專利名稱：生物傳感器的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于測(cè)量樣品中所含基質(zhì)的生物傳感器。
作為定量樣品中所含組分的一種示例性的方法，此處描述了一種定量葡萄糖的方法。β-D-葡萄糖氧化酶(本文以下稱作“GOx”)是專門(mén)用于催化葡萄糖氧化的酶。在含有GOx和葡萄糖的反應(yīng)溶液中存在氧分子，當(dāng)葡萄糖氧化時(shí)，氧被還原，從而產(chǎn)生過(guò)氧化氫。使用氧電極或過(guò)氧化氫電極，氧或過(guò)氧化氫被分別還原或氧化，并且測(cè)量通過(guò)的電流量。氧的減少量和過(guò)氧化氫的增加量與葡萄糖的量成比例。產(chǎn)生的電流量與氧的減少量和過(guò)氧化氫的增加量成比例。因此，上述測(cè)量方法實(shí)現(xiàn)了葡萄糖的定量(例如，參見(jiàn)A.P.F.Turner等，生物傳感器，原理及應(yīng)用(Biosensors，F(xiàn)undamentals andApplications)，Oxford University Press，1987)。氧和過(guò)氧化氫調(diào)節(jié)反應(yīng)中產(chǎn)生的電子從酶到電極的轉(zhuǎn)移，并被稱為“電子介體”。
當(dāng)用氧和過(guò)氧化氫作為電子介體時(shí)，可能產(chǎn)生測(cè)量誤差，因?yàn)槊總€(gè)樣品具有不同的氧含量。
為了解決這個(gè)問(wèn)題，已經(jīng)發(fā)展了一種使用合成的氧化還原化合物作為電子介體的測(cè)量方法。通過(guò)在樣品中溶解規(guī)定量的電子介體，可以實(shí)現(xiàn)帶有較小誤差的穩(wěn)定測(cè)量。還可通過(guò)將電子介體與GOx一起裝載到電極上，并且由此在幾乎干燥的狀態(tài)下使電子介體與電極系統(tǒng)結(jié)合在一起的方法來(lái)形成傳感元件。最近，已經(jīng)發(fā)展了一種基于這種技術(shù)的一次性葡萄糖傳感器，該傳感器引起了很大的關(guān)注。這種傳感器的一個(gè)代表性的實(shí)例是日本專利第2517153號(hào)中描述的生物傳感器。使用一次性葡萄糖傳感器，通過(guò)將樣品溶液簡(jiǎn)單引入可分開(kāi)地偶合在測(cè)量裝置上的傳感元件中，就能夠容易地測(cè)量葡萄糖的含量。
傳感器的測(cè)量誤差還可能是由樣品中所含不同于待測(cè)量基質(zhì)的物質(zhì)的影響所引起的。例如，在使用血液作為樣品的生物傳感器的情況下，測(cè)量誤差可能按下述情況發(fā)生。包括血液中所含的血細(xì)胞或蛋白質(zhì)的肽被吸附到電極的表面。這降低了電極反應(yīng)中涉及的電極的有效面積。因此，降低了對(duì)應(yīng)于葡萄糖氧化的電流，引起測(cè)量誤差。電流的降低程度取決于肽的吸附程度。肽的吸附程度取決于樣品中肽的濃度。因此，很難預(yù)測(cè)電流降低的程度從而補(bǔ)償誤差。
產(chǎn)生上述測(cè)量誤差的物質(zhì)稱作“干擾物質(zhì)”。為了削除干擾物質(zhì)的影響，使用了各種測(cè)量方法。例如，美國(guó)專利第6033866號(hào)公開(kāi)了一種在電極上提供血細(xì)胞分離過(guò)濾器，使得血細(xì)胞被高效地完全去除的方法。然而，該方法使傳感器的結(jié)構(gòu)變得復(fù)雜，并且因?yàn)檠?xì)胞的分離需要時(shí)間而阻礙了快速定量。
在日本專利第2517153號(hào)描述的傳感器中，電極表面用親水聚合物如羧甲基纖維素覆蓋，從而阻止了干擾物質(zhì)如血細(xì)胞的吸附。由于這種結(jié)構(gòu)，該傳感器實(shí)現(xiàn)了快速測(cè)量。但是，該方法不能完全阻止干擾物質(zhì)吸附到電極的表面。原因是因?yàn)橛脕?lái)覆蓋電極的親水聚合物在與樣品溶液接觸時(shí)會(huì)溶解，這樣，樣品中的干擾物質(zhì)就能夠接近電極的表面了。
