專利名稱：一種生產(chǎn)3－羥基癸酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)3-羥基癸酸的方法，屬基因工程及微生物發(fā)酵領(lǐng)域。
基因phaG編碼催化由(R)-3-羥基癸酰-酰基轉(zhuǎn)移蛋白向(R)-3-羥基癸酰輔酶A轉(zhuǎn)化的(R)-3-羥基癸酰-?；D(zhuǎn)移蛋白輔酶A轉(zhuǎn)?；?，單獨(dú)運(yùn)用輔酶A轉(zhuǎn)?；讣茨軌虼呋?R)-3-羥基癸酰-?；D(zhuǎn)移蛋白向(R)-3-羥基癸酰輔酶A轉(zhuǎn)化，進(jìn)而生成3-羥基癸酸。基因phaG來源是很廣泛的，它們可以來自絕大多數(shù)假單孢菌以及伯克霍爾德氏菌等多種微生物，比如Genebank上的AY039840、AY039839、AF396832、AB047080、AF052507、AF169252、AF209711(Genebank登陸號(hào))等。
一種生產(chǎn)3-羥基癸酸的方法，其特征在于發(fā)酵培養(yǎng)含有基因phaG的重組微生物菌株而獲得3-羥基癸酸。
基因phaG的來源選擇范圍很寬，具有前述功能的微生物基因均可以選擇作為phaG的來源。所述基因phaG可以選自下述序列家族中的一種AY039840、AY039839、AF396832、AB047080、AF052507、AF169252、AF209711。
所述重組微生物菌株優(yōu)選為大腸桿菌。所述大腸桿菌選自JM109、HB101、DH5α或野生型菌株。
實(shí)現(xiàn)本發(fā)明方法的具體步驟可以是(1)將基因phaG克隆到質(zhì)粒中構(gòu)建出新質(zhì)粒；(2)將所構(gòu)建質(zhì)粒轉(zhuǎn)到菌株中構(gòu)建DNA重組菌株；(3)培養(yǎng)重組菌株獲取3-羥基癸酸。
所述重組菌株的培養(yǎng)溫度較適宜的為28-42℃；培養(yǎng)的pH值較適宜的為4.5-7.2。
用分批培養(yǎng)的方式或流加(fed-batch)培養(yǎng)的方式及補(bǔ)加三氯生培養(yǎng)的方式培養(yǎng)所述重組菌株均會(huì)取得較好的效果。
本發(fā)明巧妙地運(yùn)用基因phaG編碼催化由(R)-3-羥基癸酰-酰基轉(zhuǎn)移蛋白向(R)-3-羥基癸酰輔酶A轉(zhuǎn)化的(R)-3-羥基癸酰ACP輔酶A轉(zhuǎn)?；?，單獨(dú)運(yùn)用即能夠催化(R)-3-羥基癸酰ACP向(R)-3-羥基癸酰輔酶A轉(zhuǎn)化，進(jìn)而生成3-羥基癸酸的原理，運(yùn)用基因工程及微生物發(fā)酵相結(jié)合的方法，創(chuàng)造性地使一步法直接生產(chǎn)3-羥基癸酸得以實(shí)現(xiàn)。簡(jiǎn)化了從聚合物降解獲得3-羥基癸酸的生產(chǎn)工藝，提高了生產(chǎn)效率，降低了傳統(tǒng)化學(xué)合成對(duì)設(shè)備的高要求，簡(jiǎn)化了繁瑣的工藝流程，省去了手性分離的復(fù)雜過程，因此可以使3-羥基癸酸的生產(chǎn)成本得到大幅度降低。同時(shí)利用本發(fā)明的方法生產(chǎn)3-羥基癸酸還解決了由于化學(xué)合成和手性分離帶來的環(huán)境污染問題。
本發(fā)明所涉及的質(zhì)粒構(gòu)建與重組菌株篩選均采用現(xiàn)有基因工程操作的方法，包括對(duì)含有基因phaG的DNA片段和所用質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，限制酶切割，連接酶連接，質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，重組菌株篩選，重組菌株的培養(yǎng)，產(chǎn)物合成的確認(rèn)及高性能重組生產(chǎn)菌株的獲得等。發(fā)酵過程中不需購(gòu)置新的設(shè)備，既可以采用微生物常規(guī)工業(yè)發(fā)酵方法，也可以采用自動(dòng)控制為基礎(chǔ)的流加發(fā)酵法。
下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施例做進(jìn)一步說明。
質(zhì)粒構(gòu)建如

