專利名稱：通過基因擴增反應(yīng)合成的寡核苷酸的自聚體形成方法、自聚體和基因的檢出方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用基因擴增反應(yīng)反應(yīng)合成的寡核苷酸來形成自聚體的方法、形成的自聚體、以及利用該自聚體的基因檢出方法。
背景技術(shù)：
近年來，為了檢出微量靶基因，開發(fā)出了各種擴增基因的基因擴增方法。其中，使用耐熱性核酸合成酶的Polymerase chainreaction法(UnitedStates Patent No.4,683，195、USP 4,683,202、以下稱為PCR法)、利用耐熱性核酸連接酶的Ligase chain reaction法(USP 5,792,607、以下稱為LCR法)、利用鏈置換型核酸合成酶的Strand Displacement Amplification法(日本特許第2076096號、以下稱為SDA法)、以及Isothermal and Chimericprimer-initiated Amplification of Nucleic acid法(WO 00/56877，以下稱為ICAN法)，均是利用合成核酸的酶的特征而開發(fā)的基因擴增方法。
這些基因擴增方法，是僅重復(fù)復(fù)制基因的特定部位的反應(yīng)，是使由該特定部位構(gòu)成的基因片段擴增的方法。由此，由于通過基因擴增法產(chǎn)生的擴增產(chǎn)物，是直鏈狀的基因片段，所以，難于簡便地檢出，目前在市售的基因診斷試劑盒中基因的檢出法中，主要是通過與EIA(enyzmeimmuno assay)的組合而檢出，或者預(yù)先將熒光物質(zhì)標記在基因上，然后檢出靶基因。
但是，在EIA或?qū)晒馕镔|(zhì)標記在基因上的測定中，須要特殊的儀器和試劑，操作也煩雜，并且需要1小時以上的時間才能判定結(jié)果，所以人們期望能夠開發(fā)出一種能夠簡便并廉價地檢出通過目前的基因擴增法擴增的基因的方法。
另一方面，本申請人已提出不使用酶的新型等溫核酸擴增法(探針自聚體的制作方法)(USP 6,261,846、日本特許第3267576號和EP1,002,877A)。該方法是利用由3個區(qū)構(gòu)成的一對探針(HoneyCombProbe、以下稱為HCP法)的方法，其中，第1探針和第2探針的各個3個區(qū)，具有互補的堿基序列，在使兩者反應(yīng)時，要設(shè)置各區(qū)的堿基序列，使僅與1個區(qū)進行雜交。通過這種設(shè)置，在使多對探針進行反應(yīng)時，相互雜交并可以形成探針的自聚體(Probe alternation link self-assembly reaction，以下稱為PALSAR法)。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是鑒于上述情況而完成的，目的在于提供不用使用特殊儀器或試劑而能夠通過EIA法測定的形成寡核苷酸自聚體的方法、以及通過該自聚體形成方法而形成的自聚體、和利用該自聚體的形成方法簡便廉價地檢出擴增的特定基因的方法。
為解決上述課題，本發(fā)明人等，對于各種寡核苷酸的自聚體的形成方法進行了銳意的研究。其結(jié)果發(fā)現(xiàn)，作為用于形成自聚體的寡核苷酸可以利用通過基因擴增反應(yīng)而擴增的寡核苷酸。擴增后的寡核苷酸，由于通過自聚反應(yīng)容易形成聚合體，所以不需要使用特殊儀器就能夠檢出基因。
本發(fā)明的寡核苷酸的自聚體的形成方法，是通過寡核苷酸的自聚反應(yīng)而形成自聚體的方法，其特征在于，作為該寡核苷酸，含有通過基因擴增反應(yīng)而合成的寡核苷酸。
作為所述自聚體的形成方法的一個例子，是利用多對由n個(n≥3)通過互補的堿基序列區(qū)構(gòu)成的寡核苷酸探針(以下有時稱為HCP)，通過使相互不同交叉地雜交，可以使寡核苷酸自聚并形成自聚體。
所述一對寡核苷酸探針中的至少一方，可以使用通過含有所述n處(n≥3)區(qū)的基因擴增反應(yīng)合成的寡核苷酸。
所述一對寡核苷酸探針的構(gòu)成為，在以1對1進行雜交時，在n處(n≥3)互補部分中，必須每1處都能夠進行特異性地雜交。
此外，所述一對寡核苷酸探針的多對，可以使用該堿基序列區(qū)至少1處不同的m(m≥2)種的一對探針。
作為所述自聚體的形成方法的另外例子，具有從含有把1號和2號的一對寡核苷酸的各寡核苷酸分成3’側(cè)區(qū)、中央?yún)^(qū)和5’側(cè)區(qū)3個區(qū)、使各寡核苷酸的中央?yún)^(qū)為互補堿基序列、使3’側(cè)區(qū)和5’側(cè)區(qū)為不互補堿基序列的多對二聚體形成用探針的第1系統(tǒng)至第(2n-1)(n≥1)系統(tǒng)依次形成的含有n個二聚體形成用探針系統(tǒng)；從分別含有把1號和2號的一對寡核苷酸的各寡核苷酸分成3’側(cè)區(qū)和5’側(cè)區(qū)2個區(qū)、使各寡核苷酸3’側(cè)區(qū)和5’側(cè)區(qū)為不互補堿基序列的多對交聯(lián)探針的第2系統(tǒng)至第2n系統(tǒng)依次形成的含有n個交聯(lián)探針系統(tǒng)；且將此交聯(lián)探針作為能夠交聯(lián)由該二聚體形成用探針形成的二聚體的堿基序列，從而能夠通過使該探針雜交使寡核苷酸自聚而形成自聚體。
作為上述多對二聚體形成用探針以及多對交聯(lián)探針中的至少一對，可以使用通過基因擴增反應(yīng)而合成的寡核苷酸。
在所述自聚體的形成方法的另外例子中，在n＝1時，第1系統(tǒng)的二聚體探針和第2系統(tǒng)的交聯(lián)探針的互補堿基序列的組合，存在兩套。作為n＝1時例子，可以使用所述探針的堿基序列為分別使下列區(qū)第1系統(tǒng)的1號寡核苷酸的3’側(cè)區(qū)與第2系統(tǒng)的1號寡核苷酸的3’側(cè)區(qū)、第1系統(tǒng)的2號寡核苷酸的5’側(cè)區(qū)與第2系統(tǒng)的2號寡核苷酸的5’側(cè)區(qū)、第2系統(tǒng)的2號寡核苷酸的3’側(cè)區(qū)與第1系統(tǒng)的2號寡核苷酸的3’側(cè)區(qū)、第2系統(tǒng)的1號寡核苷酸的5’側(cè)區(qū)與第1系統(tǒng)的1號寡核苷酸的5’側(cè)區(qū)，成為互補的堿基序列。
作為n＝1時的另外的例子，可以使用所述探針的堿基序列為分別使下列區(qū)，第1系統(tǒng)的1號寡核苷酸的3’側(cè)區(qū)與第2系統(tǒng)的1號寡核苷酸的3’側(cè)區(qū)、第1系統(tǒng)的2號寡核苷酸的5’側(cè)區(qū)與第2系統(tǒng)的2號寡核苷酸的5’側(cè)區(qū)、第1系統(tǒng)的2號寡核苷酸的3’側(cè)區(qū)與第2系統(tǒng)的2號寡核苷酸的3’側(cè)區(qū)、第1系統(tǒng)的1號寡核苷酸的5’側(cè)區(qū)與第2系統(tǒng)的2號寡核苷酸的5’側(cè)區(qū)互，成為補的堿基序列。
在所述自聚體的形成方法的另外的例子中，在n≥2時，第1、第3、……、第(2n-1)系統(tǒng)的二聚體形成用探針和第2、第4、……、
第2n系統(tǒng)的交聯(lián)探針的互補堿基序列的組合，存在兩套。作為n≥2時例子，可以使用所述探針的堿基序列為分別使下列區(qū)，第(2n-3)系統(tǒng)的1號寡核苷酸的3’側(cè)區(qū)與第(2n-2)系統(tǒng)的1號寡核苷酸的3’側(cè)區(qū)、第(2n-3)系統(tǒng)的2號寡核苷酸的5’側(cè)區(qū)與第(2n-2)系統(tǒng)的2號寡核苷酸的5’側(cè)區(qū)、第(2n-2)系統(tǒng)的2號寡核苷酸的3’側(cè)區(qū)與第(2n-3)系統(tǒng)的2號寡核苷酸的3’側(cè)區(qū)、第(2n-2)系統(tǒng)的1號寡核苷酸的5’側(cè)區(qū)與第(2n-3)系統(tǒng)的1號寡核苷酸的5’側(cè)區(qū)、二聚體形成用探針的最后系統(tǒng)的1號寡核苷酸的3’側(cè)區(qū)與交聯(lián)探針的最后系統(tǒng)的1號寡核苷酸的3’側(cè)區(qū)、二聚體形成用探針的最后系統(tǒng)的2號寡核苷酸的5’側(cè)區(qū)與交聯(lián)探針的最后系統(tǒng)的2號寡核苷酸的5’側(cè)區(qū)、交聯(lián)探針的最后系統(tǒng)的2號寡核苷酸的3’側(cè)區(qū)與第1系統(tǒng)的2號寡核苷酸的3’側(cè)區(qū)、交聯(lián)探針的最后系統(tǒng)的1號寡核苷酸的5’側(cè)區(qū)與第1系統(tǒng)的1號寡核苷酸的5’側(cè)區(qū)，成為分別互補的堿基序列。
作為n≥2時的另外的例子，可以使用所述探針的堿基序列為分別使下列區(qū)第(2n-3)系統(tǒng)的1號寡核苷酸的3’側(cè)區(qū)與第(2n-2)系統(tǒng)的1號寡核苷酸的3’側(cè)區(qū)、第(2n-3)系統(tǒng)的2號寡核苷酸的5’側(cè)區(qū)與第(2n-2)系統(tǒng)的2號寡核苷酸的5’側(cè)區(qū)、第(2n-2)系統(tǒng)的2號寡核苷酸的3’側(cè)區(qū)與第(2n-1)系統(tǒng)的2號寡核苷酸的3’側(cè)區(qū)、第(2n-2)系統(tǒng)的1號寡核苷酸的5’側(cè)區(qū)與第(2n-1)系統(tǒng)的1號寡核苷酸的5’側(cè)區(qū)、二聚體形成用探針的最后系統(tǒng)的1號寡核苷酸的3’側(cè)區(qū)與交聯(lián)探針的最后系統(tǒng)的1號寡核苷酸的3’側(cè)區(qū)、
二聚體形成用探針的最后系統(tǒng)的2號寡核苷酸的5’側(cè)區(qū)與交聯(lián)探針的最后系統(tǒng)的1號寡核苷酸的5’側(cè)區(qū)、交聯(lián)探針的最后系統(tǒng)的2號寡核苷酸的3’側(cè)區(qū)與第1系統(tǒng)的2號寡核苷酸的3’側(cè)區(qū)、交聯(lián)探針的最后系統(tǒng)的2號寡核苷酸的5’側(cè)區(qū)與第1系統(tǒng)的1號寡核苷酸的5’側(cè)區(qū)，成為互補的堿基序列。
所述探針的雜交，優(yōu)選在預(yù)先從所述二聚體形成用探針形成二聚體后，使所述交聯(lián)探針和該二聚體進行雜交。
所述多對二聚體形成用探針，可以使用所述中央?yún)^(qū)不同的m(m≥2)種的二聚體形成用探針。
所述一對二聚體形成用探針的3’側(cè)區(qū)和/或5’側(cè)區(qū)，可以為相同的堿基序列。
所述交聯(lián)探針的至少一個，可以使用通過含有所述交聯(lián)探針的2個區(qū)的基因擴增反應(yīng)而合成的寡核苷酸。
作為通過所述基因擴增反應(yīng)而合成的寡核苷酸，可以使用分別具有與第(2n-1)系統(tǒng)的寡核苷酸的5’側(cè)區(qū)和3’側(cè)區(qū)互補的區(qū)各2處的、至少由4處區(qū)構(gòu)成的互補的基因片段。
在所述HCP、二聚體形成用探針和交聯(lián)探針的自聚體形成中所用的寡核苷酸探針(以下有的只稱為探針)，由選自DNA、RNA、PNA或LNA中的任何一個的堿基構(gòu)成。
在所述探針的互補堿基序列區(qū)的端部上，至少配置1個G(鳥嘌呤)或C(胞嘧啶)，所述探針在雜交時，通過在互補的堿基序列區(qū)的端部至少形成一個G-C鍵，通過堿基的疊重(stacking of base)使產(chǎn)生堿基的π電子的特殊相互作用，可以形成更穩(wěn)定的寡核苷酸的自聚體。
作為通過所述基因擴增反應(yīng)而擴增的寡核苷酸，第1，可以使用通過利用耐熱性核酸合成酶的基因擴增反應(yīng)而擴增的寡核苷酸。