已知分子中含有至少一個(gè)硫原子的化合物能夠強(qiáng)烈地吸附到許多過(guò)渡金屬的表面上，形成一層非常薄的薄膜(超薄薄膜)(例如，參見(jiàn)M.J.Weaver等，J.Am.Chem.Soc.106(1984)，6107-6108)。在這些化合物中，硫醇和二硫化物能化學(xué)吸附到貴金屬的表面，并與貴金屬原子形成強(qiáng)的鍵。在J.Am.Chem.Soc.105(1983)，4481-4483和109(1987)，3559-3568中，R.G.Nuzzo和D.L.Allara已經(jīng)闡明了這些化合物能形成硫醇鹽化合物的超薄薄膜，該薄膜由自組裝、組織并且稠密堆積的單分子形成。覆蓋有這種超薄薄膜的貴金屬可以用作電極。甚至在與任何常用溶劑接觸時(shí)，這種覆蓋層也不會(huì)溶解或剝離。甚至當(dāng)覆蓋層由稠密堆積的分子形成時(shí)，只要覆蓋層足夠薄就幾乎觀察不到電極界面的IR電位降。因此，電化學(xué)活性化合物的電極反應(yīng)能夠以滿意方式進(jìn)行。
I.Willner等公開(kāi)了使用硫醇和二硫化物單分子薄膜作為將酶共價(jià)地固定到電極上的錨(參見(jiàn)I.Willner等，J.Am.Chem.Soc.114(1992)，10965)。圖3(B)所示為I.Willner等公開(kāi)的單分子薄膜的結(jié)構(gòu)。圖3(B)中，“E”代表酶，“S-N”表示形成單分子薄膜的硫醇和二硫化物的結(jié)構(gòu)(“S”代表硫，“N”代表氮)，E和N間的之字形線表示共價(jià)鍵。現(xiàn)有技術(shù)并沒(méi)有公開(kāi)硫醇和二硫化物單分子薄膜具有阻止干擾物質(zhì)吸附的作用。
為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明用于測(cè)量樣品溶液中所含基質(zhì)的生物傳感器包括一個(gè)或多個(gè)絕緣基板；包含設(shè)置在基板上的一對(duì)電極(一個(gè)工作電極和一個(gè)對(duì)電極)的電極系統(tǒng)；以及包含氧化還原酶和電子介體的測(cè)量試劑。樣品溶液含有肽，工作電極包括金屬，而且工作電極至少有部分表面被含有至少一個(gè)硫原子的有機(jī)化合物的薄膜所覆蓋。
本發(fā)明涉及用于測(cè)量樣品溶液中所含基質(zhì)的生物傳感器，該傳感器包括絕緣基板、設(shè)置在該絕緣基板上的工作電極和對(duì)電極，以及包含氧化還原酶和電子介體的測(cè)量試劑。樣品溶液含有肽，工作電極包括金屬，而且工作電極至少有部分表面被含有至少一個(gè)硫原子的有機(jī)化合物的薄膜所覆蓋。
生物傳感器可以進(jìn)一步包括參比電極。
對(duì)電極至少有部分表面被含有至少一個(gè)硫原子的有機(jī)化合物的薄膜所覆蓋。
含有至少一個(gè)硫原子的有機(jī)化合物可以是硫醇化合物、二硫化物、或硫醇鹽化合物。
含有至少一個(gè)硫原子的有機(jī)化合物可以是由下面通式(1)、(2)或(3)表示的化合物HS-(CH2)n-X 通式(1)X-(CH2)n-S-S-(CH2)n-X 通式(2)-S-(CH2)n-X 通式(3)式中n表示1-10的整數(shù)，X表示氨基、羧基、羥基、甲基、氨芐基、羧基芐基、或苯基。
優(yōu)選地，含有至少一個(gè)硫原子的有機(jī)化合物可以在工作電極的表面上形成基本上是單分子的薄膜。
工作電極的1/30至1/3的面積可被含有至少一個(gè)硫原子的有機(jī)化合物所覆蓋。
金屬可包括金、鈀、或鉑。
氧化還原酶可選自以下組中葡萄糖氧化酶、幽門(mén)喹啉醌相關(guān)葡糖脫氫酶、煙堿酰胺腺嘌呤二核苷酸相關(guān)葡糖脫氫酶、煙堿酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸鹽相關(guān)葡糖脫氫酶、以及膽固醇氧化酶。
電子介體可以是鐵氰酸離子。
