專利名稱：細(xì)胞診斷方法及該方法所用裝置和儀器的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于測定目的細(xì)胞狀態(tài)的細(xì)胞診斷方法，同時還涉及該診斷方法中所使用的裝置和儀器。
背景技術(shù)：
按照慣例，已常規(guī)使用各種不同的抗體對活檢樣品或者體液進(jìn)行染色的方法，以便做出病理診斷。
但是，由于病理學(xué)家的經(jīng)驗差異或者由于抗體滴度造成診斷錯誤等的原故，這些方法會產(chǎn)生不同的診斷結(jié)論。而且，這些方法需要花費(fèi)很長時間。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明可供解決上述問題，它提供一種通過測量細(xì)胞的各物理化學(xué)特性的變化進(jìn)行細(xì)胞診斷的方法，可以快而簡便地處理大量樣品，又不會出現(xiàn)診斷錯誤。這些物理化學(xué)特性是與細(xì)胞內(nèi)的變化有關(guān)的。同時本發(fā)明還提供該方法中所需的裝置和儀器。
本發(fā)明涉及一種對細(xì)胞狀態(tài)和特征進(jìn)行診斷的方法，其步驟包括為測量細(xì)胞物理化學(xué)特性提供一種反應(yīng)系統(tǒng)，將混有細(xì)胞膜成分的樣品放置在該反應(yīng)系統(tǒng)中，用刺激物作用于樣品，獲得一個樣品物理化學(xué)特性的指標(biāo)值(index)，然后根據(jù)這個指標(biāo)值對細(xì)胞狀態(tài)進(jìn)行診斷。
該診斷步驟可以包括將所述指標(biāo)值與對照樣本的指標(biāo)值進(jìn)行比較。
一般說來，所述刺激物可以選自化學(xué)物質(zhì)、蛋白質(zhì)、氨基酸、電壓脈沖、電流脈沖、電磁波、和激光束等。
本發(fā)明涉及用于該反應(yīng)系統(tǒng)的裝置包括放置樣品的基板、參比電極及測量電極。參比電極的放置環(huán)境或者其特性與測量電極的放置環(huán)境或者其特性不同。
一般說來，裝置的基板中有一個貫通的孔，以便放置樣品；樣品被放置在參比電極和測量電極之間，并且與那個孔臨近。
一般說來，參比電極的放置環(huán)境或者其特性以及測量電極的放置環(huán)境或者其特性，分別是放置參比電極和測量電極的區(qū)域的容積。而且，測量電極的放置區(qū)域的容積一般都比參比電極的小一些。
一般說來，在本方法中，提供的反應(yīng)系統(tǒng)的步驟包括將足夠量的電解液放置在裝置中，使得參比電極和測量電極都完全浸在其中，放置步驟包括將樣品定位在裝置的那個貫通的孔上。浸沒參比電極的電解液的量比浸沒測量電極的要大些。
一般說來，本裝置還包括一個安置在基板中的細(xì)胞培養(yǎng)部分，以及一個安置在基板下的抽吸細(xì)胞的部分。細(xì)胞培養(yǎng)部分由基板和一個分隔構(gòu)件組成。
一般說來，參比電極位于這個分隔構(gòu)件的內(nèi)壁。
一般說來，獲得指標(biāo)值的步驟包括(a)記錄樣品發(fā)出的一個物理化學(xué)信號，將之作為時間序列的信號值；(b)取樣這個時間序列的信號值，以得到多組由多個數(shù)值組成的提取出來的數(shù)據(jù)，計算每組數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)差；(c)計算這些標(biāo)準(zhǔn)差的平均值；(d)將這個平均值作為指標(biāo)值。
一般說來，獲得指標(biāo)值的步驟還包括(a)記錄樣品發(fā)出的一個物理化學(xué)信號，將之作為時間序列的信號值；(b)取樣這個時間序列的信號值，以得到多組由多個數(shù)值組成的提取出來的數(shù)據(jù)，計算每組數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)差；(c)將標(biāo)準(zhǔn)差分入多個類別中，這些類別均是預(yù)先以標(biāo)準(zhǔn)差的大小作為單位來確定的，這樣我們就得到一個代表著樣本物理化學(xué)特性的分布曲線；(d)將所得到的分布曲線向正態(tài)分布曲線逼近；(e)計算最終得到的正態(tài)分布曲線的平均值和半寬度，將此兩者作為指標(biāo)值。
在本方法中，步驟(b)到(e)將被重復(fù)數(shù)次，被取樣的時間序列信號值的數(shù)目在每次為獲取多個正態(tài)分布曲線而進(jìn)行的重復(fù)中都是不同的。指標(biāo)值從這些正態(tài)分布曲線的平均值和半寬度中選擇。
在本方法中，可能存在多個用于測量細(xì)胞的物理化學(xué)特性的反應(yīng)系統(tǒng)，且在步驟(b)之前，可能還包括將反應(yīng)系統(tǒng)中的多個樣品發(fā)出的各個時間序列信號值相加。
在本方法中，在步驟(a)之前，可能還包括同時激發(fā)反應(yīng)系統(tǒng)中的所有樣品。