作為通過所述基因擴增反應(yīng)而擴增的寡核苷酸，第2，可以使用通過利用耐熱性核酸連接酶的基因擴增反應(yīng)而擴增的寡核苷酸。
作為通過所述基因擴增反應(yīng)而擴增的寡核苷酸，第3，可以使用通過利用鏈置換型核酸合成酶的基因擴增反應(yīng)而擴增的寡核苷酸。
作為通過所述基因擴增反應(yīng)而合成的寡核苷酸，可以使用由雙鏈DNA和/或RNA構(gòu)成的寡核苷酸片段。
作為通過所述基因擴增反應(yīng)而合成的寡核苷酸，可以使用由單鏈DNA和/或RNA構(gòu)成的寡核苷酸片段。
作為用于所述基因擴增反應(yīng)的擴增用探針(以下也有只稱為擴增用探針)，可以舉出由DNA、RNA、或DNA和RNA構(gòu)成的嵌合體型探針。
用于所述基因擴增反應(yīng)的擴增用探針，優(yōu)選使用在一對擴增用探針的至少一方上具有被甲基化的堿基的擴增用探針。被甲基化的堿基的位置，優(yōu)選為擴增用探針的5’末端～5’末端周邊或3’末端～3’末端周邊，更優(yōu)選從各末端起5個堿基以內(nèi)。在本發(fā)明中，將5’末端和5’末端周邊稱為5’末端側(cè)，將3’末端和3’末端周邊稱為3’末端側(cè)。一對擴增用探針，可以使用僅一方的探針被甲基化的一對擴增用探針，也可以使用兩方的探針均被甲基化的一對擴增用探針。此外，可以使5’末端側(cè)和3’末端側(cè)均甲基化，也可以使僅是任何一個的末端側(cè)甲基化。另外，作為擴增用探針在使用由DNA和RNA構(gòu)成的嵌合體型探針時，也能夠使用使DNA區(qū)和/或RNA區(qū)的末端側(cè)甲基化的探針，這也包括在本發(fā)明中。
在通過所述基因擴增反應(yīng)合成的寡核苷酸中，優(yōu)選使用預(yù)先在該互補的區(qū)內(nèi)切斷具有與靶基因互補的區(qū)的寡核苷酸，并通過連接反應(yīng)而連接的寡核苷酸。
通過所述基因擴增反應(yīng)合成的寡核苷酸，優(yōu)選利用核酸分解酶分解。
作為所述核酸分解酶，優(yōu)選使用核酸外切酶、RNase H、限制酶等。
本發(fā)明的自聚體，是利用所述寡核苷酸自聚體的形成方法而形成的自聚體。
本發(fā)明的基因檢出方法，其特征在于，利用所述寡核苷酸的自聚體的形成方法形成自聚體，通過檢出形成的所述自聚體，從而檢出通過所述基因擴增反應(yīng)合成的寡核苷酸。
在所述基因擴增反應(yīng)中，在被擴增的靶基因中可以使用雙鏈DNA和/或RNA。
在所述基因擴增反應(yīng)中，在被擴增的靶基因中可以使用單鏈DNA和/或RNA。
在所述基因擴增反應(yīng)中，在被擴增的靶基因中可以使用單堿基多態(tài)。
圖1是表示利用本發(fā)明中所用的PALSA法的一對HCP的自聚體形成方法的一例的示意圖，(a)表示一對HCP，(b)表示HCP結(jié)合狀態(tài)的一例，(c)表示自聚體的形成。
圖2表示利用本發(fā)明中所用的PALSA法的一對HCP的自聚體形成方法的另一例的示意圖，(a)、(b)分別表示互補區(qū)的1處不同的一對HCP，(c)表示由上述HCP形成的二聚體，(d)表示自聚體的形成。
圖3是表示利用本發(fā)明中所用的PALSA法的n＝1時二聚體形成用探針和交聯(lián)探針的自聚體的形成方法的一例示意圖，(a)表示一對二聚體形成用探針，(b)表示一對交聯(lián)探針，(c)表示自聚體的形成。
圖4是表示利用本發(fā)明中所用的PALSA法的n＝1時二聚體形成用探針和交聯(lián)探針的自聚體的形成方法的另一例示意圖，(a)表示一對二聚體形成用探針，(b)表示一對交聯(lián)探針，(c)表示自聚體的形成。
圖5是表示利用本發(fā)明中所用的PALSA法的n≥2時二聚體形成用探針和交聯(lián)探針的自聚體的形成方法的一例示意圖，(a)表示由一對二聚體形成用探針形成的4組二聚體探針、以及4組的一對交聯(lián)探針，(b)表示自聚體的形成。
圖6是表示利用本發(fā)明中所用的PALSA法的n≥2時二聚體形成用探針和交聯(lián)探針的自聚體的形成方法的另一例示意圖，(a)表示由一對二聚體形成用探針形成的4組二聚體探針、以及4組的一對交聯(lián)探針，(b)表示自聚體的形成。
圖7是表示本發(fā)明的寡核苷酸的自聚體形成方法的第1例的第1實施方式的原理的示意圖，(a)表示一對基因片段，(b)表示一對二聚體形成用探針，(c)表示自聚體形成。
圖8是表示本發(fā)明的寡核苷酸的自聚體形成方法的第1例的第2實施方式的原理的示意圖，(a)表示一對基因片段，(b)表示一對二聚體形成用探針，(c)表示自聚體形成。
圖9是表示本發(fā)明的寡核苷酸的自聚體形成方法的第1例的第3實施方式的原理的示意圖，(a)表示一對基因片段，(b)表示一對二聚體形成用探針，(c)表示自聚體形成。
圖10是表示本發(fā)明的寡核苷酸的自聚體形成方法的第1例的第4實施方式的原理的示意圖，(a)表示一對基因片段，(b)表示一對二聚體形成用探針，(c)表示自聚體形成。
圖11是表示利用被酶剪切的一對基因片段的自聚體形成方法的第1例的示意圖，(a)表示一對基因片段，(b)表示一對二聚體形成用探針，(c)表示自聚體形成。
圖12是表示利用被酶剪切的一對基因片段的自聚體形成方法的第2例的示意圖，(a)表示一對基因片段，(b)表示一對二聚體形成用探針，(c)表示自聚體形成。
圖13是表示利用被酶剪切的一對基因片段的自聚體形成方法的第3例的示意圖，(a)表示一對基因片段，(b)表示一對二聚體形成用探針，(c)表示自聚體形成。
圖14是表示預(yù)先制作為基因片段的交聯(lián)探針的自聚體形成方法的示意圖，(a)表示單鏈基因片段，(b)表示一對二聚體形成用探針，(c)表示預(yù)先制作的交聯(lián)探針，(d)表示自聚體的形成。
圖15是表示利用通過使用擴增用RNA探針的基因擴增而被擴增的基因片段和RNase H的自聚體形成方法的一例示意圖，(a)表示利用擴增用RNA探針的DNA擴增。
圖16是表示利用通過使用擴增用RNA探針的基因擴增而被擴增的基因片段和RNase H的自聚體形成方法的一例示意圖，(b)表示利用擴增用RNA探針被擴增的一對基因片段，(c)表示RNase H處理后的一對基因片段，(d)表示一對二聚體形成用探針，(e)表示自聚體的形成。
圖17是表示本發(fā)明中所用的寡核苷酸中被甲基化的堿基。
圖18是表示本發(fā)明的寡核苷酸的自聚體形成方法的第2例的實施方式的原理的示意圖，(a)表示靶基因，(b)表示被剪切的甲基化后的二聚體形成用探針。
圖19是表示本發(fā)明的寡核苷酸的自聚體形成方法的第2例的實施方式的原理的示意圖，(c)表示靶基因和被剪切的二聚體形成用探針的雜交，(d)表示被剪切的二聚體形成用探針的連接反應(yīng)。
圖20是表示本發(fā)明的寡核苷酸的自聚體形成方法的第2例的實施方式的原理的示意圖，(e)表示對被連接的二聚體形成用探針進行的核酸分解酶的分解處理，(f)表示對未反應(yīng)的二聚體形成用探針進行的核酸分解酶的分解處理。
圖21是表示本發(fā)明的寡核苷酸的自聚體形成方法的第2例的實施方式的原理的示意圖，(g)表示對被連接的二聚體形成用探針中自聚體的形成，(h)分解后的二聚體形成用探針中自聚體的形成。
圖22是表示本發(fā)明的寡核苷酸的自聚體形成方法的第3例的第1實施方式的原理的示意圖，(a)表示靶基因，(b)表示甲基化的擴增用探針。
圖23是表示本發(fā)明的寡核苷酸的自聚體形成方法的第3例的第1實施方式的原理的示意圖，(c)表示靶基因和甲基化的擴增用探針的雜交，(d)表示DNA合成。
圖24是表示本發(fā)明的寡核苷酸的自聚體形成方法的第3例的第1實施方式的原理的示意圖，(e)表示合成的DNA和擴增用探針的雜交，(f)表示DNA的合成。
圖25是表示本發(fā)明的寡核苷酸的自聚體形成方法的第3例的第1實施方式的原理的示意圖，(g)表示合成探針，(h)表示核酸分解酶的分解。
圖26是表示本發(fā)明的寡核苷酸的自聚體形成方法的第3例的第1實施方式的原理的示意圖，(i)表示通過核酸分解酶分解后的合成探針，(j)表示合成探針作為交聯(lián)探針的使用，(k)表示合成探針作為HCP的使用。
圖27是表示本發(fā)明的寡核苷酸的自聚體形成方法的第3例的第1實施方式的原理的示意圖，(l)及(m)表示分解的合成探針和未反應(yīng)探針的雜交，(n)表示核酸分解酶的處理。
圖28是表示本發(fā)明的寡核苷酸的自聚體形成方法的第3例的第2實施方式的原理的示意圖，(a)表示靶基因，(b)表示僅一方甲基化的擴增用探針。
圖29是表示本發(fā)明的寡核苷酸的自聚體形成方法的第3例的第2實施方式的原理的示意圖，(c)表示靶基因和擴增用探針的雜交，(d)表示DNA合成。
圖30是表示本發(fā)明的寡核苷酸的自聚體形成方法的第3例的第2實施方式的原理的示意圖，(e)表示合成的DNA和擴增用探針的雜交，(f)表示DNA的合成。
圖31是表示本發(fā)明的寡核苷酸的自聚體形成方法的第3例的第2實施方式的原理的示意圖，(g)表示合成探針，(h)表示通過核酸分解酶的分解。
圖32是表示本發(fā)明的寡核苷酸的自聚體形成方法的第3例的第2實施方式的原理的示意圖，(i)表示通過核酸分解酶分解后的合成探針，(i)表示合成探針作為交聯(lián)探針的使用，(k)表示合成探針作為HCP的使用。
圖33是表示本發(fā)明的寡核苷酸的自聚體形成方法的第3例的第2實施方式的原理的示意圖，(l)表示分解的合成探針和未反應(yīng)探針的雜交，(m)表示通過核酸分解酶的處理。
圖34是表示本發(fā)明的寡核苷酸的自聚體形成方法的第4例的實施方式的原理的示意圖，(a)表示靶基因，(b)表示甲基化的嵌合型擴增用探針。
圖35是表示本發(fā)明的寡核苷酸的自聚體形成方法的第4例的實施方式的原理的示意圖，(c)表示靶基因和甲基化的嵌合型擴增用探針的雜交，(d)表示通過RNase H的處理。
圖36是表示本發(fā)明的寡核苷酸的自聚體形成方法的第4例的實施方式的原理的示意圖，(e)表示利用鏈置換型酶的DNA合成，(f)表示合成DNA，(g)表示未反應(yīng)的探針。
圖37是表示本發(fā)明的寡核苷酸的自聚體形成方法的第4例的實施方式的原理的示意圖，(h)表示合成探針，(i)表示通過核酸分解酶的分解。
圖38是表示本發(fā)明的寡核苷酸的自聚體形成方法的第4例的實施方式的原理的示意圖，(i)表示通過核酸分解酶分解后的合成探針，(k)表示合成探針作為交聯(lián)探針的使用，(l)表示合成探針作為HCP的使用。
圖39是表示本發(fā)明的寡核苷酸的自聚體形成方法的第4例的實施方式的原理的示意圖，(m)和(n)表示分解的合成探針和未反應(yīng)探針的雜交，(o)表示通過核酸分解酶的處理。
圖40是表示本發(fā)明的寡核苷酸的自聚體形成方法的第5例的實施方式的原理的示意圖，(a)表示靶基因，(b)表示嵌合型擴增用探針。
圖41是表示本發(fā)明的寡核苷酸的自聚體形成方法的第5例的實施方式的原理的示意圖，(c)表示靶基因和嵌合型擴增用探針的雜交，(d)表示通過RNase H的處理。
圖42是表示本發(fā)明的寡核苷酸的自聚體形成方法的第5例的實施方式的原理的示意圖，(e)表示利用鏈置換型酶的DNA合成，(f)表示合成探針，(g)表示未反應(yīng)的探針。
圖43是表示本發(fā)明的寡核苷酸的自聚體形成方法的第5例的實施方式的原理的示意圖，(h)表示合成探針，(i)表示通過核酸分解酶的分解。
圖44是表示本發(fā)明的寡核苷酸的自聚體形成方法的第5例的實施方式的原理的示意圖，(j)表示通過核酸分解酶分解后的合成探針，(k)表示合成探針作為交聯(lián)探針的使用，(l)表示合成探針作為HCP的使用。
圖45是表示本發(fā)明的寡核苷酸的自聚體形成方法的第5例的實施方式的原理的示意圖，(m)和(n)表示分解的合成探針和未反應(yīng)探針的雜交，(o)表示通過核酸分解酶的處理。
圖46是表示實施例1～16結(jié)果的照片。