測(cè)量用試劑可以進(jìn)一步包括pH緩沖劑。
本發(fā)明還涉及一種生物傳感器，其包括絕緣基板、設(shè)置在絕緣基板上的一對(duì)電極，至少一對(duì)電極之一包含金屬，而且至少一個(gè)電極的部分表面被含有至少一個(gè)硫原子的有機(jī)化合物薄膜所覆蓋。含有肽的樣品溶液和氧化還原酶之間的反應(yīng)在電子介體存在的情況下被定量。
氧化還原酶和電子介體可以在含有至少一個(gè)硫原子的有機(jī)化合物薄膜中提供。
本發(fā)明還涉及測(cè)量含肽樣品溶液中所含基質(zhì)的生物傳感器。該生物傳感器包括絕緣基板，基板上包括一對(duì)電極以及與兩個(gè)電極相連的導(dǎo)線，至少該一對(duì)電極之一包括含有至少一個(gè)硫原子的有機(jī)化合物薄膜，該薄膜在至少一個(gè)電極的至少部分表面形成；還包括設(shè)置在基板上的帶有裂縫的隔離層；以及設(shè)置在裂縫上提供的具有氣孔的覆蓋層。該裂縫可以形成樣品溶液的供給通道，并且裂縫的開(kāi)口端形成了樣品的供給口。
本發(fā)明生物傳感器可以進(jìn)一步包括一層在兩個(gè)電極上提供的測(cè)量試劑。
測(cè)量試劑層可以包括pH緩沖劑。
圖2是

圖1中所示生物傳感器的部分垂直截面圖。
圖1和2中顯示的標(biāo)記代表如下元件。
1基板；2工作電極；3對(duì)電極；4和5導(dǎo)線；6裂縫；7隔離層；8氣孔；9覆蓋層；10含有至少一個(gè)硫原子的有機(jī)化合物薄膜；11試劑系統(tǒng)。
圖3所示為是一個(gè)垂直截面圖，以與現(xiàn)有技術(shù)比較的方式圖示性地說(shuō)明了本發(fā)明生物傳感器的原理。圖3(A)表示生物傳感器，圖3(B)表示I.Willner等(如前所述)公開(kāi)的固定酶電極。圖3(A)中，標(biāo)記2代表工作電極，標(biāo)記101代表干擾物質(zhì)，標(biāo)記103代表電子介體(Medred是它們的還原態(tài)，Medox是它們的氧化態(tài))，S-NH2表示硫醇化合物、二硫化物或硫醇鹽化合物的分子結(jié)構(gòu)，標(biāo)記10代表單分子薄膜。圖中，指向工作電極2的箭頭表示由電子介體供應(yīng)的電子(e-)流向。
在此，術(shù)語(yǔ)“肽”是主要由氨基酸形成的分子或顆粒的通稱。肽例如是蛋白質(zhì)、酶或血細(xì)胞。
工作電極表面可以通過(guò)將其浸入有機(jī)化合物溶液中的方法、或者將溶液滴到工件電極表面上的方法、或者將表面暴露于有機(jī)化合物蒸汽中而被含有至少一個(gè)硫原子的有機(jī)化合物薄膜所覆蓋。
在測(cè)量樣品溶液所含基質(zhì)時(shí)使用的指標(biāo)可以是任何隨電化學(xué)反應(yīng)進(jìn)行而變化的輸出量。例如，電流量或者電荷量都可以用作指標(biāo)。
本發(fā)明的生物傳感器優(yōu)選地可進(jìn)一步包括參比電極。
在本發(fā)明的生物傳感器中，優(yōu)選至少對(duì)電極的部分表面也被含有至少一個(gè)硫原子的有機(jī)化合物薄膜所覆蓋。優(yōu)選地，形成覆蓋對(duì)電極表面的薄膜的有機(jī)化合物與形成覆蓋工作電極的薄膜的有機(jī)化合物相同。這在生產(chǎn)中提供了方便。
為了降低覆蓋工作電極表面的薄膜的IR位降，優(yōu)選含有至少一個(gè)硫原子的有機(jī)化合物分子量為1,000或者更低；而且為了形成具有短鏈的分子，更優(yōu)選地分子量為200或更低。含有至少一個(gè)硫原子的有機(jī)化合物優(yōu)選為硫醇化合物、二硫化物、或硫醇鹽化合物。特別優(yōu)選含有至少一個(gè)硫原子的有機(jī)化合物是下面通式(1)、(2)或(3)表示的化合物HS-(CH2)n-X 通式(1)X-(CH2)n-S-S-(CH2)n-X 通式(2)-S-(CH2)n-X 通式(3)式中n表示1-10的整數(shù)，X表示氨基、羧基、羥基、甲基、氨芐基、羧基芐基、或者苯基。