獲得指標(biāo)值的步驟還可能包括(a)記錄樣品發(fā)出的一個物理化學(xué)信號，將之作為時間序列的信號值；(b)取樣這個時間序列的信號值，以得到多組由多個數(shù)值組成的提取出來的數(shù)據(jù)，計算每組數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)差；(c)將標(biāo)準(zhǔn)差分入多個類別中，這些類別均是預(yù)先以標(biāo)準(zhǔn)差的大小作為單位來確定的，這樣我們就得到一個代表著樣本物理化學(xué)特性的分布曲線；(d)將所得到的分布曲線進(jìn)行曲線逼近擬和分析，分析方法選自指標(biāo)值遞減分析、指標(biāo)值遞增分析、高斯分布、勞倫斯分布、σ分析、多峰分析以及非線性分析；(e)根據(jù)經(jīng)步驟(d)得到的擬和曲線峰值前后的斜率，獲得樣品的另一個物理化學(xué)特性的指標(biāo)值。
可以從初始數(shù)據(jù)a中以時間序列的形式多次進(jìn)行步驟(b)的取樣，前者是時間序列信號值中的一個，并且可以在初始數(shù)據(jù)a之后于預(yù)先確定的時間記錄的數(shù)據(jù)b中以時間序列的形式多次進(jìn)行步驟(b)的取樣。
獲得指標(biāo)值的步驟還可能包括(a)記錄樣品發(fā)出的一個物理化學(xué)信號，將其作為時間序列的信號值；(b)取樣這個時間序列的信號值，以得到多組由多個數(shù)值組成的提取出來的數(shù)據(jù)，計算每組數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)差；(c)對所得的標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行取樣，以得到多組由多個數(shù)值組成的提取出來的標(biāo)準(zhǔn)差，計算每組標(biāo)準(zhǔn)差的平均值；(d)當(dāng)時間序列信號值的平均值達(dá)到一個預(yù)先設(shè)定的閾值時，根據(jù)達(dá)到該閾值的時間得到另一個樣品的物理化學(xué)特性的指標(biāo)值。
一般說來，步驟(a)可以在標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)物質(zhì)和待測化學(xué)物質(zhì)的存在下進(jìn)行，這種標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)物質(zhì)有著對樣品已知的作用；變化標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)物質(zhì)和待測化學(xué)物質(zhì)的濃度，重復(fù)步驟(b)到(e)；診斷步驟還可以包括在標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)物質(zhì)存在下和在待測化學(xué)物質(zhì)存在下得到的兩個指標(biāo)值的比較。
本發(fā)明還涉及細(xì)胞診斷儀器，其包括一個反應(yīng)系統(tǒng)，這個反應(yīng)系統(tǒng)包括細(xì)胞診斷裝置以及為了測定樣品物理化學(xué)特性的方法。
本發(fā)明還與細(xì)胞診斷分析芯片相關(guān)，它包括一個放置樣品的基板，還有其上細(xì)胞的細(xì)胞膜成分，一個參比電極，一個測量電極。所述基板具有a.組織粉碎部分；b.細(xì)胞培養(yǎng)部分；c.傳感器部分；d.刺激物作用部分；e.信號放大部分；f.信號處理部分；g.數(shù)據(jù)顯示部分；h.控制面板部分，這樣就可以顯示樣品的狀態(tài)。
其中的a.組織粉碎部分包含一個直徑1-100μm的微濾器。
其中的b.細(xì)胞培養(yǎng)部分需要有溫控裝置。
其中的b.細(xì)胞培養(yǎng)部分還需要有濕度控制裝置。
溫度控制的裝置可以使用Peltier設(shè)備或者是IH加熱器。


圖1是本發(fā)明的一個實施方案中的細(xì)胞診斷裝置的示意圖。圖1中的數(shù)字分別代表以下構(gòu)件1細(xì)胞診斷裝置；2SOI基板；3裝置壁；4測量電極；5培養(yǎng)溶液；6下陷槽；7貫通孔；8參比電極。
圖2是本發(fā)明的另一個實施方案中的細(xì)胞診斷裝置的示意圖。圖2中的數(shù)字分別代表以下構(gòu)件10細(xì)胞診斷裝置；4測量電極；5培養(yǎng)溶液；6下陷槽；7貫通孔；12硅層；13SiO2(二氧化硅)層；14基板支持物；19樣品。
圖3是本發(fā)明的另一個實施方案中的細(xì)胞診斷裝置的示意圖。圖3中的數(shù)字分別代表以下構(gòu)件5培養(yǎng)溶液；13SiO2(二氧化硅)層；31間隔部分；35抽吸管道附件；37細(xì)胞抽吸系統(tǒng)管道。
圖4是本發(fā)明的一個實施方案的細(xì)胞診斷儀器的結(jié)構(gòu)示意圖。圖4中的數(shù)字分別代表以下構(gòu)件101信號源；102單位標(biāo)準(zhǔn)差計算部分；103正態(tài)分布曲線擬和部分；104刺激物產(chǎn)生部分；105平均值計算部分；106平均值和半寬度計算部分；107信號加和部分；108特征計算部分；109特征分類部分；110數(shù)據(jù)顯示部分。
圖5是本發(fā)明的另一個實施方案中的細(xì)胞診斷儀器的結(jié)構(gòu)示意圖。圖5中的數(shù)字所代表的構(gòu)件與圖4中的一致。
圖6是本發(fā)明的另一個實施方案中的細(xì)胞診斷儀器的結(jié)構(gòu)示意圖。圖6中的數(shù)字分別代表以下構(gòu)件101信號源；102單位標(biāo)準(zhǔn)差計算部分；103正態(tài)分布曲線擬和部分；106平均值和半寬度計算部分；109特征分類部分；111樣品編號分類部分。
