(1991))。
僅有限程度復(fù)制的載體是指質(zhì)粒載體，其根據(jù)宿主或載體培養(yǎng)條件下而復(fù)制或不復(fù)制。因此，僅在低于31℃才能復(fù)制的棒狀細(xì)菌的溫度敏感性質(zhì)粒已經(jīng)由Nakamura等描述(US-A-6,303，383)。
本發(fā)明還提供了產(chǎn)生L-賴(lài)氨酸的棒狀細(xì)菌，特別是棒桿菌菌屬，其特征在于這些細(xì)菌除了在天然位點(diǎn)(基因座)存在用于賴(lài)氨酸生產(chǎn)的開(kāi)放讀框(ORF)、基因或等位基因的至少一個(gè)拷貝之外，在每種情況下，在每種情況下第二個(gè)、任選地第三個(gè)或第四個(gè)位點(diǎn)具有整合形式的相應(yīng)開(kāi)放讀框(ORF)、基因或等位基因的第二個(gè)、任選地第三個(gè)或第四個(gè)拷貝，在該特定的第二個(gè)、任選地第三個(gè)或第四個(gè)位點(diǎn)沒(méi)有能/使得能在微生物中附加型復(fù)制的核苷酸序列，沒(méi)有能轉(zhuǎn)座/使得發(fā)生轉(zhuǎn)座的核苷酸序列，及沒(méi)有授予抗生素抗性的核苷酸序列。
本發(fā)明還提供了生產(chǎn)L-賴(lài)氨酸的方法，包括以下步驟
a)在使所述開(kāi)放讀框(ORF)、基因或等位基因表達(dá)的條件下，發(fā)酵棒狀細(xì)菌尤其谷氨酸棒桿菌，這些細(xì)菌特征在于除了在天然位點(diǎn)(基因座)存在用于賴(lài)氨酸生產(chǎn)的開(kāi)放讀框(ORF)、基因或等位基因的至少一個(gè)拷貝之外，在每種情況下，在每種情況下第二個(gè)、任選地第三個(gè)或第四個(gè)位點(diǎn)還具有整合形式的相應(yīng)開(kāi)放讀框(ORF)、基因或等位基因的第二個(gè)、任選地第三個(gè)或第四個(gè)拷貝，在該特定的第二個(gè)、任選地第三個(gè)或第四個(gè)位點(diǎn)沒(méi)有能/使得能在微生物中附加型復(fù)制的核苷酸序列，沒(méi)有能轉(zhuǎn)座/使得發(fā)生轉(zhuǎn)座的核苷酸序列，及沒(méi)有授予抗生素抗性的核苷酸序列，b)濃縮發(fā)酵肉湯中的L-賴(lài)氨酸，c)從發(fā)酵肉湯中分離L-賴(lài)氨酸，任選地d)伴有＞(大于)0-100％的發(fā)酵肉湯的組分和/或生物量。
“用于賴(lài)氨酸生產(chǎn)的開(kāi)放讀框(ORF)、基因或等位基因的拷貝”是指所有的優(yōu)選內(nèi)源性的開(kāi)放讀框、基因或等位基因，其增強(qiáng)/過(guò)表達(dá)可以具有改良賴(lài)氨酸生產(chǎn)的作用。增強(qiáng)是指特定的基因產(chǎn)物、蛋白質(zhì)或酶的胞內(nèi)濃度或活性提高。
這些特別包括以下開(kāi)放讀框、基因或等位基因accBC，accDA，cstA，cysD，cysE，cysH，cysK，cysN，cysQ，dapA，dapB，dapC，dapD，dapE，dapF，ddh，dps，eno，gap，gap2，gdh，gnd，lysC，lysCFBR，lysE，msiK，opcA，oxyR，ppc，ppcFBR，pgk，pknA，pknB，pknD，pknG，ppsA，ptsH，ptsI，ptsM，pyc，pyc P458S，sigC，sigD，sigE，sigH，sigM，tal，thyA，tkt，tpi，zwa1，zwf和zwfA213T。這些在表1中概括及說(shuō)明。
這些特別包括編碼反饋抗性天冬氨酸激酶的lysCFBR等位基因。各種lysCFBR等位基因在表2中概括及說(shuō)明。
優(yōu)選以下lysCFBR等位基因lysC A279T(用蘇氨酸置換SEQ IDNO2所示編碼的天冬氨酸激酶蛋白的第279位丙氨酸)，lysC A279V(用纈氨酸置換SEQ ID NO2所示編碼的天冬氨酸激酶蛋白的第279位丙氨酸)，lysC S301F(用苯丙氨酸置換SEQ ID NO2所示編碼的天冬氨酸激酶蛋白的第301位絲氨酸)，lysC T308I(用異亮氨酸置換SEQ ID NO2所示編碼的天冬氨酸激酶蛋白的第308位蘇氨酸)，lysCS301Y(用酪氨酸置換SEQ ID NO2所示編碼的天冬氨酸激酶蛋白的第301位絲氨酸)，lysC G345D(用天冬氨酸置換SEQ ID NO2所示編碼的天冬氨酸激酶蛋白的第345位甘氨酸)，lysC R320G(用甘氨酸置換SEQ ID NO2所示編碼的天冬氨酸激酶蛋白的第320位精氨酸)，lysC T311I(用異亮氨酸置換SEQ ID NO2所示編碼的天冬氨酸激酶蛋白的第311位蘇氨酸)，lysC S381F(用苯丙氨酸置換SEQ ID NO2所示編碼的天冬氨酸激酶蛋白的第381位絲氨酸)。
特別優(yōu)選的是lysCFBR等位基因lysC T311I(用異亮氨酸置換SEQID NO2所示編碼的天冬氨酸激酶蛋白的第311位蘇氨酸)，其核苷酸序列示于SEQ ID NO3；編碼的天冬氨酸激酶蛋白的氨基酸序列示于SEQ ID NO4。
所述用于賴(lài)氨酸生產(chǎn)的開(kāi)放讀框、基因或等位基因的第二，任選地第三或第四拷貝在每種情況下可以整合進(jìn)第二個(gè)、任選地第三個(gè)或第四個(gè)位點(diǎn)?？梢允褂靡韵麻_(kāi)放讀框、基因或核苷酸序列aecD，ccpA1，ccpA2，citA，citB，citE，fda，gluA，gluB，gluC，gluD，luxR，luxS，lysR1，lysR2，lysR3，menE，mqo，pck，pgi，poxB和zwa2，特別是基因aecD，gluA，gluB，gluC，gluD和pck。這些在表3中概括并說(shuō)明。
所述位點(diǎn)當(dāng)然不僅包括所述開(kāi)放讀框或基因的編碼區(qū)，還包括位于上游的與表達(dá)和調(diào)節(jié)相關(guān)的區(qū)域或核苷酸序列，例如核糖體結(jié)合位點(diǎn)，啟動(dòng)子，調(diào)節(jié)蛋白的結(jié)合位點(diǎn)，調(diào)節(jié)核糖核酸的結(jié)合位點(diǎn)及弱化子。這些區(qū)域一般位于編碼區(qū)上游的1-800，1-600，1-400，1-200，1-100或1-50個(gè)核苷酸范圍內(nèi)。同樣，還包括位于下游的區(qū)域，例如轉(zhuǎn)錄終止子，這些區(qū)域一般位于編碼下游的1-400，1-200，1-100，1-50或1-25個(gè)核苷酸范圍內(nèi)。
另外可以使用染色體內(nèi)的基因間區(qū)域，即無(wú)編碼功能的核苷酸序列。最后，還可以使用染色體中包含的原噬菌體或缺陷噬菌體。
原噬菌體是指一種噬菌體，特別是其基因組，其與宿主的基因組一起復(fù)制且不發(fā)生感染顆粒的形成。缺陷噬菌體是指一種原噬菌體，特別是其基因組，其由于各種突變的結(jié)果而喪失形成所謂感染顆粒的能力。缺陷噬菌體也稱(chēng)為隱性噬菌體。原噬菌體和缺陷噬菌體通常以整合形式存在于其宿主的染色體中。現(xiàn)有技術(shù)中關(guān)于其的進(jìn)一步詳述例如Edward A.Birge的教材所述(細(xì)菌和噬菌體遺傳學(xué)，3rded.，Springer-Verlag，美國(guó)紐約1994)，或者S.Klaus等的教材所述(Bakterienviren，Gustav Fischer Verlag，Jena，德國(guó)1992)。
表1用于賴(lài)氨酸生產(chǎn)的開(kāi)放讀框、基因和等位基因
表2 編碼反饋抗性天冬氨酸激酶的lysCFBR等位基因
表3 用于整合賴(lài)氨酸生產(chǎn)的開(kāi)放讀框、基因和等位基因的靶位點(diǎn)
本發(fā)明還提供了一種生產(chǎn)棒狀細(xì)菌的方法，所述細(xì)菌產(chǎn)生L-賴(lài)氨酸，所述方法包括a)分離用于賴(lài)氨酸生產(chǎn)的至少一個(gè)所希望的ORF、基因或等位基因的核苷酸序列，其任選地包括表達(dá)和/或調(diào)節(jié)信號(hào)，b)將靶位點(diǎn)的核苷酸序列提供給所述用于賴(lài)氨酸生產(chǎn)的ORF、基因或等位基因的5’和3’末端，c)優(yōu)選地將具有靶位點(diǎn)核苷酸序列的所希望的ORF、基因或等位基因的核苷酸序列摻入一個(gè)載體中，所述載體在棒狀細(xì)菌中不復(fù)制或僅有限程度復(fù)制，d)將b)或c)的核苷酸序列轉(zhuǎn)移進(jìn)棒狀細(xì)菌中，e)分離這樣的棒狀細(xì)菌，所述棒狀細(xì)菌中a)核苷酸序列摻入靶位點(diǎn)，在該靶位點(diǎn)沒(méi)有能/使得能在微生物中附加型復(fù)制的核苷酸序列，沒(méi)有能轉(zhuǎn)座/使得發(fā)生轉(zhuǎn)座的核苷酸序列，及沒(méi)有授予抗生素抗性的核苷酸序列。
本發(fā)明還提供了產(chǎn)生L-甲硫氨酸和/或L-蘇氨酸的棒狀細(xì)菌，特別是棒桿菌菌屬，其特征在于除了在天然位點(diǎn)(基因座)存在用于甲硫氨酸生產(chǎn)或蘇氨酸生產(chǎn)的開(kāi)放讀框(ORF)、基因或等位基因的至少一個(gè)拷貝之外，在每種情況下，在第二個(gè)、任選地第三個(gè)或第四個(gè)位點(diǎn)具有整合形式的相應(yīng)開(kāi)放讀框(ORF)、基因或等位基因的第二個(gè)、任選地第三個(gè)或第四個(gè)拷貝，在該特定的第二個(gè)、任選地第三個(gè)或第四個(gè)位點(diǎn)沒(méi)有能/使得能在微生物中附加型復(fù)制的核苷酸序列，沒(méi)有能轉(zhuǎn)座/使得發(fā)生轉(zhuǎn)座的核苷酸序列，及沒(méi)有授予抗生素抗性的核苷酸序列。
本發(fā)明還提供了一種生產(chǎn)L-甲硫氨酸和/或L-蘇氨酸的方法，其包括以下步驟a)在使所述開(kāi)放讀框(ORF)、基因或等位基因表達(dá)的條件下發(fā)酵棒狀細(xì)菌，特別是谷氨酸棒桿菌，這些細(xì)菌的特征在于除了在天然位點(diǎn)(基因座)存在用于甲硫氨酸生產(chǎn)或蘇氨酸生產(chǎn)的開(kāi)放讀框(ORF)、基因或等位基因的至少一個(gè)拷貝之外，在每種情況下在第二個(gè)、任選地第三個(gè)或第四個(gè)位點(diǎn)具有整合形式的開(kāi)放讀框(ORF)、基因或等位基因的第二個(gè)、任選地第三個(gè)或第四個(gè)拷貝，在該特定的第二個(gè)、任選地第三個(gè)或第四個(gè)位點(diǎn)沒(méi)有能/使得能在微生物中附加型復(fù)制的核苷酸序列，沒(méi)有能轉(zhuǎn)座/使得發(fā)生轉(zhuǎn)座的核苷酸序列，及沒(méi)有授予抗生素抗性的核苷酸序列，b)濃縮發(fā)酵肉湯中的L-甲硫氨酸和/或L-蘇氨酸，c)從發(fā)酵肉湯中分離L-甲硫氨酸和/或L-蘇氨酸，任選地d)任選地伴有＞(大于)0-100％的發(fā)酵肉湯的組分和/或生物量。
“用于甲硫氨酸生產(chǎn)的開(kāi)放讀框(ORF)、基因或等位基因的拷貝”是指所有的優(yōu)選地內(nèi)源的開(kāi)放讀框、基因或等位基因，其增強(qiáng)/過(guò)表達(dá)可以具有改良甲硫氨酸生產(chǎn)的作用。
這些包括以下開(kāi)放讀框、基因或等位基因accBC，accDA，aecD，cstA，cysD，cysE，cysH，cysR，cysN，cysQ，dps，eno，fda，gap，gap2，gdh，gnd，glyA，hom，homFBR，lysC，lysCFBR，metA，metB，metE，metH，metY，msiK，opcA，oxyR，ppc，ppcFBR，pgk，pknA，pknB，pknD，pknG，ppsA，ptsH，ptsI，ptsM，pyc，pyc P458S，sigC，sigD，sigE，sigH，sigM，tal，thyA，tkt，tpi，zwa1，zwf和zwfA213T。這些在表4中概括并說(shuō)明。這些特別包括編碼反饋抗性天冬氨酸激酶的lysCFBR等位基因(見(jiàn)表2)，及編碼反饋抗性高絲氨酸脫氫酶的homFBR等位基因。
所述用于甲硫氨酸生產(chǎn)的開(kāi)放讀框(ORF)、基因或等位基因的第二個(gè)、任選地第三個(gè)或第四個(gè)拷貝在每種情況中可以整合在第二個(gè)、任選地第三個(gè)或第四個(gè)位點(diǎn)?？梢允褂靡韵麻_(kāi)放讀框、基因或核苷酸序列bmE，bmF，bmQ，ccpA1，ccpA2，citA，citB，citE，ddh，gluA，gluB，gluC，gluD，luxR，luxS，lysR1，lysR2，lysR3，menE，metD，metK，pck，pgi，poxB和zwa2。這些在表5中概括并說(shuō)明。。
所述位點(diǎn)當(dāng)然不僅包括所述開(kāi)放讀框或基因的編碼區(qū)，還包括位于上游的與表達(dá)和調(diào)節(jié)相關(guān)的區(qū)域或核苷酸序列，例如核糖體結(jié)合位點(diǎn)，啟動(dòng)子，調(diào)節(jié)蛋白的結(jié)合位點(diǎn)，調(diào)節(jié)核糖核酸的結(jié)合位點(diǎn)及弱化子。這些區(qū)域一般位于編碼區(qū)上游的1-800，1-600，1-400，1-200，1-100或1-50個(gè)核苷酸范圍內(nèi)。同樣，還包括位于下游的區(qū)域，例如轉(zhuǎn)錄終止子，這些區(qū)域一般位于編碼區(qū)下游的1-400，1-200，1-100，1-50或1-25個(gè)核苷酸范圍內(nèi)。
另外可以使用染色體內(nèi)的基因間區(qū)域，即無(wú)編碼功能的核苷酸序列。最后，還可以使用染色體中包含的原噬菌體或缺陷噬菌體。
表4用于甲硫氨酸生產(chǎn)的開(kāi)放讀框、基因和等位基因
表5 用于整合甲硫氨酸生產(chǎn)的開(kāi)放讀框、基因和等位基因的靶位點(diǎn)
“用于蘇氨酸生產(chǎn)的開(kāi)放讀框(ORF)、基因或等位基因的拷貝”是指所有的其增強(qiáng)/過(guò)表達(dá)可以具有改良蘇氨酸生產(chǎn)的作用的開(kāi)放讀框、基因或等位基因。
這些包括以下開(kāi)放讀框、基因或等位基因accBC，accDA，cstA，cysD，cysE，cysH，cysI，cysN，cysQ，dps，eno，fda，gap，gap2，gdh，gnd，hom，homFBR，lysC，lysCFBR，msiK，opcA，oxyR，ppc，ppcFBR，pgk，pknA，pknB，pknD，pknG，ppsA，ptsH，ptsI，ptsM，pyc，pyc P458S，sigC，sigD，sigE，sigH，sigM，tal，thyA，tkt，tpi，thrB，thrC，thrE，zwal，zwf和zwfA213T。這些在表6中概括并說(shuō)明。這些特別包括編碼反饋抗性天冬氨酸激酶的lysCFBR等位基因(見(jiàn)表2)及編碼反饋抗性高絲氨酸脫氫酶的homFBR等位基因。
用于蘇氨酸生產(chǎn)的開(kāi)放讀框、基因或等位基因的第二個(gè)、任選地第三個(gè)或第四個(gè)拷貝在每種情況下可以整合入第二個(gè)、任選地第三個(gè)或第四個(gè)位點(diǎn)。為此可以使用以下開(kāi)放讀框、基因或核苷酸序列ccpA1，ccpA2，citA，citB，citE，ddh，gluA，gluB，gluC，gluD，glyA，ilvA，ilvBN，ilvC，ilvD，luxR，luxS，lysR1，lysR2，lysR3，mdh，menE，metA，metD，pck，poxB，sigB和zwa2。這些在表7中概括并說(shuō)明。
所述位點(diǎn)當(dāng)然不僅包括所述開(kāi)放讀框或基因的編碼區(qū)，還包括位于上游的與表達(dá)和調(diào)節(jié)相關(guān)的區(qū)域或核苷酸序列，例如核糖體結(jié)合位點(diǎn)，啟動(dòng)子，調(diào)節(jié)蛋白的結(jié)合位點(diǎn)，調(diào)節(jié)核糖核酸的結(jié)合位點(diǎn)及弱化子。這些區(qū)域一般位于編碼區(qū)上游的1-800，1-600，1-400，1-200，1-100或1-50個(gè)核苷酸范圍內(nèi)。同樣，還包括位于下游的區(qū)域，例如轉(zhuǎn)錄終止子，這些區(qū)域一般位于編碼下游的1-400，1-200，1-100，1-50或1-25個(gè)核苷酸范圍內(nèi)。
另外可以使用染色體內(nèi)的基因間區(qū)域，即無(wú)編碼功能的核苷酸序列。最后，還可以使用染色體中包含的原噬菌體或缺陷噬菌體。
表6 用于蘇氨酸生產(chǎn)的開(kāi)放讀框、基因和等位基因
表7 用于整合蘇氨酸生產(chǎn)的開(kāi)放讀框、基因和等位基因的靶位點(diǎn)
本發(fā)明還提供了生產(chǎn)棒狀細(xì)菌的方法，所述細(xì)菌產(chǎn)生L-甲硫氨酸和/或L-蘇氨酸，所述方法包括a)分離用于甲硫氨酸生產(chǎn)或蘇氨酸生產(chǎn)的至少一個(gè)所希望的ORF、基因或等位基因的核苷酸序列，其任選地包括表達(dá)和/或調(diào)節(jié)信號(hào)，b)將靶位點(diǎn)的核苷酸序列提供給用于賴(lài)氨酸生產(chǎn)的ORF、基因或等位基因的5’和3’末端，c)優(yōu)選地將具有靶位點(diǎn)核苷酸序列的所希望的ORF、基因或等位基因的核苷酸序列摻入一個(gè)載體中，所述載體在棒狀細(xì)菌中不復(fù)制或僅有限程度復(fù)制，d)將b)或c)的核苷酸序列轉(zhuǎn)移進(jìn)棒狀細(xì)菌中，e)分離這樣的棒狀細(xì)菌，所述中a)核苷酸序列摻入靶位點(diǎn)，在該靶位點(diǎn)沒(méi)有能/使得能在微生物中附加型復(fù)制的核苷酸序列，沒(méi)有能轉(zhuǎn)座/使得發(fā)生轉(zhuǎn)座的核苷酸序列，及沒(méi)有授予抗生素抗性的核苷酸序列。
本發(fā)明還提供了產(chǎn)生L-纈氨酸的棒狀細(xì)菌，特別是棒桿菌菌屬，其特征在于除了在天然位點(diǎn)(基因座)存在用于纈氨酸生產(chǎn)的開(kāi)放讀框(ORF)、基因或等位基因的至少一個(gè)拷貝之外，在每種情況下在第二個(gè)、任選地第三個(gè)或第四個(gè)位點(diǎn)還具有整合形式的相應(yīng)開(kāi)放讀框(ORF)、基因或等位基因的第二個(gè)、任選地第三個(gè)或第四個(gè)拷貝，在該特定的第二個(gè)、任選地第三個(gè)或第四個(gè)位點(diǎn)沒(méi)有能/使得能在微生物中附加型復(fù)制的核苷酸序列，沒(méi)有能轉(zhuǎn)座/使得發(fā)生轉(zhuǎn)座的核苷酸序列，及沒(méi)有授予抗生素抗性的核苷酸序列。