優(yōu)選地，含有至少一個(gè)硫原子的有機(jī)化合物在工作電極表面上基本形成單分子薄膜。硫醇化合物、二硫化物、或者硫醇鹽化合物趨向于強(qiáng)烈且不可逆地吸附并結(jié)合到金屬表面上，以至于形成基本上是單分子層的膜。單分子形成的薄膜沒(méi)有明顯改變電極上存在的電子介體的電極反應(yīng)速率，因而降低了覆蓋在工作電極表面上的薄膜的IR位降。優(yōu)選地，工作電極的1/30到1/3的面積被含有至少一個(gè)硫原子的有機(jī)化合物所覆蓋。使用低濃度的含有至少一個(gè)硫原子的有機(jī)化合物溶液可以在短時(shí)間內(nèi)形成具有相對(duì)較低密度的薄膜，從而降低了傳感器的生產(chǎn)成本。
工作電極優(yōu)選地包括貴金屬如金、鈀、鉑等、或過(guò)渡金屬如銀、銅、鎘等，因?yàn)楹兄辽僖粋€(gè)硫原子的有機(jī)化合物能強(qiáng)烈地吸附并結(jié)合到這些金屬上。在這些金屬中，優(yōu)選工作電極含有金、鈀、或鉑。工作電極可以含有這些金屬的合金。
作為氧化還原酶，適當(dāng)?shù)拿缚梢愿鶕?jù)所測(cè)量的基質(zhì)類型來(lái)選擇。當(dāng)測(cè)量的基質(zhì)是葡萄糖時(shí)，適當(dāng)?shù)难趸€原酶包括例如葡萄糖氧化酶、幽門(mén)喹啉醌(本文以下稱作“PQQ”)相關(guān)葡糖脫氫酶、煙堿酰胺腺嘌呤二核苷酸(本文以下稱作“NAD”)相關(guān)葡糖脫氫酶、煙堿酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸鹽(本文以下稱作“NADP”)相關(guān)葡糖脫氫酶。當(dāng)測(cè)量基質(zhì)是膽固醇時(shí)，適當(dāng)?shù)难趸€原酶例如是膽固醇氧化酶。為了測(cè)量這些基質(zhì)，含有肽的溶液如全血、血漿、或尿經(jīng)常用作樣品。除了上面所列的酶之外，可以根據(jù)所測(cè)量的基質(zhì)類型使用其它氧化還原酶?？墒褂玫难趸€原酶包括例如醇脫氫酶、乳酸氧化酶、黃嘌呤氧化酶、氨基酸氧化酶、抗壞血酸氧化酶、?；o酶A(acyl-CoA)氧化酶、尿酸酶、谷氨酸脫氫酶和果糖脫氫酶。
本發(fā)明中可使用的電子介體包括例如金屬?gòu)?fù)合物如鐵氰酸離子、鋨-三(二吡啶鹽)、以及二茂鐵衍生物；醌衍生物如對(duì)苯醌；吩嗪鹽衍生物如吩嗪硫酸甲酯化物；吩噻嗪鹽(phenothiazinium)衍生物如亞甲基藍(lán)；煙堿酰胺腺嘌呤二核苷酸；以及煙堿酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸。在這些化合物中，鐵氰酸離子因?yàn)楦叻€(wěn)定性和高電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)速率而優(yōu)選。這些電子介體可以是與聚合物骨架結(jié)合的形式，或者是電子介體的部分或全部形成聚合物鏈的形式。氧可以用作電子介體。可以使用單一類型的電子介體、或者聯(lián)合使用多種類型的電子介體。
本發(fā)明的生物傳感器中，優(yōu)選測(cè)量試劑進(jìn)一步包括pH緩沖劑。通過(guò)調(diào)節(jié)混合有測(cè)量試劑的樣品溶液的pH至對(duì)酶活性適合的值，酶能夠在傳感器中發(fā)揮有效的作用。當(dāng)基質(zhì)是葡萄糖或膽固醇時(shí)，混合測(cè)量試劑的樣品溶液的pH值特別優(yōu)選是4到9，該pH值由pH緩沖劑來(lái)提供?？墒褂玫木彌_劑例如是磷酸鹽、乙酸鹽、硼酸鹽、檸檬酸鹽、鄰苯二甲酸鹽和甘氨酸?？梢允褂眠@些物質(zhì)之一，或者混合使用多種物質(zhì)。也可以使用上述鹽的一種或多種氫鹽，或者可以使用用于所謂優(yōu)良緩沖劑的試劑。pH緩沖劑可以根據(jù)傳感器的結(jié)構(gòu)以不同的形式包含在本發(fā)明傳感器系統(tǒng)中，pH緩沖劑可以是固體或者溶液。