圖1所示，從含有基因phaG的質(zhì)粒中，采用PCR方法得到phaG的基因片斷，限制性內(nèi)切酶XbaI和HindIII雙酶切后片段插入質(zhì)粒載體pBluescriptSK-中。所得到的質(zhì)粒pLZZGPp含有位于啟動(dòng)子lac下游的基因pbaG。所用引物為上游引物5’-GGT TCTAGACTGCAGGAGTCGATGACATGAGGC-3’；下游引物為5’-TCCAAGCTTCCCGGGCTCAGATGGCAA ATGCATG-3’。
培養(yǎng)基為L(zhǎng)B培養(yǎng)基(g/L)蛋白胨10，酵母浸出物5，NaCl 10；或礦物培養(yǎng)基(g/L)4.5 Na2HPO4.2H2O，1.5 KH2PO4，0.5(NH4)2SO4，0.2 MgSO4，0.05Fe(III)-NH4-Citrate(17％)，0.02 CaCl2·2H2O以及SL-6微量元素。為了維持質(zhì)粒在重組菌中的傳代，應(yīng)加入100mg/L氨卞青霉素。碳源可以選擇葡萄糖或果糖，濃度根據(jù)需要而定。
質(zhì)粒轉(zhuǎn)化用電擊轉(zhuǎn)化法或化學(xué)轉(zhuǎn)化法將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入菌株E.coli。
在該實(shí)施例中，大腸桿菌E.coli還可以選自JM109，DH5α以及野生型大腸桿菌如AB1157等，phaG還可以是AY039840、AY039839、AF396832、AB047080、AF169252、AF209711，但構(gòu)建基因重組菌株的方法和步驟是相同的。
實(shí)施例2、以葡萄糖為碳源利用重組大腸桿菌在LB培養(yǎng)基上合成3-羥基癸酸菌種含質(zhì)粒pLZZGPp的重組大腸桿菌HB101，(質(zhì)粒中基因phaG為AF052507)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化方式電轉(zhuǎn)化法培養(yǎng)溫度37℃培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基初始pH7.2培養(yǎng)48小時(shí)后pH4.5發(fā)酵時(shí)間48小時(shí)攪拌轉(zhuǎn)速200rpm工藝流程如下將種子液接入加有滅菌發(fā)酵液的搖瓶中，接種量為每100毫升發(fā)酵液接入2毫升種子液。葡萄糖起始濃度5g/L。9小時(shí)后加入1mMIPTG，12小時(shí)后加入15g/L葡萄糖。發(fā)酵結(jié)束后，對(duì)樣品離心、洗滌、分析得到細(xì)胞干重和3-羥基癸酸含量等有關(guān)數(shù)據(jù)。
分析結(jié)果表明，48小時(shí)后得到3-羥基癸酸含量為196mg/L。
實(shí)施例3、以果糖為碳源利用重組大腸桿菌在LB培養(yǎng)基上合成3-羥基癸酸菌種含質(zhì)粒pLZZGPp的重組大腸桿菌HB101，(質(zhì)粒中基因phaG為AF052507)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化方法電擊轉(zhuǎn)化法培養(yǎng)溫度37℃培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基初始pH7.2培養(yǎng)48小時(shí)后pH5.0發(fā)酵時(shí)間48小時(shí)攪拌轉(zhuǎn)速200rpm工藝流程如下將種子液接入加有滅菌發(fā)酵液的搖瓶中，接種量為每100毫升發(fā)酵液接入2毫升種子液。果糖起始濃度5g/L。9小時(shí)后加入1mMIPTG，12小時(shí)后加入25g/L果糖。發(fā)酵結(jié)束后，對(duì)樣品離心、洗滌、分析得到細(xì)胞干重和3-羥基癸酸含量等有關(guān)數(shù)據(jù)。
分析結(jié)果表明，48小時(shí)得到3-羥基癸酸678mg/L。