圖47是表示實施例17和比較例1的變性PAGE電泳法的結(jié)果的照片。
圖48是表示實施例17和比較例1的瓊脂糖凝膠電泳法的結(jié)果的照片。
圖49是表示實施例18和比較例2的PAGE電泳法的結(jié)果的照片。
圖50是表示實施例18的瓊脂糖凝膠電泳法的結(jié)果的照片。
圖51是表示實施例19和比較例3的PAGE電泳法的結(jié)果的照片。
圖52是表示實施例19的利用熒光顯微鏡的結(jié)果的照片。
圖53是表示比較例4的利用熒光顯微鏡的結(jié)果的照片。
圖54是表示比較例5的利用熒光顯微鏡的結(jié)果的照片。
具體實施例方式
以下根據(jù)附圖對本發(fā)明的實施方式進行說明，但是這些實施方式只是舉出的例子，只要不脫離本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思，可以進行各種變形。
本發(fā)明是利用以基因擴增方法合成的寡核苷酸，在等溫并且不存在酶的條件下，通過自聚反應(yīng)而形成雙鏈自聚體的發(fā)明。
使用的探針的數(shù)目，沒有特殊限制，可以使用102～1015個范圍。反應(yīng)緩沖液的組成、濃度沒有特殊限制，可以適宜地使用核酸擴增重常用的普通的緩沖液。pH也可以為常用的范圍，可以優(yōu)選使用pH7.0～pH9.0的范圍。反應(yīng)溫度為40～90℃，優(yōu)選為55～70℃。這些條件沒有特殊限制。
構(gòu)成探針的核酸，通常由DNA或RNA構(gòu)成，但是也可以是核酸類似體。作為核酸類似體，例如可以舉出肽核酸(PNA，WO 92/20702)或LockedNucleic Acid(LNA，Koshkin AA et al.Tetrahedron 1998.54，3607-3630.，Koshkin AA et al.，J.Am.Chem.Soc.1998.120，13252-13253.，WahlestedtC et al.，PNAS.2000.97，5633-5638)。此外，探針通常由同類核酸構(gòu)成，但是，例如DNA探針和RNA探針也可以成為一對。即，探針的核酸種類，可以選自DNA、RNA或和核酸類似體(例如PNA或LNA等)。此外，在一個探針內(nèi)的核酸組成，沒有必要由一種、例如僅由DNA構(gòu)成，根據(jù)需要，例如也可以使用由DNA和RNA構(gòu)成的探針(嵌合型探針)，本發(fā)明就包括這樣探針。
另外，探針的各區(qū)的長度，以堿基數(shù)計，至少為5個堿基，優(yōu)選至少為8個堿基，更優(yōu)選為10個堿基～100個堿基，特別優(yōu)選為10～40個堿基。
所述基因擴增方法，沒有特殊限制，例如作為自聚反應(yīng)的寡核苷酸可以使用通過PCR法、SDA法、ICAN法、NASBA法、TMA法、3SR法、LCR法等現(xiàn)有的基因擴增方法擴增的雙鏈或單鏈DNA和/或RNA。
圖1是表示利用PALSAR法的一對HCP(1號探針和2號探針)的自聚體形成方法的一例示意圖。在該圖中，1號探針具有X1區(qū)、X2區(qū)和X3區(qū)，2號探針具有X’1區(qū)、X’2區(qū)和X’3區(qū)[圖1(a)]。該1號探針和2號探針的構(gòu)成為，在使兩者進行雜交時，僅是X1區(qū)和X’1區(qū)結(jié)合、X2區(qū)和X’2區(qū)結(jié)合、X3區(qū)和X’3區(qū)結(jié)合，以3個結(jié)合模式，一對探針進行相互不同地雜交。[圖1(b)]。
以3個結(jié)合模式進行相互不同地雜交的多對HCP，如圖1(c)中示意的一個例子那樣，根據(jù)PALSAR法的原理，通過寡核苷酸的自聚，可以形成雙鏈的自聚體。
圖1對由3處互補堿基序列區(qū)構(gòu)成的HCP進行了說明，即使對于使用具有4處以上的互補堿基序列區(qū)的HCP時，也可以同樣地形成自聚體。
在利用所述HCP的自聚體的形成方法中，可以使用具有不同的互補區(qū)的2種以上的HCP。圖2表示由通過3處互補區(qū)構(gòu)成的2種的一對HCP(3號和4號探針、5號和6號探針)形成的自聚體的一例檢出方法。在該圖中，3號探針具有X區(qū)、α區(qū)和Z區(qū)，4號探針具有X’區(qū)、α’區(qū)和Z’區(qū)[圖2(a)]。另外，5號探針具有X區(qū)、β區(qū)和Z區(qū)，6號探針具有X’區(qū)、β’區(qū)和Z’區(qū)[圖2(b)]。如圖2所示，2組HCP為1個互補區(qū)不同的HCP。各探針的構(gòu)成為，在使兩者進行雜交時，能夠使X區(qū)僅和X’區(qū)結(jié)合、Z區(qū)僅和X’區(qū)結(jié)合、α區(qū)僅和α’區(qū)結(jié)合、β區(qū)僅和β’區(qū)結(jié)合。2組的HCP，各自α區(qū)和α’區(qū)或β區(qū)和β’區(qū)雜交，能夠形成二聚體，根據(jù)PALSAR法的原理，由這些二聚體[圖2(c)]通過寡核苷酸的自聚，可以形成雙鏈的自聚體[圖2(d)]。
圖3是表示利用PALSAR法的二聚體形成用探針和交聯(lián)用探針的自聚體形成方法的一例示意圖。如圖3所示，第1系統(tǒng)的一對二聚體形成用探針，是將一對寡核苷酸分為3個區(qū)，在使中央?yún)^(qū)為互補區(qū)的同時，3’側(cè)區(qū)和5’側(cè)區(qū)為不互補的堿基序列，從而形成二聚體探針[圖3(a)]。第2系統(tǒng)的一對交聯(lián)探針，是將一對寡核苷酸分為3’側(cè)區(qū)和5’側(cè)區(qū)的2個區(qū)，使各區(qū)為不互補的堿基序列，3’側(cè)區(qū)和二聚體形成用探針的3’側(cè)區(qū)、5’側(cè)區(qū)二聚體形成用探針的5’側(cè)區(qū)分別為互補的堿基序列[圖3(b)]。相對于第1系統(tǒng)的二聚體探針，通過使第2系統(tǒng)的交聯(lián)探針交聯(lián)地雜交，寡核苷酸自聚形成雙鏈自聚體[圖3(c)]。
圖4是表示利用PALSAR法的二聚體形成用探針和交聯(lián)用探針的自聚體形成方法的另一例示意圖。作為二聚體形成用探針和交聯(lián)探針的5’側(cè)區(qū)以及3’側(cè)區(qū)的互補區(qū)的組合，也可以如圖4那樣變更圖3的組合。
在圖3和圖4中，對利用由第1系統(tǒng)構(gòu)成的二聚體形成用探針和第2系統(tǒng)構(gòu)成的交聯(lián)探針的自聚體的形成方法進行了說明，如圖5和圖6所示，利用由第1、3、……(2n-1)的系統(tǒng)構(gòu)成的二聚體形成用探針和由第2、4、……2n的系統(tǒng)構(gòu)成的交聯(lián)探針，可以形成自聚體。圖5是表示n≥2時的自聚體的形成方法的一例的圖，圖6是表示n≥2時的自聚體的形成方法的另一例的圖。
在利用所述二聚體形成用探針和交聯(lián)探針的自聚體的形成方法中，所謂不互補的堿基序列，只要是不相互雜交的堿基序列，都可以，包括相同的堿基序列也包括不互補的堿基序列。
所述二聚體形成用探針的構(gòu)成，各系統(tǒng)的二聚體形成用探針，可以是一種，在一個系統(tǒng)中可以包括中央?yún)^(qū)不同的多種二聚體形成用探針，沒有特殊限制。另外，也可以同時組合2組以上的不完全互補的二聚體形成用探針和交聯(lián)探針。
在利用所述二聚體形成用探針和交聯(lián)探針的自聚體的形成方法中，由二聚體形成用探針形成二聚體的時期，可以同時使二聚體形成前的二聚體形成用探針和交聯(lián)探針同時反應(yīng)，也可以預(yù)先通過二聚體形成用探針形成二聚體后，再與交聯(lián)探針反應(yīng)，沒有特殊限制，但是更優(yōu)選預(yù)先形成二聚體后再與交聯(lián)探針反應(yīng)而形成自聚體。
通過本發(fā)明的寡核苷酸形成自聚體的方法，為在所述自聚體的形成方法中，作為探針至少使用一個通過基因擴增反應(yīng)而合成的寡核苷酸的方法。
通過本發(fā)明的基因擴增方法合成的寡核苷酸的自聚體形成方法的第1例，是在所述PALSAR法中，作為探針使用耐熱性核酸合成酶或鏈置換型合成酶等現(xiàn)有基因擴增法擴增的基因的例子。以下對作為交聯(lián)探針使用擴增后的基因的情況進行闡述。
圖7是表示通過所述寡核苷酸形成自聚體的方法的第1例的第1實施方式的原理示意圖。如圖7所示，利用通過現(xiàn)有的基因擴增法擴增的互補的一對基因片段，可以形成自聚體。首先，如圖7(a)所示，將互補的基因片段分為四個區(qū)(A～D區(qū)和A’～D’區(qū))。進而，選擇一對寡核苷酸的5’側(cè)區(qū)的2區(qū)(A區(qū)和B區(qū)、C’區(qū)和D’區(qū))，將選擇的2區(qū)中的位于5’側(cè)區(qū)的區(qū)(A區(qū)、D’區(qū))作為交聯(lián)探針的5’側(cè)區(qū)，將位于3’側(cè)區(qū)的區(qū)(B區(qū)、C’區(qū))作為交聯(lián)探針的3’側(cè)區(qū)，如圖7(b)所示制作與其對應(yīng)的一對二聚體形成用探針。在基因片段中，分別存在在3’側(cè)區(qū)與二聚體形成用探針的各區(qū)不雜交的多余序列(C區(qū)和D區(qū)、A’區(qū)和B’區(qū))，一對基因片段，在由一對二聚體形成用探針構(gòu)成的二聚體探針上交聯(lián)地雜交，根據(jù)PALSAR法的原理，寡核苷酸自聚形成雙鏈的自聚體[圖7(c)]。
圖8是表示通過所述寡核苷酸形成自聚體的方法的第1例的第2實施方式的原理示意圖。如圖8(a)和(b)所示，對于一對基因片段，作為一對交聯(lián)探針的5’側(cè)區(qū)和3’側(cè)區(qū)可以使用各3’側(cè)的2區(qū)(C區(qū)和D區(qū)、A’區(qū)和B’區(qū))。此時，在基因片段中，分別存在在5’側(cè)區(qū)與二聚體形成用探針的各區(qū)不雜交的多余序列(A區(qū)和B區(qū)、C’區(qū)和D’區(qū))。該一對基因片段，在由一對二聚體形成用探針構(gòu)成的二聚體探針上交聯(lián)地雜交，根據(jù)PALSAR法的原理，寡核苷酸自聚形成雙鏈的自聚體[圖8(c)]。
圖9是表示通過所述寡核苷酸形成自聚體的方法的第1例的第3實施方式的原理示意圖。如圖9(a)和(b)所示，對于一對基因片段，作為一對交聯(lián)探針的5’側(cè)區(qū)和3’側(cè)區(qū)可以使用不相鄰的2區(qū)(A區(qū)和B區(qū)、C’區(qū)和D’區(qū))。此時，如圖9(c)所示，一對基因片段，在由一對二聚體形成用探針構(gòu)成的二聚體探針上交聯(lián)地雜交，根據(jù)PALSAR法的原理，寡核苷酸自聚形成雙鏈的自聚體。
此外，將通過現(xiàn)有的基因擴增法擴增的一對基因片段分為5個區(qū)以上，其中的每2區(qū)也可以作為與二聚體探針交聯(lián)的2區(qū)使用。
圖10是表示通過所述寡核苷酸形成自聚體的方法的第1例的第4實施方式的原理示意圖。如圖10(a)和(b)所示，將互補的基因片段分為5個區(qū)(A～E區(qū)和A’～E’區(qū))。進而，選擇一對寡核苷酸的5’側(cè)的2區(qū)(A區(qū)和B區(qū)、C’區(qū)和D’區(qū))，將選擇的2區(qū)中的位于5’側(cè)的區(qū)(A區(qū)、D’區(qū))作為交聯(lián)探針的5’側(cè)區(qū)，將位于3’側(cè)的區(qū)(B區(qū)、C’區(qū))作為交聯(lián)探針的3’側(cè)區(qū)，如圖10(b)所示制作與其對應(yīng)的一對二聚體形成用探針。在基因片段中，分別存在在3’側(cè)區(qū)與二聚體形成用探針的各區(qū)不雜交的多余序列(E、C區(qū)和D區(qū)、A’、B’和E’區(qū))，一對基因片段，在由一對二聚體形成用探針構(gòu)成的二聚體探針上交聯(lián)地雜交，根據(jù)PALSAR法的原理，寡核苷酸自聚形成雙鏈的自聚體[圖10(c)]。