本發(fā)明還提供了一種制備L-纈氨酸的方法，其包括以下步驟a)在使所述開(kāi)放讀框(ORF)、基因或等位基因表達(dá)的條件下發(fā)酵棒狀細(xì)菌，特別是谷氨酸棒桿菌，這些細(xì)菌的特征在于除了在天然位點(diǎn)(基因座)存在用于纈氨酸生產(chǎn)的開(kāi)放讀框(ORF)、基因或等位基因的至少一個(gè)拷貝之外，在每種情況下在第二個(gè)、任選地第三個(gè)或第四個(gè)位點(diǎn)還具有整合形式的相應(yīng)開(kāi)放讀框(ORF)、基因或等位基因的第二個(gè)、任選地第三個(gè)或第四個(gè)拷貝，在該特定的第二個(gè)、任選地第三個(gè)或第四個(gè)位點(diǎn)沒(méi)有能/使得能在微生物中附加型復(fù)制的核苷酸序列，沒(méi)有能轉(zhuǎn)座/使得發(fā)生轉(zhuǎn)座的核苷酸序列，及沒(méi)有授予抗生素抗性的核苷酸序列，b)濃縮發(fā)酵肉湯中的L-纈氨酸，c)從發(fā)酵肉湯中分離L-纈氨酸，任選地d)伴有＞(大于)0-100％的發(fā)酵肉湯的組分和/或生物量。
“用于纈氨酸生產(chǎn)的開(kāi)放讀框(ORF)、基因或等位基因的拷貝”是指所有的其增強(qiáng)/過(guò)表達(dá)可以具有改良纈氨酸生產(chǎn)的作用的開(kāi)放讀框、基因或等位基因。
這些包括以下開(kāi)放讀框、基因或等位基因brnE，brnF，brnEF，cstA，cysD，dps，eno，fda，gap，gap2，gdh，ilvB，ilvN，ilvBN，ilvC，ilvD，ilvE，msiK，pgk，ptsH，ptsI，ptsM，sigC，sigD，sigE，sigH，sigM，tpi，zwa1。這些在表8中概括并說(shuō)明。這些特別包括編碼纈氨酸抗性的乙酰乳酸合酶的ilvBN等位基因。
用于纈氨酸生產(chǎn)的開(kāi)放讀框(ORF)、基因或等位基因的第二個(gè)、任選地第三個(gè)或第四個(gè)拷貝在每種情況下可以整合入第二個(gè)、任選地第三個(gè)或第四個(gè)位點(diǎn)。為此可以使用以下開(kāi)放讀框、基因或核苷酸序列aecD，ccpA1，ccpA2，citA，citB，citE，ddh，gluA，gluB，gluC，gluD，glyA，ilvA，luxR，lysR1，lysR2，lysR3，panB，panC，poxB和zwa2。這些在表9中概括并說(shuō)明。
所述位點(diǎn)當(dāng)然不僅包括所述開(kāi)放讀框或基因的編碼區(qū)，還包括位于上游的與表達(dá)和調(diào)節(jié)相關(guān)的區(qū)域或核苷酸序列，例如核糖體結(jié)合位點(diǎn)，啟動(dòng)子，調(diào)節(jié)蛋白的結(jié)合位點(diǎn)，調(diào)節(jié)核糖核酸的結(jié)合位點(diǎn)及弱化子。這些區(qū)域一般位于編碼區(qū)上游的1-800，1-600，1-400，1-200，1-100或1-50個(gè)核苷酸范圍內(nèi)。同樣，還包括位于下游的區(qū)域，例如轉(zhuǎn)錄終止子，這些區(qū)域一般位于編碼區(qū)下游的1-400，1-200，1-100，1-50或1-25個(gè)核苷酸范圍內(nèi)。
另外可以使用染色體內(nèi)的基因間區(qū)域，即無(wú)編碼功能的核苷酸序列。最后，還可以使用染色體中包含的原噬菌體或缺陷噬菌體。
表8 用于纈氨酸生產(chǎn)的開(kāi)放讀框、基因和等位基因
表9 用于整合纈氨酸生產(chǎn)的開(kāi)放讀框、基因和等位基因的靶位點(diǎn)
本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)棒狀細(xì)菌的方法，所述細(xì)菌產(chǎn)生L-纈氨酸，所述方法包括a)分離用于纈氨酸生產(chǎn)的至少一個(gè)所希望的ORF、基因或等位基因的核苷酸序列，其任選地包括表達(dá)和/或調(diào)節(jié)信號(hào)，b)將靶位點(diǎn)的核苷酸序列提供給用于賴(lài)氨酸生產(chǎn)的ORF、基因或等位基因的5’和3’末端，c)優(yōu)選地將具有靶位點(diǎn)核苷酸序列的所希望的ORF、基因或等位基因的核苷酸序列摻入一個(gè)載體中，所述載體在棒狀細(xì)菌中不復(fù)制或僅有限程度復(fù)制，d)將b)或c)的核苷酸序列轉(zhuǎn)移進(jìn)棒狀細(xì)菌中，e)分離這樣的棒狀細(xì)菌，所述棒狀細(xì)菌中a)核苷酸序列摻入靶位點(diǎn)，在該靶位點(diǎn)沒(méi)有能/使得能在微生物中附加型復(fù)制的核苷酸序列，沒(méi)有能轉(zhuǎn)座/使得發(fā)生轉(zhuǎn)座的核苷酸序列，及沒(méi)有授予抗生素抗性的核苷酸序列。
在實(shí)施本發(fā)明期間，可以將lysCFBR等位基因的第二個(gè)拷貝摻入谷氨酸棒桿菌的gluB基因中，同時(shí)使該gluB基因位點(diǎn)中沒(méi)有能/使得能在微生物中附加型復(fù)制的核苷酸序列，沒(méi)有能轉(zhuǎn)座/使得發(fā)生轉(zhuǎn)座的核苷酸序列，沒(méi)有授予的抗生素抗性的核苷酸序列。這個(gè)稱(chēng)為DSM13994glu∷lysC的菌株，在其天然lysC位點(diǎn)攜帶lysCFBR等位基因lysC T311I，在第二個(gè)位點(diǎn)(靶位點(diǎn))即gluB基因攜帶lysCFBR等位基因lysCT311I的第二個(gè)拷貝?？梢杂糜趯?shí)現(xiàn)將lysCFBR等位基因摻入gluB基因的質(zhì)粒示于

圖1。所述質(zhì)粒稱(chēng)為pK18mobsacBglu1_1。
在實(shí)施本發(fā)明期間，還可以將lysCFBR等位基因的一個(gè)拷貝摻入谷氨酸棒桿菌的gluB基因的靶位點(diǎn)中，同時(shí)使得該gluB基因位點(diǎn)沒(méi)有能/使得能在微生物中附加型復(fù)制的核苷酸序列，沒(méi)有能轉(zhuǎn)座/使得發(fā)生轉(zhuǎn)座的核苷酸序列，沒(méi)有授予抗生素抗性的核苷酸序列。這個(gè)稱(chēng)為DSM12866glu∷lysC的菌株，在其天然lysC位點(diǎn)攜帶野生型形式的lysC基因，在第二個(gè)位點(diǎn)(靶位點(diǎn))即gluB基因攜帶lysCFBR等位基因lysC T311I形式的lysC基因的第二個(gè)拷貝。這一菌株已經(jīng)保藏在德意志微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為DSM15039?？梢杂糜趯?shí)現(xiàn)將lysCFBR等位基因摻入gluB基因的質(zhì)粒示于圖1。所述質(zhì)粒稱(chēng)為pK18mobsacBglu1_1。
在實(shí)施本發(fā)明期間，還可以將lysCFBR等位基因的一個(gè)拷貝摻入谷氨酸棒桿菌的aecD基因的靶位點(diǎn)中，同時(shí)使在該aceD基因位點(diǎn)沒(méi)有能/使得能在微生物中附加型復(fù)制的核苷酸序列，沒(méi)有能轉(zhuǎn)座/使得發(fā)生轉(zhuǎn)座的核苷酸序列，及沒(méi)有授予抗生素抗性的核苷酸序列。這個(gè)稱(chēng)為DSM12866aecD∷lysC的菌株，在其天然lysC位點(diǎn)攜帶野生型形式的lysC基因，在第二個(gè)位點(diǎn)(靶位點(diǎn))即aecD基因攜帶lysCFBR等位基因lysC T311I形式的lysC基因的第二個(gè)拷貝?？梢杂糜趯?shí)現(xiàn)將lysCFBR等位基因摻入aecD基因的質(zhì)粒示于圖2。所述質(zhì)粒稱(chēng)為pK18mobsacBaecD1_1。
在實(shí)施本發(fā)明期間，還可以將lysCFBR等位基因的一個(gè)拷貝摻入谷氨酸棒桿菌的pck基因的靶位點(diǎn)中，同時(shí)使該pck基因位點(diǎn)沒(méi)有能/使得能在微生物中附加型復(fù)制的核苷酸序列，沒(méi)有能轉(zhuǎn)座/使得發(fā)生轉(zhuǎn)座的核苷酸序列，及沒(méi)有授予抗生素抗性的核苷酸序列。這個(gè)稱(chēng)為DSM12866pck∷lysC的菌株，在其天然lysC位點(diǎn)攜帶野生型形式的lysC基因，在第二個(gè)位點(diǎn)(靶位點(diǎn))即pck基因攜帶lysCFBR等位基因lysCT311I形式的lysC基因的第二個(gè)拷貝?？梢杂糜趯?shí)現(xiàn)摻入pck基因中的質(zhì)粒示于圖3。所述質(zhì)粒稱(chēng)為pK18mobsacBpck1_1。
在實(shí)施本發(fā)明期間，還可以將ddh基因的一個(gè)拷貝摻入谷氨酸棒桿菌的gluB基因中，同時(shí)使該gluB基因位點(diǎn)沒(méi)有能/使得能在微生物中附加型復(fù)制的核苷酸序列，沒(méi)有能轉(zhuǎn)座/使得發(fā)生轉(zhuǎn)座的核苷酸序列，及沒(méi)有授予抗生素抗性的核苷酸序列。這個(gè)稱(chēng)為DSM12866glu∷ddh的菌株，在其天然ddh位點(diǎn)攜帶ddh基因的一個(gè)拷貝，在第二個(gè)位點(diǎn)(靶位點(diǎn))即gluB基因攜帶ddh基因的第二個(gè)拷貝?？梢杂糜趯?shí)現(xiàn)將ddh基因摻入gluB基因的質(zhì)粒示于圖4。所述質(zhì)粒稱(chēng)為pK18mobsacBgluB2_1。
在實(shí)施本發(fā)明期間，還可以將dapA基因的一個(gè)拷貝摻入谷氨酸棒桿菌的aecD基因中，同時(shí)使該aecD基因位點(diǎn)沒(méi)有能/使得能在微生物中附加型復(fù)制的核苷酸序列，沒(méi)有能轉(zhuǎn)座/使得發(fā)生轉(zhuǎn)座的核苷酸序列，及沒(méi)有授予抗生素抗性的核苷酸序列。這個(gè)稱(chēng)為DSM12866aecD∷dapA的菌株，在其天然dapA位點(diǎn)攜帶dapA基因的一個(gè)拷貝，在第二個(gè)位點(diǎn)(靶位點(diǎn))即aecD基因攜帶dapA基因的第二個(gè)拷貝?？梢杂糜趯?shí)現(xiàn)將dapA基因摻入aecD基因的質(zhì)粒示于圖5。所述質(zhì)粒稱(chēng)為pK18mobsacBaecD2_1。
在實(shí)施本發(fā)明期間，可以將pyc基因的一個(gè)拷貝摻入谷氨酸棒桿菌的pck基因的靶位點(diǎn)中，同時(shí)使該pck基因位點(diǎn)沒(méi)有能/使得能在微生物中附加型復(fù)制的核苷酸序列，沒(méi)有能轉(zhuǎn)座/使得發(fā)生轉(zhuǎn)座的核苷酸序列，及沒(méi)有授予抗生素抗性的核苷酸序列。這個(gè)稱(chēng)為DSM12866pck∷pyc的菌株，在其天然pyc位點(diǎn)攜帶野生型形式的pyc基因的一個(gè)拷貝，在第二個(gè)位點(diǎn)(靶位點(diǎn))即pck基因攜帶pyc等位基因pyc P458S形式的pyc基因的第二個(gè)拷貝。可以用于實(shí)現(xiàn)將pyc等位基因摻入pck基因的質(zhì)粒示于圖6。所述質(zhì)粒稱(chēng)為pK18mobsacBpck1_3。
為生產(chǎn)化合物，根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的棒狀細(xì)菌可以連續(xù)培養(yǎng)或者不連續(xù)培養(yǎng)，所述不連續(xù)培養(yǎng)是分批培養(yǎng)或補(bǔ)料分批培養(yǎng)或者重復(fù)補(bǔ)料分批培養(yǎng)。已知培養(yǎng)方法的概述見(jiàn)Chmiel所著教材(Bioprozesstechnik1.Einfhrung in dieBioverfahrenstechnik(Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1991))或者Storhas所著教材(Bioreaktoren und periphere Einrichtungen(Vieweg Verlag，Braunschweig/Wiesbaden，1994))。
所用培養(yǎng)基必須以適當(dāng)方式符合各菌株的需求。關(guān)于各種微生物培養(yǎng)基的闡述見(jiàn)于美國(guó)細(xì)菌學(xué)會(huì)的“細(xì)菌學(xué)通用方法手冊(cè)”(美國(guó)華盛頓D.C.，1981)。
可使用的碳源包括糖及碳水化合物，例如葡萄糖，蔗糖，乳糖，果糖，麥芽糖，糖蜜，淀粉和纖維素，油和脂肪如豆油，葵花油，落花生油和椰子油，脂肪酸如棕櫚酸，硬脂酸和亞油酸，醇如甘油和乙醇，及有機(jī)酸如乙酸。這些物質(zhì)可單獨(dú)或混合使用。
可使用的氮源包括含氮的有機(jī)化合物如胨，酵母提取物，肉膏，麥芽提取物，玉米浸液，大豆粉和尿素，或無(wú)機(jī)化物如硫酸銨，氯化銨，磷酸銨，碳酸銨和硝酸銨。氮源可單獨(dú)或混合使用。
可使用的磷源包括磷酸，磷酸二氫鉀或磷酸氫二鉀，或相應(yīng)鈉鹽。培養(yǎng)基另外還必須含有為生長(zhǎng)所需的金屬鹽如硫酸鎂或硫酸鐵。最后，除了上述物質(zhì)之外，可使用生長(zhǎng)必需物質(zhì)如氨基酸和維生素。此外，可將適當(dāng)前體加入培養(yǎng)基中，上述物質(zhì)可以單批形式或在培養(yǎng)期間適當(dāng)補(bǔ)加。
可以適當(dāng)方式加入堿性化合物如NaOH，KOH，氨或氨水，或酸性化合物如磷酸或硫酸，以調(diào)節(jié)培養(yǎng)物的PH值?？古菽瓌├缰舅峋垡叶减タ捎糜诳刂婆菽a(chǎn)生。適當(dāng)?shù)倪x擇性作用物質(zhì)例如抗生素，可加入培養(yǎng)基中以保持質(zhì)粒的穩(wěn)定性。氧氣或含氧混合氣，例如空氣，可充入培養(yǎng)物中以保持有氧條件。培養(yǎng)溫度通常在20℃～45℃，優(yōu)選25℃-40℃。持續(xù)培養(yǎng)直至所需產(chǎn)物形成最大量。此目的通常在10～160小時(shí)范圍內(nèi)達(dá)到。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的棒狀細(xì)菌，尤其產(chǎn)生L-賴(lài)氨酸的棒狀細(xì)菌，具有令人意想不到的高穩(wěn)定性。它們?cè)谥辽?0-20，20-30，30-40，40-50個(gè)，優(yōu)選至少50-60，60-70，70-80和80-90個(gè)代次或細(xì)胞分裂周期過(guò)程中保持穩(wěn)定。
以下微生物已經(jīng)保藏谷氨酸棒桿菌菌株DSM12866glu∷lysC以純培養(yǎng)物形式于2002年6月5日根據(jù)布達(dá)佩斯條約保藏在德意志微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(DSMZ，德國(guó)不倫瑞克)，保藏號(hào)DSM15039。
質(zhì)粒pK18mobsacBglu1_1以大腸桿菌菌株DH5αmcr/pK18mobsacBglu1_1(＝DH5alphamcr/pK18mobsacBglu1_1)的純培養(yǎng)物形式，根據(jù)布達(dá)佩斯條約于2001年4月20日保藏在德意志微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(DSMZ，德國(guó)不倫瑞克)，保藏號(hào)DSM14243。
質(zhì)粒pK18mobsacBaecD1_1以大腸桿菌菌株DH5αmcr/pK18mobsacBaecD1_1(＝DH5alphamcr/pK18mobsacBaecD1_1)的純培養(yǎng)物形式，根據(jù)布達(dá)佩斯條約于2002年6月5日保藏在德意志微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(DSMZ，Braunschweig，德國(guó))，保藏號(hào)DSM15040。
實(shí)施例1將lysCFBR等位基因的第二個(gè)拷貝摻入菌株DSM13994和菌株DSM12866的染色體中谷氨酸棒桿菌菌株DSM13994從谷氨酸棒桿菌ATCC13032中通過(guò)多次非定向誘變、選擇和突變體選擇而產(chǎn)生。該菌株對(duì)賴(lài)氨酸類(lèi)似物S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸有抗性，并具有一種反饋抗性天冬氨酸激酶，其對(duì)賴(lài)氨酸和蘇氨酸的混合物(各25mM)的抑制作用不敏感。這個(gè)菌株的lysCFBR等位基因的核苷酸序列示于SEQ ID NO3。在下文也稱(chēng)為lysC T311I。所編碼的天冬氨酸激酶蛋白的氨基酸序列示于SEQ ID NO4。這個(gè)菌株的純培養(yǎng)物根據(jù)布達(dá)佩斯條約于2001年1月16日保藏在德意志微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(DSMZ，Braunschweig，德國(guó))。
菌株DSM12866從谷氨酸棒桿菌ATCC13032中通過(guò)非定向誘變及選擇具有最佳L-賴(lài)氨酸積累的突變體而產(chǎn)生，其是甲硫氨酸敏感性的。在包含L-甲硫氨酸的基本培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)可以通過(guò)加入蘇氨酸而再建立。這個(gè)菌株具有野生型形式的lysC基因，示于SEQ IDNO1。野生型天冬氨酸激酶蛋白的相應(yīng)氨基酸序列示于SEQ ID NO2。這個(gè)菌株的純培養(yǎng)物根據(jù)布達(dá)佩斯條約于1999年6月10日保藏于德意志微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(DSMZ，Braunschweig，德國(guó))。
1.1 分離和測(cè)序菌株DSM13994的lysC等位基因的DNA通過(guò)常規(guī)方法從菌株DSM13994中分離染色體DNA(Eikmanns等，微生物學(xué)1401817-1828(1994))。借助于聚合酶反應(yīng)，擴(kuò)增攜帶lysC基因或等位基因的一個(gè)DNA節(jié)段?；谝阎墓劝彼岚魲U菌lysC基因的序列(Kalinowski等，分子微生物學(xué)5(5)，1197-1204(1991)；登記號(hào)X57226)，選擇以下寡核苷酸引物進(jìn)行PCRlysC1beg(SEQ ID No5)5’TA(G GAT CC)T CCG GTG TCT GAC CAC GGT G3’lysC2end(SEQ ID NO6)5’AC(G GAT CC)G CTG GGA AAT TGCGCT CTT CC3’所示引物由MWG Biotech合成，PCR反應(yīng)通過(guò)Innis等所述標(biāo)準(zhǔn)PCR方法進(jìn)行(PCR方案，方法與應(yīng)用指導(dǎo)，1990，學(xué)術(shù)出版社)。所述引物可以擴(kuò)增長(zhǎng)度大約為1.7kb的一個(gè)DNA節(jié)段，其攜帶lysC基因或等位基因。所述引物另外還含有限制性?xún)?nèi)切酶BamHI的切割位點(diǎn)的序列，其在以上所示核苷酸序列中用括號(hào)標(biāo)示。