下文中，本發(fā)明生物傳感器的結(jié)構(gòu)將參照?qǐng)D1和2來(lái)描述。但是，本發(fā)明并非限制于以下實(shí)施例。
圖1是忽略了測(cè)量試劑的本發(fā)明生物傳感器的立體等角視圖。在玻璃電絕緣基板1上設(shè)有樹(shù)脂組成的電極圖案掩膜，并且噴金。這樣就形成工作電極2和對(duì)電極3。在金和玻璃之間形成作為粘合層的鎘層，以便改善金和玻璃間的粘附作用。工作電極2和對(duì)電極3被分別經(jīng)導(dǎo)線4和5電連接到生物傳感器外的測(cè)量端。
在工作電極2上，形成分子中含有至少一個(gè)硫原子的有機(jī)化合物(在下面描述)薄膜，接著形成包括氧化還原酶和電子介體的測(cè)量試劑層。然后，帶有裂縫6的隔離層7和帶有氣孔8的覆蓋層9按圖1中點(diǎn)劃線表示的位置關(guān)系被結(jié)合到基板1上。這樣就得到了生物傳感器。隔離層7的裂縫6形成樣品溶液的供給通道。傳感器一端的裂縫6的開(kāi)口端作為樣品溶液供給通道的樣品供給口。
圖2是本發(fā)明生物傳感器的垂直截面圖。在基板上設(shè)置的工作電極2上提供分子內(nèi)含有硫原子的有機(jī)化合物的薄膜10。包含氧化還原酶和電子介體的測(cè)量試劑層11在薄膜10上提供。在示例性的實(shí)施例中，形成測(cè)量試劑層11，以便覆蓋電極對(duì)(工作電極2和對(duì)電極3)。這樣，大大增加了提供給電極上電化學(xué)反應(yīng)的電子介體的量，因而得到更高程度的響應(yīng)。
當(dāng)放入樣品溶液與裂縫6的開(kāi)口端接觸，形成圖2所示傳感器結(jié)構(gòu)的樣品溶液供給通道時(shí)，樣品溶液通過(guò)毛細(xì)現(xiàn)象引入樣品溶液供給通道，并且溶解包含在測(cè)量試劑層11中的組分，如酶和電子介體。酶反應(yīng)由此開(kāi)始進(jìn)行。在這種結(jié)構(gòu)中，樣品溶液供給通道由帶有電極系統(tǒng)的基板1與包括隔離層7和覆蓋層9的覆蓋單元組合而形成，因而供給傳感器的含有待測(cè)量基質(zhì)的樣品溶液能夠保持不變。因此可以改善測(cè)量的準(zhǔn)確性。
在帶有樣品溶液供給通道的傳感器中，試劑系統(tǒng)并不需要在電極系統(tǒng)上提供。試劑系統(tǒng)可以在傳感器的試劑系統(tǒng)能暴露于樣品溶液供給通道以便溶解在樣品溶液中的任何部位提供。例如，試劑系統(tǒng)可以在覆蓋層9的某部位提供，其中試劑系統(tǒng)暴露于樣品溶液供給通道；或者在基板1的某部位提供，其中試劑系統(tǒng)沒(méi)有與電極系統(tǒng)接觸，但暴露于樣品溶液的供給通道。試劑系統(tǒng)可以被分成多個(gè)層，以便一層在基板上，另一層在覆蓋層的另一側(cè)。每個(gè)分割層并不需要都包括所有的試劑組分。例如，氧化還原酶和電子介體或pH緩沖劑可以包含在不同的層中。
由工作電極2或?qū)﹄姌O3和相應(yīng)導(dǎo)線4或5形成的第二塊絕緣基板可以用來(lái)代替覆蓋層9。在這種情況下，樣品溶液供給通道也由基板1、隔離層7和第二塊基板組成。因此，供向傳感器的樣品溶液的量保持不變，這也改善了測(cè)量的準(zhǔn)確性。
或者，傳感器可以僅由基板1組成，而沒(méi)有形成樣品溶液的供給通道。在此情況下，試劑系統(tǒng)在電極系統(tǒng)中或在它們的附近提供。