如上所述，作為PALSAR法的交聯(lián)探針可以使用互補的一對基因片段。在基因片段的各區(qū)中，將哪2區(qū)作為與二聚體探針雜交的區(qū)，沒有特殊限制，2區(qū)可以相鄰也可以不相鄰。另外，也未必都存在于基因片段的末端。
在本發(fā)明的寡核苷酸的自聚體形成方法中，優(yōu)選預(yù)先利用酶等將與二聚體形成用探針不互補的區(qū)剪切，將該剪切的一對基因片段用作交聯(lián)探針，再根據(jù)PALSAR法的原理使通過現(xiàn)有的基因擴增反應(yīng)擴增的基因片段形成自聚體。
在圖11～圖13中示例了剪切的基因片段的自聚體形成方法。圖11和圖12分別表示剪切圖7和圖10的一對基因片段時的自聚體形成方法。圖13是表示將二聚體形成用探針和交聯(lián)探針的互補區(qū)進行如圖4所示的組合時，剪切一對基因片段時的自聚體形成方法。通過剪切在二聚體探針上沒有交聯(lián)的多余區(qū)，可以提高自聚體的形成效率。
基因片段的剪切方法，沒有特殊限制，優(yōu)選使用限制酶或RNase H等的酶。
在本發(fā)明的寡核苷酸的自聚體形成方法中，由二聚體形成用探針形成二聚體的時期，可以同時使二聚體形成前的二聚體形成用探針和交聯(lián)探針同時反應(yīng)，也可以預(yù)先通過二聚體形成用探針形成二聚體探針后，再與基因片段反應(yīng)，沒有特殊限制，但更優(yōu)選預(yù)先形成二聚體探針后再形成自聚體。
本發(fā)明的寡核苷酸的自聚體形成方法，包括與由所述的二聚體形成用探針構(gòu)成的二聚體探針相同的二聚體探針，能夠與交聯(lián)探針交聯(lián)地雜交而形成自聚體的自聚體的形成方法。
本發(fā)明的寡核苷酸的自聚體形成方法中所用的一對基因片段，沒有必要兩條鏈都是通過基因擴增反應(yīng)擴增的基因片段，例如，如圖14所示，在作為交聯(lián)探針使用的一對基因片段中，使用了通過現(xiàn)有的基因擴增法擴增一方的基因片段[圖14(a)]，也可以使用另一方是預(yù)先制作的基因片段[圖14(c)]。通過使這些一對基因片段和與之對應(yīng)的一對二聚體形成用探針[圖14(b)]雜交，形成自聚體[圖14(d)]。所用的基因片段，如上所述，只要是含有分別與二聚體探針交聯(lián)的2區(qū)，就沒有特殊限制。在圖14(a)中，作為優(yōu)選的例子，示例出了由分別與二聚體探針交聯(lián)的A區(qū)和B區(qū)、以及與其都不雜交的Y區(qū)構(gòu)成的單鏈基因片段，Y區(qū)可以是任何序列，沒有特殊限制。如上所述，在含有多余標記的基因片段時，可以直接使用，但更優(yōu)選將該區(qū)剪切后形成自聚體。
在現(xiàn)有的基因擴增法中，由于利用過量的引物等的擴增用探針進行基因擴增，所以在擴增后的溶液中既存在擴增的基因片段也存在過剩的擴增用探針。在該過剩的擴增用探針存在下，容易產(chǎn)生自聚體形成的效率降低等問題。作為除去該擴增用探針提高自聚體形成效率的方法，優(yōu)選使用核酸外切酶(例如Exonuclease I或Exonuclease VII等)或由RNA構(gòu)成的擴增用探針和RNase H。在利用擴增用RNA探針和RNase H時，作為用作自聚體形成反應(yīng)的探針的靶基因，可優(yōu)選使用通過耐熱性DNA合成酶擴增的基因片段、通過鏈置換型DNA合成酶擴增的基因片段。作為耐熱性DNA合成酶，優(yōu)選使用KOD Dash(TOYOBO社制)等。在圖15和圖16中，示例了利用耐熱性DNA合成酶、擴增用RNA探針和RNase H的自聚體形成方法的示意圖。
如圖15(a)所示，若利用一對擴增用RNA探針進行DNA擴增時，由DNA(A’、B’區(qū)、C、D區(qū))和RNA(X區(qū)、Y區(qū))構(gòu)成的一對基因片段被擴增[圖15(a)和圖16(b)]。通過在該擴增后的溶液中添加RNase H使反應(yīng)，基因片段地RNA區(qū)部分和擴增用RNA探針被水解。如圖16(c)所示，通過將RNase H處理后的一對基因片段分為2區(qū)，形成由不互補的2區(qū)構(gòu)成的一對交聯(lián)探針。在RNase H處理后的一對基因片段上優(yōu)選構(gòu)成擴增用RNA探針，使不殘存互補的區(qū)，但是沒有特殊限制，含有互補的區(qū)也包括在本發(fā)明中。所述的一對交聯(lián)探針，在預(yù)先制作的與交聯(lián)探針對應(yīng)的二聚體探針[圖16(D)]上交聯(lián)地雜交，并形成自聚體[圖16(e)]。通過所述方法，除去擴增用探針，并且消除在二聚體探針上不交聯(lián)的多余序列，可以提高自聚體的形成效率。
通過本發(fā)明的基因擴增反應(yīng)合成的寡核苷酸的自聚體形成方法的第2例，是在所述PALSAR法中，作為探針使用通過耐熱性核酸連接酶連接的并且末端側(cè)堿基被甲基化的寡核苷酸(以下有的稱為甲基化探針)的例子。利用具有與靶基因互補的區(qū)的甲基化探針，預(yù)先剪切與靶基因互補的區(qū)，在靶基因存在下通過耐熱性連接酶使剪切的基因片段進行連接反應(yīng)。其特征在于，在連接反應(yīng)后，利用核酸外切酶分解作為自聚反應(yīng)的競爭物質(zhì)的未反應(yīng)的甲基化探針。在基因擴增反應(yīng)中所用的寡核苷酸的甲基化堿基如圖17所示。以下對將擴增后的基因用作二聚體形成用探針的一例進行闡述。
圖18～圖21是表示所述寡核苷酸的自聚體形成方法的第2例的實施方式的原理示意圖。如圖18所示，在利用第1系統(tǒng)的二聚體形成用探針和第2系統(tǒng)的交聯(lián)探針的自聚體形成方法中，如圖18(a)(b)所示，由靶基因[圖18(a)]制作在中央?yún)^(qū)具有與靶基因互補的區(qū)(α’區(qū)和β’區(qū)、α區(qū)和β區(qū))的二聚體形成用探針，將5’側(cè)末端和3’側(cè)末端的堿基進行甲基化，進而預(yù)先剪切與靶基因互補的中央?yún)^(qū)[圖18(b)]。如圖19(c)所示，剪切后的二聚體形成用探針，在于靶基因進行雜交后，如圖19(d)所示，通過耐熱性連接酶，連接二聚體形成用探針。通過熱循環(huán)控制器反復(fù)該系列反應(yīng)，從而增加被連接的二聚體形成用探針。之后，若加入核酸分解酶、例如Exonuclease VII等的核酸外切酶，若靶基因存在并且二聚體形成用探針被連接時，如圖20(e)所示，被連接的二聚體形成用探針的兩端堿基，由于被甲基化，所以不被分解，但是，若靶基因不存在并且二聚體形成用探針在以被剪切的狀態(tài)存在時，沒有連接的二聚體形成用探針[圖20(f)]，由于被剪切的部分沒有被甲基化，所以被完全分解，也不能形成自聚體[圖21(h)]。被連接的二聚體形成用探針，通過加入另外準備的交聯(lián)探針，能夠形成自聚體[圖21(g)]。所以，通過確認自聚體的形成，可以確認自聚體的存在。
通過本發(fā)明的基因擴增反應(yīng)合成的寡核苷酸的自聚體形成方法的第3例，是在所述PALSAR法中，作為探針使用末端側(cè)堿基被甲基化的擴增用探針和利用耐熱性核酸合成酶擴增的寡核苷酸的例子。將至少一方的擴增用探針的3’末端側(cè)堿基進行甲基化，5’末端側(cè)堿基進行磷酸化，作為耐熱性DNA合成酶的基因擴增用探針使用。其特征在于，在基因擴增后，利用核酸外切酶分解作為自聚反應(yīng)的競爭物質(zhì)的過剩存在的擴增用探針。以下對將擴增的基因(以下也有的稱為合成探針)用作交聯(lián)探針或HCP的情況進行說明。
圖22～圖27是表示所述寡核苷酸的自聚體形成方法的第3例的第1實施方式的原理示意圖。準備與圖22(a)所示的靶基因的實線部分互補并且3’末端側(cè)堿基被甲基化的探針[圖22(b)]。然后，在靶基因上使甲基化的擴增用探針進行退火[圖23(c)]，通過耐熱性DNA合成酶合成DNA[圖23(d)]。通過熱循環(huán)控制器反復(fù)該系列反應(yīng)[圖24(e)，(f)]，增加被擴增的探針[圖25(g)]，通過添加核酸分解酶例如T7 Gene 6 Exonuclease等核酸外切酶，如圖25(h)所示，擴增的合成探針，從5’側(cè)到被甲基化的堿基之前被分解。分解后的合成探針[圖26(i)]，可以用作一對交聯(lián)探針[圖26(j]或者兩種一對HCP的一方[圖26(k)]，通過添加另外準備的二聚體形成用探針或另一方的HCP可以形成自聚體。
另外，如圖27(l)、(m)所示，分解后的合成探針，進而與未反應(yīng)的探針雜交后，通過酶處理，可以使從5’側(cè)到被甲基化的堿基之前更加完全地分解[圖27(n)]。
圖28～圖33是表示所述寡核苷酸的自聚體形成方法的第3例的第2實施方式的原理示意圖。圖28是表示利用被甲基化的擴增用探針的通過耐熱性DNA合成酶進行基因擴增和自聚體形成的圖。準備與圖28(a)所示的靶基因的實線部分互補并且只是3’末端側(cè)堿基被甲基化的探針[圖28(b)]。然后，在靶基因上使甲基化的擴增用探針進行退火[圖29(c)]，通過耐熱性DNA合成酶合成DNA[圖29(d)]。通過熱循環(huán)控制器反復(fù)該系列反應(yīng)[圖30(e)，(f)]，增加被擴增的探針[圖31(g)]，通過添加核酸分解酶例如T7 Gene 6 Exonuclease等核酸外切酶，如圖31(h)所示，擴增的合成探針，從5’側(cè)到被甲基化的堿基之前被分解。分解后的合成探針[圖32(i)]，可以用作一對交聯(lián)探針的一方[圖32(j]或者一對HCP的一方[圖32(k)]，通過添加另外準備的另一方交聯(lián)探針和一對二聚體形成用探針或另一方的HCP可以形成自聚體。
另外，如圖33(1)所示，分解后的合成探針，進而與未反應(yīng)的探針雜交后，通過酶處理，可以使從未反應(yīng)的探針更加完全地分解[圖33(m)]。
通過本發(fā)明的基因擴增反應(yīng)合成的寡核苷酸的自聚體形成方法的第4例，是在所述PALSAR法中，作為擴增用探針使用由DNA和RNA構(gòu)成的嵌合型探針并且該探針的與RNA相鄰的DNA的3’末端側(cè)堿基被甲基化的探針，作為探針使用通過鏈置換型DNA合成酶擴增的基因(合成探針)的例子。將至少一方的擴增用探針的3’側(cè)堿基設(shè)為RNA、5’側(cè)堿基設(shè)為DNA并且將3’末端側(cè)的堿基進行甲基化，作為鏈置換型DNA合成酶的基因擴增用的探針使用，其特征在于，基因擴增后，利用核酸外切酶分解作為自聚反應(yīng)的競爭物質(zhì)而過剩存在的擴增用探針。以下對將擴增后的基因用作交聯(lián)探針或HCP的情況進行說明。
圖34～圖39是表示所述寡核苷酸的自聚體形成方法的第4例的實施方式的一例原理示意圖。準備與靶基因[圖34(a)]的實線部分互補、由DNA和RNA構(gòu)成的并且僅有與RNA相鄰的3’末端側(cè)堿基被甲基化的擴增用探針[圖34(b)]。然后，在靶基因上使甲基化的擴增用探針進行退火[圖35(c)]，通過RNase H剪切RNA部分[圖35(d)]，通過鏈置換型DNA合成酶合成DNA[圖36(e)]。通過等溫反復(fù)該系列反應(yīng)，增加被擴增的探針[圖36(f)，圖36(h)]，通過添加核酸分解酶例如T7 Gene 6 Exonuclease等核酸外切酶，如圖37(i)所示，擴增的合成探針，從5’側(cè)到被甲基化的堿基之前被分解。分解后的合成探針[圖38(j)]，可以用作一對交聯(lián)探針[圖38(k)]或者兩種一對HCP的一方[圖38(l)]，通過添加另外準備的一對二聚體形成用探針或另一方的HCP可以形成自聚體。
另外，如圖39(m)、(n)所示，分解后的合成探針，進而與未反應(yīng)的探針雜交后，通過酶處理，可以使未反應(yīng)探針更加完全地分解[圖39(o)]。