攜帶菌株DSM13994的lysC等位基因的長(zhǎng)度大約為1.7kb的擴(kuò)增的DNA片段，通過(guò)在0.8％瓊脂糖凝膠中電泳鑒別，從凝膠中分離并通過(guò)常規(guī)方法純化(QIA快速凝膠提取試劑盒，Qiagen，Hilden)。
然后利用Topo TA克隆試劑盒(Invitrogen，Leek，The Netherlands，Cat.Number K4600-01)，在載體pCRII-TOPO中進(jìn)行片段連接。將連接混合物轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌菌株TOP10(Invitrogen，Leek，荷蘭)中。將轉(zhuǎn)化混合物鋪板于含有卡那霉素(50mg/l)的具有X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷，64mg/l)的LB瓊脂上選擇攜帶質(zhì)粒的細(xì)胞。
獲得的質(zhì)粒通過(guò)在分離DNA后限制切割而檢測(cè)，并在瓊脂糖凝膠中電泳。所得質(zhì)粒稱(chēng)為pCRIITOPOlysC。
擴(kuò)增的DNA片段或PCR產(chǎn)物的核苷酸序列通過(guò)Sanger等所述雙脫氧鏈終止方法測(cè)定(美國(guó)科學(xué)院院報(bào)745463-5467(1977))，使用PE Applied Biosystems的ABI Prism377測(cè)序設(shè)備(Weiterstadt，德國(guó))。所述PCR產(chǎn)物的編碼區(qū)序列示于SEQ ID No3。相關(guān)天冬氨酸激酶蛋白的氨基酸序列示于SEQ ID NO4。
堿基胸腺嘧啶在菌株DSM13994的lysCFBR等位基因編碼區(qū)的核苷酸序列的第932位發(fā)現(xiàn)(SEQ ID NO3)。堿基胞嘧啶在野生型基因的相應(yīng)位置發(fā)現(xiàn)(SEQ ID NO1)。
異亮氨酸在菌株DSM13994的天冬氨酸激酶蛋白的氨基酸序列的第311位發(fā)現(xiàn)(SEQ ID No4)。蘇氨酸在野生型蛋白的相應(yīng)位置蛋白發(fā)現(xiàn)(SEQ ID No2)。
在編碼區(qū)第932位含有胸腺嘧啶并因此編碼在氨基酸序列第311位含有異亮氨酸的天冬氨酸激酶蛋白的lysC等位基因，在下文稱(chēng)為lysCFBR等位基因或lysC T311I。
攜帶lysCFBR等位基因lysC T311I的質(zhì)粒pCRIITOPOlysC，根據(jù)布達(dá)佩斯條約于2001年4月20日以大腸桿菌菌株TOP10/pCRIITOPOlysC的純培養(yǎng)物形式保藏于德意志微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(DSMZ，Braunschweig，德國(guó))，保藏號(hào)DSM14242。
1.2 構(gòu)建置換載體pK18mobsacBglu1_1谷氨酸棒桿菌菌株ATCC13032用作染色體DNA的供體。使用常規(guī)方法從菌株ATCC13032中分離染色體DNA(Eikmanns等，微生物學(xué)1401817-1828(1994))。借助于聚合酶鏈反應(yīng)，擴(kuò)增攜帶gluB基因和周?chē)鷧^(qū)域的DNA片段?；谝阎墓劝彼岚魲U菌gluABCD基因簇的序列(Kronemeyer等，細(xì)菌學(xué)雜志1771152-1158(1995))(登記號(hào)X81191)，選擇以下寡核苷酸引物進(jìn)行PCRgluBg11(SEQ ID NO7)5’TA(AGAT CT)G TGT TGG ACG TCA TGG CAA G3’gluBg12(SEQ ID NO8)5’AC(A GAT CT)T GAA GCC AAG TAC GGC CAA G3’所示引物由MWG Biotech合成，并通過(guò)Innis所述標(biāo)準(zhǔn)PCR方法進(jìn)行PCR(PCR方案，方法和應(yīng)用指導(dǎo)，1990，學(xué)術(shù)出版社)。所述引物可以擴(kuò)增大約1.7kb的DNA片段，其攜帶gluB基因和周?chē)鷧^(qū)域。所述周?chē)鷧^(qū)域是代表gluA基因的3’末端的位于gluB基因上游的大約0.33kb的序列節(jié)段，和代表gluC基因的5’末端的gluB基因下游的大約0.44kb的序列節(jié)段。所述引物還含有限制性?xún)?nèi)切酶BglII的切割位點(diǎn)序列，在上述核苷酸序列中用括號(hào)加以標(biāo)示。
攜帶gluB基因和周?chē)鷧^(qū)域的大約1.7kb的擴(kuò)增的DNA片段，通過(guò)在0.8％瓊脂糖凝膠中電泳及從凝膠中分離并通過(guò)常規(guī)方法純化而鑒別(QIAquick凝膠提取試劑盒，Qiagen，Hilden)。
然后在載體pCRII-TOPO中利用TOPO TA克隆試劑盒(Invitrogen，Leek，荷蘭，Cat.Number K4600-01)進(jìn)行片段連接。將連接混合物轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌菌株TOP10(Invitrogen，Leek，荷蘭)中。通過(guò)將轉(zhuǎn)化物鋪板于含有卡那霉素(50mg/l)的具有X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷，64mg/l)的LB瓊脂上選擇攜帶質(zhì)粒的細(xì)胞。
獲得的質(zhì)粒在分離DNA后通過(guò)限制切割而檢測(cè)，并在瓊脂糖凝膠中鑒別。所得質(zhì)粒稱(chēng)為pCRII-TOPOglu。
將質(zhì)粒pCRII-TOPOglu用限制酶BglII(Amersham-Pharmacia，F(xiàn)reiburg，德國(guó))切割，并在瓊脂糖凝膠(0.8％)中借助于QIAquick凝膠提取試劑盒(Qiagen，Hilden，德國(guó))分離后，從該瓊脂糖凝膠中分離大約1.7kb的gluB片段，用于與Sch_fer所述可移動(dòng)克隆載體pK18mobsacB(基因1469-73(1994))連接。預(yù)先將該載體用限制酶BamHI切割及用堿性磷酸酶去磷酸化(堿性磷酸酶，BoehringerMannheim)，與大約1.7kb的gluB片段混合，并將混合物用T4 DNA連接酶處理(Amersham-Pharmacia，F(xiàn)reiburg，德國(guó))。
然后將大腸桿菌菌株DH5α(Grant等，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)87(1990)4645-4649)用連接混合物轉(zhuǎn)化(Hanahan，DNA克隆實(shí)用方案，第1卷，ILR-出版社，冷泉港，紐約，1989)。通過(guò)將轉(zhuǎn)化物鋪板于補(bǔ)加50mg/l卡那霉素的LB瓊脂上選擇攜帶質(zhì)粒的細(xì)胞(Sambrook等，分子克隆實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)，第2版，冷泉港，紐約，1989)。
借助于得自Qiagen的QIAprep Spin Miniprep試劑盒從轉(zhuǎn)化體中分離質(zhì)粒DNA，并通過(guò)限制切割及隨后的瓊脂糖凝膠電泳而檢測(cè)。所述質(zhì)粒稱(chēng)為pK18mobsacBglu1。
從攜帶質(zhì)粒pCRIITOPOlysC的菌株DSM14242中分離質(zhì)粒DNA(見(jiàn)實(shí)施例1.1)，用限制酶BamHI切割(Amersham-Pharmacia，F(xiàn)reiburg，德國(guó))，借助于QIAquick凝膠提取試劑盒(Qiagen，Hilden，德國(guó))在瓊脂糖凝膠(0.8％)中分離后，將大約1.7kb的含有l(wèi)ySCFBR的DNA片段從瓊脂糖凝膠中分離，并用于與上述載體pK18mobsacBglu1連接。該載體預(yù)先用限制酶BamHI切割，用堿性磷酸酶去磷酸化(堿性磷酸酶，Boehringer Mannheim，德國(guó))，與大約1.7kb的lysCFBR片段混合，將所述混合物用T4 DNA連接酶(Amersham-Pharmacia，F(xiàn)reiburg，德國(guó))處理。
然后將大腸桿菌菌株DH5αmcr(Life Technologies GmbH，Karlsruhe，德國(guó))用連接混合物轉(zhuǎn)化(Hanahan，DNA克隆實(shí)用方案，第1卷，ILR-出版社，冷泉港，紐約，1989)。通過(guò)將轉(zhuǎn)化物鋪板于補(bǔ)加50mg/l卡那霉素的LB瓊脂上選擇攜帶質(zhì)粒的細(xì)胞(Sambrook等，分子克隆實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)，第2版，冷泉港，紐約，1989)。
借助于得自Qiagen的QIAprep Spin Miniprep試劑盒從轉(zhuǎn)化體中分離質(zhì)粒DNA，并通過(guò)限制切割及隨后的瓊脂糖凝膠電泳而檢測(cè)。所述質(zhì)粒稱(chēng)為pK18mobsacBglu1_1。該質(zhì)粒圖示于圖1。
質(zhì)粒pK18mobsacBglu1_1根據(jù)布達(dá)佩斯條約，于2001年4月20日以大腸桿菌菌株DH5αmcr/pK18mobsacBglu1_1(＝DH5alphamcr/pK18mobsacBglu1_1)的純培養(yǎng)物形式保藏于德意志微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(DSMZ，Braunschweig，德國(guó))，保藏號(hào)DSM14243。
1.3 利用置換載體pK18mobsacBglu1_1將lySCFBR等位基因lysC T311I的第二個(gè)拷貝摻入菌株DSM13994的染色體中(靶位點(diǎn)gluB基因)通過(guò)Schafer等所述方法(微生物學(xué)雜志1721663-1666(1990))，將實(shí)施例1.2所述載體pK18mobsacBglu1_1通過(guò)接合轉(zhuǎn)移進(jìn)谷氨酸棒桿菌菌株DSM13994中。所述載體在DSM13994中不能獨(dú)立復(fù)制，只有整合進(jìn)染色體中才保留在細(xì)胞中。將接合混合物鋪板于補(bǔ)加15mg/l卡那霉素和50mg/萘啶酸的LB瓊脂(Sambrook等，分子克隆實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)，第2版，冷泉港，紐約，1989)上選擇具有整合的pK18mobsacBglu1_1的克隆或轉(zhuǎn)接合子。將卡那霉素抗性轉(zhuǎn)接合子鋪板于具有25mg/l卡那霉素的LB瓊脂上，在33℃溫育48小時(shí)。
為選擇由于第二次重組已經(jīng)切除所述質(zhì)粒的突變體，將克隆在LB液態(tài)培養(yǎng)基中培養(yǎng)20小時(shí)，然后鋪板于具有10％蔗糖的LB瓊脂上并溫育48小時(shí)。
與起始質(zhì)粒pK18mobsacB相似，質(zhì)粒pK18mobsacBglu1_1除了卡那霉素抗性基因之外還含有編碼Bacillus subtilis的果聚糖蔗糖酶的sacB基因的一個(gè)拷貝?？捎烧崽敲刚T導(dǎo)的表達(dá)導(dǎo)致果聚糖蔗糖酶形成，其催化對(duì)谷氨酸棒桿菌有毒性的產(chǎn)物果聚糖合成。因此只有由于第二次重組已經(jīng)切除整合的pK18mobsacBglu1_1的那些克隆在LB瓊脂上生長(zhǎng)。根據(jù)第二次重組事件的位置，在切除后，lysCFBR等位基因的第二個(gè)拷貝在染色體gluB基因座顯示出，或者宿主的原始gluB基因座得以保留。
對(duì)大約40-50個(gè)菌落測(cè)試“在蔗糖存在下生長(zhǎng)”及“在卡那霉素存在下不生長(zhǎng)”的表型。對(duì)示出“在蔗糖存在下生長(zhǎng)”及“在卡那霉素存在下不生長(zhǎng)”表型的大約20個(gè)菌落借助于聚合酶鏈反應(yīng)進(jìn)行研究。從所述菌落的染色體DNA中擴(kuò)增攜帶gluB基因和周?chē)鷧^(qū)域的DNA片段。選擇與實(shí)施例1.2中構(gòu)建整合質(zhì)粒相同的引物進(jìn)行PCR。
gluBg11(SEQ ID NO7)5’TA(A GAT CT)G TGT TGG ACG TCA TGG CAA G3’gluBg12(SEQ ID NO8)5′AC(A GATCT)T GAA GCCAAG TAC GGC CAA G3’所述引物在具有原始gluB基因座的對(duì)照克隆中可以擴(kuò)增出大約1.7kb的DNA片段。在染色體gluB基因座具有l(wèi)ysCFBR等位基因第二個(gè)拷貝的克隆中，大約3.4kb的DNA片段被擴(kuò)增。
擴(kuò)增的DNA片段通過(guò)在0.8％瓊脂糖凝膠中電泳加以鑒別。
以這種方式鑒別一種克隆，所述克隆除了存在于lysC基因座的拷貝之外，在染色體gluB基因座還具有l(wèi)ysCFRB等位基因lysC T311I形式的lysC基因的第二個(gè)拷貝。這個(gè)克隆稱(chēng)為菌株DSM13994glu∷lysC。
1.4通過(guò)置換載體pK18mobsacBglu1_1將lysCFBR等位基因lysC T311I形式的lysC基因的第二個(gè)拷貝摻入菌株DSM12866的染色體中(靶位點(diǎn)gluB基因)如實(shí)施例1.3所述，將質(zhì)粒pK18mobsacBglu1_1通過(guò)接合轉(zhuǎn)移進(jìn)谷氨酸棒桿菌菌株DSM12866中。以實(shí)施例1.3所述方式鑒別一個(gè)克隆，所述克隆除了在lysC基因座存在野生型基因的拷貝之外，在染色體的gluB基因座還具有l(wèi)ysCFBR等位基因lysC T311I形式的lysC基因的第二個(gè)拷貝。這個(gè)克隆稱(chēng)為菌株DSM12866glu∷lysC。
攜帶在gluB基因中的lysCFBR等位基因第二個(gè)拷貝的本發(fā)明谷氨酸棒桿菌菌株，根據(jù)布達(dá)佩斯條約于2002年6月5日以谷氨酸棒桿菌菌株DSM12866glu∷lysC的純培養(yǎng)物形式保藏于德意志微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(DSMZ，Braunschweig，德國(guó))，保藏號(hào)DSM15039。
1.5 構(gòu)建置換載體pK18mobsacBpck1_1谷氨酸棒桿菌菌株ATCC13032用作染色體DNA的供體。使用常規(guī)方法從菌株ATCC13032中分離染色體DNA(Eikmanns等，微生物學(xué)1401817-1828(1994))。借助于聚合酶鏈反應(yīng)，擴(kuò)增攜帶pck基因和周?chē)鷧^(qū)域的DNA片段?；谝阎墓劝彼岚魲U菌pck基因的序列(EP1094111及Riedel等，分子和微生物技術(shù)雜志3573-583(2001))(登錄號(hào)AJ269506)，選擇以下寡核苷酸引物進(jìn)行PCRpck_beg(SEQ ID NO9)5’TA(AGAT CT)G CCG GCA TGA CTT CAG TTT3’pck_end(SEQ ID NO10)5’AC(A GAT CT)G GTG GGA GCC TTT CTT GTTATT3’所示引物由MWG Biotech合成，通過(guò)Innis所述標(biāo)準(zhǔn)PCR方法進(jìn)行PCR(PCR方案，方法和應(yīng)用指導(dǎo)，1990，學(xué)術(shù)出版社)。所述引物可以擴(kuò)增出大約2.9kb的DNA片段，其攜帶pck基因和周?chē)鷧^(qū)域。所述引物還含有限制性?xún)?nèi)切酶BglII的切割位點(diǎn)序列，在上述核苷酸序列中用括號(hào)加以標(biāo)示。
攜帶pck基因和周?chē)鷧^(qū)域的大約2.9kb的擴(kuò)增的DNA片段，通過(guò)在0.8％瓊脂糖凝膠中電泳及從凝膠中分離并通過(guò)常規(guī)方法純化而鑒別(QIAquick凝膠提取試劑盒，Qiagen，Hilden)。
然后在載體pCRII-TOPO中利用TOPO TA克隆試劑盒(Invitrogen，Leek，荷蘭，Cat.Number K4600-01)進(jìn)行片段連接。將連接混合物轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌菌株TOP10(Invitrogen，Leek，荷蘭)中。通過(guò)將轉(zhuǎn)化物鋪板于含有卡那霉素(50mg/l)的具有X-Gal(64mg/l)的LB瓊脂上選擇攜帶質(zhì)粒的細(xì)胞。
獲得的質(zhì)粒在分離DNA后通過(guò)限制切割而檢測(cè)，并在瓊脂糖凝膠中鑒別。所得質(zhì)粒稱(chēng)為pCRII-TOP0pck。
將質(zhì)粒pCRII-TOPOpck用限制酶BglII(Amersham-Pharmacia，F(xiàn)reiburg，德國(guó))切割，并在瓊脂糖凝膠(0.8％)中借助于QIAquick凝膠提取試劑盒(Qiagen，Hilden，德國(guó))分離后，從該瓊脂糖凝膠中分離大約2.9kb的pck片段，用于與Sch_fer所述可移動(dòng)克隆載體pK18mobsacB(基因1469-73(1994))連接。預(yù)先將該載體用限制酶BamHI切割及用堿性磷酸酶去磷酸化(堿性磷酸酶，BoehringerMannheim)，與大約2.9kb的pck片段混合，并將混合物用T4 DNA連接酶處理(Amersham-Pharmacia，F(xiàn)reiburg，德國(guó))。
然后將大腸桿菌菌株DH5α(Grant等，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)87(1990)4645-4649)用連接混合物轉(zhuǎn)化(Hanahan，DNA克隆實(shí)用方案，第1卷，ILR-出版社，冷泉港，紐約，1989)。通過(guò)將轉(zhuǎn)化物鋪板于補(bǔ)加50mg/l卡那霉素的LB瓊脂上選擇攜帶質(zhì)粒的細(xì)胞(Sambrook等，分子克隆實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)，第2版，冷泉港，紐約，1989)。
