專利名稱：用于診斷地中海貧血的dna芯片及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于診斷地中海貧血的DNA芯片，具體地說涉及用于診斷α-型和β-型地中海貧血的DNA芯片。
本發(fā)明還涉及診斷地中海貧血的DNA芯片的制備方法。
本發(fā)明還涉及用于擴(kuò)增待檢樣品中DNA的PCR引物；
本發(fā)明還涉及用于診斷地中海貧血的試劑盒以及檢測待檢樣品中是否存在地中海貧血的相關(guān)基因的方法。
背景技術(shù)：
地中海貧血(也稱地貧)是一種常見的遺傳性疾病，世界各地都有發(fā)作，最多見于西自地中海區(qū)域，中經(jīng)土耳其、中東各國，東至東南亞和我國南部。在我國β-型地中海貧血最多見于西南和華南一帶，包括云南、貴州、四川、廣西、廣東、海南各省區(qū)，在苗、瑤、黎、壯等少數(shù)民族中尤為多見，其次為長江以南各地，北方很少見。據(jù)全國血紅蛋白病協(xié)作組調(diào)查，β-型地中海貧血發(fā)生率為0.67％。α-型地中海貧血在我國高發(fā)于西南及華南一帶，全國協(xié)作組調(diào)查國內(nèi)α-地中海貧血發(fā)生率為2.93％，是我國南方最常見、危害最為嚴(yán)重地遺傳病種之一。地中海貧血癥的臨床表型多樣，可以從正常到需要反復(fù)輸血，甚至危及生命，導(dǎo)致患者在未成年前夭折甚至死胎。
由于該病在我國南方的高發(fā)病率，對社會和家庭產(chǎn)生巨大的精神和經(jīng)濟(jì)壓力。然而目前尚缺乏有效的治療措施，因此做好遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷，阻止該類病重癥患兒的出生，對有效監(jiān)控此類疾病，提高人口素質(zhì)有重要意義。
由于地中海貧血的臨床癥狀具有較大的變異性，輕型患者及攜帶者的檢測易出現(xiàn)漏檢。隨著地中海貧血癥分子遺傳學(xué)研究的進(jìn)展，使基因診斷成為可能。其中α-地中海貧血的基因缺陷主要為缺失型突變，當(dāng)α-球蛋白鏈基因中的1條或多條喪失功能時就會引發(fā)α-型地中海貧血癥，在中國地區(qū)普遍發(fā)生的3種α-地中海貧血癥分別是由α基因上-α3.7，-α4.2和-SEA的片段缺失引起的。β-地中海貧血的基因只有一對，基因缺陷絕大多數(shù)屬于非缺失型，即由于基因點(diǎn)突變造成β-球蛋白合成異常。β-地中海貧血癥具有種族特異性，表現(xiàn)為許多突變僅發(fā)生在某個別種族中，而且?guī)缀趺恳环N族都具有幾種常見的突變。到1998年，在中國β-地中海貧血群體中已發(fā)現(xiàn)23種不同的突變類型(見表1)。其中5種突變在中國人群中表現(xiàn)出較高的發(fā)病頻率，約占總發(fā)生率的90％以上。大陸各省份共發(fā)現(xiàn)22種(其中3種僅見于少數(shù)民族)，臺灣共發(fā)現(xiàn)18種(其中4種僅現(xiàn)于臺灣)。
α-地中海貧血癥的傳統(tǒng)基因診斷技術(shù)主要采用Southern印跡雜交方法，技術(shù)準(zhǔn)確可靠，但操作繁瑣，而且依賴用同位素，難以大面積推廣。另外還有PCR擴(kuò)增技術(shù)，這種方法簡單快速，但容易出現(xiàn)假陽性。β-地中海貧血癥常用診斷技術(shù)有反向點(diǎn)雜交(RDB)、PCR-SSCP、PCR-異源雙鏈分析、PCR-DGGE、PCR-ARMS、PCR-ASO、PCR-RFLP以及PCR-錯配化學(xué)裂解等技術(shù)。
DNA芯片技術(shù)適用于基因缺陷的檢測，一個芯片能同時容納許多個探針，和PCR擴(kuò)增技術(shù)結(jié)合，具有技術(shù)操作簡單、自動化程度高、序列數(shù)量大、檢測效率高、應(yīng)用范圍廣、成本相對低的特點(diǎn)。
DNA芯片技術(shù)是一種高度集成的DNA檢測技術(shù)。首先采用專用自動化設(shè)備將已知DNA寡核苷酸探針排列在玻片或硅片上，然后將待檢測樣本中的所有DNA成分與芯片探針雜交，有相對應(yīng)的靶DNA就會出現(xiàn)相應(yīng)的雜交信號。理論上就可以做到一次實(shí)驗(yàn)檢測多個基因。
DNA芯片技術(shù)的設(shè)想可以追溯到90年代初，美國Affymetrix公司首先開始這方面的研究(http//www.affymetrix.com)。由于這項(xiàng)技術(shù)的廣泛的應(yīng)用前景以及巨大的經(jīng)濟(jì)效益，目前美國的斯坦福大學(xué)、美國橡樹嶺國家實(shí)驗(yàn)室、德國的自動化公司(http//www.mpimg-berlin-dahlem.mpg.de/～autom)、Incyte商業(yè)公司和Hyseq公司都在進(jìn)行全力研究，競爭市場份額。國內(nèi)也有單位開始跟進(jìn)了DNA芯片的研究。由于該技術(shù)需要高精度的DNA探針點(diǎn)樣設(shè)備或光刻合成設(shè)備和專用的激光掃描檢測裝置，尚未普及應(yīng)用。