圖3以與現(xiàn)有技術(shù)相比較的方式圖示性地表明了本發(fā)明生物傳感器的原理。圖3(A)表示本發(fā)明的生物傳感器，圖3(B)表示I.Willner等(如前所述)公開(kāi)的固定酶電極。如圖3(A)中所示，工作電極2用硫醇化合物、二硫化物或硫醇鹽化合物形成的單分子薄膜10覆蓋。因此，樣品中的干擾物質(zhì)101不與工作電極2接觸，或不吸附到單分子薄膜10上。因?yàn)閱畏肿颖∧?0非常薄，而且此處IR位降的程度也低，所以有足夠高的電勢(shì)施加給電子介體103。當(dāng)形成的單分子薄膜的密度相當(dāng)?shù)蜁r(shí)，相對(duì)較大的分子形式的肽并不會(huì)侵入單分子薄膜的內(nèi)部，但以相對(duì)小的分子形式存在的電子介體103卻能夠容易地侵入單分子薄膜的內(nèi)部。因而電子介體103就能與工作電極交換電子。由于此機(jī)理，單分子薄膜10并沒(méi)有防礙電流和電荷值的測(cè)量，電流和電荷隨著工作電極2附近的電化學(xué)反應(yīng)的進(jìn)行而改變。相比而言，在圖3(B)表示的I.Willner等公開(kāi)(如前所述)的固定酶電極中，硫醇化合物或二硫化物形成的單分子薄膜僅用作固定酶到電極上的錨。
含有規(guī)定量D-葡萄糖(400mg/dL)的血液作為樣品供給到樣品溶液供給通道的開(kāi)口處，即隔離層7的裂縫6的開(kāi)口端。使用具有25％、40％和60％的不同的紅細(xì)胞的血液百分比(血細(xì)胞比容，本文以下稱作“Hct”)的樣品。在預(yù)定時(shí)間(反應(yīng)時(shí)間25秒)后，在對(duì)電極3和工作電極2間施加500mV的電壓，測(cè)量流動(dòng)5秒鐘后的電流值。當(dāng)為比較例的傳感器時(shí)，電流值隨著Hct的增加而降低。這表明吸附到電極表面的紅細(xì)胞的量隨著Hct的增加而增加，并且電極反應(yīng)因此受到抑制。因此即使在相同的葡萄糖濃度下，電流值也根據(jù)Hct而變化，這被認(rèn)為引起了測(cè)量誤差。當(dāng)為本發(fā)明傳感器時(shí)，電流值基本上保持恒定，與Hct無(wú)關(guān)。紅細(xì)胞對(duì)電極表面的吸附被認(rèn)為已經(jīng)受到工作電極表面上存在的胱胺薄膜的抑制。用有機(jī)化合物胱胺薄膜覆蓋的電極表面的物理性質(zhì)明顯不同于那些未覆蓋的金電極。或者，覆蓋薄膜的末端基團(tuán)使電極界面帶有電荷。我們認(rèn)為是這些改變之一或兩者影響了血細(xì)胞的吸附。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)胱胺薄膜是非常薄的，并且基本上對(duì)鐵氰酸離子的電化學(xué)氧化反應(yīng)沒(méi)有影響。如上所述，由干擾物質(zhì)吸附引起的測(cè)量誤差可以通過(guò)用胱胺薄膜覆蓋電極而消除。
血液中葡萄糖的響應(yīng)基本上按實(shí)施例1中的相同方式測(cè)量。同實(shí)施例1一樣，本實(shí)施例中電流值也基本上保持不變，與Hct無(wú)關(guān)。實(shí)施例1中，發(fā)現(xiàn)胱胺薄膜覆蓋了工作電極大約1/3的面積。在本實(shí)施例的傳感器中，發(fā)現(xiàn)胱胺薄膜是非常稀疏的，并且覆蓋了工作電極大約1/30的面積。肽，如血細(xì)胞或蛋白質(zhì)由相對(duì)較大的顆粒和分子形成，因此認(rèn)為即使金屬僅被含硫原子的有機(jī)化合物稀疏地覆蓋，它們也不會(huì)緊密地接近金屬表面。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)即使在含硫原子的有機(jī)化合物覆蓋的金屬表面的面積比相當(dāng)?shù)蜁r(shí)，這種覆蓋也提供了阻止肽吸附到金屬表面的作用。
下面描述用正癸硫醇代替胱胺的實(shí)施例。
將正癸硫醇的乙醇溶液(濃度0.05mM)滴到基板1上的工作電極2的表面上。十分鐘后，工作電極2先用乙醇漂洗，再用超純水漂洗。溶解GOx和作為電子介體的鐵氰酸鉀得到的水溶液被滴到工作電極2上，并干燥。從而形成了試劑系統(tǒng)11。在所得的基板1上提供隔離層7和覆蓋層9，由此產(chǎn)生圖2所示的傳感器。在此傳感器中，發(fā)現(xiàn)正癸硫醇薄膜是稀疏的，并且覆蓋了工作電極大約1/20的面積。血液中葡萄糖的響應(yīng)基本上按實(shí)施例1中的相同方式測(cè)量。同實(shí)施例1一樣，本實(shí)施例中電流值也基本上保持不變，與Hct無(wú)關(guān)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)正癸硫醇薄膜是非常薄的，對(duì)鐵氰酸離子的電化學(xué)反應(yīng)沒(méi)有非常明顯的影響，并且具有消除干擾物質(zhì)吸附引起測(cè)量誤差的作用。