借助于得自Qiagen的QIAprep Spin Miniprep試劑盒從轉(zhuǎn)化體中分離質(zhì)粒DNA，并通過(guò)限制切割及隨后的瓊脂糖凝膠電泳而檢測(cè)。所述質(zhì)粒稱(chēng)為pK18mobsacBpck1。
從攜帶質(zhì)粒pCRIITOPOlysC的菌株DSM14242中分離質(zhì)粒DNA(見(jiàn)實(shí)施例1.1)，用限制酶BamHI切割(Amersham-Pharmacia，F(xiàn)reiburg，德國(guó))，借助于QIAquick凝膠提取試劑盒(Qiagen，Hilden，德國(guó))在瓊脂糖凝膠(0.8％)中分離后，將大約1.7kb的含有l(wèi)ySCFBR的DNA片段從瓊脂糖凝膠中分離，并用于與上述載體pK18mobsacBpck1連接。將該載體預(yù)先用限制酶BamHI切割，用堿性磷酸酶去磷酸化(堿性磷酸酶，Boehringer Mannheim，德國(guó))，與大約1.7kb的lysCFBR片段混合，將所述混合物用T4 DNA連接酶(Amersham-Pharmacia，F(xiàn)reiburg，德國(guó))處理。
然后將大腸桿菌菌株DH5αmcr(Life Technologies GmbH，Karlsruhe，德國(guó))用連接混合物轉(zhuǎn)化(Hanahan，DNA克隆實(shí)用方案，第1卷，ILR-出版社，冷泉港，紐約，1989)。通過(guò)將轉(zhuǎn)化物鋪板于補(bǔ)加50mg/l卡那霉素的LB瓊脂上選擇攜帶質(zhì)粒的細(xì)胞(Sambrook等，分子克隆實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)，第2版，冷泉港，紐約，1989)。
借助于得自Qiagen的QIAprep Spin Miniprep試劑盒從轉(zhuǎn)化體中分離質(zhì)粒DNA，并通過(guò)限制切割及隨后的瓊脂糖凝膠電泳而檢測(cè)。所述質(zhì)粒稱(chēng)為pK18mobsacBpck1_1。該質(zhì)粒圖示于圖3。1.6通過(guò)置換載體pK18mobsacBpck1_1將lysCFBR等位基因lysCT311I形式的lysC基因的第二個(gè)拷貝摻入菌株DSM12866的染色體(靶位點(diǎn)pck基因)中如實(shí)施例1.3所述，將實(shí)施例1.5所述載體pK18mobsacBpck1_1通過(guò)接合轉(zhuǎn)移進(jìn)谷氨酸棒桿菌菌株DSM12866中。如實(shí)施例1.3所述在谷氨酸棒桿菌DSM12866的染色體中針對(duì)定向重組事件進(jìn)行選擇。根據(jù)第二次重組事件的位置，在切除后，lysCFBR等位基因的第二個(gè)拷貝在染色體中的pck基因座顯示出，或者宿主的原始pck基因座得以保留。
對(duì)大約40-50個(gè)菌落測(cè)試“在蔗糖存在下生長(zhǎng)”及“在卡那霉素存在下不生長(zhǎng)”的表型。對(duì)示出“在蔗糖存在下生長(zhǎng)”及“在卡那霉素存在下不生長(zhǎng)”表型的大約20個(gè)菌落借助于聚合酶鏈反應(yīng)進(jìn)行研究。從所述菌落的染色體DNA中擴(kuò)增攜帶pck基因和周?chē)鷧^(qū)域的DNA片段。選擇與實(shí)施例1.5中構(gòu)建整合質(zhì)粒相同的引物進(jìn)行PCR。
pck_beg(SEQ ID NO9)5’TA(A GAT CT)G CCG GCA TGA CTT CAG TTT3’pck_end(SEQ ID NO10)5’AC(A GAT.CT)G GTG GGA GCC TTT CTT GTTATT3’所述引物在具有原始pck基因座的對(duì)照克隆中可以擴(kuò)增出大約2.9kb的DNA片段。在染色體pck基因座具有l(wèi)ysCFBR等位基因第二個(gè)拷貝的克隆中，大約4.6kb的DNA片段被擴(kuò)增。
擴(kuò)增的DNA片段通過(guò)在0.8％瓊脂糖凝膠中電泳加以鑒別。
以這種方式鑒別一種克隆，所述克隆除了在lysC基因座存在野生型基因的拷貝之外，在染色體pck基因座還具有l(wèi)ysCFRB等位基因lysC T311I形式的lysC基因的第二個(gè)拷貝。這個(gè)克隆稱(chēng)為菌株DSM12866pck∷lysC。
1.7 構(gòu)建置換載體pK18mobsacBaecD1_1谷氨酸棒桿菌菌株ATCC13032用作染色體DNA的供體。使用常規(guī)方法從菌株ATCC13032中分離染色體DNA(Eikmanns等，微生物學(xué)1401817-1828(1994))。借助于聚合酶鏈反應(yīng)，擴(kuò)增攜帶aecD基因和周?chē)鷧^(qū)域的DNA片段。基于已知的谷氨酸棒桿菌aecD基因的序列(Kronemeyer等，細(xì)菌學(xué)雜志1771152-1158(1995))(登記號(hào)X81191)，選擇以下寡核苷酸引物進(jìn)行PCRaecD_beg(SEQ ID NO11)5’GAA CTT ACG CCA AGC TGT TC3’aecD_end(SEQ ID NO12)5’AGC ACC ACA ATC AAC GTG AG3’所示引物由MWG Biotech合成，通過(guò)Innis所述標(biāo)準(zhǔn)PCR方法進(jìn)行PCR(PCR方案，方法和應(yīng)用指導(dǎo)，1990，學(xué)術(shù)出版社)。所述引物可以擴(kuò)增出大約2.1kb的DNA片段，其攜帶aecD基因和鄰近區(qū)域。
該大約2.1kb的擴(kuò)增的DNA片段，通過(guò)在0.8％瓊脂糖凝膠中電泳及從凝膠中分離并通過(guò)常規(guī)方法純化而鑒別(QIAquick凝膠提取試劑盒，Qiagen，Hilden)。
將純化的DNA片段用限制酶BamHI和EcoRV切割(AmershamPharmacia，F(xiàn)reiburg，德國(guó))。然后在載體pUC18中進(jìn)行片段連接(Norrander等，基因26101-106(1983))。預(yù)先將該載體用限制酶BglII和SmaI切割，去磷酸化，與大約1.5kb的攜帶aecD的片段混合，并將混合物用T4 DNA連接酶處理(Amersham-Pharmacia，F(xiàn)reiburg，德國(guó))。將連接混合物在大腸桿菌菌株TOP10(Invitrogen，Leek，荷蘭)中轉(zhuǎn)化。通過(guò)將轉(zhuǎn)化物鋪板于含有50mg/l卡那霉素的具有X-Gal(64mg/l)的LB瓊脂上選擇攜帶質(zhì)粒的細(xì)胞。
獲得的質(zhì)粒在分離DNA之后通過(guò)限制切割檢測(cè)，并在瓊脂糖凝膠中鑒別。所得質(zhì)粒稱(chēng)為pUC18aecD。
從攜帶質(zhì)粒pCRIITOPOlysC的菌株DSM14242中分離質(zhì)粒DNA(見(jiàn)實(shí)施例1.1)，用限制酶BamHI切割(Amersham-Pharmacia，F(xiàn)reiburg，德國(guó))，然后用Klenow聚合酶處理。借助于QIAquick凝膠提取試劑盒(Qiagen，Hilden，德國(guó))在瓊脂糖凝膠(0.8％)中分離后，將大約1.7kb的含有l(wèi)ySCFBR的DNA片段從瓊脂糖凝膠中分離，并用于與上述載體pUC18aecD連接。將該載體預(yù)先用限制酶StuI切割，用堿性磷酸酶去磷酸化(堿性磷酸酶，Boehringer Mannheim，德國(guó))，與大約1.7kb的lysCFBR片段混合，將所述混合物用T4 DNA連接酶(Amersham-Pharmacia，F(xiàn)reiburg，德國(guó))處理。
然后將大腸桿菌菌株DH5αmcr(Life Technologies GmbH，Karlsruhe，德國(guó))用連接混合物轉(zhuǎn)化(Hanahan，DNA克隆實(shí)用方案，第1卷，ILR-出版社，冷泉港，紐約，1989)。通過(guò)將轉(zhuǎn)化物鋪板于補(bǔ)加50mg/l卡那霉素的LB瓊脂上選擇攜帶質(zhì)粒的細(xì)胞(Sambrook等，分子克隆實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)，第2版，冷泉港，紐約，1989)。
借助于得自Qiagen的QIAprep Spin Miniprep試劑盒從轉(zhuǎn)化體中分離質(zhì)粒DNA，并通過(guò)限制切割及隨后的瓊脂糖凝膠電泳而檢測(cè)。所述質(zhì)粒稱(chēng)為pUC18aecD1。
將質(zhì)粒pUC18aecD1用限制酶KpnI切割然后用Klenow聚合酶處理。然后該質(zhì)粒用限制酶SalI(Amersham-Pharmacia，F(xiàn)reiburg，德國(guó))切割，借助于QIAquick凝膠提取試劑盒(Qiagen，Hilden，德國(guó))在瓊脂糖凝膠(0.8％)中分離后，將大約3.2kb的攜帶aecD和lysC的片段從瓊脂糖凝膠中分離，并用于與Schafer等人(基因1469-73(1994))所述的可移動(dòng)克隆載體pK18mobsacB連接。將該載體預(yù)先用限制酶SmaI和SalI切割，用堿性磷酸酶去磷酸化(堿性磷酸酶，BoehringerMannheim，德國(guó))，與大約3.2kb的該攜帶aecD和lysC的片段混合，將所述混合物用T4 DNA連接酶(Amersham-Pharmacia，F(xiàn)reiburg，德國(guó))處理。
然后將大腸桿菌菌株DH5α(Grant等人，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)87(1990)4645-4649)用連接混合物轉(zhuǎn)化(Hanahan，DNA克隆實(shí)用方案，第1卷，ILR-出版社，冷泉港，紐約，1989)。通過(guò)將轉(zhuǎn)化物鋪板于補(bǔ)加50mg/l卡那霉素的LB瓊脂上選擇攜帶質(zhì)粒的細(xì)胞(Sambrook等，分子克隆實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)，第2版，冷泉港，紐約，1989)。
借助于得自Qiagen的QIAprep Spin Miniprep試劑盒從轉(zhuǎn)化體中分離質(zhì)粒DNA，并通過(guò)限制切割及隨后的瓊脂糖凝膠電泳而檢測(cè)。所述質(zhì)粒稱(chēng)為pK18mobsacBaecD1_1。該質(zhì)粒圖示于圖2。
質(zhì)粒pK18mobsacBaecD1_1根據(jù)布達(dá)佩斯條約，于2002年6月5日以大腸桿菌菌株DH5αmcr/pK18mobsacBaecD1_1(＝DH5alphamcr/pK18mobsacBaecD1_1)的純培養(yǎng)物形式保藏于德意志微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(DSMZ，Braunschweig，德國(guó))，保藏號(hào)DSM15040。
1.8 通過(guò)置換載體pK18mobsacBaecD1_1，將lysCFBR等位基因形式的lysC基因的第二個(gè)拷貝摻入菌株DSM12866的染色體中(靶位點(diǎn)aecD基因)如實(shí)施例1.3所述，將實(shí)施例1.4所述質(zhì)粒pK18mobsacBaecD1_1通過(guò)接合轉(zhuǎn)移進(jìn)谷氨酸棒桿菌菌株DSM12866中。如實(shí)施例1.3所述在谷氨酸棒桿菌DSM12866的染色體中針對(duì)定向重組事件進(jìn)行選擇。根據(jù)第二次重組事件的位置，在切除后，lysCFBR等位基因的第二個(gè)拷貝在染色體aecD基因座中顯示出，或者宿主的原始aecD基因座得以保留。
對(duì)大約40-50個(gè)菌落測(cè)試“在蔗糖存在下生長(zhǎng)”及“在卡那霉素存在下不生長(zhǎng)”的表型。對(duì)示出“在蔗糖存在下生長(zhǎng)”及“在卡那霉素存在下不生長(zhǎng)”表型的大約20個(gè)菌落借助于聚合酶鏈反應(yīng)進(jìn)行研究。從所述菌落的染色體DNA中擴(kuò)增攜帶aecD基因和周?chē)鷧^(qū)域的DNA片段。選擇與實(shí)施例1.7中構(gòu)建整合質(zhì)粒相同的引物進(jìn)行PCR。
aecD_beg(SEQ ID NO11)5’GAA CTT ACG CCA AGC TGT TC3’aecD_end(SEQ ID NO12)5’AGC ACC ACA ATC AAC GTG AG3’所述引物在具有原始aecD基因座的對(duì)照克隆中可以擴(kuò)增出大約2.1kb的DNA片段。在染色體aecD基因座具有l(wèi)ysCFBR等位基因第二個(gè)拷貝的克隆中，大約3.8kb的DNA片段被擴(kuò)增。
擴(kuò)增的DNA片段通過(guò)在0.8％瓊脂糖凝膠中電泳加以鑒別。
以這種方式鑒別一種克隆，所述克隆除了在lysC基因座存在野生型基因的拷貝之外，在染色體aecD基因座還具有l(wèi)ysCFRB等位基因lysC T311I形式的lysC基因的第二個(gè)拷貝。這個(gè)克隆稱(chēng)為菌株DSM12866aecD∷lysC。
實(shí)施例2將ddh基因的第二個(gè)拷貝摻入菌株DSM12866的染色體中(靶位點(diǎn)gluB)2.1 構(gòu)建置換載體pK18mobsacBglu2_1谷氨酸棒桿菌菌株ATCC13032用作染色體DNA的供體。使用常規(guī)方法從菌株ATCC13032中分離染色體DNA(Eikmanns等，微生物學(xué)1401817-1828(1994))。借助于聚合酶鏈反應(yīng)，擴(kuò)增攜帶gluB基因和周?chē)鷧^(qū)域的DNA片段?；谝阎墓劝彼岚魲U菌gluABCD基因簇的序列(Kronemeyer等，細(xì)菌學(xué)雜志1771152-1158(1995))(登記號(hào)X81191)，選擇以下寡核苷酸引物進(jìn)行PCRgluA_beg(SEQ ID NO13)5’CAC GGT TGC TCA TTG TAT CC3’gluD_end(SEQ ID NO14)5’CGA GGC GAA TCA GAC TTC TT3’所示引物由MWG Biotech合成，并通過(guò)Innis所述標(biāo)準(zhǔn)PCR方法進(jìn)行PCR(PCR方案，方法和應(yīng)用指導(dǎo)，1990，學(xué)術(shù)出版社)。所述引物可以擴(kuò)增出大約4.4kb的DNA片段，其攜帶gluB基因和周?chē)鷧^(qū)域。
擴(kuò)增的DNA片段，通過(guò)在0.8％瓊脂糖凝膠中電泳及從凝膠中分離并通過(guò)常規(guī)方法純化而鑒別(QIAquick凝膠提取試劑盒，Qiagen，Hilden)。
然后在載體pCRII-TOPO中利用TOPO TA克隆試劑盒(Invitrogen，Leek，荷蘭，Cat.Number K4600-01)進(jìn)行片段連接。將連接混合物轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌菌株TOP10(Invitrogen，Leek，荷蘭)中。通過(guò)將轉(zhuǎn)化物鋪板于含有卡那霉素(50mg/l)的具有X-Gal(64mg/l)的LB瓊脂上選擇攜帶質(zhì)粒的細(xì)胞。
獲得的質(zhì)粒在分離DNA后通過(guò)限制切割而檢測(cè)，并在瓊脂糖凝膠中鑒別。所得質(zhì)粒稱(chēng)為pCRII-TOPOglu2。
將質(zhì)粒pCRII-TOPOglu2用限制酶EcoRI和SalI(Amersham-Pharmacia，F(xiàn)reiburg，德國(guó))切割，并在瓊脂糖凝膠(0.8％)中借助于QIAquick凝膠提取試劑盒(Qiagen，Hilden，德國(guó))分離后，從該瓊脂糖凝膠中分離大約3.7kb的gluB片段，用于與Sch_fer所述可移動(dòng)克隆載體pK18mobsacB(基因1469-73(1994))連接。預(yù)先將該載體用限制酶EcoRI和SalI切割及用堿性磷酸酶去磷酸化(堿性磷酸酶，Boehringer Mannheim)，與大約3.7kb的gluB片段混合，并將混合物用T4 DNA連接酶處理(Amersham-Pharmacia，F(xiàn)reiburg，德國(guó))。
然后將大腸桿菌菌株DH5α(Grant等，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)87(1990)4645-4649)用連接混合物轉(zhuǎn)化(Hanahan，DNA克隆實(shí)用方案，第1卷，ILR-出版社，冷泉港，紐約，1989)。通過(guò)將轉(zhuǎn)化物鋪板于補(bǔ)加50mg/l卡那霉素的LB瓊脂上選擇攜帶質(zhì)粒的細(xì)胞(Sambrook等，分子克隆實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)，第2版，冷泉港，紐約，1989)。
借助于得自Qiagen的QIAprep Spin Miniprep試劑盒從轉(zhuǎn)化體中分離質(zhì)粒DNA，并通過(guò)限制切割及隨后的瓊脂糖凝膠電泳而檢測(cè)。所述質(zhì)粒稱(chēng)為pK18mobsacBglu2。
如實(shí)施例2.1所述，借助于聚合酶反應(yīng)擴(kuò)增攜帶ddh基因和周?chē)鷧^(qū)域的DNA片段?；谝阎墓劝彼岚魲U菌ddh基因簇的序列(Ishino等，核酸研究15，3917(1987))(登錄號(hào)Y00151)，選擇以下引物進(jìn)行PCRddh_beg(SEQ ID NO15)5’CTG AAT CAA AGG CGG ACA TG3′ddh_end(SEQ ID NO16)
5’TCG AGCTAA ATT AGA CGT CG3’所示引物由MWG Biotech合成，并通過(guò)Innis所述標(biāo)準(zhǔn)PCR方法進(jìn)行PCR(PCR方案，方法和應(yīng)用指導(dǎo)，1990，學(xué)術(shù)出版社)。所述引物可以擴(kuò)增出大約1.6kb的DNA片段，其攜帶ddh基因。
攜帶ddh基因的大約1.6kb的擴(kuò)增的DNA片段，通過(guò)在0.8％瓊脂糖凝膠中電泳及從凝膠中分離并通過(guò)常規(guī)方法純化而鑒別(QIAquick凝膠提取試劑盒，Qiagen，Hilden)。