臨床上，遺傳病診斷與檢測、細(xì)菌及病毒的檢測、白細(xì)胞配型是DNA芯片應(yīng)用的最具潛力的方面。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種用于臨床診斷α-型和β-型地貧的DNA芯片，其利用現(xiàn)有的激光掃描儀，可以用于地中海貧血疾病的診斷并可提高診斷效率和診斷準(zhǔn)確性、降低成本、縮短診斷時間。
本發(fā)明的另一目的在于提供診斷地中海貧血的DNA芯片的制備方法；
本發(fā)明的再一目的是提供用于擴(kuò)增待檢樣品中DNA的PCR引物；
本發(fā)明的又一目的是提供用于診斷地中海貧血的試劑盒以及檢測待檢樣品中是否存在地中海貧血相關(guān)基因的方法。
根據(jù)本發(fā)明的一方面，用于診斷α-型和β-型地貧的DNA芯片由一基底和固定于基底上的探針組成，用于該DNA芯片的基底可以是任何適于固定DNA探針的載體，例如，市售的EMS Electronic Microscopy Science CompanyLtd.生產(chǎn)的聚-L-賴氨酸包被并硅烷化的顯微鏡玻片，固定于基底上的探針則根據(jù)迄今已知的α-和β-球蛋白突變基因的序列，根據(jù)DNA序列特異性識別的原理設(shè)計(jì)的診斷這些突變的DNA探針。通過點(diǎn)樣裝置將探針按照一定規(guī)律排列在載體玻片或硅片上，經(jīng)過固定和相關(guān)處理后就制成了DNA芯片。本發(fā)明的DNA芯片上可以僅包含針對α-球蛋白缺失基因設(shè)計(jì)的用于檢測α-型地貧的DNA探針，或僅包含針對β-球蛋白突變基因設(shè)計(jì)的用于檢測β-型地貧的DNA探針，也可以同時包含檢測α-型和β-型地貧的DNA探針。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供一種用于診斷地貧的DNA芯片的制備方法，該方法包括合成探針、將合成的探針及相應(yīng)的對照組DNA按一定的順序點(diǎn)樣并排列于基底上、將點(diǎn)樣后的探針DNA固定于基底上而制備得到DNA芯片。
為了使DNA探針能有效地固定在玻片上，通常采用兩種方法，第一種，在DNA探針合成后進(jìn)行DNA探針5’末端活性基團(tuán)的標(biāo)記，這些活性基團(tuán)有氨基、硫基等，固定DNA的玻片也需要進(jìn)行活化處理，使之表面帶有醛基或氨基，可以與DNA探針形成共價(jià)鍵。在直接寡核苷酸DNA探針的固定中，先將DNA探針用消毒雙蒸水稀釋至200pmol/ul和等量1.0M1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride(EDC)和1.0MN-Hydroxysuccinimide(NHS)混合，進(jìn)行點(diǎn)樣。第二種，將DNA探針與點(diǎn)樣緩沖液混合，用玻片點(diǎn)樣機(jī)點(diǎn)在玻片上，80℃加熱1到4小時，使用UVStratalinker 2400紫外交聯(lián)儀在60mJ/cm2強(qiáng)度下進(jìn)行紫外交聯(lián)，然后用終止液終止反應(yīng)。
根據(jù)本發(fā)明的再一方面，提供用于擴(kuò)增待檢樣品中DNA的PCR引物，該引物根據(jù)α-型和β-型地貧癥基因突變的序列資料設(shè)計(jì)，其中α-型地貧的引物包括4對引物，檢測β-型地貧的引物包括2對引物。
在對待檢樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，為進(jìn)行熒光標(biāo)記，本發(fā)明進(jìn)一步設(shè)計(jì)了延伸引物，延伸引物的Tm值為50-65℃，3’端與突變位點(diǎn)相鄰。與β-地中海貧血癥基因的20種點(diǎn)突變類型及α-地中海貧血癥3種缺失突變類型相對應(yīng)設(shè)計(jì)了20條和4條引物。
根據(jù)本發(fā)明的又一方面，提供了用于檢測地中海貧血癥的試劑盒，其中包含用于診斷地中海貧血的本發(fā)明的DAN芯片以及用于擴(kuò)增待檢樣品中DNA的本發(fā)明的PCR引物。
本發(fā)明同時還提供了檢測待檢樣品中是否存在地貧相關(guān)基因的方法，通過將待檢樣品用本發(fā)明特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，再用延伸因?yàn)閷U(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行熒光標(biāo)記，將標(biāo)記后的產(chǎn)物與診斷地貧的本發(fā)明DNA芯片進(jìn)行雜交，然后用相應(yīng)的儀器讀取信號并對信號進(jìn)行分析獲得結(jié)果。