如上所述，即使是用相對(duì)低濃度的溶液在相對(duì)短的時(shí)間內(nèi)形成的含硫原子有機(jī)化合物薄膜也提供了阻止肽吸附到電極表面的作用。這對(duì)降低傳感器生產(chǎn)成本是非常有利的。
在上述實(shí)施例中，測(cè)量的是電流值?？蛇x地，還可以測(cè)量電荷值，在這種情況下，提供了相同的作用。
在上述實(shí)施例中，電極系統(tǒng)中施加500mV的電壓。但是電壓并沒(méi)有限制為該值。可以使用任何電子介體在工作電極上氧化的電壓值。
在上述實(shí)施例中，反應(yīng)時(shí)間是25秒或55秒。反應(yīng)時(shí)間并沒(méi)有限制為這些值?？梢允褂萌魏文塬@得可觀測(cè)電流量的時(shí)間段。
通過(guò)固定一種或多種測(cè)量試劑到工作電極上，可以將酶或電子介體制成不溶性的或非流動(dòng)性的。固定可以通過(guò)共價(jià)鍵合、交聯(lián)固定、配位鍵合、或特殊鍵合相互作用實(shí)現(xiàn)。為了實(shí)施本發(fā)明，試劑可以通過(guò)共價(jià)鍵固定到電極上含硫原子的有機(jī)化合物薄膜上?？蛇x地，在聚合物內(nèi)部封裝酶或電子介體以便提供偽固定，對(duì)容易地形成測(cè)量試劑層是有效的。聚合物可以是疏水的或者親水的，但是親水性聚合物是優(yōu)選的。親水性聚合物的實(shí)例是水溶性的纖維素衍生物如羧甲基纖維素、羥乙基纖維素和乙基纖維素，聚乙烯醇，明膠，聚丙烯酸，淀粉及其衍生物，馬來(lái)酐聚合物、以及甲基丙烯酸酯衍生物。
在上述實(shí)施例中，電極和它們的圖案用掩模噴涂形成。例如，圖案還可以如下形成通過(guò)噴涂、離子鍍、汽相沉積或化學(xué)汽相沉積形成的金屬膜進(jìn)行光刻和刻蝕處理。圖案可以通過(guò)使用激光的金屬修剪來(lái)形成?？蛇x地，電極圖案可以通過(guò)在基板上絲網(wǎng)印刷金屬糊來(lái)形成。形成有的金屬箔片可以連接到絕緣基板上。
電極的形狀、配置和數(shù)量并不限于實(shí)施例中描述的情況。例如，工作電極和對(duì)電極可以設(shè)置在不同的絕緣基板上，或者可以設(shè)置多個(gè)工作電極和多個(gè)對(duì)電極。導(dǎo)線的形狀、配置和數(shù)量也不限于實(shí)施例中描述的情況。
為了改善測(cè)量的準(zhǔn)確性，優(yōu)選包括隔離層作為生物傳感器的組件，因?yàn)楦綦x層容易使含測(cè)量基質(zhì)的溶液的量保持恒定。在本發(fā)明傳感器與獲取規(guī)定體積樣品的裝置組合使用時(shí)，包括隔離層的覆蓋構(gòu)件和覆蓋層并不是絕對(duì)需要的。
工業(yè)應(yīng)用性如上所述，本發(fā)明提供了一種快速并高效地測(cè)量樣品中基質(zhì)而不受樣品中所含肽的任何影響的結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的生物傳感器。
權(quán)利要求
1.一種用于測(cè)量樣品溶液中所含基質(zhì)的生物傳感器，該生物傳感器包括絕緣基板、在基板上設(shè)置的工作電極和對(duì)電極、以及含有氧化還原酶和電子介體的測(cè)量試劑，其中樣品溶液含有肽，工作電極包括金屬，并且工作電極的至少一部分表面用含有至少一個(gè)硫原子的有機(jī)化合物的薄膜覆蓋。
2.如權(quán)利要求1的生物傳感器，其進(jìn)一步包括參比電極。
3.如權(quán)利要求1的生物傳感器，其中所述對(duì)電極的至少一部分表面用含有至少一個(gè)硫原子的有機(jī)化合物的薄膜覆蓋。
