專利名稱：納米微粒與親和素標(biāo)記探針及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基因檢測技術(shù)，更具體地說，涉及納米或膠體微粒與親和素復(fù)合物標(biāo)記探針及其制備方法，以及該探針聯(lián)合銀增強/金增強的檢測DNA的方法。
基因檢測一般采用直接測序或雜交檢測。雜交檢測有放射法、酶標(biāo)法、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記法等。放射法靈敏度高，但因其對環(huán)境有污染，正逐漸被非放射法所取代。酶標(biāo)法由于反應(yīng)過程復(fù)雜，酶催化底物反應(yīng)過快，顯色區(qū)域不集中，限制了它的使用，特別是不適合生物芯片領(lǐng)域的應(yīng)用。熒光檢測存在著過程復(fù)雜、檢測儀器昂貴、操作人員需經(jīng)培訓(xùn)，從而難于推廣和應(yīng)用等缺點。
化學(xué)發(fā)光標(biāo)記法、普通銀染法及一些其它的標(biāo)記方法則由于靈敏度較低而使其應(yīng)用受到很大限制。迄今，比較成熟的基因芯片檢測方法是激光掃描共聚焦顯微鏡法，但其程序復(fù)雜，檢測設(shè)備昂貴，難于推廣和應(yīng)用。
中國專利CN1339609A公開了一種納米微粒標(biāo)記的基因探針及其在基因檢測中的應(yīng)用，該技術(shù)由于制備獲得的鈉米顆粒不穩(wěn)定，易聚集等原因，存在著制作成本高、穩(wěn)定性差以及使用不便的缺陷。
目前，某些生物分子與其他分子間特定的結(jié)合能力已被醫(yī)藥、生物技術(shù)人員廣泛應(yīng)用于不同的診斷和篩選芯片。當(dāng)一種生物分子具有與另一種生物分子的特異性結(jié)合力時，這兩個分子就能形成有效的配體-受體連接，如發(fā)生于親和素與小分子生物素間的非共價結(jié)合。這種生物素和親和素之間的作用被廣泛的用于DNA、RNA和蛋白的定量和純化。這些技術(shù)被應(yīng)用于細(xì)胞、組織中抗原的定位、免疫檢測、DNA雜交技術(shù)。但是，由于納米顆粒與DNA間的連接問題及其保存問題還沒有根本解決，因此其推廣使用還存在實際的困難。如CN1339609A專利所公開的技術(shù)。
本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思是這樣的鏈霉親和素是一種四聚體蛋白，其每個單體通過親水鍵和范德華力與一個生物素結(jié)合后兩者間形成的鏈穩(wěn)定且難斷裂。因此，利用生物素和鏈霉親和素間的親和力，用一個生物素標(biāo)記的探針與樣品反應(yīng)，再利用標(biāo)記好的抗生物素蛋白或鏈霉親和素的檢測探針反應(yīng)，本發(fā)明將表面合成化學(xué)、生物化學(xué)及生物化學(xué)技術(shù)有機結(jié)合起來制備親和素/鏈霉親和素/抗生物素-納米/膠體微粒復(fù)合物，利用生物素和親和素間的形成的較穩(wěn)定的鍵，以解決納米顆粒與DNA間的連接問題。提供銀粒子/金粒子著色進行微量DNA檢測與信號放大的最新工藝，解決目視法檢測的關(guān)鍵問題。根據(jù)T.Andrew Taton等在Scanmetric DNAArray Detection with nanoparticle Probes(science，289，2000)中提到采用納米微粒-探針復(fù)合物時，DNA的特異性結(jié)合率與單堿基錯配率的比值在一個較窄溫度范圍內(nèi)發(fā)生巨大變化。因此，可利用DNA-生物素-親和素/鏈霉親和素/抗生物素-納米/膠體微粒復(fù)合物特有的物理性質(zhì)用于突變體的檢測。
本發(fā)明的技術(shù)方案本發(fā)明的納米微粒與親和素標(biāo)記探針為一種復(fù)合物，由納米或膠體微粒與親和素、鏈霉親和素或抗生物素構(gòu)成，親和素、鏈霉親和素或抗生物素通過CNHO基團與納米或膠體微粒相接合。
所述及的納米或膠體微粒的化學(xué)組分包括金、銀、鐵等，其粒徑為5-160nm。
本發(fā)明的基因探針的制備方法包括如下步驟(1)膠體金或納米粒子的制備膠體金或納米粒子的制備可采用常規(guī)的氯金酸溶液煮沸還原法，通過添加還原劑和攪拌速度來控制粒徑，也可采取其他方法來制備。如可采用CNI1339609A專利所披露的方法，該技術(shù)為常規(guī)的技術(shù)，本發(fā)明不再贅述。