本發(fā)明的用于地中海貧血疾病診斷的DNA芯片，可提高診斷效率和診斷準(zhǔn)確性、降低成本、縮短診斷時間。
附圖的簡要說明
圖1為本發(fā)明的DNA芯片的檢測結(jié)果圖；其中掃描得到的雜交信號a圖和b圖經(jīng)圖像處理得到圖表c，圖表c代表玻片上不同的點(diǎn)的突變型和野生型信號強(qiáng)度的比值。根據(jù)圖表c，-28號位點(diǎn)突變型和野生型信號強(qiáng)度比值特別高，說明樣品的-28位點(diǎn)處發(fā)生突變。a圖和b圖掃描圖像上黃色方框標(biāo)出了代表-28突變的探針位置。
發(fā)明的詳細(xì)描述
實(shí)施例1用于檢測α-型和β-型地貧的DNA芯片的制備
1、探針的設(shè)計(jì)
表1為23種β-地中海貧血癥中常見的基因突變類型和位點(diǎn)
表1β-球蛋白基因中常見的突變
(A)在中國人群中最常見的5個等位基因突變
(B)在南亞人群中發(fā)現(xiàn)的18個最常見的β-球蛋白基因突變
為檢測α-和β-地中海貧血癥常見的突變類型，共設(shè)計(jì)了24條探針及陽性對照，探針的長度一般在15-30個堿基左右，這些探針的DNA序列如表2和表3。試驗(yàn)探針估計(jì)可覆蓋地中海貧血癥超過98％的發(fā)生率。在直接寡核苷酸DNA探針的固定中，先將DNA探針用1M NHS，1M EDC混合，進(jìn)行點(diǎn)樣。完成DNA探針的合成之后，啟動DNA點(diǎn)樣裝置，在芯片制作程序的控制下，進(jìn)行DNA探針的打印。通過DNA打印針每次取一個DNA探針，通過三維定點(diǎn)傳遞裝置將DNA探針傳遞到指定的點(diǎn)樣位置。完成一次打印后，荷樣打印針清洗、干燥，進(jìn)行下一輪探針的點(diǎn)樣，依次類推，直至所有DNA探針傳遞點(diǎn)樣完畢。
表2α-球蛋白基因的探針DNA序列
在上表中包括了4組探針序列，即UP-ALPHA2-R、UP-3.7/50.2-R、8866和UP-SEA-R，每組分別包括12條探針，覆蓋了α-球蛋白可能的突變位點(diǎn)，在選擇探針時，可以從每組中任選一條，但在一個芯片中應(yīng)同時包括來自四組的4條探針。表3不同長度的β-球蛋白基因21個點(diǎn)突變位點(diǎn)探針DNA序列
在上表中共包括20組探針，每組探針分別包括8條可任選的序列，在檢測β-地貧的芯片中應(yīng)同時包含從20組的每一組中選擇的一個序列。此外，為了增加適宜的碳鏈長度，在表3的各序列5’末端還可以修飾了15～30個dT，形成連拉臂。這些間隔的連接臂將增加探針與玻片表面的距離，有利于探針與被檢測DNA的雜交體的形成。
2、DNA探針的點(diǎn)樣和固定
1)探針的點(diǎn)樣和排列
在直接寡核苷酸DNA探針的固定中，先將DNA探針用1M NHS，1M EDC混合，進(jìn)行點(diǎn)樣。完成DNA探針的合成之后，啟動DNA點(diǎn)樣裝置，在芯片制作程序的控制下，進(jìn)行DNA探針的打印。通過DNA打印針每次取一個DNA探針，通過三維定點(diǎn)傳遞裝置將DNA探針傳遞到指定的點(diǎn)樣位置。完成一次打印后，荷樣打印針清洗、干燥，進(jìn)行下一輪探針的點(diǎn)樣，依次類推，直至所有DNA探針傳遞點(diǎn)樣完畢。
2)DNA探針的固定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明采用兩種方法將探針固定在玻片表面第一種，通過活性基團(tuán)的標(biāo)記，包括氨基、巰基的標(biāo)記。固定DNA的玻片也需要進(jìn)行活化處理。通常進(jìn)行活化處理的表面帶有醛基或氨基，可以與DNA探針形成共價(jià)鍵。第二種，首先將DNA探針與點(diǎn)樣緩沖液混合后點(diǎn)樣，80℃加熱1～4小時，然后使用UV Stratalinker 2400紫外交聯(lián)儀在60mJ/cm2強(qiáng)度下進(jìn)行紫外交聯(lián)，最后用終止液終止反應(yīng)。
實(shí)施例2用于擴(kuò)增待檢樣品中DNA的引物的設(shè)計(jì)及檢測方法
1、用于擴(kuò)增待檢樣品中DNA的PCR引物的設(shè)計(jì)