圖7是本發(fā)明的另一個實施方案中的細(xì)胞診斷儀器的結(jié)構(gòu)示意圖。圖7中的數(shù)字分別代表以下構(gòu)件101信號源；103正態(tài)分布曲線擬和部分；104信號產(chǎn)生部分；106平均值和半寬度計算部分；109特征分類部分；110數(shù)據(jù)顯示部分。
圖8的組方圖顯示的是正常細(xì)胞和包括從大鼠胃底獲得的癌癥細(xì)胞在內(nèi)的細(xì)胞的碳酰膽堿(carbachol)濃度依賴反應(yīng)，測定使用了本發(fā)明的一個實施方案中的細(xì)胞診斷裝置。
圖9的組方圖顯示的是正常細(xì)胞和包括從大鼠胃底獲得的癌癥細(xì)胞在內(nèi)的細(xì)胞在碳酰膽堿作用之前和之后的測定結(jié)果，測定使用了本發(fā)明的另一個實施方案中的細(xì)胞診斷裝置。
圖10的組方圖顯示的是大鼠正常胃底細(xì)胞及大鼠胃底癌癥細(xì)胞對200赫茲電壓脈沖的反應(yīng)，測定使用了本發(fā)明的一個實施方案中的細(xì)胞診斷儀器。
圖11的組方圖顯示的是大鼠正常胃底細(xì)胞來源的細(xì)胞膜成分及大鼠胃底癌癥細(xì)胞來源的細(xì)胞膜成分對200赫茲電壓脈沖的反應(yīng)，測定使用了本發(fā)明的一個實施方案中的細(xì)胞診斷儀器。
圖12是一個示意圖，顯示的是本發(fā)明的實施方案中的細(xì)胞診斷分析芯片。在這個細(xì)胞診斷分析芯片中，a.組織粉碎部分、b.細(xì)胞培養(yǎng)部分、c.傳感器部分、d.刺激物作用部分、e.信號放大部分、f.數(shù)據(jù)處理部分、g.數(shù)據(jù)顯示部分以及h.控制面板部分都在細(xì)胞診斷裝置的基板中予以提供，這樣就可以顯示樣品的狀態(tài)。圖12中的數(shù)字分別代表以下構(gòu)件201樣品入口；202細(xì)胞裂解部分；203細(xì)胞培養(yǎng)部分和傳感器部分；204刺激物作用部分；205信號放大部分；206信號處理部分；207數(shù)據(jù)顯示部分；208控制面板部分。
具體實施例方式
本發(fā)明的細(xì)胞診斷的方法，包括以下步驟提供一個用于測定細(xì)胞物理化學(xué)特性的反應(yīng)系統(tǒng)；在該反應(yīng)系統(tǒng)中放入細(xì)胞或者細(xì)胞膜成分，即樣品；對該樣品進(jìn)行刺激；獲取該樣品的物理化學(xué)特性的指標(biāo)值，并根據(jù)該指標(biāo)值診斷或者描述該細(xì)胞的狀態(tài)。
放置在反應(yīng)系統(tǒng)中的細(xì)胞可以是組織樣品，也可以是分離的、游離的細(xì)胞或者是混合的細(xì)胞。
作為刺激物，可以是物理刺激(如電壓脈沖、電流脈沖、電磁波或者激光)，也可以是化學(xué)刺激(如與藥物的接觸)，或者其他很多方式。
本發(fā)明的相關(guān)裝置是用于細(xì)胞診斷方法的一個反應(yīng)系統(tǒng)。這個裝置包括放置樣品的基板，樣品可以是細(xì)胞或者細(xì)胞膜成分，以及參比電極和測量電極，其特征是參比電極的放置環(huán)境或者其特性與測量電極的放置環(huán)境或者其特性不同。
基板包括一個貫穿的孔，樣品就放在那里，參比電極和測量電極就安置在這個孔的附近，貫穿的孔插在參比電極和測量電極之間。
至于基板所用的材料，可以使用任何一種半導(dǎo)體、絕緣體、無機(jī)材料、有機(jī)材料等，如硅、硅氧化物、絕緣體襯底硅(silicon-on-insulator，以下稱為SOI)、塑料、橡膠、聚合物膜。其中，優(yōu)選使用SOI和聚合物膜，更優(yōu)選是使用多孔聚合物膜。基板厚度一般在1到10000μm之間，優(yōu)選在1到100μm之間，更優(yōu)選在5到10μm之間。
上述放置環(huán)境或特性的一個例子是參比電極或者測量電極所在區(qū)域的容積。測量電極所在的區(qū)域容積優(yōu)選小于參比電極的。在這個例子中，放置參比電極的區(qū)域容積至少是測量電極的5倍，優(yōu)選是10倍。
典型地，裝置應(yīng)包括在基板之上的細(xì)胞培養(yǎng)部分，以及基板之下的細(xì)胞抽吸部分。細(xì)胞培養(yǎng)部分可以是由基板和一個分隔構(gòu)件組成。在這個例子中，這個分隔構(gòu)件的形狀優(yōu)選是圓柱形的，但不存在嚴(yán)格的限制。這個分隔構(gòu)件的材料優(yōu)選是硅、硅氧化物、塑料、橡膠、或者相類似的材料。這里的術(shù)語“傳感器部分”是特指除細(xì)胞培養(yǎng)部分及細(xì)胞抽吸部分以外的裝置。
我們將借助圖1和圖2具體描述本發(fā)明。圖1是本裝置的一個橫斷面示意圖，其示范性地示出這個裝置被用做本發(fā)明的方法中所使用的反應(yīng)系統(tǒng)。
細(xì)胞診斷裝置1包括一個SOI基板2。SOI基板2的上表面上有壁3(細(xì)胞培養(yǎng)部分)以容納樣品(細(xì)胞或者細(xì)胞膜成分)。由金或者其他材料制成的測量電極4位于SOI基板2的下表面，用于探測信號。壁3內(nèi)盛有大約50μl的培養(yǎng)液5作為電解液。在SOI基板2的貫通孔7中，大約有1μl或者更少的培養(yǎng)液。
壁3由用于盛放培養(yǎng)液的分隔構(gòu)件(未顯示)和SOI基板2組成。壁3內(nèi)的SOI基板中有下陷槽6，其形狀是最適于盛放細(xì)胞或者細(xì)胞膜成分的。一般說來，下陷槽6的開口直徑約為10μm為一個半橢圓形。參比電極8(一般是Ag-AgCl)放在壁3之內(nèi)，浸在培養(yǎng)液5中。