通過本發(fā)明的基因擴增反應(yīng)合成的寡核苷酸的自聚體形成方法的第5例，是在所述PALSAR法中，作為擴增用探針使用由DNA和RNA構(gòu)成的嵌合型探針，作為探針使用通過鏈置換型DNA合成酶擴增的基因的例子。將至少一方的擴增用探針的3’側(cè)堿基設(shè)為RNA、5’側(cè)堿基設(shè)為DNA，作為鏈置換型DNA合成酶的基因擴增用的探針使用。其特征在于，基因擴增后，利用核酸外切酶分解作為自聚反應(yīng)的競爭物質(zhì)而過剩存在的擴增用探針。以下對將擴增后的基因(合成探針)用作交聯(lián)探針或HCP的情況進行說明。
圖40～圖45是表示所述寡核苷酸的自聚體形成方法的第5例的實施方式的一例原理示意圖。準備與圖40(a)所示的靶基因的實線部分互補、由DNA和RNA構(gòu)成的擴增用探針[圖40(b)]。然后，在靶基因上使甲基化的擴增用探針進行退火[圖41(c)]，通過RNase H剪切RNA部分[圖41(d)]，通過鏈置換型DNA合成酶合成DNA[圖42(e)]。通過等溫反復(fù)該系列反應(yīng)，增加被擴增的合成探針[圖42(f)，圖43(h)]，通過添加核酸分解酶，例如T7 Gene 6 Exonuclease等核酸外切酶，如圖43(i)所示，擴增的合成探針，從5’側(cè)到RNA部分被分解。分解后的合成探針[圖44(j)]，可以用作一對交聯(lián)探針[圖44(k)]或者兩種一對HCP的一方[圖44(l)]，通過添加另外準備的一對二聚體形成用探針或另一方的HCP可以形成自聚體。
另外，如圖45(m)、(n)所示，分解后的合成探針，進而與未反應(yīng)的探針雜交后，通過酶處理，可以使未反應(yīng)探針更加完全地分解[圖45(o)]。
通過所述方法形成的自聚體，通過一般的瓊脂糖凝膠電泳法等能夠簡單地確認。
此外，根據(jù)在本發(fā)明中形成的自聚體的堿基的疊重構(gòu)成的有規(guī)則的高級結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)260nm處紫外部的所謂吸收帶強度減弱“減色性”的淡色效果，也可以確認自聚體的狀態(tài)。
進而，添加具有與核酸結(jié)合性質(zhì)的熒光物質(zhì)，從該熒光物質(zhì)的變化也可以確認自聚體的狀態(tài)。例如，在寡核苷酸的兩條鏈上插入并添加發(fā)出熒光的色素，利用SPHAIDE社的I-CORETM(Smart CyclerTM)等，通過觀察熒光的發(fā)光狀態(tài)，也可以檢出自聚體。
如上所述，本發(fā)明的寡核苷酸的自聚體的形成方法，由于僅在靶基因存在時才形成自聚體，所以通過檢出形成的自聚體，也可以檢出靶基因。
實施例以下根據(jù)實施例對本發(fā)明進行說明，但本發(fā)明不受這些實施例限制。
(實施例1～16)以下表示在實施例1～16中所用的寡核苷酸探針。
交聯(lián)探針-1[下劃線，多余的序列(標記)]5’-TTGGATCAACCCGCTCAATG CCTGGAGATTTGGGCGTGCC-CCCGCAAGACTGCTAGCCGAGTAGTGTTGGGTCGCGAAAG-3’[2]交聯(lián)探針-2[下劃線，多余的序列(標記)]3’-AACCTAGTTGGGCGATTACGGACCTCTAAACCCGCACGG-GGGCGTTCTGACGATCGGCT CATCACAACCCAGCGCTTTC-5’[3]交聯(lián)探針-35’-TTGGATCAACCCGCTCAATGCCTGGAGATTTGGGCGTGCC-3’ 交聯(lián)探針-43’-GGGCGTTCTGACGATCGGCTCATCACAACCCAGCGCTTTC-5’[5]二聚體形成用探針-15’-GTAGTGTTGGGTCGCGAAAG-GCTCACAGTTAAGCCGTGAG-CCCGCAAGACTGCTAGCCGA-3’[6]二聚體形成用探針-25’-CATTGAGCGGGTTGATCCAA-CTCACGGCTTAACTGTGAGC-GGCACGCCCAAATCTCCAGG-3’(實施例1～14)(1)目的作為交聯(lián)探針在使用具有與通過現(xiàn)有的基因擴增法擴增為預(yù)想的二聚體探針不雜交的多余序列(標記)的基因片段時，探討能否與二聚體探針形成自聚體。
(2)材料(a)作為交聯(lián)探針，制作假設(shè)通過現(xiàn)有的基因擴增法擴增的具有互補序列的80堿基的合成寡核苷酸2條鏈(交聯(lián)探針-1和交聯(lián)探針-2)、以及與它們對應(yīng)的二聚體形成用探針(二聚體形成用探針-1和二聚體形成用探針-2)。各探針分別調(diào)配為100pmol/μL。
(b)實施例1～7，作為緩沖液使用2M-CaCl2溶液。實施例8～14，作為緩沖液使用20×SSC溶液(3M-NaCl、0.3M-C6H5Na3·2H2O，在實施8～14中，20×SSC溶液，作為3M-NaCl處理)。
(3)方法(a)反應(yīng)液的調(diào)配加入交聯(lián)探針-1、交聯(lián)探針-2、二聚體形成用探針-1和二聚體形成探針各0.5μL，添加緩沖液(2M-CaCl2溶液或3M-NaCl溶液)和滅菌再蒸餾水，調(diào)配成共計20μL的反應(yīng)液。添加緩沖液和滅菌再蒸餾水，使反應(yīng)液中的緩沖液的濃度分別為1.2M(實施例1、8)、1.0M(實施例2、9)、0.8M(實施例3、10)、0.6M(實施例4、11)、0.4M(實施例5、12)、0.2M(實施例6、13)、0.5M(實施例7、14)。
(b)自聚體的形成反應(yīng)利用熱循環(huán)控制器(Parkinelmer社制)，首先使上述各反應(yīng)液反應(yīng)94℃/30秒，之后通過70℃/1小時反應(yīng)，進行自聚體的形成反應(yīng)。
(c)通過瓊脂糖凝膠電泳法進行自聚體的確認在自聚體形成反應(yīng)后的反應(yīng)液8μL中添加2μL的loading buffer，通過2％Nusieve 3∶1 agarose gel(Bio Whittaker Molecular Applications社制)進行100V、30分鐘的電泳。作為分子大小標記，使用DNA Molwxule WeightMarker XV(BERINGA·MANNHEIM社制)。
(實施例15和實施例16)(1)目的作為交聯(lián)探針在使用通過現(xiàn)有的基因擴增法擴增并且通過酶等消除與二聚體探針不雜交的多余序列(標記)的基因片段時，根據(jù)PALSAR法，探討能否形成自聚體。
(2)材料(a)作為交聯(lián)探針，合成從實施例1～14中所用的合成寡核苷酸上除去標記的并且不互補的一對寡核苷酸(交聯(lián)探針-3和交聯(lián)探針-4)，并且作為交聯(lián)探針使用。作為二聚體形成用探針，利用實施例1～14中所用的二聚體形成用探針1和二聚體形成用探針2。各探針分別調(diào)配為100pmol/μL。
(b)緩沖液，在實施例15中使用2M-CaCl2溶液，在實施例16中使用3M-NaCl溶液。
(3)方法(a)反應(yīng)液的調(diào)配加入交聯(lián)探針-3、交聯(lián)探針-4、二聚體形成用探針-1和二聚體形成探針各0.5μL，添加緩沖液和滅菌再蒸餾水，調(diào)配成共計20μL的反應(yīng)液。添加緩沖液和滅菌再蒸餾水，使反應(yīng)液中的緩沖液的濃度為1.2M。
(b)自聚體形成反應(yīng)通過與實施例1～14相同的操作和條件，進行自聚體形成反應(yīng)。
(c)通過瓊脂糖凝膠電泳法進行自聚體的確認通過與實施例1～14相同的操作和條件，進行自聚體形成的確認。
(4)結(jié)果實施例1～16的結(jié)果表示在圖46中。在具有多余序列(標記)的交聯(lián)探針時，若比較觀察實施例1～7的CaCl2溶液中的反應(yīng)(泳道1～7)和實施例8～14的20×SSC溶液中的反應(yīng)(泳道9～15)，發(fā)現(xiàn)僅在CaCl2溶液中形成自聚體。自聚體形成尤其顯著的CaCl2溶液濃度，可知為0.8M(泳道3)附近。在消除多余序列(標記)的實施例15(泳道8)和實施例16(泳道16)中，均觀察到了自聚體的形成，不依賴于緩沖液。由這些結(jié)果可以確認，消除多余序列(標記)的交聯(lián)探針，自聚體形成的效率良好，為互補的序列，即使在具有多余序列(標記)的交聯(lián)探針中，也能夠與二聚體探針形成自聚體。由此，顯示可以應(yīng)用于將現(xiàn)有的基因擴增法和自聚體形成反應(yīng)組合的系統(tǒng)中。
(實施例17和比較例1)以下，表示在實施例17和比較例1中所用的寡核苷酸探針。其中□表示被甲基化的堿基。
靶基因-A(下劃線部分為互補區(qū))5’-AACATGAAAA ATGATTATGGCTCAGGTACTGCTATCCACCCT CAAACAGGTGAATTATTAGCACTTGTAAGCACACCTTC-3’[8]靶基因-B(下劃線部分為互補區(qū))5’-GAAGGTGTGC TTACAAGTGC TAATAATTCACCTGTTTGAGGGT GGATA GCAGTACCTG AGCCATA ATCAT TTTTCATGTT-3’[9]甲基化探針-1(下劃線部分為中央?yún)^(qū)) T-3’[10]甲基化探針-2(下劃線部分為中央?yún)^(qū))5’(磷酸化)-ATCCACCCT CAAACAGGTG-GATTGGTACT [11]甲基化探針-3(下劃線部分為中央?yún)^(qū)) 3’[12]甲基化探針-4(下劃線部分為中央?yún)^(qū))
5’(磷酸化)-GCAGTACCTG AGCCATAATC-CTAGAACGGA [13]交聯(lián)探針-55’-CTATACACGCAGAAAGCGTC-CGAAGTACGA TCCGTTCTAG-3’[14]交聯(lián)探針-65’-GTATCCGGTT AAGTCAGCAC-CCTATCTCGC AGTACCATTC-3’(1)目的通過對依賴于與靶基因的雜交并被連接的二聚體形成用探針、和利用該連接的二聚體形成用探針和交聯(lián)探針的自聚體的形成確認靶基因。
(2)材料(a)作為靶基因，利用源于MRSA的PBPgene的合成寡核苷酸的靶基因-A和靶基因-B。靶基因分別調(diào)配為1pmol/μL。
(b)制作中央?yún)^(qū)具有與靶基因-A和B互補的區(qū)的一對二聚體形成用探針和對應(yīng)的一對交聯(lián)探針(交聯(lián)探針-5，6)，分別將上述一對二聚體形成用探針的5’末端和3’末端進行甲基化，并剪切各個中央?yún)^(qū)，制作將剪切部位的5’末端磷酸化的探針(甲基化探針1～4)。探針分別調(diào)配至50pmol/μL。
(c)作為緩沖液，使用20×SSC(3M-NaCl，0.3M-C6H5O7Na3·2H2O，pH7.0)。
(3)方法(a)反應(yīng)液的調(diào)配在0.2mL試管中分別加入靶基因A和B各1μL、甲基化探針1～4各1μL、耐熱性連接酶(Tsc-Ligase、日本ROSHU社制)1μL、添加連接酶的10×incubation buffer2μL，用滅菌蒸餾水調(diào)制為20μL的反應(yīng)液(實施例37)。另外，作為對照，相對于上述反應(yīng)液，也制作不加靶基因的反應(yīng)液(比較例1)。
(b)甲基化探針通過耐熱性連接酶的基因擴增方法利用熱循環(huán)控制器(Parkinelmer社制)，使上述各反應(yīng)液反應(yīng)95℃3分鐘后，進行40個循環(huán)“94℃15秒鐘→63℃4分鐘”，通過連接反應(yīng)進行二聚體形成用探針的擴增。然后，在99℃反應(yīng)10分鐘使連接酶失活后，進行冰冷，制作單鏈的二聚體形成用探針。