根據(jù)α-地中海貧血癥基因突變的序列資料設(shè)計(jì)了4對引物用于檢測。這4對引物的序列信息以及在基因簇上的位置見表4，四對引物分別為第一對上游引物A2/3.7-F、下游引物A2-R；第二對上游引物A2/3.7-F、下游A3.7-R；第三對上游引物A4.2-F、下游引物A4.2-R；第四對上游引物SEA-F、下SEA-F游引物SEA-R；表4中的每一上游或下游引物均包括一組分別由8條引物組成的序列，在選擇時，可以從一組引物中任選一個序列作為一個引物，但應(yīng)同時包含來自八組的8個引物。每50μL反應(yīng)體積包括了10ng基因組DNA、8個引物、10x buffer、1.5mM MgCl2、200μM dNTPs、1x Q-solution和2.5UHotStarTaq DNA聚合酶。反應(yīng)條件為96℃15min，98℃變性45s、60℃退火90sec、72℃延伸3min，共35個循環(huán)，最后一步72℃延伸15min。表4不同長度的α-球蛋白基因擴(kuò)增引物的DNA序列
用兩對特異性的、具有不同長度和Tm值的引物擴(kuò)增出β-球蛋白基因的2個片段。引物的核酸序列見表5，其中第一對引物上游為HBB-1、下游為HBB-2；第二對引物上游為HBB-3、下游為HBB-4，表5中每組引物包括8條可任選的序列。每50μL反應(yīng)體積包括了100-200ng基因組DNA、從4組引物中分別選擇4個引物、10x buffer、1.5mM MgCl2、200μM dNTPs和5UTaq DNA聚合酶。熱循環(huán)反應(yīng)條件為95℃ 2min，94℃變性30s、60℃退火30sec、72℃延伸30sec，共30個循環(huán)，最后一步72℃延伸5min。將PCR產(chǎn)物純化和定量。表5不同長度的β-球蛋白基因擴(kuò)增引物DNA序列2、PCR產(chǎn)物的延伸和熒光標(biāo)記1)延伸引物的設(shè)計(jì)
延伸引物的Tm值為50-65℃，3’端與突變位點(diǎn)相鄰。與α-地中海貧血癥3種缺失突變類型及β-地中海貧血癥基因的20種點(diǎn)突變類型相對應(yīng)設(shè)計(jì)了4條和20條引物，見表6和表7。表6α-球蛋白基因的延伸引物DNA序列表7β-球蛋白基因點(diǎn)突變延伸引物的DNA序列5)PCR產(chǎn)物的熒光標(biāo)記
在用Tris、MgCl2、延伸引物(分別從表6和/或表7的各組引物中任選一條序列，對于檢測α-型地貧，延伸引物應(yīng)包含分別來自表6中四組引物中的四條引物，對于檢測β-型地貧，延伸引物應(yīng)包含分別來自表7中20組引物中的20條引物)、DNA聚合酶、TAMRA-ddATP、TAMRA-ddCTP、Cy5-ddGTP和ROX-ddUTP配成的SBE溶液5μL中加入10μL PCR產(chǎn)物。SBE反應(yīng)包括30個循環(huán)的變性(96℃ 30s)、退火(50℃ 30s)和延伸(60℃ 1min)。6)雜交
將5-10μL的熒光標(biāo)記產(chǎn)物與雜交液(包含8×SSC、0.2mg/ml的鮭魚精DNA和0.4％的SDS)混合，與固定在玻片上的探針雜交，蓋上蓋玻片，放入潮濕的雜交倉內(nèi)50℃孵育4小時。然后將玻片用2×SSC、0.1％SDS洗一次，用2×SSC洗3次，再用0.2×SSC洗一次。將玻片1300rpm離心5分鐘甩干，在ScanArray 4000掃描儀上進(jìn)行掃描。掃描結(jié)果圖例見圖一a和b。7)檢測
雜交信號檢測可以通過專用激光芯片掃描儀進(jìn)行檢測。掃描獲得的圖像，用芯片圖像專用分析軟件分析每個基片的雜交信號的強(qiáng)弱，從而確定突變有沒有發(fā)生。如圖一c。
以上對本發(fā)明的實(shí)施例的描述并不限制本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)本發(fā)明作出各種改變和變形，這些改變和變形均應(yīng)屬于本發(fā)明后附的權(quán)利要求所定義的范圍。
SEQUENCE LISTING<110>亞能生物技術(shù)(深圳)有限公司<120>用于診斷地中海貧血的DNA芯片及其制備方法<130>PI02952<160>504<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>1gggccctcct cccctcct18<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>2gggccctcct cccctccttg 20<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>3gggccctcct cccctccttg 20<210>4<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>4gggccctcct cccctccttg c21<210>5<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>5cccaacgggc cctcctcc18<210>6<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>6cccaacgggc cctcctccc 