實(shí)施例4、補(bǔ)加三氯生(triclosan)為添加劑，以果糖為碳源利用重組大腸桿菌在LB培養(yǎng)基或礦物培養(yǎng)基上合成3-羥基癸酸菌種含質(zhì)粒pLZZGPp的重組大腸桿菌HB101，(質(zhì)粒中基因phaG為AF052507)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化方法電擊轉(zhuǎn)化法培養(yǎng)溫度35℃培養(yǎng)溫度37℃培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基或礦物培養(yǎng)基初始pH7.2培養(yǎng)48小時(shí)后pH5.0發(fā)酵時(shí)間48小時(shí)攪拌轉(zhuǎn)速200rpm工藝流程如下將種子液接入加有滅菌發(fā)酵液的搖瓶中，接種量為每100毫升發(fā)酵液接入2毫升種子液。果糖起始濃度5g/L。9小時(shí)后加入1mMIPTG，12小時(shí)后加入15g/L果糖，24小時(shí)后加入0.1mg/L三氯生。發(fā)酵結(jié)束后，對(duì)樣品離心、洗滌、分析得到細(xì)胞干重和3-羥基癸酸含量等有關(guān)數(shù)據(jù)。
分析結(jié)果表明，48小時(shí)得到3-羥基癸酸342mg/L(礦物培養(yǎng)基上)及722mg/L(LB培養(yǎng)基上)。
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)3-羥基癸酸的方法，其特征在于發(fā)酵培養(yǎng)含有基因phaG的重組微生物菌株而獲得3-羥基癸酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)3-羥基癸酸的方法，其特征在于所述基因phaG選自下述序列家族中的一種AY039840、AY039839、AF396832、AB047080、AF052507、AF169252、AF209711。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)3-羥基癸酸的方法，其特征在于所述重組微生物菌株為大腸桿菌。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的生產(chǎn)3-羥基癸酸的方法，其特征在于所述方法包括以下步驟(1)將基因phaG克隆到質(zhì)粒中構(gòu)建出新質(zhì)粒；(2)將所構(gòu)建質(zhì)粒轉(zhuǎn)到菌株中構(gòu)建DNA重組菌株；(3)培養(yǎng)重組菌株獲取3-羥基癸酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的生產(chǎn)3-羥基癸酸的方法，其特征在于所述重組菌株的培養(yǎng)溫度為28-42℃。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的生產(chǎn)3-羥基癸酸的方法，其特征在于所述重組菌株的培養(yǎng)pH值為4.5-7.2。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的生產(chǎn)3-羥基癸酸的方法，其特征在于用分批培養(yǎng)的方式培養(yǎng)所述重組菌株。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的生產(chǎn)3-羥基癸酸的方法，其特征在于用補(bǔ)加三氯生培養(yǎng)的方式培養(yǎng)所述重組菌株。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種生產(chǎn)3－羥基癸酸的方法,其目的是提供一種工藝簡(jiǎn)單,具有一定生產(chǎn)效率的制備3－羥基癸酸的方法。本發(fā)明的技術(shù)方案是發(fā)酵培養(yǎng)含有基因phaG的重組微生物菌株而獲得3－羥基癸酸。實(shí)現(xiàn)本發(fā)明方法的具體步驟可以是:(1)將基因phaG克隆到質(zhì)粒中構(gòu)建出新質(zhì)粒;(2)將所構(gòu)建質(zhì)粒轉(zhuǎn)到菌株中構(gòu)建DNA重組菌株;(3)培養(yǎng)重組菌株獲取3－羥基癸酸。本發(fā)明運(yùn)用基因工程及微生物發(fā)酵相結(jié)合的方法,創(chuàng)造性地使一步法直接生產(chǎn)3－羥基癸酸得以實(shí)現(xiàn)。簡(jiǎn)化了從聚合物降解獲得3－羥基癸酸的生產(chǎn)工藝,提高了生產(chǎn)效率,具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12P7/42GK1379110SQ0211757
公開日2002年11月13日 申請(qǐng)日期2002年5月8日 優(yōu)先權(quán)日2002年5月8日
發(fā)明者陳國(guó)強(qiáng), 鄭重 申請(qǐng)人:清華大學(xué)