在純化后，將攜帶ddh基因的片段連接在所述載體pK18mobsacBglu2中。所述載體預(yù)先用限制酶BamHI部分切割。在用Klenow聚合酶(Amersham-Pharmacia，F(xiàn)reiburg，德國(guó))處理載體后，切割末端的突出端完全成為平端，然后將此載體與攜帶ddh基因的大約1.6kb的DNA片段混合，將混合物用T4 DNA連接酶(Amersham-Pharmacia，F(xiàn)reiburg，德國(guó))處理。通過(guò)使用Vent聚合酶(New England Biolabs，F(xiàn)rankfurt，德國(guó))進(jìn)行PCR反應(yīng)，產(chǎn)生一個(gè)攜帶ddh的DNA片段，其具有平端并適于連接在預(yù)處理的載體pK18mobsacBglu2中。
然后將大腸桿菌菌株DH5αmcr((Life Technologies GmbH，Karlsmhe，德國(guó)))用連接混合物轉(zhuǎn)化(Hanahan，DNA克隆實(shí)用方案，第1卷，ILR-出版社，冷泉港，紐約，1989)。通過(guò)將轉(zhuǎn)化物鋪板于補(bǔ)加50mg/l卡那霉素的LB瓊脂上選擇攜帶質(zhì)粒的細(xì)胞(Sambrook等，分子克隆實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)，第2版，冷泉港，紐約，1989)。
借助于得自Qiagen的QIAprep Spin Miniprep試劑盒從轉(zhuǎn)化體中分離質(zhì)粒DNA，并通過(guò)限制切割及隨后的瓊脂糖凝膠電泳而檢測(cè)。所述質(zhì)粒稱(chēng)為pK18mobsacBglu2_1。該質(zhì)粒圖示于圖4。
2.2 通過(guò)置換載體pK18mobsacBglu2_1將ddh基因的第二個(gè)拷貝摻入菌株DSM12866的染色體中(靶位點(diǎn)gluB基因)
如實(shí)施例1.3所述，將實(shí)施例2.1所述載體pK18mobsacBglu2_1通過(guò)接合轉(zhuǎn)移進(jìn)谷氨酸棒桿菌菌株DSM12866中。如實(shí)施例1.3所述在谷氨酸棒桿菌DSM12866的染色體中針對(duì)定向重組事件進(jìn)行選擇。根據(jù)第二次重組事件的位置，在切除后，ddh基因的第二個(gè)拷貝在染色體gluB基因座中顯示，或者宿主的原始gluB基因座得以保留。
對(duì)大約40-50個(gè)菌落測(cè)試“在蔗糖存在下生長(zhǎng)”及“在卡那霉素存在下不生長(zhǎng)”的表型。對(duì)示出“在蔗糖存在下生長(zhǎng)”及“在卡那霉素存在下不生長(zhǎng)”表型的大約20個(gè)菌落借助于聚合酶鏈反應(yīng)進(jìn)行研究。從所述菌落的染色體DNA中擴(kuò)增攜帶glu區(qū)域的DNA片段。選擇與實(shí)施例2.1中構(gòu)建置換質(zhì)粒相同的引物進(jìn)行PCR。
gluA_beg(SEQ ID NO13)5’CAC GGT TGC TCA TTG TAT CC3’gluD_end(SEQ ID NO14)5’CGA GGC GAA TCA GAC TTC TT3’所述引物在具有原始glu基因座的對(duì)照克隆中可以擴(kuò)增出大約4.4kb的DNA片段。在染色體gluB基因座具有ddh基因第二個(gè)拷貝的克隆中，大約6kb的DNA片段被擴(kuò)增。
擴(kuò)增的DNA片段通過(guò)在0.8％瓊脂糖凝膠中電泳加以鑒別。
以這種方式鑒別一種克隆，所述克隆除了在ddh基因座存在的拷貝之外，在染色體gluB基因座還具有ddh基因的第二個(gè)拷貝。這個(gè)克隆稱(chēng)為菌株DSM12866glu∷ddh。
實(shí)施例3將dapA基因的第二個(gè)拷貝摻入菌株DSM12866的染色體中(靶位點(diǎn)aecD基因)3.1 構(gòu)建置換載體pK18mobsacBaecD2_1谷氨酸棒桿菌菌株ATCC13032用作染色體DNA的供體。使用常規(guī)方法從菌株ATCC13032中分離染色體DNA(Eikmanns等，微生物學(xué)1401817-1828(1994))。借助于聚合酶鏈反應(yīng)，擴(kuò)增攜帶aecD基因和周?chē)鷧^(qū)域的DNA片段?；谝阎墓劝彼岚魲U菌aecD基因的序列(Rossol等，細(xì)菌學(xué)雜志1742968-2977(1992))(登錄號(hào)M89931)，選擇以下寡核苷酸引物進(jìn)行PCRaecD_beg(SEQ ID NO11)5’GAA CTT ACG CCA AGC TGT TC3’aecD_end(SEQ ID NO12)5’AGC ACC ACA ATC AAC GTG AG 3’所示引物由MWG Biotech合成，并通過(guò)Innis所述標(biāo)準(zhǔn)PCR方法進(jìn)行PCR(PCR方案，方法和應(yīng)用指導(dǎo)，1990，學(xué)術(shù)出版社)。所述引物可以擴(kuò)增出大約2.1kb的DNA片段，其攜帶aecD基因和鄰近區(qū)域。
大約2.1kb的擴(kuò)增的DNA片段，通過(guò)在0.8％瓊脂糖凝膠中電泳及從凝膠中分離并通過(guò)常規(guī)方法純化而鑒別(QIAquick凝膠提取試劑盒，Qiagen，Hilden)。
將純化的DNA片段用限制酶BglII和EcoRV切割(Amersham-Pharmacia，F(xiàn)reiburg，德國(guó))。然后在載體pUC18中進(jìn)行片段連接(Norrander等，基因26101-106(1983))。所述載體預(yù)先用限制酶BamHI和SmaI切割及去磷酸化，與大約1.5kb的攜帶aecD基因的片段混合，并將混合物用T4 DNA連接酶處理(Amersham-Pharmacia，F(xiàn)reiburg，德國(guó))。將連接混合物轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌菌株TOP10(Invitrogen，Leek，荷蘭)中。通過(guò)將轉(zhuǎn)化物鋪板于含有50mg/l卡那霉素的具有X-Gal(64mg/l)的LB瓊脂上選擇攜帶質(zhì)粒的細(xì)胞。
所得質(zhì)粒在分離DNA后通過(guò)限制切割檢測(cè)，并在瓊脂糖凝膠中鑒別。所得質(zhì)粒稱(chēng)為pUC18aecD。
借助于聚合酶反應(yīng)，擴(kuò)增攜帶dapA基因和周?chē)鷧^(qū)域的另一個(gè)DNA片段?；谝阎墓劝彼岚魲U菌dapA基因的序列(Bonassi等，核酸研究18，6421(1990))(登錄號(hào)X53993和AX127149)，選擇以下寡核苷酸引物進(jìn)行PCRdapA_beg(SEQ ID NO17)5’AGA GCC AGT GAA CAT GCA GA3’dapA_end(SEQ D NO18)5’CTT GAG CAC CTT GCG CAG CA3’所示引物由MWG Biotech合成，并通過(guò)Innis所述標(biāo)準(zhǔn)PCR方法進(jìn)行PCR(PCR方案，方法和應(yīng)用指導(dǎo)，1990，學(xué)術(shù)出版社)。所述引物可以擴(kuò)增出大約1.4kb的DNA片段，其攜帶dapA基因和鄰近區(qū)域。
大約1.4kb的擴(kuò)增的DNA片段，通過(guò)在0.8％瓊脂糖凝膠中電泳及從凝膠中分離并通過(guò)常規(guī)方法純化而鑒別(QIAquick凝膠提取試劑盒，Qiagen，Hilden)。
在純化后，將大約1.4kb的含有dapA基因的DNA片段在上述載體pUC18aecD中連接。所述載體預(yù)先用限制酶StuI切割，與大約1.4kb的DNA片段混合，將混合物用T4 DNA連接酶(Amersham-Pharmacia，F(xiàn)reiburg，德國(guó))處理。
然后將大腸桿菌菌株DH5αmcr(Life Technologies GmbH，Karlsruhe，德國(guó))用連接混合物轉(zhuǎn)化(Hanahan，DNA克隆實(shí)用方案，第1卷，ILR-出版社，冷泉港，紐約，1989)。通過(guò)將轉(zhuǎn)化物鋪板于補(bǔ)加50mg/l卡那霉素的LB瓊脂上選擇攜帶質(zhì)粒的細(xì)胞(Sambrook等，分子克隆實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)，第2版，冷泉港，紐約，1989)。
借助于得自Qiagen的QIAprep Spin Miniprep試劑盒從轉(zhuǎn)化體中分離質(zhì)粒DNA，并通過(guò)限制切割及隨后的瓊脂糖凝膠電泳而檢測(cè)。所述質(zhì)粒稱(chēng)為pUC18aecD2。
將質(zhì)粒pUC18aecD2用限制酶SalI切割及用EcoRI部分切割(Amersham-Pharmacia，F(xiàn)reiburg，德國(guó))，并在瓊脂糖凝膠(0.8％)中借助于QIAquick凝膠提取試劑盒(Qiagen，Hilden，德國(guó))分離后，從該瓊脂糖凝膠中分離大約2.7kb的攜帶aecD和dapA的片段，用于與Sch_fer所述可移動(dòng)克隆載體pK18mobsacB(基因1469-73(1994))連接。預(yù)先將該載體用限制酶EcoRI和SalI切割及用堿性磷酸酶去磷酸化(堿性磷酸酶，Boehringer Mannheim)，與大約2.7kb的攜帶aecD和dapA的片段混合，并將混合物用T4 DNA連接酶處理(Amersham-Pharmacia，F(xiàn)reiburg，德國(guó))。
然后將大腸桿菌菌株DH5α(Grant等，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)87(1990)4645-4649)用連接混合物轉(zhuǎn)化(Hanahan，DNA克隆實(shí)用方案，第1卷，ILR-出版社，冷泉港，紐約，1989)。通過(guò)將轉(zhuǎn)化物鋪板于補(bǔ)加50mg/l卡那霉素的LB瓊脂上選擇攜帶質(zhì)粒的細(xì)胞(Sambrook等，分子克隆實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)，第2版，冷泉港，紐約，1989)。
借助于得自Qiagen的QIAprep Spin Miniprep試劑盒從轉(zhuǎn)化體中分離質(zhì)粒DNA，并通過(guò)限制切割及隨后的瓊脂糖凝膠電泳而檢測(cè)。所述質(zhì)粒稱(chēng)為pK18mobsacBaecD2_1。該質(zhì)粒圖示于圖5。
3.2 通過(guò)置換載體pK18mobsacBaecD2_1，將dapA基因的第二個(gè)拷貝摻入菌株DSM12866的染色體中(靶位點(diǎn)aecD基因)如實(shí)施例1.3所述，將實(shí)施例3.1所述載體pK18mobsacBaecD2_1通過(guò)接合轉(zhuǎn)移進(jìn)谷氨酸棒桿菌菌株DSM12866中。如實(shí)施例1.3所述在谷氨酸棒桿菌DSM12866的染色體中針對(duì)定向重組事件進(jìn)行選擇。根據(jù)第二次重組事件的位置，在切除后，dapA基因的第二個(gè)拷貝在染色體aecD基因座中顯示出，或者宿主的原始aecD基因座得以保留。
對(duì)大約40-50個(gè)菌落測(cè)試“在蔗糖存在下生長(zhǎng)”及“在卡那霉素存在下不生長(zhǎng)”的表型。對(duì)示出“在蔗糖存在下生長(zhǎng)”及“在卡那霉素存在下不生長(zhǎng)”表型的大約20個(gè)菌落借助于聚合酶鏈反應(yīng)進(jìn)行研究。從所述菌落的染色體DNA中擴(kuò)增攜帶aecD基因和周?chē)鷧^(qū)域的DNA片段。選擇與實(shí)施例3.1中構(gòu)建整合質(zhì)粒相同的寡核苷酸引物進(jìn)行PCR。
aecD_beg(SEQ ID NO11)5’GAA CTT ACG CCA AGC TGT TC3’aecD_end(SEQ ID NO12)5’AGC ACC ACA ATC AAC GTG AG3’所述引物在具有原始aecD基因座的對(duì)照克隆中可以擴(kuò)增出大約2.1kb的DNA片段。在染色體aecD基因座具有dapA基因第二個(gè)拷貝的克隆中，大約3.6kb的DNA片段被擴(kuò)增。
擴(kuò)增的DNA片段通過(guò)在0.8％瓊脂糖凝膠中電泳加以鑒別。
以這種方式鑒別一種克隆，所述克隆除了在dapA基因座存在的拷貝之外，在染色體aecD基因座還具有dapA基因的第二個(gè)拷貝。這個(gè)克隆稱(chēng)為菌株DSM12866aecD∷dapA。
實(shí)施例4將pyc等位基因pycP458S形式的pyc基因的第二個(gè)拷貝摻入菌株DSM12866的染色體中(靶位點(diǎn)pck基因)4.1 構(gòu)建置換載體pK18mobsacBpck1_3將實(shí)施例1.5所述置換載體pK18mobsacBpck1用作插入pyc等位基因的基礎(chǔ)載體。
如實(shí)施例2.1所述，借助于聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增攜帶pyc基因和周?chē)鷧^(qū)域的一個(gè)DNA片段?；谝阎劝彼岚魲U菌pyc基因簇的序列(Peters-Wendisch等，微生物學(xué)雜志144915-927(1998))(登記號(hào)Y09548)，選擇以下寡核苷酸引物進(jìn)行PCRpyc_beg(SEQ ID NO19)5’TC(A CGC GT)C TTG AAG TCG TGC AGG TCA G3’pyc_end(SEQ ID NO20)5’TC(A CGC GT)C GCC TCC TCC ATG AGG AAG A3’
所示引物由MWG Biotech合成，并通過(guò)Innis所述標(biāo)準(zhǔn)PCR方法進(jìn)行PCR(PCR方案，方法和應(yīng)用指導(dǎo)，1990，學(xué)術(shù)出版社)。所述引物可以擴(kuò)增出大約3.6kb的攜帶pyc基因DNA片段。所述引物另外還含有限制性?xún)?nèi)切酶MluI的切割位點(diǎn)的序列，在上述核苷酸序列中用括號(hào)加以標(biāo)示。
攜帶pyc基因的大約3.6kb的擴(kuò)增的DNA片段用限制性?xún)?nèi)切酶MluI切割，通過(guò)在0.8％瓊脂糖凝膠中電泳及從凝膠中分離并通過(guò)常規(guī)方法純化而鑒別(QIAquick凝膠提取試劑盒，Qiagen，Hilden)。
在純化后，將攜帶pyc基因的DNA片段在上述載體pK18mobsacBpck1中連接。所述載體預(yù)先用限制酶BssHII切割，用堿性磷酸酶去磷酸化(堿性磷酸酶，Boehringer Mannheim)，與大約3.6kb的攜帶pyc基因的DNA片段混合，將混合物用T4 DNA連接酶(Amersham-Pharmacia，F(xiàn)reiburg，德國(guó))處理。
然后將大腸桿菌菌株DH5αmcr(Life Technologies GmbH，Karlsruhe，德國(guó))用連接混合物轉(zhuǎn)化(Hanahan，DNA克隆實(shí)用方案，第1卷，ILR-出版社，冷泉港，紐約，1989)。通過(guò)將轉(zhuǎn)化物鋪板于補(bǔ)加50mg/l卡那霉素的LB瓊脂上選擇攜帶質(zhì)粒的細(xì)胞(Sambrook等，分子克隆實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)，第2版，冷泉港，紐約，1989)。
借助于得自Qiagen的QIAprep Spin Miniprep試劑盒從轉(zhuǎn)化體中分離質(zhì)粒DNA，并通過(guò)限制切割及隨后的瓊脂糖凝膠電泳而檢測(cè)。所述質(zhì)粒稱(chēng)為pK18mobsacBpck1_2。
4.2 通過(guò)位點(diǎn)特異性誘變野生型pyc基因構(gòu)建pyc等位基因pyc P458S用QuikChange定點(diǎn)誘變?cè)噭┖?Stratagene，La Jolla，美國(guó))進(jìn)行定點(diǎn)誘變。EP-A-1108790描述了谷氨酸棒桿菌pyc基因的點(diǎn)突變，其使L-賴(lài)氨酸的生產(chǎn)得以改良?；趐yc基因第1372位胞嘧啶置換為胸腺嘧啶的核苷酸序列中的點(diǎn)突變，因此導(dǎo)致其氨基酸序列中脯氨酸置換為絲氨酸。該等位基因稱(chēng)為pyc P458S。為產(chǎn)生所述突變，選擇以下寡核苷酸引物進(jìn)行線性擴(kuò)增P458S-1(SEQ ID NO21)5′GGATTCATTGCCGATCAC(TCG)CACCTCCTTCAGGCTCCA3′P458S-2(SEQID NO22)5′GTGGAGGAAGTCCGAGGT(CGA)GTGATCGGCAATGAATCC3′所述引物由MWG Biotech合成。置換第458位脯氨酸的絲氨酸密碼子在上述核苷酸序列中用括號(hào)標(biāo)示。將實(shí)施例4.1所述質(zhì)粒pK18mobsacBpck1_2與兩個(gè)引物一起用于通過(guò)Pfu Turbo DNA聚合酶進(jìn)行線性擴(kuò)增，所述引物均互補(bǔ)于所述質(zhì)粒鏈。通過(guò)引物的這種延伸，形成具有斷裂的環(huán)形鏈的突變質(zhì)粒。將線性擴(kuò)增的產(chǎn)物用DpnI處理，這種內(nèi)切酶特異性切割甲基化和半甲基化的模板DNA。將新合成的斷裂的突變載體DNA轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌菌株XL1 Blue(Bullock，F(xiàn)ernandez和Short，生物技術(shù)(5)376-379(1987))中。在轉(zhuǎn)化后，XL1 Blue細(xì)胞修補(bǔ)突變質(zhì)粒中的斷裂之處。在具有50mg/l卡那霉素的LB培養(yǎng)基上選擇轉(zhuǎn)化體。獲得的質(zhì)粒在分離DNA后通過(guò)限制性切割檢測(cè)，并在瓊脂糖凝膠中鑒別。突變DNA片段的DNA序列通過(guò)測(cè)序檢測(cè)。PCR產(chǎn)物的序列與Ohnishi等(2002)所述序列一致。所得質(zhì)粒稱(chēng)為pK18mobsacBpck1_3。該質(zhì)粒圖示于圖6。
4.3 通過(guò)置換載體pK18mobsacspck1_3，將pyc等位基因pycP458S形式的pyc基因的第二個(gè)拷貝摻入菌株DSM12866的染色體中(靶位點(diǎn)pck基因)將實(shí)施例4.2所述質(zhì)粒pK18mobsacBpck1_3如實(shí)施例1.3所述通過(guò)接合轉(zhuǎn)移進(jìn)谷氨酸棒桿菌菌株DSM12866中。如實(shí)施例1.3所述在谷氨酸棒桿菌DSM12866的染色體中針對(duì)定向重組事件進(jìn)行選擇。根據(jù)第二次重組事件的位置，在切除后，pyc等位基因的第二個(gè)拷貝在染色體中pck基因座顯示出，或者宿主的原始pck基因座得以保留。