19<210>7<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>7cccaacgggc cctcctcccc 20<210>8<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>8cccaacgggc cctcctcccc t21<210>9<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>9ccctcctccc ctccttgca 19<210>10<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>10ccctcctccc ctccttgcac 20<210>11<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>11ccctcctccc ctccttgcac c21<210>12<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>12ccctcctccc ctccttgcac cg 22<210>13<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>13gcgaagtcca gctggaaa 18<210>14<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>14gcgaagtcca gctggaaaa 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21<210>486<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>486cgtggatcct gagaacttca gg22<210>487<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>487acgtggatcc tgagaacttc agg 23<210>488<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>488cacgtggatc ctgagaactt cagg 24<210>489<211>16<212>DNA<213>人工序列<400>489tcaagggtcc cataga 16<210>490<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>490atcaagggtc ccataga 17<210>491<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>491catcaagggt cccataga 18<210>492<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>492acatcaaggg tcccataga19<210>493<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>493aacatcaagg gtcccataga 20<210>494<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>494aaacatcaag ggtcccatag a 21<210>495<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>495aaaacatcaa gggtcccata ga22<210>496<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>496gaaaacatca agggtcccat aga 23<210>497<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>497tttatatgca gaaatattgc tatt 24<210>498<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>498atttatatgc agaaatattg ctatt 25<210>499<211>26<212>DNA<213>人工序列<400>499tatttatatg cagaaatatt gctatt26<210>500<211>27<212>DNA<213>人工序列<400>500atatttatat gcagaaatat tgctatt 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1、一種用于診斷地中海貧血的DNA芯片，包括
一基底；以及
固定于所述基底上的探針；其特征在于