(2)復(fù)合物的制備復(fù)合物的自組裝與封閉只有嚴(yán)格控制反應(yīng)條件，才能使親和素/鏈霉親和素/抗生物素牢牢地結(jié)合到納米金或納米粒子上，并使用牛血清白蛋白分閉多余的活性位點。
用K2CO3(碳酸鉀)或Tris堿(三羥甲基氨基甲烷堿)調(diào)節(jié)膠體金或納米粒子溶液的pH至選定值6-8，離心去除沉淀物，將親和素、鏈霉親和素或抗生物素加入到膠體金或納米粒子溶液中，親和素/鏈霉親和素/抗生物素與膠體金或納米粒子的重量比為親和素/鏈霉親和素/抗生物素∶膠體金或納米粒子＝1∶1～1∶3；室溫放置10-40分鐘后加入牛血清白蛋白分閉多余的活性位點，再室溫放置2～6小時后，16000～25000/分鐘轉(zhuǎn)離心20～60分鐘，取上清，加入含PBS(磷酸緩沖液)和穩(wěn)定劑如甘油的溶液重懸，可重復(fù)數(shù)次，以除去不穩(wěn)定的納米金/膠體金、游離的蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，將其加入濃度為0.1～0.2M的氯化鈉，20～60mM磷酸緩沖液，0.1～0.5wt％的BSA(牛血清白蛋白)，0.05～0.15wt％的疊氮鈉的溶液體系中，該體系的pH值為6～8，即獲得本發(fā)明的納米微粒與親和素標(biāo)記探針，4℃保存。
本發(fā)明的納米微粒與親和素標(biāo)記探針可用于DNA突變及非突變的檢測，檢測方法包括如下步驟(1)含biotin(生物素)標(biāo)記的寡核苷酸，與固定在固相載體上檢測探針進行雜交。該步驟為常規(guī)步驟，本發(fā)明不再贅述。
(2)復(fù)合物與雜交物反應(yīng)①對于檢測Tm值相差較小的突變體，雜交后用PBS，0.1％Tween-20洗滌后加入用1×PBS(磷酸緩沖液)，0.1～0.5wt％BSA(牛血清白蛋白)溶液稀釋的Avidin/streptavidin-Au的復(fù)合物，室溫溫浴0.5～1小時后用高嚴(yán)緊度的洗液(如SSC或SSPE溶液)在30～60的溫度下洗脫。再用PBS洗滌后，加入銀增強劑或金增強劑來增強檢測信號，最后用蒸餾水多次洗滌，自然干燥。
②對于其他雜交檢測，則可在雜交后直接洗脫，再與復(fù)合物溫浴，PBS洗滌后，加入銀增強劑或金增強劑來增強檢測信號，(3)結(jié)果判定凡是著色很深、呈斑點，與背景反差強者判為強陽性；著色較深，與背景反差強者判為陽性；著色較淡，與背景反差小者判為弱陽性；不著色者判為陰性。
本發(fā)明提供的檢測方法有如下優(yōu)點①靈敏度高、特異性好，簡便、快速、廉價。
②可進行高通量、低成本的篩選，完全以手工完成而不用昂貴的液體操作機械手?？蓪ν蛔凅w進行檢測，只需目視判別結(jié)果，無需利用昂貴的檢測設(shè)備。
③既可用于單基因檢測，也可用于多基因集成檢測，如多種傳染性微生物病原體的臨床檢測、癌癥早期診斷、遺傳病產(chǎn)前診斷與在體外常規(guī)體檢，基因表達(dá)調(diào)控研究，特征基因表達(dá)譜檢測，基因文庫篩選等，尤其適用于低集成度基因芯片檢測，有很好的臨床使用價值。
最后加入終濃度為0.15M NaCl，20mM磷酸緩沖液，0.1％BSA，0.05％疊氮鈉的溶液體系中，4℃保存。如

圖1所示。
實施例2結(jié)核分枝桿菌對利福平抗藥性檢測將固定好的固相載體置于雜交管中，加入含堿變性后的PCR擴增產(chǎn)物的6×SSPE/0.5％SDS雜交液45～60℃雜交2小時。將雜交后的固相載體取出，用1×PBS、吐溫-20室溫洗滌10分鐘后置于用1×PBS/0.1％BSA溶液200倍稀釋的實施例1的溶液中，室溫溫浴1-2小時。再將固相載體置于雜交管中，用1×SSPE洗脫液50-65℃洗脫10-20分鐘。
取出固相載體用1×PBS洗滌3次，每次5分鐘，加入配置好的銀增強劑(現(xiàn)配的硝酸銀和還原劑構(gòu)成的混合物)，反應(yīng)10分鐘，最后用蒸餾水多次洗滌后自然干燥。結(jié)果判定凡是著色很深、呈斑點，與背景反差強者判為強陽性；著色較深，與背景反差強者判為陽性；著色較淡，與背景反差小者判為弱陽性；不著色者判為陰性。
權(quán)利要求