壁3內(nèi)有參比電極8，浸有參比電極8的培養(yǎng)液5，下陷槽6，這些共同組成參比電極的放置環(huán)境，貫通孔7和其中的培養(yǎng)液共同組成測量電極的放置環(huán)境。
下陷槽6的尺寸依樣品的不同而變化，并無特別限定，只要下陷槽6可容納樣品。一般說來，下陷槽6的開口直徑在10到500μm，其深度一般在1-500μm之間。典型地，下陷槽6的直徑在10-100μm之間，其深度一般在2-100μm之間。舉個例子，優(yōu)選的下陷坑的開口直徑是20μm，深度是10μm，另一種優(yōu)選的下陷坑的開口直徑是20μm，深度是20μm。同時，貫通孔的尺寸也不做特別限制，只要樣品不會穿過這個貫通孔，并能被容納在下陷坑里就可以。一般說來，貫通孔的直徑在1-100μm之間，深度在10-100μm之間。舉個例子，優(yōu)選的貫通孔的直徑是5μm，深度為1.5μm。
圖1的下半部分顯示的為下陷坑的放大的平面圖示。
圖2是本發(fā)明的方法所用的反應(yīng)系統(tǒng)的另一個示范性裝置的示意圖。圖2中的裝置10與圖1中的裝置1不同，它有著多個下陷槽6及貫通孔7。如圖2所示，幾個樣品19(在圖中是橢圓形的)被分別放入不同的下陷槽6?；?2至14由SOI制成。SiO2(二氧化硅)層13在硅層12之下，支持基板14在SiO2(二氧化硅)層13之下。測量電極4在基板12-14的背側(cè)表面，其中測量電極4沿SiO2(二氧化硅)層13和支持基板14的部分表面走行，測量電極4與樣品19相接觸，或者就在樣品19的附近，優(yōu)選是與樣品19的距離在10μm之內(nèi)。
本發(fā)明方法的反應(yīng)系統(tǒng)所使用的裝置中，在測量電極4周圍僅需要非常少量的電解液。需要特別指出的是，在基板與放置樣品的一面相對的另一個表面(即背面)附近的電解液的量不應(yīng)超過1-10μl，這其中還應(yīng)包括充滿貫通孔的電解液。
如圖1和圖2所示，每個測量電極都可以有自己的下陷槽6和貫通孔7，或者每個測量電極也可以有多個下陷槽6和貫通孔7。
圖3是個顯示細(xì)胞抽吸部分的示意圖。這個部分可以在使用圖2中的裝置10進(jìn)行樣品(細(xì)胞或者細(xì)胞膜成分)物理化學(xué)特性測定時選擇性使用。圖3顯示的是一個細(xì)胞抽吸系統(tǒng)，包括一個抽吸管道附件35和一個細(xì)胞抽吸系統(tǒng)管道37，該系統(tǒng)位于SiO2(二氧化硅)層13的背面表面，并共同構(gòu)成基板。抽吸管道附件35由諸如丙烯酸樹脂、PMDS、硅橡膠等類似材料制成，構(gòu)成間隔部分31，后者與細(xì)胞抽吸系統(tǒng)管道37相連接，并且與基板中的貫通孔7相呼應(yīng)。抽吸管道附件35通過硅橡膠或其類似材料貼靠在基板的背側(cè)表面。另外，抽吸管道附件35還可以附著整合在基板上。如圖3所示，當(dāng)測量細(xì)胞或者細(xì)胞膜成分的物理化學(xué)特性時，由于受到從細(xì)胞抽吸系統(tǒng)管道37而來的抽吸壓力，樣品(細(xì)胞或者細(xì)胞膜成分)緊緊地附著在基板上。在本例中，只要樣品(細(xì)胞或者細(xì)胞膜成分)的物理化學(xué)特性能夠被測量電極準(zhǔn)確地測量到，細(xì)胞抽吸部分就不需要完全充滿電解液。請注意，在圖3中樣品(細(xì)胞或者細(xì)胞膜成分)并沒有加以顯示，下陷槽和貫穿孔的結(jié)構(gòu)也被簡化了。
圖4是一個概念性示意圖，顯示的是本發(fā)明裝置的一個細(xì)胞診斷儀器的結(jié)構(gòu)。這個儀器是用來測定細(xì)胞狀態(tài)的。該儀器包括測量部分(信號源101)(組成裝置的一部分)；單位標(biāo)準(zhǔn)差計算部分102，對來自測量部分101的信號進(jìn)行取樣，計算標(biāo)準(zhǔn)差；平均值計算部分105，用于計算所得到的標(biāo)準(zhǔn)差的平均值；特征值計算部分108，用于通過對平均值計算部分105得到并輸出的標(biāo)準(zhǔn)差平均值的計算，得到樣品(細(xì)胞或者細(xì)胞膜成分)的物理化學(xué)特性值；數(shù)據(jù)顯示部分110，用于顯示所得到的物理化學(xué)特性值。各部分之間的連接在圖4中用虛線或者實線表示。一般而言，單位標(biāo)準(zhǔn)差計算部分102、平均值計算部分105及特征值計算部分108都是為實現(xiàn)上述計算而設(shè)計的程序，貯存于與系統(tǒng)相連的計算機(jī)硬盤中。而顯示數(shù)據(jù)部分110則就是CRT。
另外，在圖4中，標(biāo)記數(shù)字103、104、106、107及109分別代表著正態(tài)分布曲線擬和部分，刺激物產(chǎn)生部分，平均值和半寬度計算部分，信號加和部分和活性值分類部分。下面我們將予以詳述。
圖12是一個示意圖，顯示的是本發(fā)明的實施方案中的細(xì)胞診斷分析芯片。這個芯片包括可將樣品(諸如細(xì)胞或者細(xì)胞碎片)放置其上的基板，參比電極和測量電極。在這個基板上，所提供的有樣品入口201，細(xì)胞裂解部分202，細(xì)胞培養(yǎng)部分和傳感器部分(此兩項在圖12中被整合在一起，用203代表)，刺激物作用部分204，信號放大部分205，信號處理部分206，數(shù)據(jù)顯示部分207和控制面板部分208。有了這些組成，就可以實現(xiàn)細(xì)胞診斷的一系列步驟并可以顯示出結(jié)果。