所述探針為針對α-和/或β-球蛋白缺失或突變基因的特異性探針。
2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA芯片，其中所述探針為α-球蛋白缺失基因的特異性探針。
3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的DNA芯片，其中所述特異性探針包括選自SEQID NO.1～SEQ ID NO.12中的至少一個序列的DNA、選自SEQ ID NO.13～SEQ ID NO.24中的至少一個序列的DNA、選自SEQ ID NO.25～SEQ ID NO.36中的至少一個序列的DNA和選自SEQ ID NO.37～SEQ ID NO.48中的至少一個序列的DNA。
4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA芯片，其中所述探針為β-球蛋白突變基因的特異性探針。
5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的DNA芯片，其中所述特異性探針包括選自SEQID NO.49～SEQ ID NO.56中的至少一個序列的DNA、選自SEQ ID NO.57～SEQ ID NO.64中的至少一個序列的DNA、選自SEQ ID NO.65～SEQ ID NO.72中的至少一個序列的DNA、選自SEQ ID NO.73～SEQ ID NO.80中的至少一個序列的DNA、選自SEQ ID NO.81～SEQ ID NO.88中的至少一個序列的DNA、選自SEQ ID NO.89～SEQ ID NO.96中的至少一個序列的DNA、選自SEQ ID NO.97～SEQ ID NO.104中的至少一個序列的DNA、選自SEQID NO.49～SEQ ID NO.56中的至少一個序列的DNA、選自SEQ ID NO.105～SEQ ID NO.112中的至少一個序列的DNA、選自SEQ ID NO.113～SEQID NO.120中的至少一個序列的DNA、選自SEQ ID NO.121～SEQ ID NO.128中的至少一個序列的DNA、選自SEQ ID NO.129～SEQ ID NO.136中的至少一個序列的DNA、選自SEQ ID NO.137～SEQ ID NO.144中的至少一個序列的DNA、選自SEQ ID NO.145～SEQ ID NO.152中的至少一個序列的DNA、選自SEQ ID NO.153～SEQ ID NO.160中的至少一個序列的DNA、選自SEQ ID NO.161～SEQ ID NO.168中的至少一個序列的DNA、選自SEQ IDNO.169～SEQ ID NO.176中的至少一個序列的DNA、選自SEQ ID NO.177～SEQ ID NO.184中的至少一個序列的DNA、選自SEQ ID NO.185～SEQ IDNO.192中的至少一個序列的DNA、選自SEQ ID NO.193～SEQ ID NO.200中的至少一個序列的DNA以及選自SEQ ID NO.201～SEQ ID NO.208中的至少一個序列的DNA。
6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的DNA芯片，其中所述各DNA序列的5’端進(jìn)一步連接一10～30個堿基的連拉臂。
7、用于診斷地中海貧血的DNA芯片的制備方法，包含下述步驟
1)合成探針DNA；
2)將合成的探針DNA及相應(yīng)的對照DNA點(diǎn)樣并排列于基底上；
3)將點(diǎn)樣后的探針DNA固定于所述基底上。
8、用于擴(kuò)增待檢測樣品中DNA的PCR引物，其特征在于所述引物的擴(kuò)增產(chǎn)物含有可與α-和/或β-球蛋白突變基因的特異性探針雜交的DNA序列。
9、根據(jù)權(quán)利要求8所述的引物，其特征在于所述引物的擴(kuò)增產(chǎn)物含有可與α-型球蛋白突變基因的特異性探針雜交的DNA序列。
10、根據(jù)權(quán)利要求9所述的引物，其特征在于所述引物包括四對引物。
11、根據(jù)權(quán)利要求10所述的引物，其中所述第一對引物含有選自SEQID NO.209～SEQ ID NO.216中的至少一個序列的DNA及選自SEQ ID NO.217～SEQ ID NO.224的至少一個序列的DNA、所述第二對引物含有選自SEQID NO.209～SEQ ID NO.216中的至少一個序列的DNA及選自SEQ ID NO.225～SEQ ID NO.232的至少一個序列的DNA、所述第三對引物含有選自SEQID NO.233～SEQ ID NO.240中的至少一個序列的DNA及選自SEQ ID NO.241～SEQ ID NO.248的至少一個序列的DNA、所述第四對引物含有選自SEQID NO.249～SEQ ID NO.256中的至少一個序列的DNA及選自SEQ ID NO.257～SEQ ID NO.264的至少一個序列的DNA。