(c)在所述反應(yīng)后的反應(yīng)液中，添加1μL的核酸外切酶(ExonucleaseVII、usb社制)，在37℃使反應(yīng)60分鐘。作為對照，不添加核酸外切酶，對于添加滅菌蒸餾水的情況都相同。利用6％改性聚丙烯酰胺97M Urea)對反應(yīng)后的反應(yīng)液進行變性PAGE電泳。
(d)自聚體的形成方法利用熱循環(huán)控制器(Parkinelmer社制)，在所述反應(yīng)后的各反應(yīng)液中加入20×SSC(最終濃度10×SSC)，在94℃使反應(yīng)30秒后，通過70℃/1小時的反應(yīng)，進行自聚體形成反應(yīng)。
(e)通過瓊脂糖凝膠電泳法確認自聚體在自聚體形成反應(yīng)后的反應(yīng)液8μL中添加2μL的loading buffer，通過2％ Nusieve 3∶1 agarose gel(Bio Whittaker Molecular Applications社制)進行100V、30分鐘的電泳。作為分子大小標記，使用DNA標記(λHindIII digest)。
(4)結(jié)果實施例17和比較例1的變性PAGE電泳法的結(jié)果如圖47所示。如圖47的泳道1(實施例17，未用酶處理)所示，在靶基因存在時，剪切的二聚體形成用探針被連接，箭頭(a)的位置的泳帶被檢出。如圖47的泳道3(實施例17，酶處理)所示，由于連接的二聚體形成用探針即使進行核酸外切酶處理，也不分解，所以在與泳道1相同的(a)的位置上泳帶被檢出。另一方面，如圖47的泳道2(比較例1，未用酶處理)和泳道4(比較例1，酶處理)所示，在靶基因不存在時，剪切的二聚體形成用探針不被連接，在(a)的位置上沒有檢出泳帶。此外，在泳道1和泳道2中在箭頭(b)的位置上檢出的沒有連接的甲基化探針，由于通過核酸外切酶處理而分解，所以在泳道3和泳道4上沒有檢出該泳帶。
實施例17和比較例1的瓊脂糖凝膠電泳法的結(jié)果如圖48所示。連接的二聚體探針通過和交聯(lián)探針反應(yīng)，形成自聚體(圖48，泳道1，實施例17)。另外，在未連接的未反應(yīng)探針的二聚體探針中，即使與交聯(lián)探針反應(yīng)，也不形成自聚體(圖48，泳道2，比較例1)。
(實施例18和比較例2)以下，表示在實施例18和比較例2中所用的寡核苷酸探針。其中，□表示堿基的甲基化。
擴增用探針-1(甲基化探針) [16]擴增用探針-2(甲基化探針) [17]擴增用探針-3(非甲基化探針)5’(磷酸化)-CGGAAGCTCC TATGACAATG-3’[18]擴增用探針-4(非甲基化探針)5’(磷酸化)-GTTGATCGTC TCGGCTAGTG-3’[19]二聚體形成用探針-35’-TATGACAATG·GATCCTAGAC·CGGAAGCTCC-3’[20]二聚體形成用探針-45’-TCGGCTAGTG·GTCTAGGATC·GTTGATCGTC-3’(1)目的利用甲基化的擴增用探針通過耐熱性DNA合成酶進行基因擴增和通過自聚體的形成確認擴增的基因。
(2)材料(a)作為靶基因使用用作Temperate DNA的Mycobacteriumtuberculosis的IS6110區(qū)的部分堿基序列。
(b)將作為擴增靶基因的擴增用探針，分別制作3’末端甲基化的一對擴增用探針-1和2(實施例18)以及沒有甲基化的一對擴增用探針-3和4(比較例2)。作為二聚體形成用探針，制作能夠?qū)U增的合成探針用作交聯(lián)探針而構(gòu)成的一對二聚體形成探針-3和4。探針分別調(diào)制為50pmol/μL。
(c)作為緩沖液，使用20×SSC(3M-NaCl，0.3M-C6H5O7Na3·2H2O，pH7.0)。
(3)方法
(a)反應(yīng)液的調(diào)配在0.2mL試管中分別加入Temperate DNA 1μL、擴增用探針-1和2各0.5μL、10×PCR緩沖液(10×Ex Taq Buffer寶酒造社制)5μL、dNTP混合物(dNTP Mixture(2.5mM each)寶酒造社制)4μL、Taq聚合酶(TaKaRa Ex Taq(5units/μ)寶酒造社制)0.1μL，用滅菌蒸餾水調(diào)制為50μL的PCR反應(yīng)液(實施例18)。另外，作為對照，在所述反應(yīng)液中，不加擴增用探針-1和2，制作添加擴增用探針3和4的PCR反應(yīng)液(比較例2)。
(b)PCR反應(yīng)利用熱循環(huán)控制器(Parkinelmer社制)，使上述各PCR反應(yīng)液反應(yīng)94℃1分鐘后，進行35個循環(huán)“94℃1分鐘→60℃2分鐘”。
(c-1)核酸外切酶的處理(1)將所述PCR反應(yīng)后的反應(yīng)液10μL移入另外的0.2mL試管中，分別加入核酸外切酶(T7 Gene 6 Exonuclease，AMASHAMU FARUMASHIABIOTECH社制)0.1μL，5×T7 Gene 6 Exonuclease buffer(AMASHAMUFARUMASHIA BIOTECH社制)2μL，用滅菌蒸餾水調(diào)制13μL的反應(yīng)液。使該反應(yīng)液在37℃反應(yīng)30分鐘后，在85℃下加熱15分鐘，使核酸外切酶失活。作為對照，不加核酸外切酶，同樣添加滅菌蒸餾水。通過核酸外切酶處理后，用16％聚丙烯酰胺凝膠(29∶1 BIOLID社制)對10μL的反應(yīng)液進行電泳。電泳后用溴一錠對凝膠進行染色。
(c-2)核酸外切酶的處理(2)對于上述PCR反應(yīng)后的實施例18的反應(yīng)液，除使所述核酸外切酶處理(1)的反應(yīng)條件從37℃/30分鐘→85℃/15分鐘的反應(yīng)變到37℃/30分鐘→57℃/30分鐘→37℃/30分鐘→85℃/15分鐘的反應(yīng)之外，其余的以同樣的條件和操作進行核酸外切酶的處理。
(d)自聚體的形成在進行所述核酸外切酶處理(1)和(2)后的實施例18的各反應(yīng)液中，添加二聚體形成用探針-3和4各1μL，添加20×SSC使最終濃度為10×SSC，在94℃下處理30分鐘后，進行60℃1小時的自聚體形成反應(yīng)。
(e)通過瓊脂糖凝膠電泳法進行自聚體的確認通過與實施例17相同的操作和條件進行自聚體的確認。
(4)結(jié)果實施例18和比較例2的PAGE的電泳法的結(jié)果如圖49所示。在圖49中，泳道1表示10bp DNA Ladder marker，泳道2表示對照用的40mer的單鏈寡核苷酸，泳道3表示對照用的60mer的單鏈寡核苷酸，泳道4表示比較例2(未用酶處理)，泳道5表示實施例18(未用酶處理)，泳道6表示比較例2(酶處理)，泳道7表示實施例18(酶處理)。
如圖49的泳道5和泳道7所示，在利用甲基化的擴增用探針的實施例18中，在40bp的位置上檢出了通過PCR反應(yīng)而擴增的作為目的擴增產(chǎn)物的合成探針的泳帶，進而，在20bp的位置上檢出了通過核酸外切酶處理而使40bp的泳帶分解的新泳帶。該20bp泳帶，是通過核酸外切酶處理分解為20mer的合成探針和20mer的未反應(yīng)的擴增用探針之間的雜交體。由此，通過核酸外切酶對利用甲基化的擴增用探針的擴增產(chǎn)物進行處理，互補鏈分解，可以得到目的的20mer的一對交聯(lián)探針。
另一方面，如圖49的泳道4和泳道6所示，在將作為對照的非甲基化探針用作擴增用探針的比較例2中，在40bp的位置上檢出了通過PCR反應(yīng)而產(chǎn)生的目的擴增產(chǎn)物的泳帶，但是，一旦進行核酸外切酶的處理，僅40bp的泳帶被分解，沒有新檢出別的大的泳帶。
實施例18的瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果如圖50所示。在泳道1[核酸外切酶處理(1)]中，由于成為合成探針的互補鏈的未反應(yīng)的擴增用探針被除去，所以，通過合成探針和二聚體形成用探針形成的自聚體被確認。
另一方面，合成探針和未反應(yīng)的擴增用探針以形成雜交體的狀態(tài)，在添加二聚體形成用探針的泳道2[核酸外切酶處理(1)]中，沒有確認自聚體的形成。
(實施例19和比較例3～5)以下表示在實施例19中所用的由DNA和RNA構(gòu)成的寡核苷酸探針。其中，□表示RNA。
擴增用嵌合探針-1(3’側(cè)3堿基為RNA) [22]擴增用嵌合探針-2(3’側(cè)3堿基為RNA)
(1)目的利用嵌合化的擴增用探針(由DNA和RNA構(gòu)成的探針)通過鏈置換型核酸合成酶進行基因擴增和通過自聚體的形成確認擴增的基因。
(2)材料(a)作為靶基因使用用作Temperate DNA的Mycobacteriumtuberculosis的IS6110區(qū)的部分堿基序列。
(b)將靶基因作為擴增的擴增用探針，分別制作3’側(cè)的3甲基作為RNA的一對擴增用嵌合探針-1和2(實施例19)。作為二聚體形成用探針，與實施例18相同，利用二聚體形成用探針-3和4。探針分別調(diào)制為50pmol/μL。
(c)作為緩沖液，使用20×SSC(3M-NaCl，0.3M-C6H5O7Na3·2H2O，pH7.0)。
(3)方法(a)反應(yīng)液的調(diào)配在0.2mL試管中分別加入Temperate DNA 1μL、擴增用嵌合探針-1和2各0.25μL、tris系緩沖液(0.1M tris鹽酸BufferpH7.5)7.5μL、dNTP混合物[dNTP Mixture(2.5mM each)寶酒造社制]1μL、Bcapolymerase(22U/μL寶酒造社制)0.15、BSA(20mg/ml寶酒造社制)0.2μL、10％甘油6.5μL、DMSO1μL、MgCl2(50omM)5μL、RNase H(60U/μL寶酒造社制)0.5μL，用滅菌蒸餾水調(diào)制為25μL的反應(yīng)液。
作為對照，不加Temperate DNA，制作添加滅菌蒸餾水的反應(yīng)液(比較例3)。
(b)擴增反應(yīng)利用熱循環(huán)控制器(Parkinelmer社制)，使上述反應(yīng)液在60℃反應(yīng)60分鐘后，在95℃進行5分鐘加熱，使酶失活。將該反應(yīng)液作為“合成探針”溶液。
(c)利用丙烯酰胺凝膠電泳法進行擴增產(chǎn)物的檢出利用16％聚丙烯酰胺凝膠(29∶1、BIOLAD社制)對8μl的所述合成探針溶液進行電泳。在電泳后用溴一錠對凝膠進行染色。
(d)自聚體的形成反應(yīng)在0.2mL試管中分別加入二聚體形成用探針-3和4各1μL、20×SSC12μL，用滅菌蒸餾水調(diào)制為20μL的反應(yīng)液。
在94℃對反應(yīng)液處理30秒鐘后，在60℃反應(yīng)18小時，將此反應(yīng)液作為“二聚體探針”溶液。
然后，作為自聚體的形成反應(yīng)，在另外0.2mL試管中分別加入合成探針溶液5μL、二聚體探針溶液10μL、20×SSC 5μL，在60℃下使反應(yīng)18小時。
作為對照，也進行僅加合成探針溶液(比較例4)、以及僅加二聚體探針溶液(比較例5)的反應(yīng)。
(e)利用熒光顯微鏡的確認在所述(d)的自聚體的形成反應(yīng)溶液5μL中，加入溴一錠(10mg/mL)5μL稀釋為1/1000，放置30分鐘。在載玻片上滴下上述溶液3μL，用熒光顯微鏡進行觀察。
(4)結(jié)果1通過丙烯酰胺凝膠電泳法進行擴增產(chǎn)物的檢出在圖51中表示了實施例19和比較例3的丙烯酰胺凝膠電泳法的結(jié)果。泳道M表示10bp DNA Ladder marker、泳道1表示比較例3、泳道2和3表示實施例19。該結(jié)果表示，實施例19的僅在添加靶DNA時，才能夠檢出40bp和20bp的擴增產(chǎn)物的泳帶。該20bp的泳帶，是擴增的40bp的合成探針，通過共存的RNase H RNA部分被分解，剪切20mer的合成探針和20mer的未反應(yīng)探針之間的雜交體。