4.如權(quán)利要求1的生物傳感器，其中所述含有至少一個(gè)硫原子的有機(jī)化合物為硫醇化合物、二硫化物或硫醇鹽化合物。
5.如權(quán)利要求1的生物傳感器，其中所述含有至少一個(gè)硫原子的有機(jī)化合物是以下通式(1)、(2)或(3)表示的化合物HS-(CH2)n-X 通式(1)X-(CH2)n-S-S-(CH2)n-X 通式(2)-S-(CH2)n-X 通式(3)式中n表示1-10的整數(shù)，X表示氨基、羧基、羥基、甲基、氨芐基、羧基芐基或苯基。
6.如權(quán)利要求1的生物傳感器，其中所述含有至少一個(gè)硫原子的有機(jī)化合物在所述工作電極表面上形成基本上是單分子的薄膜。
7.如權(quán)利要求1的生物傳感器，其中所述工作電極面積的1/30-1/3用所述含有至少一個(gè)硫原子的有機(jī)化合物覆蓋。
8.如權(quán)利要求1的生物傳感器，其中所述金屬包括金、鈀或鉑。
9.如權(quán)利要求1的生物傳感器，其中所述氧化還原酶選自葡萄糖氧化酶、幽門(mén)喹啉醌相關(guān)葡糖脫氫酶、煙堿酰胺腺嘌呤二核苷酸相關(guān)葡糖脫氫酶、煙堿酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸鹽相關(guān)葡糖脫氫酶、以及膽固醇氧化酶。
10.如權(quán)利要求1的生物傳感器，其中所述電子介體為鐵氰酸離子。
11.如權(quán)利要求1的生物傳感器，其中所述測(cè)量試劑進(jìn)一步包括pH緩沖劑。
12.一種生物傳感器，其包括絕緣基板和在該基板上設(shè)置的一對(duì)電極，其中該一對(duì)電極至少之一含有金屬，而且該至少一個(gè)電極的至少一部分表面用含有至少一個(gè)硫原子的有機(jī)化合物的薄膜覆蓋；以及含有肽的樣品溶液和氧化還原酶之間的反應(yīng)在電子介體存在的情況下定量。
13.如權(quán)利要求1的生物傳感器，其中所述氧化還原酶和電子介體設(shè)置在含有至少一個(gè)硫原子的有機(jī)化合物薄膜中。
14.一種測(cè)量含肽樣品溶液中所含基質(zhì)的生物傳感器，該生物傳感器包括包括一對(duì)電極以及與該一對(duì)電極中的每個(gè)相連的導(dǎo)線的絕緣基板，至少該一對(duì)電極之一包括含有至少一個(gè)硫原子的有機(jī)化合物薄膜，該薄膜在該至少一個(gè)電極的至少一部分表面上形成；在絕緣基板上設(shè)置的隔離層，該隔離層具有裂縫；以及在裂縫上設(shè)置的覆蓋層，該覆蓋層具有氣孔，其中所述裂縫形成樣品溶液供給通道，裂縫的開(kāi)口端形成樣品供給開(kāi)口。
15.如權(quán)利要求14的生物傳感器，其進(jìn)一步包括在該一對(duì)電極上設(shè)置的測(cè)量試劑層。
16.如權(quán)利要求15的生物傳感器，其中所述測(cè)量試劑層包括pH緩沖劑。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種簡(jiǎn)單結(jié)構(gòu)的生物傳感器，用于快速并精密地測(cè)量樣品基質(zhì)，而不會(huì)明顯受樣品中的肽影響。測(cè)量樣品溶液中所含基質(zhì)的生物傳感器包括一個(gè)或多個(gè)絕緣基板(1)；一對(duì)電極，包括在基板(1)上設(shè)置的工作電極(2)和對(duì)電極(3)；以及包含氧化還原酶和電子介體的測(cè)量試劑(11)。樣品溶液含有肽，工作電極(2)包括一種金屬，并且至少工作電極(2)的一部分表面覆蓋有含有至少一個(gè)硫原子的有機(jī)化合物的薄膜(10)。
文檔編號(hào)C12Q1/00GK1463362SQ02802090
公開(kāi)日2003年12月24日 申請(qǐng)日期2002年6月14日 優(yōu)先權(quán)日2001年6月14日
發(fā)明者中南貴裕, 池田信, 吉岡俊彥 申請(qǐng)人:松下電器產(chǎn)業(yè)株式會(huì)社