樣品從樣品入口被注入，經(jīng)過一個引流連接管，進(jìn)入到細(xì)胞裂解部分202。一般說來細(xì)胞裂解部分202是由一個微過濾器組成，其直徑為20μm(Millipore公司有售)，將之覆蓋在細(xì)胞培養(yǎng)部分中的待測樣品(如細(xì)胞或者細(xì)胞膜成分)上。然后，將被覆蓋的樣品通過引流連接管引入細(xì)胞培養(yǎng)部分。細(xì)胞培養(yǎng)部分位于傳感器(如前所述的)之上，后者包括參比電極和測量電極。利用控制面板208的控制，使用激發(fā)部分204在傳感器中激發(fā)被引入的樣品，這樣，就能產(chǎn)生一個信號，也就是這個樣品的物理化學(xué)特性的指標(biāo)值。
典型地，細(xì)胞培養(yǎng)部分包括溫度控制器，以保證樣品處在激活狀態(tài)。另外，還需要一個濕度控制器。溫度控制的裝置可以使用Peltier裝置、IH加熱器或者其他類似儀器。所產(chǎn)生的信號，被信號放大部分205放大，然后再由信號處理部分206進(jìn)行處理，最后傳入數(shù)據(jù)顯示部分207，這里我們就能夠看到處理后的結(jié)果了。注意，用于構(gòu)成上述各構(gòu)件以及構(gòu)成各構(gòu)件之間的連接物的元件，可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的元件，在此我們就不再加以詳述。另外，根據(jù)圖12中所示的例子，細(xì)胞診斷分析芯片包括四個流水線，每個都有上述各構(gòu)件組成，可以實現(xiàn)上述一系列的操作步驟。而且流水線的數(shù)目是不限的。
本發(fā)明方法、裝置以及細(xì)胞診斷用儀器，提供了一種新的進(jìn)行細(xì)胞診斷的方法。這種方法所用儀器及裝置簡單，可以提取到普通細(xì)胞外方法無法得到的信號。
本發(fā)明的細(xì)胞診斷方法不需要抗體，所以，也不需要使用抗體的方法中必需的染色步驟。因此，由于抗體滴度問題所造成的診斷錯誤也就不會發(fā)生。本發(fā)明的細(xì)胞診斷方法是通過測量細(xì)胞或者其膜碎片的物理化學(xué)特性來測知待診斷的目的細(xì)胞內(nèi)的變化的?？梢酝瑫r處理大量樣品，且速度快，處理可以實現(xiàn)自動化。
本發(fā)明的細(xì)胞診斷方法一般說來是處理數(shù)字信號(時間序列信號值)的，這些信號都是在測定細(xì)胞或其膜碎片的物理化學(xué)特性的指標(biāo)值的步驟中以預(yù)先確定的取樣速度取樣得到的，這樣就可以在對細(xì)胞及其膜碎片的物理化學(xué)特性進(jìn)行提取、測量、分類時明確地與噪音信號相區(qū)別。
本發(fā)明的細(xì)胞診斷裝置及儀器不需要專門的控制儀器，僅需將樣品放在基板上，不需要在樣品和基板間制造一個高阻抗層(gigaseal)，這就可以用很短的時間對樣品(細(xì)胞或者細(xì)胞膜成分)的細(xì)胞外電位進(jìn)行測量。
使用本發(fā)明的裝置，就可以通過改變測量電極或者參比電極的放置環(huán)境，來測量細(xì)胞或者細(xì)胞碎片的物理化學(xué)特性，而不需要在樣品和基板間制造一個高阻抗層(gigaseal)。實施例下面將就參照圖示介紹幾個本發(fā)明的特殊實施例。
實施例的目的在于用來描述本發(fā)明，而非對其進(jìn)行限制。(實施例1)本例中使用的細(xì)胞診斷儀器的結(jié)構(gòu)組成示意圖見圖4，該儀器包括圖3中所示的裝置，后者在這里用于測量部分(信號源)101。來自大鼠胃底的正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞作為樣品。我們使用該儀器來測定化學(xué)物質(zhì)碳酰膽堿對這些樣品的作用。
化學(xué)物質(zhì)碳酰膽堿是一種神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿的類似物。將碳酰膽堿(Sigma生產(chǎn))溶于林格氏液(Krebs Ringer)中，濃度分別是0、0.1、0.3、1、3、10、30以及100μM。將每個溶液都分別對來自大鼠胃底的正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞進(jìn)行處理，這些不同濃度的溶液可用于測量電信號。使用圖3中所示的細(xì)胞診斷裝置的測量部分(信號源)101，給每個不同濃度的碳酰膽堿溶液測定10秒的時間序列信號值，每隔100ms取樣一次，以獲得時間序列數(shù)據(jù)，接著計算取樣數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)差。圖8所示為用標(biāo)準(zhǔn)差的平均值所做的圖。在圖8中，黑色圓圈代表從腫瘤細(xì)胞得到的數(shù)據(jù)，白色圓圈代表從正常細(xì)胞得到的數(shù)據(jù)。
如圖8所示，可以肯定，無論是正常細(xì)胞還是腫瘤細(xì)胞，碳酰膽堿的濃度越高，100ms間隔的標(biāo)準(zhǔn)差平均值就越高。這表明來自大鼠胃底細(xì)胞的離子通道的活化對碳酰膽堿的濃度有依賴性。