2通過熒光顯微鏡的確認在圖52～54中分別表示了實施例19和比較例4、5熒光顯微鏡的觀察結(jié)果。僅在使二聚體形成用探針和合成探針的混合溶液進行反應(yīng)時(實施例19)，才能夠在載玻片上確認粒子狀的自聚體。
在工業(yè)上的利用可能性如上所述，根據(jù)本發(fā)明的通過基因擴增反應(yīng)得到的合成探針的自聚體形成方法，不須要EIA的特殊儀器或試劑而能夠形成寡核苷酸的自聚體，根據(jù)本發(fā)明的基因的檢出方法，不用特殊的儀器或煩雜的操作而能夠低成本并且簡便地檢出特定的基因。本發(fā)明的自聚體，是根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸的自聚體形成方法而有效合成的自聚體。
序列表<110>三光純藥株式會社<120>通過基因擴增反應(yīng)合成的寡核苷酸的自聚體形成方法<130>76206-PCT-CN<140>PCT/JP02/11321<141>2002-10-30<150>JP 2001-342709<151>2001-11-08<150>JP 2002-132402<151>2002-05-08<160>22<110>三光純藥株式會社<210>1<211>80<212>DNA<213>人工序列<220><213>人工序列的描述合成的交聯(lián)探針-1<400>1ttggatcaac ccgctcaatg cctggagatt tgggcgtgcc cccgcaagac tgctagccga 60gtagtgttgg gtcgcgaaag80<210>2<211>80<212>DNA<213>人工序列<220><213>人工序列的描述合成的交聯(lián)探針-2<400>2ctttcgcgac ccaacactac tcggctagca gtcttgcggg ggcacgccca aatctccagg 60cattgagcgg gttgatccaa 80<210>3<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><213>人工序列的描述合成的交聯(lián)探針-3<400>3ttggatcaac ccgctcaatg cctggagatt tgggcgtgcc 40<210>4<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><213>人工序列的描述合成的交聯(lián)探針-4<400>4ctttcgcgac ccaacactac tcggctagca gtcttgcggg 40<210>5<211>60<212>DNA<213>人工序列<220><213>人工序列的描述合成的二聚體形成用探針-1<400>5gtagtgttgg gtcgcgaaag gctcacagtt aagccgtgag cccgcaagac tgctagccga 60<210>6<211>60<212>DNA<213>人工序列<220><213>人工序列的描述合成的二聚體形成用探針-2<400>6cattgagcgg gttgatccaa ctcacggctt aactgtgagc ggcacgccca aatctccagg 60<210>7<211>80<212>DNA<213>人工序列<220><213>人工序列的描述合成的靶基因-A<400>7aacatgaaaa atgattatgg ctcaggtact gctatccacc ctcaaacagg tgaattatta 60gcacttgtaa gcacaccttc80<210>8<211>80<212>DNA<213>人工序列<220><213>人工序列的描述合成的靶基因-B<400>8gaaggtgtgc ttacaagtgc taataattca cctgtttgag ggtggatagc agtacctgag 60ccataatcat ttttcatgtt 80<210>9<211>41<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>連接在5′端的甲基<220><213>人工序列的描述合成的甲基化探針-1<400>9gtgctgactt aaccggatac gattatggct caggtactgc t 41<210>10<211>39<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>連接在5′端的磷酸<220><221>misc_feature<223>連接在3′端的甲基<220><213>人工序列的描述合成的甲基化探針-2<400>10atccaccctc aaacaggtgg attggtactg cgagatagg39<210>11<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>連接在5′端的甲基<220><213>人工序列的描述合成的甲基化探針-3<400>11gacgctttct gcgtgtatag cacctgtttg agggtggata 40<210>12<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>連接在5′端的磷酸<220><221>misc_feature<223>連接在3′端的甲基<220><213>人工序列的描述合成的甲基化探針-4<400>12gcagtacctg agccataatc ctagaacgga tcgtacttcg 40<210>13<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><213>人工序列的描述合成的交聯(lián)探針-5<400>13ctatacacgc agaaagcgtc cgaagtacga tccgttctag 40<210>14<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><213>人工序列的描述合成的交聯(lián)探針-6<400>14gtatccggtt aagtcagcac-cctatctcgc agtaccattc 40<210>15<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>連接在5′端的磷酸<220><221>misc_feature<223>連接在3′端的甲基<220><213>人工序列的描述合成的擴增用探針-1<400>15cggaagctcc tatgacaatg20<210>16<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>連接在5′端的磷酸<220><221>misc_feature<223>連接在3′端的甲基<220><213>人工序列的描述合成的擴增用探針-2<400>16gttgatcgtc tcggctagtg20<210>17<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>連接在5′端的磷酸<220><213>人工序列的描述合成的擴增用探針-3<400>17cggaagctcc tatgacaatg20<210>18<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>連接在5′端的磷酸<220><213>人工序列的描述合成的擴增用探針-4<400>18gttgatcgtc tcggctagtg 20<210>19<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><213>人工序列的描述合成的二聚體形成用探針-3<400>19tatgacaatg gatcctagac cggaagctcc30<210>20<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><213>人工序列的描述合成的二聚體形成用探針-4<400>20tcggctagtg gtctaggatc gttgatcgtc30<210>21<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>連接在5′端的磷酸<220><221>misc_RNA<222>(18)...(20)<223>嵌合的DNA/RNA<220><213>人工序列的描述合成的擴增用嵌合探針-1<400>21cggaagctcc tatgacaaug 20<210>22<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>連接在5′端的磷酸<220><221>misc_RNA<222>(18)...(20)<223>嵌合的DNA/RNA<220><213>人工序列的描述合成的擴增用嵌合探針-2<400>22gttgatcgtc tcggctagug 20
權(quán)利要求
1.一種寡核苷酸的自聚體形成方法，是通過寡核苷酸的自聚反應(yīng)而形成自聚體的方法，其特征在于，作為該寡核苷酸，含有通過基因擴增反應(yīng)而合成的寡核苷酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的寡核苷酸的自聚體形成方法，其特征在于，所述自聚體的形成方法，是利用多對由n處(n≥3)的互補的堿基序列區(qū)構(gòu)成的一對寡核苷酸探針，通過相互不同交叉地雜交，寡核苷酸自聚形成自聚體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的寡核苷酸的自聚體形成方法，其特征在于，所述一對寡核苷酸探針的至少一方，是通過含有所述n處(n≥3)區(qū)的基因擴增反應(yīng)而合成的寡核苷酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的一對寡核苷酸的自聚體形成方法，其特征在于，所述一對寡核苷酸探針的構(gòu)成為，以1對1進行雜交時，在n處(n≥3)互補的部分中必須每1處都能夠特異地雜交。
5.根據(jù)權(quán)利要求2～4中任一項所述的寡核苷酸的自聚體形成方法，其特征在于，所述一對寡核苷酸探針的多對，是由該堿基序列區(qū)至少1處不同的m(m≥2)種的一對探針構(gòu)成。
6.根據(jù)權(quán)利要求2～5中任一項所述的寡核苷酸的自聚體形成方法，其特征在于，所述寡核苷酸探針是由選自DNA、RNA、PNA或LNA中任何一種的堿基構(gòu)成。
7.根據(jù)權(quán)利要求2～6中任一項所述的寡核苷酸的自聚體形成方法，其特征在于，在所述寡核苷酸探針的互補堿基序列區(qū)的端部上，至少配置1個G(鳥嘌呤)或C(胞嘧啶)，所述探針在雜交時，在互補堿基序列區(qū)的端部至少形成一個G-C鍵。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的寡核苷酸的自聚體形成方法，其特征在于，所述自聚體的形成方法，是具有從含有把1號和2號的一對寡核苷酸的各寡核苷酸分成3’側(cè)區(qū)、中央?yún)^(qū)和5’側(cè)區(qū)3個區(qū)、使各寡核苷酸的中央?yún)^(qū)為互補堿基序列、使3’側(cè)區(qū)和5’側(cè)區(qū)為不互補堿基序列的多對二聚體形成用探針的第1系統(tǒng)至第(2n-1)(n≥1)系統(tǒng)依次形成的含有n個二聚體形成用探針系統(tǒng)；從分別含有把1號和2號的一對寡核苷酸的各寡核苷酸分成3’側(cè)區(qū)和5’側(cè)區(qū)2個區(qū)、使各寡核苷酸的3’側(cè)區(qū)和5’側(cè)區(qū)為不互補堿基序列的多對交聯(lián)探針的第2系統(tǒng)至第2n系統(tǒng)依次形成的含有n個交聯(lián)探針系統(tǒng)；且將此交聯(lián)探針作為能夠交聯(lián)由該二聚體形成用探針形成的二聚體的堿基序列，從而能夠通過使該探針雜交，使寡核苷酸自聚而形成自聚體。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的寡核苷酸的自聚體形成方法，其特征在于，所述探針中的至少一個是通過基因擴增反應(yīng)而合成的寡核苷酸。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的寡核苷酸的自聚體形成方法，其特征在于，所述n＝1，所述探針的堿基序列為分別使下列區(qū)第1系統(tǒng)的1號寡核苷酸的3’側(cè)區(qū)與第2系統(tǒng)的1號寡核苷酸的3’側(cè)區(qū)、第1系統(tǒng)的2號寡核苷酸的5’側(cè)區(qū)與第2系統(tǒng)的2號寡核苷酸的5’側(cè)區(qū)、第2系統(tǒng)的2號寡核苷酸的3’側(cè)區(qū)與第1系統(tǒng)的2號寡核苷酸的3’側(cè)區(qū)、第2系統(tǒng)的1號寡核苷酸的5’側(cè)區(qū)與第1系統(tǒng)的1號寡核苷酸的5’側(cè)區(qū)，成為互補的堿基序列。