對(duì)大約40-50個(gè)菌落測(cè)試“在蔗糖存在下生長(zhǎng)”及“在卡那霉素存在下不生長(zhǎng)”的表型。對(duì)示出“在蔗糖存在下生長(zhǎng)”及“在卡那霉素存在下不生長(zhǎng)”表型的大約20個(gè)菌落借助于聚合酶鏈反應(yīng)進(jìn)行研究。從所述菌落的染色體DNA中擴(kuò)增攜帶pck基因和周?chē)鷧^(qū)域的DNA片段。選擇與實(shí)施例1.5中構(gòu)建置換質(zhì)粒相同的寡核苷酸引物進(jìn)行PCR。
pck_beg(SEQ ID NO9)5’TA(A GATCT)G CCG GCA TGA CTT CAG TTT3’pck_end(SEQ ID NO10)5’AC(A GATCT)G GTG GGA GCC TTT CTT GTTATT3’所述引物在具有原始pck基因座的對(duì)照克隆中可以擴(kuò)增出大約2.9kb的DNA片段。在染色體pck基因座具有pyc基因第二個(gè)拷貝的克隆中，大約6.5kb的DNA片段被擴(kuò)增。
擴(kuò)增的DNA片段通過(guò)在0.8％瓊脂糖凝膠中電泳加以鑒別。
以這種方式鑒別一種克隆，所述克隆除了在pyc基因座存在的野生型基因的拷貝之外，在染色體pck基因座還具有pyc等位基因pycP458S形式的pyc基因的第二個(gè)拷貝。這個(gè)克隆稱(chēng)為菌株DSM12866pck∷pyc。
實(shí)施例5生產(chǎn)賴(lài)氨酸將在實(shí)施例1，2，3和4中獲得的谷氨酸棒桿菌菌株DSM13994glu∷lysC，DSM12866glu∷lysC，DSM12866pck∷lysC，DSM12866aecD∷lysC，DSM12866glu∷ddh，DSM12866aecD∷dapA和DSM12866pck∷pyc，在適于賴(lài)氨酸生產(chǎn)的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，測(cè)定培養(yǎng)上清中賴(lài)氨酸含量。
首先，在33℃將培養(yǎng)物在腦心瓊脂板(Merck，Darmstadt，德國(guó))上溫育24小時(shí)。此瓊脂板培養(yǎng)物用于接種預(yù)培養(yǎng)物(10ml培養(yǎng)基于100ml錐形瓶)。用于預(yù)培養(yǎng)的培養(yǎng)基是MM培養(yǎng)基。在搖床上于33℃以240rpm溫育預(yù)培養(yǎng)物24小時(shí)。用這些預(yù)培養(yǎng)物接種主培養(yǎng)物，由此主培養(yǎng)物的起始OD(波長(zhǎng)660nm)為0.1。培養(yǎng)基MM也用作主培養(yǎng)物。
培養(yǎng)基MMCSL 5g/lMOPS20g/l葡萄糖(單獨(dú)高壓滅菌)50g/l(NH4)2SO425g/lKH2PO40.1g/lMgSO4·7H2O 1.0g/lCaCl2·2H2O 10mg/lFeSO4·7H2O10mg/lMnSO4·H2O5.0mg/l生物素(過(guò)濾滅菌)0.3mg/l硫胺素·HCl(過(guò)濾滅菌) 0.2mg/lCaCO325g/l用氨水將CSL(玉米漿)，MOPS(嗎啉代丙磺酸)和所述鹽溶液的pH調(diào)節(jié)為7，并高壓滅菌。然后加入無(wú)菌底物和維生素溶液，以及在干燥狀態(tài)下高壓滅菌的CaCO3。
在具有擋板的100ml錐形瓶中以10ml體積進(jìn)行培養(yǎng)。在33℃和80％濕度下進(jìn)行培養(yǎng)。
48小時(shí)后，用Biomek1000(Beckmann Instruments GmbH，Munich)在660nm測(cè)定波長(zhǎng)下測(cè)定OD。用Eppendorf-BioTronik公司的氨基酸分析儀(漢堡，德國(guó))經(jīng)離子交換層析和用茚三酮檢測(cè)柱后衍生化而確定賴(lài)氨酸生成量。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果示于表10。
表10
附圖簡(jiǎn)述指定的堿基對(duì)數(shù)目是在重復(fù)測(cè)定中獲的近似值。
圖1質(zhì)粒pK18mobsacBglu1_1圖。
所用縮寫(xiě)和名稱(chēng)具有以下含義KanR卡那霉素抗性基因HindIII限制酶HindIII的切割位點(diǎn)BamHI限制酶BamHI的切割位點(diǎn)lysClysCFBR等位基因，lysC T311I′gluAgluA基因的3’末端片段gluB′gluB基因的5’末端片段′gluBgluB基因的3’末端片段gluC′gluC基因的5’末端片段sacBsacB基因RP4mob具有用于轉(zhuǎn)移的復(fù)制起點(diǎn)(oriT)的mob區(qū)域
oriV復(fù)制起點(diǎn)V圖2質(zhì)粒pK18mobsacBaecD1_1圖。
所用縮寫(xiě)和名稱(chēng)具有以下含義KanR卡那霉素抗性基因SalI限制酶SalI的切割位點(diǎn)lysClysC等位基因，lysC T311IaecD′aecD基因的5’末端′aecDaecD基因的3’末端sacBsacB基因RP4mob具有用于轉(zhuǎn)移的復(fù)制起點(diǎn)(oriT)的mob區(qū)域oriV復(fù)制起點(diǎn)V圖3質(zhì)粒pK18mobsacBpck1_1圖。
所用縮寫(xiě)和名稱(chēng)具有以下含義KanR卡那霉素抗性基因BamHI限制酶BamHI的切割位點(diǎn)lysClysCFBR等位基因，lysC T311Ipck′pck基因的5’末端片段′pckpck基因的3’末端片段sacBsacB基因RP4mob具有用于轉(zhuǎn)移的復(fù)制起點(diǎn)(oriT)的mob區(qū)域oriV復(fù)制起點(diǎn)V圖4質(zhì)粒pK18mobsacBgluB2_1圖。
所用縮寫(xiě)和名稱(chēng)具有以下含義KanR卡那霉素抗性基因SalI限制酶SalI的切割位點(diǎn)EcoRI限制酶EcoRI的切割位點(diǎn)BamHI限制酶BamHI的切割位點(diǎn)
ddhddh基因gluAgluA基因gluB′gluB基因的5’末端片段′gluBgluB基因的3’末端片段gluCgluC基因gluD′gluD基因的5’末端片段sacBsacB基因RP4mob具有用于轉(zhuǎn)移的復(fù)制起點(diǎn)(oriT)的mob區(qū)域oriV復(fù)制起點(diǎn)V圖5質(zhì)粒pK18mobsacBaecD2_1圖。
所用縮寫(xiě)和名稱(chēng)具有以下含義KanR卡那霉素抗性基因EcoRI限制酶EcoRI的切割位點(diǎn)SalI限制酶SalI的切割位點(diǎn)dapAdapA基因aecD′aecD基因的5’末端片段′aecDaecD基因的3’末端片段sacBsacB基因RP4mob具有用于轉(zhuǎn)移的復(fù)制起點(diǎn)(oriT)的mob區(qū)域oriV復(fù)制起點(diǎn)V圖6質(zhì)粒pK18mobsacBpck1_3圖。
所用縮寫(xiě)和名稱(chēng)具有以下含義KanR卡那霉素抗性基因pycpyc等位基因，pyc P458Spck′pck基因的5’末端片段′pckpck基因的3’末端片段sacBsacB基因RP4mob具有用于轉(zhuǎn)移的復(fù)制起點(diǎn)(oriT)的mob區(qū)域oriV復(fù)制起點(diǎn)V
序列表<110>德古薩股份公司<120>通過(guò)遺傳修飾的谷氨酸菌株生產(chǎn)L-賴(lài)氨酸<130>DEDEG0213<160>22<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1263<212>DNA<213>Corynebacterium glutamicum<220>
<221>CDS<222>(1)..(1263)<223>lysC野生型基因<400>1gtg gcc ctg gtc gta cag aaa tat ggc ggt tcc tcg ctt gag agt gcg48Met Ala Leu Val Val Gln Lys Tyr Gly Gly Ser Ser Leu Glu Ser Ala1 5 10 15gaa cgc att aga aac gtc gct gaa cgg atc gtt gcc acc aag aag gct96Glu Arg Ile Arg Asn Val Ala Glu Arg Ile Val Ala Thr Lys Lys Ala20 25 30gga aat gat gtc gtg gtt gtc tgc tcc gca atg gga gac acc acg gat 144Gly Asn Asp Val Val Val Val Cys Ser Ala Met Gly Asp Thr Thr Asp35 40 45gaa ctt cta gaa ctt gca gcg gca gtg aat ccc gtt ccg cca gct cgt 192Glu Leu Leu Glu Leu Ala Ala Ala Val Asn Pro Val Pro Pro Ala Arg50 55 60gaa atg gat atg ctc ctg act gct ggt gag cgt att tct aac gct ctc 240Glu Met Asp Met Leu Leu Thr Ala Gly Glu Arg Ile Ser Asn Ala Leu65 70 75 80gtc gcc atg gct att gag tcc ctt ggc gca gaa gcc caa tct ttc acg 288Val Ala Met Ala Ile Glu Ser Leu Gly Ala Glu Ala Gln Ser Phe Thr85 90 95ggc tct cag gct ggt gtg ctc acc acc gag cgc cac gga aac gca cgc 336Gly Ser Gln Ala Gly Val Leu Thr Thr Glu Arg His Gly Asn Ala Arg100 105 110att gtt gat gtc act cca ggt cgt gtg cgt gaa gca ctc gat gag ggc 384Ile Val Asp Val Thr Pro Gly Arg Val Arg Glu Ala Leu Asp Glu Gly115 120 125aag atc tgc att gtt gct ggt ttc cag ggt gtt aat aaa gaa acc cgc 432Lys Ile Cys Ile Val Ala Gly Phe Gln Gly Val Asn Lys Glu Thr Arg
130 135 140gat gtc acc acg ttg ggt cgt ggt ggt tct gac acc act gca gtt gcg 480Asp Val Thr Thr Leu Gly Arg Gly Gly Ser Asp Thr Thr Ala Val Ala145 150 155 160ttg gca gct gct ttg aac gct gat gtg tgt gag att tac tcg gac gtt 528Leu Ala Ala Ala Leu Asn Ala Asp Val Cys Glu Ile Tyr Ser Asp Val165 170 175gac ggt gtg tat acc gct gac ccg cgc atc gtt cct aat gca cag aag 576Asp Gly Val Tyr Thr Ala Asp Pro Arg Ile Val Pro Asn Ala Gln Lys180 185 190ctg gaa aag ctc agc ttc gaa gaa atg ctg gaa ctt gct gct gtt ggc 624Leu Glu Lys Leu Ser Phe Glu Glu Met Leu Glu Leu Ala Ala Val Gly195 200 205tcc aag att ttg gtg ctg cgc agt gtt gaa tac gct cgt gca ttc aat 672Ser Lys Ile Leu Val Leu Arg Ser Val Glu Tyr Ala Arg Ala Phe Asn210 215 220gtg cca ctt cgc gta cgc tcg tct tat agt aat gat ccc ggc act ttg 720Val Pro Leu Arg Val Arg Ser Ser Tyr Ser Asn Asp Pro Gly Thr Leu225 230 235 240att gcc ggc tct atg gag gat att cct gtg gaa gaa gca gtc ctt acc 768Ile Ala Gly Ser Met Glu Asp Ile Pro Val Glu Glu Ala Val Leu Thr245 250 255ggt gtc gca acc gac aag tcc gaa gcc aaa gta acc gtt ctg ggt att 816Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu Ala Lys Val Thr Val Leu Gly Ile260 265 270tcc gat aag cca ggc gag gct gcg aag gtt ttc cgt gcg ttg gct gat 864Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp275 280 285gca gaa atc aac att gac atg gtt ctg cag aac gtc tct tct gta gaa 912Ala Glu Ile Asn Ile Asp Met Val Leu Gln Asn Val Ser Ser Val Glu290 295 300gac ggc acc acc gac atc acc ttc acc tgc cct cgt tcc gac ggc cgc 960Asp Gly Thr Thr Asp Ile Thr Phe Thr Cys Pro Arg Ser Asp Gly Arg305 310 315 320cgc gcg atg gag atc ttg aag aag ctt cag gtt cag ggc aac tgg acc 1008Arg Ala Met Glu Ile Leu Lys Lys Leu Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr325 330 335aat gtg ctt tac gac gac cag gtc ggc aaa gtc tcc ctc gtg ggt gct 1056Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gln Val Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala340 345 350ggc atg aag tct cac cca ggt gtt acc gca gag ttc atg gaa gct ctg 1104Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu355 360 365cgc gat gtc aac gtg aac atc gaa ttg att tcc acc tct gag att cgt 1152Arg Asp Val Asn Val Asn Ile Glu Leu Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg
370 375 380att tcc gtg ctg atc cgt gaa gat gat ctg gat gct gct gca cgt gca 1200Ile Ser Val Leu Ile Arg Glu Asp Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala385 390 395 400ttg cat gag cag ttc cag ctg ggc ggc gaa gac gaa gcc gtc gtt tat 1248Leu His Glu Gln Phe Gln Leu Gly Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr405 410 415gca ggc acc gga cgc 1263Ala Gly Thr Gly Arg420<210>2<211>421<212>PRT<213>Corynebacterium glutamicum<400>2Met Ala Leu Val Val Gln Lys Tyr Gly Gly Ser Ser Leu Glu Ser Ala1 5 10 15Glu Arg Ile Arg Asn Val Ala Glu Arg Ile Val Ala Thr Lys Lys Ala20 25 30Gly Asn Asp Val Val Val Val Cys Ser Ala Met Gly Asp Thr Thr Asp35 40 45Glu Leu Leu Glu Leu Ala Ala Ala Val Asn Pro Val Pro Pro Ala Arg50 55 60Glu Met Asp Met Leu Leu Thr Ala Gly Glu Arg Ile Ser Asn Ala Leu65 70 75 80Val Ala Met Ala Ile Glu Ser Leu Gly Ala Glu Ala Gln Ser Phe Thr85 90 95Gly Ser Gln Ala Gly Val Leu Thr Thr Glu Arg His Gly Asn Ala Arg100 105 110Ile Val Asp Val Thr Pro Gly Arg Val Arg Glu Ala Leu Asp Glu Gly115 120 125Lys Ile Cys Ile Val Ala Gly Phe Gln Gly Val Asn Lys Glu Thr Arg130 135 140Asp Val Thr Thr Leu Gly Arg Gly Gly Ser Asp Thr Thr Ala Val Ala145 150 155 160Leu Ala Ala Ala Leu Asn Ala Asp Val Cys Glu Ile Tyr Ser Asp Val165 170 175Asp Gly Val Tyr Thr Ala Asp Pro Arg Ile Val Pro Asn Ala Gln Lys180 185 190Leu Glu Lys Leu Ser Phe Glu Glu Met Leu Glu Leu Ala Ala Val Gly195 200 205