1.一種納米微粒與親和素標(biāo)記探針，其特征在于由納米或膠體微粒與親和素、鏈霉親和素或抗生物素構(gòu)成，親和素、鏈霉親和素或抗生物素通過CNHO基團與納米或膠體微粒相接合。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的探針，其特征在于所述及的納米或膠體微粒的化學(xué)組分包括金、銀或鐵。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的探針，其特征在于納米或膠體微粒的粒徑為5-160nm。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的探針的制備方法，其特征在于包括如下步驟(1)膠體金或納米粒子的制備；(2)復(fù)合物的制備用K2CO3或三羥甲基氨基甲烷堿調(diào)節(jié)膠體金或納米粒子溶液的pH至選定值6-8，離心去除沉淀物，將親和素、鏈霉親和素或抗生物素加入到膠體金或納米粒子溶液中，親和素/鏈霉親和素/抗生物素與膠體金或納米粒子的重量比為親和素/鏈霉親和素/抗生物素∶膠體金或納米粒子＝1∶1～1∶3；加入牛血清白蛋白分閉多余的活性位點，再室溫靜置2～6小時后，16000～25000/分鐘轉(zhuǎn)離心分離20～60分鐘，取上清，加入含磷酸緩沖液和穩(wěn)定劑溶液重懸，除去雜質(zhì)，將其加入濃度為0.1～0.2M的氯化鈉，20～60mM磷酸緩沖液，0.1～0.5wt％的牛血清白蛋白，0.05～0.15wt％的疊氮鈉的溶液體系中，該體系的pH值為6～8，即獲得本發(fā)明的納米微粒與親和素標(biāo)記探針。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，室溫放置10-40分鐘后加入牛血清白蛋白分閉多余的活性位點。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，加入牛血清白蛋白分閉多余的活性位點，再室溫靜置2～6小時后，16000～25000轉(zhuǎn)/分鐘離心分離20～60分鐘。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，加入牛血清白蛋白分閉多余的活性位點，再室溫靜置2～6小時后，16000～25000轉(zhuǎn)/分鐘離心分離20～60分鐘。
8.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的探針的應(yīng)用，其特征在于用于DNA突變及非突變的檢測。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于檢測方法包括如下步驟(1)含biotin(生物素)標(biāo)記的寡核苷酸，與固定在固相載體上檢測探針進行雜交；(2)復(fù)合物與雜交物反應(yīng)①對于檢測Tm值相差較小的突變體，雜交后用PBS，0.1％Tween-20洗滌后加入用1×PBS(磷酸緩沖液)，0.1～0.5wt％BSA(牛血清白蛋白)溶液將Avidin/streptavidin-Au的復(fù)合物稀釋至工作濃度(以納米金上結(jié)合的streptavidin量計為0.1ng/ml-20ng/ml)，室溫溫浴0.5～2小時后用高嚴(yán)緊度的洗液在室溫～60的溫度下洗脫，再用PBS洗滌后，加入銀增強劑或金增強劑來增強檢測信號，最后用蒸餾水多次洗滌，自然干燥；②對于其他雜交檢測，則可在雜交后直接洗脫，再與復(fù)合物溫浴，PBS洗滌后，加入銀增強劑或金增強劑來增強檢測信號；(3)結(jié)果判定凡是著色很深、呈斑點，與背景反差強者判為強陽性；著色較深，與背景反差強者判為陽性；著色較淡，與背景反差小者判為弱陽性；不著色者判為陰性。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種納米微粒與親和素標(biāo)記探針及其制備方法和應(yīng)用。該探針由納米或膠體微粒與親和素、鏈霉親和素或抗生物素構(gòu)成。本發(fā)明的基因探針的制備方法包括(1)膠體金或納米粒子的制備和(2)復(fù)合物的制備。本發(fā)明的探針可用于DNA的突變及非突變檢測，檢測時加入銀增強劑或金增強劑來增強檢測信號。本發(fā)明的方法靈敏度高、特異性好，簡便、快速、廉價，可進行高通量、低成本的篩選，用于單基因檢測或多基因集成檢測，如多種傳染性微生物病原體的臨床檢測、癌癥早期診斷、遺傳病產(chǎn)前診斷與在體外常規(guī)體檢，基因表達(dá)調(diào)控研究，特征基因表達(dá)譜檢測，基因文庫篩選等，尤其適用于低集成度基因芯片檢測，有很好的臨床使用價值。
文檔編號C12Q1/68GK1415759SQ02137418
公開日2003年5月7日 申請日期2002年10月14日 優(yōu)先權(quán)日2002年10月14日
發(fā)明者蘇蓓, 胡志能, 費西, 金維榮, 趙國屏 申請人:上海華冠生物芯片有限公司