12、根據(jù)權(quán)利要求10所述的引物，其中它進(jìn)一步包括一延伸引物，所述延伸引物含有選自SEQ ID NO.265～SEQ ID NO.276中的至少一個序列的DNA、選自SEQ ID NO.277～SEQ ID NO.288中的至少一個序列的DNA、選自SEQ ID NO.289～SEQ ID NO.300中的至少一個序列的DNA以及選自SEQID NO.301～SEQ ID NO.312中的至少一個序列的DNA。
13、根據(jù)權(quán)利要求8所述的引物，其特征在于所述引物的擴(kuò)增產(chǎn)物含有可與β-型球蛋白突變基因的特異性探針雜交的DNA序列。
14、根據(jù)權(quán)利要求13所述的引物，其特征在于所述引物包括二對引物。
15、根據(jù)權(quán)利要求14所述的引物，其中所述第一對引物含有選自SEQID NO.313～SEQ ID NO.319中的至少一個序列的DNA以及選自SEQ ID NO.320～SEQ ID NO.328中的至少一個序列的DNA、所述第二對引物含有選自選自SEQ ID NO.329～SEQ ID NO.336中的至少一個序列的DNA以及選自SEQID NO.337～SEQ ID NO.344中的至少一個序列的DNA。
16、根據(jù)權(quán)利要求15所述的引物，其中它進(jìn)一步包括一延伸引物，所述延伸引物含有選自SEQ ID NO.345～SEQ ID NO.352中的至少一個序列的DNA、選自SEQ ID NO.353～SEQ ID NO.360中的至少一個序列的DNA、選自SEQ ID NO.361～SEQ ID NO.368中的至少一個序列的DNA、選自SEQ IDNO.369～SEQ ID NO.376中的至少一個序列的DNA、選自SEQ ID NO.377～SEQ ID NO.384中的至少一個序列的DNA、選自SEQ ID NO.385～SEQID NO.392中的至少一個序列的DNA、選自SEQ ID NO.393～SEQ ID NO.400中的至少一個序列的DNA、選自SEQ ID NO.401～SEQ ID NO.408中的至少一個序列的DNA、選自SEQ ID NO.409～SEQ ID NO.416中的至少一個序列的DNA、選自SEQ ID NO.417～SEQ ID NO.424中的至少一個序列的DNA、選自SEQ ID NO.425～SEQ ID NO.432中的至少一個序列的DNA、選自SEQID NO.433～SEQ ID NO.440中的至少一個序列的DNA、選自SEQ ID NO.441～SEQ ID NO.448中的至少一個序列的DNA、選自SEQ ID NO.449～SEQID NO.456中的至少一個序列的DNA、選自SEQ ID NO.457～SEQ ID NO.464中的至少一個序列的DNA、選自SEQ ID NO.465～SEQ ID NO.472中的至少一個序列的DNA、選自SEQ ID NO.473～SEQ ID NO.480中的至少一個序列的DNA、選自SEQ ID NO.481～SEQ ID NO.488中的至少一個序列的DNA、選自SEQ ID NO.489～SEQ ID NO.496中的至少一個序列的DNA以及選自SEQ ID NO.497～SEQ ID NO.504中的至少一個序列的DNA。
17、一種用于診斷地中海貧血的試劑盒，其特征在于它包含
用于診斷地中海貧血的DNA芯片；以及
用于擴(kuò)增待檢樣品中DNA的PCR引物。
18、一種檢測待檢樣品中是否存在地中海貧血的相關(guān)基因的方法，包含下述步驟
1)將待檢樣品用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
2)用延伸引物對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行熒光標(biāo)記；
3)將標(biāo)記后的產(chǎn)物與診斷地中海貧血的DNA芯片進(jìn)行雜交；
4)檢測結(jié)果。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于診斷地中海貧血的DNA芯片及其制備方法，提供一種用于臨床診斷α－型和β－型地貧的DNA芯片，芯片由一基底和固定于基底上的探針組成，根據(jù)迄今已知的α－和β－球蛋白突變基因的序列，根據(jù)DNA序列特異性識別的原理設(shè)計(jì)的診斷這些突變的DNA探針。本發(fā)明的用于地中海貧血疾病診斷的DNA芯片，可提高診斷效率和診斷準(zhǔn)確性、降低成本、縮短診斷時間。
文檔編號C12Q1/68GK1453363SQ0211728
公開日2003年11月5日 申請日期2002年4月23日 優(yōu)先權(quán)日2002年4月23日
發(fā)明者楊夢蘇 申請人:亞能生物技術(shù)(深圳)有限公司