如圖8所示，與正常細(xì)胞相比，從腫瘤細(xì)胞所得到的電信號的標(biāo)準(zhǔn)差較大，表明腫瘤細(xì)胞的碳酰膽堿依賴方式可能與正常細(xì)胞不同。這里碳酰膽堿的濃度是1到30μM。因此，本發(fā)明的方法和細(xì)胞診斷儀器可以用于測量細(xì)胞的物理化學(xué)特性，并可以用于探知是否存在有腫瘤細(xì)胞。(實施例2)圖5是一個示意圖，顯示的是本發(fā)明中用于測定目的細(xì)胞狀態(tài)的細(xì)胞診斷儀器的構(gòu)造。這里的儀器與圖4中的相似，只是正態(tài)分布曲線擬和部分103、平均值和半寬度計算部分106及特征分類部分109在這里就相當(dāng)于平均值計算部分105和特征計算部分108的位置。各個部分之間的連接在圖5中用虛線或者實線表示。
通過單位標(biāo)準(zhǔn)差計算部分102，正態(tài)分布曲線擬和部分103將多個標(biāo)準(zhǔn)差的值分為多個組，單位是預(yù)先確定了的標(biāo)準(zhǔn)差寬度。在坐標(biāo)軸上標(biāo)注各標(biāo)準(zhǔn)差值，X軸表示組、y軸則表示該組的標(biāo)準(zhǔn)差值的數(shù)字。然后將所得的曲線與正態(tài)分布曲線擬和。接著，平均值和半寬度計算部分106計算所得的正態(tài)分布曲線的平均值和半寬度。特征分類部分109根據(jù)所得的平均值和半寬度對物理化學(xué)特性進(jìn)行分類。注意，與圖4所示儀器相似，單位標(biāo)準(zhǔn)差計算部分102，正態(tài)分布曲線擬和部分103、平均值和半寬度計算部分106及特征分類部分109一般都可以軟件程序的形式保留在計算機(jī)的硬盤上。顯示數(shù)據(jù)部分110可以是CRT。
儀器的結(jié)構(gòu)示意圖如圖5所示，它包括圖3中所示的裝置，作為其測量部分(信號源)，用來測量碳酰膽堿在樣品中的變化。這里的樣品同例1一樣，也是來自大鼠胃底的正常細(xì)胞和混有腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞。
用濃度為50μM的碳酰膽堿對來自大鼠胃底的正常細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞進(jìn)行處理之前和之后，我們可以從測量部分(信號源)101獲得相應(yīng)的信號，接著就可以計算信號的標(biāo)準(zhǔn)差，這與實施例1中的方式相似。正態(tài)分布曲線擬和部分103將各標(biāo)準(zhǔn)差繪成圖形，如圖9所示。
圖9(A)中所示，是一個根據(jù)時間序列的電信號數(shù)據(jù)計算得到的標(biāo)準(zhǔn)差值的柱狀圖，這個時間序列是在正常細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞用碳酰膽堿處理之前的10秒內(nèi)每隔5毫秒取樣一次得到的。圖9(B)所示的也是一個根據(jù)時間序列的電信號數(shù)據(jù)計算得到的標(biāo)準(zhǔn)差值的柱狀圖，但這個時間序列是在正常細(xì)胞用碳酰膽堿處理之后的10秒內(nèi)每隔5毫秒取樣一次得到的。圖9(C)所示的則是根據(jù)腫瘤細(xì)胞用碳酰膽堿處理之后的所得數(shù)據(jù)的相應(yīng)柱狀圖。如圖9所示，這證實，用碳酰膽堿處理后，每隔5毫秒所得的正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)差平均值都有所增高。另外，這還證實，腫瘤細(xì)胞的平均值和半寬度值都比正常細(xì)胞的大些。因此，本發(fā)明的這種方法和細(xì)胞診斷儀器可以用來測定細(xì)胞的物理化學(xué)特性及判斷腫瘤細(xì)胞的存在與否。(實施例3)與實施例1相同，使用來自大鼠正常胃底的細(xì)胞及患有胃底癌的大鼠的胃底腫瘤細(xì)胞作為樣品細(xì)胞。使用200Hz電脈沖激發(fā)樣品，接著測量樣品所發(fā)出的電壓信號。結(jié)果見圖10。然后，取分別來自正常細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜成分作為樣品，進(jìn)行相同的實驗。結(jié)果見圖11。在每個圖中，實線代表來自正常細(xì)胞樣品的結(jié)果，虛線代表來自腫瘤細(xì)胞樣品的結(jié)果。
如圖10和11所示，無論是用細(xì)胞作為樣品還是用細(xì)胞碎片作為樣品，與正常細(xì)胞相比，腫瘤細(xì)胞中的電壓信號的振幅較小。因此，本發(fā)明的這種方法和細(xì)胞診斷儀器可以用來測定細(xì)胞的物理化學(xué)特性及判斷腫瘤細(xì)胞的存在與否。
在本實施例中，沒有使用如圖4所示的單位標(biāo)準(zhǔn)差值計算部分，而只是比較了電壓信號的衰減。當(dāng)然，如果進(jìn)行更詳細(xì)的分析，也可以對不同的頻率、電阻抗變化或者電容進(jìn)行比較。
如上所述，可以看出，使用本發(fā)明的方法和細(xì)胞診斷儀器來代替?zhèn)鹘y(tǒng)的免疫染色技術(shù)，可以簡便的測定細(xì)胞或者細(xì)胞膜成分的物理化學(xué)特性，進(jìn)而判斷細(xì)胞的狀態(tài)。在上面提及的幾個實施例中都是在一個反應(yīng)系統(tǒng)中對多個細(xì)胞或者由多個細(xì)胞制備而得的細(xì)胞膜成分同時進(jìn)行測定，但對單個細(xì)胞進(jìn)行測量也可以得到相似的結(jié)果。
注意，雖然上述實施例采用了圖4和圖5中所示意的儀器，但實際上具有圖6或者圖7中所示意的構(gòu)造的儀器也同樣可以使用。