11.根據(jù)權(quán)利要求8所述的寡核苷酸的自聚體形成方法，其特征在于，所述n＝1，所述探針的堿基序列為分別使下列區(qū)第1系統(tǒng)的1號寡核苷酸的3’側(cè)區(qū)與第2系統(tǒng)的1號寡核苷酸的3’側(cè)區(qū)、第1系統(tǒng)的2號寡核苷酸的5’側(cè)區(qū)與第2系統(tǒng)的1號寡核苷酸的5’側(cè)區(qū)、第1系統(tǒng)的2號寡核苷酸的3’側(cè)區(qū)與第2系統(tǒng)的2號寡核苷酸的3’側(cè)區(qū)、第1系統(tǒng)的1號寡核苷酸的5’側(cè)區(qū)與第2系統(tǒng)的2號寡核苷酸的5’側(cè)區(qū)，成為互補的堿基序列。
12.根據(jù)權(quán)利要求8所述的寡核苷酸的自聚體形成方法，其特征在于，所述n≥2，所述探針的堿基序列是分別使下列區(qū)第(2n-3)系統(tǒng)的1號寡核苷酸的3’側(cè)區(qū)與第(2n-2)系統(tǒng)的1號寡核苷酸的3’側(cè)區(qū)、第(2n-3)系統(tǒng)的2號寡核苷酸的5’側(cè)區(qū)與第(2n-2)系統(tǒng)的2號寡核苷酸的5’側(cè)區(qū)、第(2n-2)系統(tǒng)的2號寡核苷酸的3’側(cè)區(qū)與第(2n-1)系統(tǒng)的2號寡核苷酸的3’側(cè)區(qū)、第(2n-2)系統(tǒng)的1號寡核苷酸的5’側(cè)區(qū)與第(2n-1)系統(tǒng)的1號寡核苷酸的5’側(cè)區(qū)、二聚體形成用探針的最后系統(tǒng)的1號寡核苷酸的3’側(cè)區(qū)與交聯(lián)探針的最后系統(tǒng)的1號寡核苷酸的3’側(cè)區(qū)、二聚體形成用探針的最后系統(tǒng)的2號寡核苷酸的5’側(cè)區(qū)與交聯(lián)探針的最后系統(tǒng)的2號寡核苷酸的5’側(cè)區(qū)、交聯(lián)探針的最后系統(tǒng)的2號寡核苷酸的3’側(cè)區(qū)與第1系統(tǒng)的2號寡核苷酸的3’側(cè)區(qū)、交聯(lián)探針的最后系統(tǒng)的1號寡核苷酸的5’側(cè)區(qū)與第1系統(tǒng)的1號寡核苷酸的5’側(cè)區(qū)，成為互補的堿基序列。
13.根據(jù)權(quán)利要求8所述的寡核苷酸的自聚體形成方法，其特征在于，所述n≥2所述探針的堿基序列為分別使下列區(qū)第(2n-3)系統(tǒng)的1號寡核苷酸的3’側(cè)區(qū)與第(2n-2)系統(tǒng)的1號寡核苷酸的3’側(cè)區(qū)、第(2n-3)系統(tǒng)的2號寡核苷酸的5’側(cè)區(qū)與第(2n-2)系統(tǒng)的2號寡核苷酸的5’側(cè)區(qū)、第(2n-2)系統(tǒng)的2號寡核苷酸的3’側(cè)區(qū)與第(2n-1)系統(tǒng)的2號寡核苷酸的3’側(cè)區(qū)、第(2n-2)系統(tǒng)的1號寡核苷酸的5’側(cè)區(qū)與第(2n-1)系統(tǒng)的1號寡核苷酸的5’側(cè)區(qū)、二聚體形成用探針的最后系統(tǒng)的1號寡核苷酸的3’側(cè)區(qū)與交聯(lián)探針的最后系統(tǒng)的1號寡核苷酸的3’側(cè)區(qū)、二聚體形成用探針的最后系統(tǒng)的2號寡核苷酸的5’側(cè)區(qū)與交聯(lián)探針的最后系統(tǒng)的1號寡核苷酸的5’側(cè)區(qū)、交聯(lián)探針的最后系統(tǒng)的2號寡核苷酸的3’側(cè)區(qū)與第1系統(tǒng)的2號寡核苷酸的3’側(cè)區(qū)、交聯(lián)探針的最后系統(tǒng)的2號寡核苷酸的5’側(cè)區(qū)與第1系統(tǒng)的1號寡核苷酸的5’側(cè)區(qū)，成為互補的堿基序列。
14.根據(jù)權(quán)利要求8～13中的任一項所述的寡核苷酸的自聚體形成方法，其特征在于，所述探針的雜交，是預(yù)先由所述二聚體形成用探針形成二聚體后，再使所述交聯(lián)探針和該二聚體雜交。
15.根據(jù)權(quán)利要求8～14中的任一項所述的寡核苷酸的自聚體形成方法，其特征在于，所述多對二聚體形成用探針，是由所述中央?yún)^(qū)不同的m(m≥2)種的二聚體形成用探針構(gòu)成。
16.根據(jù)權(quán)利要求8～15中的任一項所述的寡核苷酸的自聚體形成方法，其特征在于，使所述一對二聚體形成用探針的3’側(cè)區(qū)和/或5’側(cè)區(qū)為彼此相同的堿基序列。
17.根據(jù)權(quán)利要求8～16中的任一項所述的寡核苷酸的自聚體形成方法，其特征在于，所述交聯(lián)探針的至少一個，是通過含有所述交聯(lián)探針的2個區(qū)的基因擴增反應(yīng)而合成的寡核苷酸。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的寡核苷酸的自聚體形成方法，其特征在于，通過所述基因擴增反應(yīng)合成的寡核苷酸，是分別具有與第(2n-1)系統(tǒng)的寡核苷酸的5’側(cè)區(qū)和3’側(cè)區(qū)互補的區(qū)各2處的、至少由4處區(qū)構(gòu)成的互補基因片段。
19.根據(jù)權(quán)利要求8～18中的任一項所述的寡核苷酸的自聚體形成方法，其特征在于，所述二聚體形成用探針和交聯(lián)探針，是由選自DNA、RNA、PNA或LNA中任何一種的堿基構(gòu)成。
20.根據(jù)權(quán)利要求8～19中的任一項所述的寡核苷酸的自聚體形成方法，其特征在于，在所述二聚體形成用探針和交聯(lián)探針的互補堿基序列區(qū)的端部上，至少配置1個G(鳥嘌呤)或C(胞嘧啶)，所述探針在雜交時，在互補堿基序列區(qū)的端部上至少形成一個G-C鍵。
21.根據(jù)權(quán)利要求1～20中的任一項所述的寡核苷酸的自聚體形成方法，其特征在于，在所述基因擴增反應(yīng)中使用耐熱性核酸合成酶。
22.根據(jù)權(quán)利要求1～20中的任一項所述的寡核苷酸的自聚體形成方法，其特征在于，在所述基因擴增反應(yīng)中使用耐熱性核酸連接酶。
23.根據(jù)權(quán)利要求1～20中的任一項所述的寡核苷酸的自聚體形成方法，其特征在于，在所述基因擴增反應(yīng)中使用鏈置換型核酸合成酶。
24.根據(jù)權(quán)利要求1～23中的任一項所述的寡核苷酸的自聚體形成方法，其特征在于，通過所述基因擴增反應(yīng)合成的寡核苷酸，是由雙鏈的DNA和/或RNA構(gòu)成的寡核苷酸片段。
25.根據(jù)權(quán)利要求1～23中的任一項所述的寡核苷酸的自聚體形成方法，其特征在于，通過所述基因擴增反應(yīng)合成的寡核苷酸，是由單鏈的DNA和/或RNA構(gòu)成的寡核苷酸片段。
26.根據(jù)權(quán)利要求1～25中的任一項所述的寡核苷酸的自聚體形成方法，其特征在于，在所述基因擴增反應(yīng)中所用的擴增用探針為DNA。
27.根據(jù)權(quán)利要求1～25中的任一項所述的寡核苷酸的自聚體形成方法，其特征在于，在所述基因擴增反應(yīng)中所用的擴增用探針為RNA。
28.根據(jù)權(quán)利要求1～25中的任一項所述的寡核苷酸的自聚體形成方法，其特征在于，在所述基因擴增反應(yīng)中所用的擴增用探針為由DNA和RNA構(gòu)成的嵌合型。
29.根據(jù)權(quán)利要求26～28中的任一項所述的寡核苷酸的自聚體形成方法，其特征在于，將在所述基因擴增反應(yīng)中所用的一對擴增用探針的至少一方的5’末端側(cè)和/或3’末端側(cè)的堿基進行甲基化。
30.根據(jù)權(quán)利要求1～29中的任一項所述的寡核苷酸的自聚體形成方法，其特征在于，通過所述基因擴增反應(yīng)合成的寡核苷酸，是預(yù)先在該互補的區(qū)上剪切具有與靶基因互補區(qū)的寡核苷酸，通過連接反應(yīng)而連接的寡核苷酸。
31.根據(jù)權(quán)利要求1～30中的任一項所述的寡核苷酸的自聚體形成方法，其特征在于，利用核酸分解酶分解通過所述基因擴增反應(yīng)合成的寡核苷酸。
32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的寡核苷酸的自聚體形成方法，其特征在于，在所述核酸分解酶中使用核酸外切酶。
33.根據(jù)權(quán)利要求31所述的寡核苷酸的自聚體形成方法，其特征在于，在所述核酸分解酶中使用RNase H。
34.根據(jù)權(quán)利要求31所述的寡核苷酸的自聚體形成方法，其特征在于，在所述核酸分解酶中使用限制酶。
35.根據(jù)權(quán)利要求1～34中的任一項所述的寡核苷酸的自聚體形成方法，其特征在于，在所述基因擴增反應(yīng)中，被擴增的靶基因使用雙鏈的DNA和/或RNA。
36.根據(jù)權(quán)利要求1～34中的任一項所述的寡核苷酸的自聚體形成方法，其特征在于，在所述基因擴增反應(yīng)中，被擴增的靶基因使用單鏈的DNA和/或RNA。
37.根據(jù)權(quán)利要求1～34中的任一項所述的寡核苷酸的自聚體形成方法，其特征在于，在所述基因擴增反應(yīng)中，被擴增的靶基因為單堿基多態(tài)。
38.一種自聚體，其特征在于，利用權(quán)利要求1～37中的任一項所述的寡核苷酸的自聚體形成方法而形成。
39.一種基因的檢出方法，其特征在于，利用權(quán)利要求1～37中的任一項所述的寡核苷酸的自聚體形成方法，形成自聚體，通過檢出形成的所述自聚體，來檢出通過所述基因擴增反應(yīng)合成的寡核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明提供不用特殊的儀器或煩雜的操作而形成寡核苷酸的自聚體的方法、通過該自聚體的形成方法形成的自聚體、以及利用該自聚體的形成方法而低成本并且簡便地檢出被擴增的特定基因的方法。在通過寡核苷酸的自聚反應(yīng)而形成自聚體的方法中，作為該寡核苷酸，含有通過基因擴增反應(yīng)合成的寡核苷酸。利用所述的寡核苷酸的自聚體形成方法形成自聚體，通過檢出形成的自聚體，而檢出通過所述基因擴增反應(yīng)合成的寡核苷酸。
文檔編號C12Q1/68GK1484697SQ02803415
公開日2004年3月24日 申請日期2002年10月30日 優(yōu)先權(quán)日2001年11月8日
發(fā)明者薄井貢, 三塚真理, 波木井千雅子, 千雅子, 理 申請人:三光純藥株式會社