Ser Lys Ile Leu Val Leu Arg Ser Val Glu Tyr Ala Arg Ala Phe Asn210 215 220Val Pro Leu Arg Val Arg Ser Ser Tyr Ser Asn Asp Pro Gly Thr Leu225 230 235 240Ile Ala Gly Ser Met Glu Asp Ile Pro Val Glu Glu Ala Val Leu Thr245 250 255Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu Ala Lys Val Thr Val Leu Gly Ile260 265 270Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp275 280 285Ala Glu Ile Asn Ile Asp Met Val Leu Gln Asn Val Ser Ser Val Glu290 295 300Asp Gly Thr Thr Asp Ile Thr Phe Thr Cys Pro Arg Ser Asp Gly Arg305 310 315 320Arg Ala Met Glu Ile Leu Lys Lys Leu Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr325 330 335Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gln Val Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala340 345 350Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu355 360 365Arg Asp Val Asn Val Asn Ile Glu Leu Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg370 375 380Ile Ser Val Leu Ile Arg Glu Asp Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala385 390 395 400Leu His Glu Gln Phe Gln Leu Gly Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr405 410 415Ala Gly Thr Gly Arg420<210>3<211>1263<212>DNA<213>Corynebacterium glutamicum<220>
<221>CDS<222>(1)..(12 63)<223>lysC-fbr allele lysC T311I<400>3gtg gcc ctg gtc gta cag aaa tat ggc ggt tcc tcg ctt gag agt gcg48Met Ala Leu Val Val Gln Lys Tyr Gly Gly Ser Ser Leu Glu Ser Ala1 5 10 15gaa cgc att aga aac gtc gct gaa cgg atc gtt gcc acc aag aag gct96
Glu Arg Ile Arg Asn Val Ala Glu Arg Ile Val Ala Thr Lys Lys Ala20 25 30gga aat gat gtc gtg gtt gtc tgc tcc gca atg gga gac acc acg gat 144Gly Asn Asp Val Val Val Val Cys Ser Ala Met Gly Asp Thr Thr Asp35 40 45gaa ctt cta gaa ctt gca gcg gca gtg aat ccc gtt ccg cca gct cgt 192Glu Leu Leu Glu Leu Ala Ala Ala Val Asn Pro Val Pro Pro Ala Arg50 55 60gaa atg gat atg ctc ctg act gct ggt gag cgt att tct aac gct ctc 240Glu Met Asp Met Leu Leu Thr Ala Gly Glu Arg Ile Ser Asn Ala Leu65 70 75 80gtc gcc atg gct att gag tcc ctt ggc gca gaa gcc caa tct ttc acg 288Val Ala Met Ala Ile Glu Ser Leu Gly Ala Glu Ala Gln Ser Phe Thr85 90 95ggc tct cag gct ggt gtg ctc acc acc gag cgc cac gga aac gca cgc 336Gly Ser Gln Ala Gly Val Leu Thr Thr Glu Arg His Gly Asn Ala Arg100 105 110att gtt gat gtc act cca ggt cgt gtg cgt gaa gca ctc gat gag ggc 384Ile Val Asp Val Thr Pro Gly Arg Val Arg Glu Ala Leu Asp Glu Gly115 120 125aag atc tgc att gtt gct ggt ttc cag ggt gtt aat aaa gaa acc cgc 432Lys Ile Cys Ile Val Ala Gly Phe Gln Gly Val Asn Lys Glu Thr Arg130 135 140gat gtc acc acg ttg ggt cgt ggt ggt tct gac acc act gca gtt gcg 480Asp Val Thr Thr Leu Gly Arg Gly Gly Ser Asp Thr Thr Ala Val Ala145 150 155 160ttg gca gct gct ttg aac gct gat gtg tgt gag att tac tcg gac gtt 528Leu Ala Ala Ala Leu Asn Ala Asp Val Cys Glu Ile Tyr Ser Asp Val165 170 175gac ggt gtg tat acc gct gac ccg cgc atc gtt cct aat gca cag aag 576Asp Gly Val Tyr Thr Ala Asp Pro Arg Ile Val Pro Asn Ala Gln Lys180 185 190ctg gaa aag ctc agc ttc gaa gaa atg ctg gaa ctt gct gct gtt ggc 624Leu Glu Lys Leu Ser Phe Glu Glu Met Leu Glu Leu Ala Ala Val Gly195 200 205tcc aag att ttg gtg ctg cgc agt gtt gaa tac gct cgt gca ttc aat 672Ser Lys Ile Leu Val Leu Arg Ser Val Glu Tyr Ala Arg Ala Phe Asn210 215 220gtg cca ctt cgc gta cgc tcg tct tat agt aat gat ccc ggc act ttg 720Val Pro Leu Arg Val Arg Ser Ser Tyr Ser Asn Asp Pro Gly Thr Leu225 230 235 240att gcc ggc tct atg gag gat att cct gtg gaa gaa gca gtc ctt acc 768Ile Ala Gly Ser Met Glu Asp Ile Pro Val Glu Glu Ala Val Leu Thr245 250 255ggt gtc gca acc gac aag tcc gaa gcc aaa gta acc gtt ctg ggt att 816
Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu Ala Lys Val Thr Val Leu Gly Ile260 265 270tcc gat aag cca ggc gag gct gcg aag gtt ttc cgt gcg ttg gct gat 864Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp275 280 285gca gaa atc aac att gac atg gtt ctg cag aac gtc tct tct gta gaa 912Ala Glu Ile Asn Ile Asp Met Val Leu Gln Asn Val Ser Ser Val Glu290 295 300gac ggc acc acc gac atc atc ttc acc tgc cct cgt tcc gac ggc cgc 960Asp Gly Thr Thr Asp Ile Ile Phe Thr Cys Pro Arg Ser Asp Gly Arg305 310 315 320cgc gcg atg gag atc ttg aag aag ctt cag gtt cag ggc aac tgg acc 1008Arg Ala Met Glu Ile Leu Lys Lys Leu Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr325 330 335aat gtg ctt tac gac gac cag gtc ggc aaa gtc tcc ctc gtg ggt gct 1056Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gln Val Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala340 345 350ggc atg aag tct cac cca ggt gtt acc gca gag ttc atg gaa gct ctg 1104Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu355 360 365cgc gat gtc aac gtg aac atc gaa ttg att tcc acc tct gag att cgt 1152Arg Asp Val Asn Val Asn Ile Glu Leu Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg370 375 380att tcc gtg ctg atc cgt gaa gat gat ctg gat gct gct gca cgt gca 1200Ile Ser Val Leu Ile Arg Glu Asp Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala385 390 395 400ttg cat gag cag ttc cag ctg ggc ggc gaa gac gaa gcc gtc gtt tat 1248Leu His Glu Gln Phe Gln Leu Gly Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr405 410 415gca ggc acc gga cgc 1263Ala Gly Thr Gly Arg420<210>4<211>421<212>PRT<213>Corynebacterium glutamicum<400>4Met Ala Leu Val Val Gln Lys Tyr Gly Gly Ser Ser Leu Glu Ser Ala1 5 10 15Glu Arg Ile Arg Asn Val Ala Glu Arg Ile Val Ala Thr Lys Lys Ala20 25 30Gly Asn Asp Val Val Val Val Cys Ser Ala Met Gly Asp Thr Thr Asp35 40 45
Glu Leu Leu Glu Leu Ala Ala Ala Val Asn Pro Val Pro Pro Ala Arg50 55 60Glu Met Asp Met Leu Leu Thr Ala Gly Glu Arg Ile Ser Asn Ala Leu65 70 75 80Val Ala Met Ala Ile Glu Ser Leu Gly Ala Glu Ala Gln Ser Phe Thr85 90 95Gly Ser Gln Ala Gly Val Leu Thr Thr Glu Arg His Gly Asn Ala Arg100 105 110Ile Val Asp Val Thr Pro Gly Arg Val Arg Glu Ala Leu Asp Glu Gly115 120 125Lys Ile Cys Ile Val Ala Gly Phe Gln Gly Val Asn Lys Glu Thr Arg130 135 140Asp Val Thr Thr Leu Gly Arg Gly Gly Ser Asp Thr Thr Ala Val Ala145 150 155 160Leu Ala Ala Ala Leu Asn Ala Asp Val Cys Glu Ile Tyr Ser Asp Val165 170 175Asp Gly Val Tyr Thr Ala Asp Pro Arg Ile Val Pro Asn Ala Gln Lys180 185 190Leu Glu Lys Leu Ser Phe Glu Glu Met Leu Glu Leu Ala Ala Val Gly195 200 205Ser Lys Ile Leu Val Leu Arg Ser Val Glu Tyr Ala Arg Ala Phe Asn210 215 220Val Pro Leu Arg Val Arg Ser Ser Tyr Ser Asn Asp Pro Gly Thr Leu225 230 235 240Ile Ala Gly Ser Met Glu Asp Ile Pro Val Glu Glu Ala Val Leu Thr245 250 255Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu Ala Lys Val Thr Val Leu Gly Ile260 265 270Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp275 280 285Ala Glu Ile Asn Ile Asp Met Val Leu Gln Asn Val Ser Ser Val Glu290 295 300Asp Gly Thr Thr Asp Ile Ile Phe Thr Cys Pro Arg Ser Asp Gly Arg305 310 315 320Arg Ala Met Glu Ile Leu Lys Lys Leu Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr325 330 335Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gln Val Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala340 345 350Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu355 360 365
Arg Asp Val Asn Val Asn Ile Glu Leu Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg370 375 380Ile Ser Val Leu Ile Arg Glu Asp Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala385 390 395 400Leu His Glu Gln Phe Gln Leu Gly Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr405 410 415Ala Gly Thr Gly Arg420<210>5<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(28)<223>引物lysc1beg<400>5taggatcctc cggtgtctga ccacggtg 28<210>6<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(29)<223>引物lysC2end<400>6acggatccgc tgggaaattg cgctcttcc29<210>7<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(28)<223>引物gluBgl1<400>7taagatctgt gttggacgtc atggcaag 28<210>8<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(28)
<223>引物gluBgl2<400>8acagatcttg aagccaagta cggccaag 28<210>9<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(27)<223>引物pck_beg<400>9taagatctgc cggcatgact tcagttt 27<210>10<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(30)<223>引物pck_end<400>10acagatctgg tgggagcctt tcttgttatt 30<210>11<211>20<212>DNA<213>Corynebacterium glutamicum<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(20)<223>引物aecD_beg<400>11gaacttacgc caagctgttc 20<210>12<211>20<212>DMA<213>Corynebacterium glutamicum<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(20)<223>引物aecD_end<400>12agcaccacaa tcaacgtgag 20<210>13<211>20<212>DNA