與圖5相比，圖6所示的儀器還包括樣品編號分類部分即標(biāo)注為111的部分。
圖7所示儀器與圖5是一樣的，只是圖7中的儀器包括多個信號源101，信號產(chǎn)生部分104是用于激發(fā)信號源101的，信號加和部分107用于對來自信號源101的多個信號進(jìn)行加和。
工業(yè)實用性本發(fā)明提供了一種細(xì)胞診斷方法及其使用的裝置和儀器，其通過測量由于細(xì)胞內(nèi)的變化所引起的物理化學(xué)特性的改變，可輕易地在短時間內(nèi)實現(xiàn)對大量樣品的處理。
權(quán)利要求
1.一種用于診斷細(xì)胞的狀態(tài)和特征的方法，所述方法包含以下步驟為測量所述細(xì)胞的物理化學(xué)特性提供一個反應(yīng)系統(tǒng)；將包括所述細(xì)胞的細(xì)胞膜成分在內(nèi)的樣品放入所述反應(yīng)系統(tǒng)內(nèi)；對所述樣品施加一種刺激物；獲取所述樣品的物理化學(xué)特性的指標(biāo)值；并參照所述指標(biāo)值對所述細(xì)胞的狀態(tài)作出診斷。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述診斷步驟包含將所述指標(biāo)值與對照樣品的物理化學(xué)特性的指標(biāo)值進(jìn)行比較。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述刺激物選自化學(xué)物質(zhì)、蛋白質(zhì)、氨基酸、電壓脈沖、電流脈沖、電磁波、以及激光。
4.用于權(quán)利要求1的反應(yīng)系統(tǒng)的裝置，其包含放置所述樣品的基板；參比電極；和測量電極，其中所述參比電極的放置環(huán)境或特性與所述測量電極的放置環(huán)境或特性是不同的。
5.權(quán)利要求4的裝置，其中所述基板包含用于放置樣品的貫通孔；而所述樣品被放置于該參比電極和測量電極之間，并置于所述貫通孔附近。
6.權(quán)利要求4的裝置，其中所述參比電極的放置環(huán)境或特性以及所述測量電極的放置環(huán)境或特性分別是放置該參比電極和測量電極的區(qū)域的容積；而所述測量電極的放置區(qū)域的容積小于所述參比電極的放置區(qū)域的容積。
7.權(quán)利要求1的方法，其中提供所述反應(yīng)系統(tǒng)的步驟包含將足夠量的電解液放置于權(quán)利要求5的裝置中，使得所述參比電極和測量電極浸沒在所述電解液中，而放置步驟包含將該樣品定位于所述裝置的貫通孔上，其中浸沒參比電極的電解液的量多于浸沒測量電極的電解液的量。
8.權(quán)利要求5的裝置，其進(jìn)一步包含一放置于所述基板上方的細(xì)胞培養(yǎng)部分，以及一放置于所述基板下方的細(xì)胞抽吸部分，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)部分由一個分隔構(gòu)件和所述基板構(gòu)成。
9.權(quán)利要求8的裝置，其中所述參比電極被放置于該分隔構(gòu)件的內(nèi)壁。
10.權(quán)利要求1的方法，其中獲取所述指標(biāo)值的步驟包含(a)將樣品發(fā)出的物理化學(xué)信號作為時間序列的信號值進(jìn)行記錄；(b)對該時間序列的信號值進(jìn)行取樣，以得到多組由多個數(shù)值組成的提取的數(shù)據(jù)，并計算每組數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)差；(c)計算所述標(biāo)準(zhǔn)差的平均值；并(d)將該平均值作為所述的指標(biāo)值。
11.權(quán)利要求1的方法，其中獲取所述指標(biāo)值的步驟包含(a)將樣品發(fā)出的物理化學(xué)信號作為時間序列的信號值進(jìn)行記錄；(b)對該時間序列的信號值進(jìn)行取樣，以得到多組由多個數(shù)值組成的提取的數(shù)據(jù)，并計算每組數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)差；(c)將所述標(biāo)準(zhǔn)差分入多個以預(yù)先確定的標(biāo)準(zhǔn)差的大小作為單位的組中，并得到一個代表所述樣品的物理化學(xué)特性的分布曲線；(d)將該分布曲線向正態(tài)分布曲線逼近；并(e)計算最終得到的正態(tài)分布曲線的平均值和半寬度，并將該平均值和半寬度作為所述的指標(biāo)值。
12.權(quán)利要求11的方法，其中的步驟(b)到(e)被重復(fù)多次，在每次重復(fù)中被取樣的所述時間序列信號值的數(shù)目被改變以獲取多個正態(tài)分布曲線，而所述的指標(biāo)值選自所述正態(tài)分布曲線的平均值和半寬度。
13.權(quán)利要求11的方法，其具有多個用于測量細(xì)胞的物理化學(xué)特性的反應(yīng)系統(tǒng)，并且在步驟(b)之前，該方法進(jìn)一步包含加和由置于反應(yīng)系統(tǒng)中的多個樣品所發(fā)出的時間序列信號值。
14.權(quán)利要求13的方法，其中在步驟(a)之前，該方法進(jìn)一步包含同時激發(fā)置于反應(yīng)系統(tǒng)中的樣品。
15.權(quán)利要求1的方法，其中獲取所述指標(biāo)值的步驟包含(a)將樣品發(fā)出的物理化學(xué)信號作為時間序列的信號值進(jìn)行記錄；(b)對該時間序列的信號值進(jìn)行取樣，以得到多組由多個數(shù)值組成的提取的數(shù)據(jù)，并計算每組提取的數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)差；(c)將所述標(biāo)準(zhǔn)差分入多個以預(yù)先確定的標(biāo)準(zhǔn)差的大小作為單位的組中，并得到一個代表所述樣品的物理化學(xué)特性的分布曲線；(d)將所得到的分布曲線通過選自指標(biāo)值遞減分析、指標(biāo)值遞增分析、高斯分布、勞倫斯分布、σ分析、多峰分析、以及非線性分析的曲線逼近擬和分析進(jìn)行擬和；以及(e)根據(jù)經(jīng)步驟(d)得到的擬和曲線峰值前后的斜率，獲取所述樣品的物理化學(xué)特性的指標(biāo)值。
16.權(quán)利要求10的方法，其中的步驟(b)以時間序列的形式自初始數(shù)據(jù)a進(jìn)行多次，所述初始數(shù)據(jù)a是時間序列信號值中的一個，并且該步驟(b)以時間序列的形式自記錄于初始數(shù)據(jù)a之后的預(yù)先確定的時間的數(shù)據(jù)b進(jìn)行多次。
17.權(quán)利要求1的方法，其中獲取所述指標(biāo)值的步驟包含(a)將樣品發(fā)出的物理化學(xué)信號作為時間序列的信號值進(jìn)行記錄；(b)對該時間序列的信號值進(jìn)行取樣，以得到多組由多個數(shù)值組成的提取的數(shù)據(jù)，并計算每組提取的數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)差；(c)對所得的標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行取樣，以得到多組由多個數(shù)值組成的提取的標(biāo)準(zhǔn)差，并計算每組提取的標(biāo)準(zhǔn)差的平均值；并(d)根據(jù)當(dāng)該時間序列的信號值的平均值達(dá)到一個預(yù)先確定的閾值的時間而獲取該樣品的物理化學(xué)特性的指標(biāo)值。
18.權(quán)利要求11的方法，其中的步驟(a)在一種對所述樣品具有已知作用的標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)物質(zhì)和一種待測化學(xué)物質(zhì)存在的情況下進(jìn)行，并通過改變標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)物質(zhì)和待測化學(xué)物質(zhì)的濃度而重復(fù)步驟(b)到(e)，并且其中的診斷步驟進(jìn)一步包含將在該標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)物質(zhì)存在的情況下獲取的指標(biāo)值與在該待測化學(xué)物質(zhì)存在的情況下獲取的指標(biāo)值進(jìn)行比較。
19.一種細(xì)胞診斷儀器，其包含一個反應(yīng)系統(tǒng)，所述反應(yīng)系統(tǒng)包含權(quán)利要求8中的細(xì)胞診斷裝置以及用于測定樣品的物理化學(xué)特性的方法。
20.一種細(xì)胞診斷分析芯片，其包含用于放置包括細(xì)胞的細(xì)胞膜成分在內(nèi)的樣品的基板，一個參比電極，和一個測量電極，其中所述基板具有a.組織粉碎部分、b.細(xì)胞培養(yǎng)部分、c.傳感器部分、d.刺激物作用部分、e.信號放大部分、f.信號處理部分、g.數(shù)據(jù)顯示部分、和h.控制面板部分，由此來顯示該樣品的狀態(tài)。
21.權(quán)利要求20的細(xì)胞診斷芯片，其中的a.組織粉碎部分包含一個直徑為1-100μm的微濾器。
22.權(quán)利要求20的細(xì)胞診斷芯片，其中的b.細(xì)胞培養(yǎng)部分具有溫控措施。
23.權(quán)利要求22的細(xì)胞診斷芯片，其中的b.細(xì)胞培養(yǎng)部分進(jìn)一步具有濕度控制措施。
24.權(quán)利要求22的細(xì)胞診斷芯片，其中所述溫度控制措施具有Peltier設(shè)備或是IH加熱器。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于診斷細(xì)胞的狀態(tài)和特征的方法，其步驟包含提供用于測定細(xì)胞的物理化學(xué)特性的反應(yīng)系統(tǒng)，將包括細(xì)胞的細(xì)胞膜成分在內(nèi)的樣品置于該反應(yīng)系統(tǒng)中，將刺激物施加于該樣品，獲取該樣品物理化學(xué)特性的指標(biāo)值，并參照該指標(biāo)值對該細(xì)胞的狀態(tài)做出診斷。其中參比電極的放置環(huán)境或特性不同于測量電極的放置環(huán)境或特性，基板包含用于放置樣品的貫通孔，所述樣品被置于該參比電極和測量電極之間并鄰近所述貫通孔。
文檔編號C12M1/36GK1464909SQ02802624
公開日2003年12月31日 申請日期2002年8月5日 優(yōu)先權(quán)日2001年8月9日
發(fā)明者岡弘章, 小川龍?zhí)?申請人:松下電器產(chǎn)業(yè)株式會社