<213>Corynebacterium glutamicum<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(20)<223>引物gluA_beg<400>13cacggttgct cattgtatcc 20<210>14<211>20<212>DNA<213>Corynebacterium glutamicum<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(20)<223>引物gluD_end<400>14cgaggcgaat cagacttctt 20<210>15<211>20<212>DNA<213>Corynebacterium glutamicum<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(20)<223>引物ddh_beg<400>15ctgaatcaaa ggcggacatg 20<210>16<211>20<212>DNA<213>Corynebacterium glutamicum<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(20)<223>引物ddh_end<400>16tcgagctaaa ttagacgtcg 20<210>17<211>20<212>DNA<213>Corynebacterium glutamicum<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(20)<223>引物dapA_beg
<400>17cgagccagtg aacatgcaga<210>18<211>20<212>DNA<213>Corynebacterium glutamicum<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(20)<223>引物dapA_end<400>18cttgagcacc ttgcgcagca<210>19<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(28)<223>引物pyc_beg<400>19tcacgcgtct tgaagtcgtg caggtcag<210>20<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(28)<223>引物pyc_end<400>20tcacgcgtcg cctcctccat gaggaaga<210>21<211>39<212>DNA<213>Corynebacterium glutamicum<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(39)<223>引物P458S-1<400>21ggattcattg ccgatcactc gcacctcctt caggctcca<210>22<211>39<212>DNA<213>Corynebacterium glutamicum
<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(39)<223>引物P458S-2<400>22gtggaggaag tccgaggtcg agtgatcggc aatgaatcc
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)化合物的棒狀細(xì)菌，其中這些細(xì)菌除了在天然位點(diǎn)(基因座)具有編碼蛋白質(zhì)或RNA合成的開(kāi)放讀框(ORF)、基因或等位基因的至少一個(gè)拷貝之外，在第二個(gè)、任選地第三個(gè)或第四個(gè)位點(diǎn)還具有整合進(jìn)染色體形式的這種開(kāi)放讀框(ORF)、基因或等位基因的第二個(gè)、任選地第三個(gè)或第四個(gè)拷貝，在所述的第二個(gè)、任選地第三個(gè)或第四個(gè)位點(diǎn)沒(méi)有能/使得能在微生物中附加型復(fù)制或轉(zhuǎn)座的核苷酸序列，沒(méi)有授予抗生素抗性的核苷酸序列，并且所述第二個(gè)、任選地第三個(gè)或第四個(gè)位點(diǎn)與細(xì)菌生長(zhǎng)和所希望的化合物生產(chǎn)所必需的開(kāi)放讀框(ORF)、基因或等位基因不相關(guān)。
2.權(quán)利要求1的生產(chǎn)化合物的棒狀細(xì)菌，其中所述棒狀細(xì)菌屬于棒桿菌屬。
3.權(quán)利要求2的棒桿菌屬的生產(chǎn)化合物的棒狀細(xì)菌，其中這些細(xì)菌屬于谷氨酸棒桿菌菌種。
4.權(quán)利要求1的生產(chǎn)化合物的棒狀細(xì)菌，其中所述化合物是選自以下一組的化合物L(fēng)-氨基酸，維生素，核苷和核苷酸。
5.權(quán)利要求1的生產(chǎn)化合物的棒狀細(xì)菌，其中所述化合物是選自以下一組的一或多種L-氨基酸L-天冬氨酸，L-天冬酰胺，L-蘇氨酸，L-絲氨酸，L-谷氨酸，L-谷氨酰胺，甘氨酸，L-丙氨酸，L-半胱氨酸，L-纈氨酸，L-甲硫氨酸，L-異亮氨酸，L-亮氨酸，L-酪氨酸，L-苯丙氨酸，L-組氨酸，L-賴(lài)氨酸，L-色氨酸，L-脯氨酸和L-精氨酸。
6.權(quán)利要求1和4的生產(chǎn)化合物的棒狀細(xì)菌，其中所述L-氨基酸是L-賴(lài)氨酸，而且這些細(xì)菌除了在天然位點(diǎn)(基因座)具有用于賴(lài)氨酸生產(chǎn)的開(kāi)放讀框(ORF)、基因或等位基因的至少一個(gè)拷貝之外，在每種情況中在第二個(gè)、任選地第三個(gè)或第四個(gè)位點(diǎn)還具有整合進(jìn)染色體形式的用于賴(lài)氨酸生產(chǎn)的開(kāi)放讀框(ORF)、基因或等位基因的第二個(gè)、任選地第三個(gè)或第四個(gè)拷貝。
7.權(quán)利要求6的生產(chǎn)L-賴(lài)氨酸的棒狀細(xì)菌，其中所述棒狀細(xì)菌屬于棒桿菌屬。
8.權(quán)利要求7的生產(chǎn)L-賴(lài)氨酸的棒桿菌屬的棒狀細(xì)菌，其中這些細(xì)菌屬于谷氨酸棒桿菌菌種。
9.權(quán)利要求6的生產(chǎn)L-賴(lài)氨酸的棒狀細(xì)菌，其中用于賴(lài)氨酸生產(chǎn)的開(kāi)放讀框(ORF)、基因或等位基因是選自以下一組的一或多個(gè)開(kāi)放讀框、基因或等位基因accBC，accDA，cstA，cysD，cysE，cysH，cysK，cysN，cysQ，dapA，dapB，dapC，dapD，dapE，dapF，ddh，dps，eno，gap，gap2，gdh，gnd，lysC，lysCFBR，lysE，msiK，opcA，oxyR，ppc，ppcFBR，pgk，pknA，pknB，pknD，pknG，ppsA，ptsH，ptsI，ptsM，pyc，pyc P458S，sigC，sigD，sigE，sigH，sigM，tal，thyA，tkt，tpi，zwal，zwf和zwfA213T。
10.權(quán)利要求6的生產(chǎn)L-賴(lài)氨酸的棒狀細(xì)菌，其中所述用于賴(lài)氨酸生產(chǎn)的開(kāi)放讀框、基因或等位基因是選自以下一組的一或多個(gè)基因或等位基因dapA，ddh，lysCFBR和pyc P458S。
11.權(quán)利要求6的生產(chǎn)L-賴(lài)氨酸的棒狀細(xì)菌，其中所述用于賴(lài)氨酸生產(chǎn)的開(kāi)放讀框、基因或等位基因是lysCFBR等位基因，其編碼反饋抗性形式天冬氨酸激酶。
12.權(quán)利要求11的生產(chǎn)L-賴(lài)氨酸的棒狀細(xì)菌，其中l(wèi)ysCFBR等位基因編碼的反饋抗性形式天冬氨酸激酶含有SEQ ID NO2所示氨基酸序列，SEQ ID NO2含有選自以下一組的一或多個(gè)氨基酸置換A279T，A279V，S301F，T308I，S301Y，G345D，R320G，T311I和S381F。
13.權(quán)利要求11的生產(chǎn)L-賴(lài)氨酸的棒狀細(xì)菌，其中由lysCFBR等位基因編碼的反饋抗性形式的天冬氨酸激酶包括SEQ ID NO4所示氨基酸序列。
14.權(quán)利要求11的生產(chǎn)L-賴(lài)氨酸的棒狀細(xì)菌，其中l(wèi)ysCFBR等位基因的編碼區(qū)包括SEQ ID NO3所示核苷酸序列。
15.權(quán)利要求6的生產(chǎn)L-賴(lài)氨酸的棒狀細(xì)菌，其中該特定的第二個(gè)、任選地第三個(gè)或第四個(gè)位點(diǎn)特別是選自以下一組的一個(gè)基因aecD，ccpA1，ccpA2，citA，citB，citE，fda，gluA，gluB，gluC，gluD，luxR，luxS，lysR1，lysR2，lysR3，menE，mqo，pck，pgi和poxB。
16.權(quán)利要求6的生產(chǎn)L-賴(lài)氨酸的棒狀細(xì)菌，其中該特定的第二個(gè)、任選地第三個(gè)或第四個(gè)位點(diǎn)特別是選自以下一組的一個(gè)位點(diǎn)染色體的基因間區(qū)域，包含于染色體中的原噬菌體及包含于染色體中的缺陷噬菌體。
17.權(quán)利要求15的生產(chǎn)L-賴(lài)氨酸的棒狀細(xì)菌，其中該特定的第二個(gè)、任選地第三個(gè)或第四個(gè)位點(diǎn)是aecD基因位點(diǎn)。
18.權(quán)利要求15的生產(chǎn)L-賴(lài)氨酸的棒狀細(xì)菌，其中該特定的第二個(gè)、任選地第三個(gè)或第四個(gè)位點(diǎn)是gluB基因位點(diǎn)。
19.權(quán)利要求15的生產(chǎn)L-賴(lài)氨酸的棒狀細(xì)菌，其中該特定的第二個(gè)、任選地第三個(gè)或第四個(gè)位點(diǎn)是pck基因位點(diǎn)。
20.通過(guò)發(fā)酵棒狀細(xì)菌制備化合物的方法，其中進(jìn)行以下步驟a)發(fā)酵這樣的棒狀細(xì)菌，a1)這些細(xì)菌除了在天然位點(diǎn)(基因座)存在編碼蛋白質(zhì)或RNA合成的開(kāi)放讀框(ORF)、基因或等位基因的至少一個(gè)拷貝之外，在每種情況下在第二個(gè)、任選地第三個(gè)或第四個(gè)位點(diǎn)還具有整合進(jìn)染色體形式的這種開(kāi)放讀框(ORF)、基因或等位基因的第二個(gè)、任選地第三個(gè)或第四個(gè)拷貝，在所述第二個(gè)、任選地第三個(gè)或第四個(gè)位點(diǎn)沒(méi)有能/使得能在微生物中附加型復(fù)制或轉(zhuǎn)座的核苷酸序列，及沒(méi)有授予抗生素抗性的核苷酸序列，并且所述第二個(gè)、任選地第三個(gè)或第四個(gè)位點(diǎn)與細(xì)菌生長(zhǎng)和所希望的化合物生產(chǎn)必需的開(kāi)放讀框(ORF)、基因或等位基因不相關(guān)，a2)這些細(xì)菌中相應(yīng)蛋白質(zhì)的胞內(nèi)活性提高，尤其編碼這種蛋白質(zhì)的核苷酸序列被過(guò)表達(dá)，b)濃縮發(fā)酵肉湯和/或細(xì)菌細(xì)胞中的化合物，c)分離所述化合物，任選地d)伴有＞(大于)0-100wt％的發(fā)酵肉湯的組分和/或生物量。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述棒狀細(xì)菌屬于棒桿菌屬。
22.權(quán)利要求20的方法，其中棒桿菌屬的棒狀細(xì)菌屬于谷氨酸棒桿菌菌種。
23.權(quán)利要求20的方法，其中所述化合物是選自以下一組的化合物L(fēng)-氨基酸，維生素，核苷和核苷酸。
24.權(quán)利要求20的方法，其中所述化合物是選自以下一組的一或多種L-氨基酸L-天冬氨酸，L-天冬酰胺，L-蘇氨酸，L-絲氨酸，L-谷氨酸，L-谷氨酰胺，甘氨酸，L-丙氨酸，L-半胱氨酸，L-纈氨酸，L-甲硫氨酸，L-異亮氨酸，L-亮氨酸，L-酪氨酸，L-苯丙氨酸，L-組氨酸，L-賴(lài)氨酸，L-色氨酸，L-脯氨酸和L-精氨酸。
25.權(quán)利要求24的方法，其中所述化合物是L-賴(lài)氨酸。
26.制備L-賴(lài)氨酸的方法，包括以下步驟a)在使所述開(kāi)放讀框(ORF)、基因或等位基因表達(dá)的條件下發(fā)酵這樣的棒狀細(xì)菌，所述細(xì)菌除了在天然位點(diǎn)(基因座)具有用于賴(lài)氨酸生產(chǎn)的開(kāi)放讀框(ORF)、基因或等位基因的至少一個(gè)拷貝之外，在每種情況下在第二個(gè)、任選地第三個(gè)或第四個(gè)位點(diǎn)還具有整合進(jìn)染色體中形式的用于賴(lài)氨酸生產(chǎn)的開(kāi)放讀框(ORF)、基因或等位基因的第二個(gè)、任選地第三個(gè)或第四個(gè)拷貝。
27.權(quán)利要求26的制備L-賴(lài)氨酸的方法，其中用于賴(lài)氨酸生產(chǎn)的開(kāi)放讀框、基因或等位基因是選自以下一組的開(kāi)放讀框(ORF)、基因或等位基因accBC，accDA，cstA，cysD，cysE，cysH，cysK，cysN，cysQ，dapA，dapB，dapC，dapD，dapE，dapF，ddh，dps，eno，gap，gap2，gdh，gnd，lysC，lysCFBR，lysE，msiK，opcA，oxyR，ppc，ppcFBR，pgk，pknA，pknB，pknD，pknG，ppsA，ptsH，ptsI，ptsM，pyc，pyc P458S，sigC，sigD，sigE，sigH，sigM，tal，thyA，tkt，tpi，zwal，zwf和zwfA213T。
28.權(quán)利要求26的制備L-賴(lài)氨酸的方法，其中用于賴(lài)氨酸生產(chǎn)的開(kāi)放讀框(ORF)、基因或等位基因是選自以下一組的基因或等位基因dapA，ddh，lysCFBR和pycP458S。
29.權(quán)利要求26的制備L-賴(lài)氨酸的方法，其中用于賴(lài)氨酸生產(chǎn)的開(kāi)放讀框(ORF)、基因或等位基因是lysCFBR等位基因，其編碼反饋抗性形式的天冬氨酸激酶。
30.權(quán)利要求29的制備L-賴(lài)氨酸的方法，其中由lysCFBR等位基因編碼的反饋抗性形式的天冬氨酸激酶含有SEQ ID NO2所示氨基酸序列，SEQ ID NO2含有選自以下一組的一或多個(gè)氨基酸置換A279T，A279V，S301F，T308I，S301Y，G345D，R320G，T311I和S381F。
31.權(quán)利要求29的制備L-賴(lài)氨酸的方法，其中由lysCFBR等位基因編碼的反饋抗性形式的天冬氨酸激酶含有SEQ ID NO4所示氨基酸序列。
32.權(quán)利要求29的制備L-賴(lài)氨酸的方法，其中l(wèi)ysCFBR等位基因編碼的反饋抗性形式的天冬氨酸激酶含有SEQ ID NO3所示核苷酸序列。
33.權(quán)利要求26的制備L-賴(lài)氨酸的方法，其中該特定的第二個(gè)、任選地第三個(gè)或第四個(gè)位點(diǎn)是選自以下一組的位點(diǎn)aecD，ccpA1，ccpA2，citA，citB，citE，fda，gluA，gluB，gluC，gluD，luxR，luxS，lysR1，lysR2，lysR3，menE，mqo，pck，pgi和poxB。
34.權(quán)利要求26的制備L-賴(lài)氨酸的方法，其中該特定的第二個(gè)、任選地第三個(gè)或第四個(gè)位點(diǎn)是aecD基因位點(diǎn)。
35.權(quán)利要求26的制備L-賴(lài)氨酸的方法，其中該特定的第二個(gè)、任選地第三個(gè)或第四個(gè)位點(diǎn)是gluB基因位點(diǎn)。
36.權(quán)利要求26的制備L-賴(lài)氨酸的方法，其中該特定的第二個(gè)、任選地第三個(gè)或第四個(gè)位點(diǎn)是pck基因位點(diǎn)。
37.生產(chǎn)棒狀細(xì)菌的方法，所述細(xì)菌產(chǎn)生一或多種化合物，所述方法包括a)優(yōu)選地從棒狀細(xì)菌中分離編碼蛋白質(zhì)或RNA的至少一種所希望的ORF、基因或等位基因的核苷酸序列，其任選地包括表達(dá)和/或調(diào)節(jié)信號(hào)，b)將靶位點(diǎn)的核苷酸序列提供給所述ORF、基因或等位基因的5’和3’末端，c)優(yōu)選將所述具有靶位點(diǎn)核苷酸序列的所希望的ORF、基因或等位基因的核苷酸序列摻入一個(gè)載體中，所述載體在棒狀細(xì)菌中不復(fù)制或僅有限復(fù)制，d)將b)或c)的核苷酸序列轉(zhuǎn)移進(jìn)棒狀細(xì)菌中，e)分離這樣的棒狀細(xì)菌，其中a)的核苷酸序列摻入在靶位點(diǎn)，在該靶位點(diǎn)沒(méi)有能/使得能在微生物中附加型復(fù)制或轉(zhuǎn)座的核苷酸序列，及沒(méi)有授予抗生素抗性的核苷酸序列。
38.質(zhì)粒pK18mobsacBglu1_1，其示于圖1，并以大腸桿菌菌株DH5αmcr/pK18mobsacBglu1_1(＝DH5alphamcr/pK18mobsacBglu1_1)的純培養(yǎng)物形式保藏，保藏號(hào)DSM14243。
39.質(zhì)粒pK18mobsacBaecD1_1，其示于圖2，并以大腸桿菌菌株DH5αmcr/pK18mobsacBaecD1_1(＝DH5alphamcr/pK18mobsacBaecD1_1)的純培養(yǎng)物形式保藏，保藏號(hào)DSM15040。
40.谷氨酸棒桿菌菌株DSM12866glu∷lysC，其以純培養(yǎng)物形式保藏，保藏號(hào)DSM15039。
全文摘要
本發(fā)明涉及棒狀細(xì)菌及通過(guò)發(fā)酵這些細(xì)菌制備化合物的方法，所述細(xì)菌除了在天然位點(diǎn)(基因座)具有編碼蛋白質(zhì)或RNA合成的開(kāi)放讀框(ORF)、基因或等位基因的至少一個(gè)拷貝之外，在每種情況下，在每種情況下第二個(gè)、任選地第三個(gè)或第四個(gè)位點(diǎn)還具有整合進(jìn)染色體形式的這種開(kāi)放讀框(ORF)、基因或等位基因的第二個(gè)、任選地第三個(gè)或第四個(gè)拷貝。
文檔編號(hào)C12N15/52GK1539015SQ02815446
公開(kāi)日2004年10月20日 申請(qǐng)日期2002年7月30日 優(yōu)先權(quán)日2001年8月6日
發(fā)明者布里吉特·巴瑟, 卡羅琳·賴(lài)內(nèi)恩, 貝蒂娜·默克爾, 格奧爾格·蒂爾巴赫, 賴(lài)內(nèi)恩, 默克爾, 布里吉特 巴瑟, 格 蒂爾巴赫 申請(qǐng)人:德古薩股份公司