專利名稱：通用限制性酶切法測定單點dna序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及測定DNA序列中單個堿基的序列，特別是應(yīng)用于檢測與分析多態(tài)性(SNP)。
背景技術(shù)：
最近人類基因組測序的基本完成，以及單核苷酸多態(tài)性(SNP)標(biāo)記的出現(xiàn)，被公認(rèn)將極大地加快確認(rèn)導(dǎo)致復(fù)雜疾病如糖尿病、癌癥和心血管疾病的遺傳變異的過程。結(jié)果之一就是將開發(fā)出更準(zhǔn)確全面的診斷和預(yù)測，以及對于疾病的更安全有效的治療。SNP指的是在同一物種不同個體之間，在同一DNA位點上的核苷酸的不同(多態(tài)性)。SNP是最常見的遺傳變異，在所有物種中都存在，目前在人類中的研究最為深入。在人類基因組中SNP的發(fā)生頻率大約為1/1300堿基對。SNP是能引發(fā)人類疾病的穩(wěn)定突變，與藥物的有效性和毒理性有關(guān)，而且不同族裔的SNP也不相同。另外最新的研究表明SNP可以作為遺傳標(biāo)記有效地發(fā)現(xiàn)疾病基因。具體來說，在有三十億個堿基對的人類基因組中掃描一個或一些與疾病易感性、藥物毒性、藥物有效性等有關(guān)的遺傳標(biāo)記，就象大海撈針一樣。目前公認(rèn)有效的是一個三階段使用SNP標(biāo)記逐步定位的方法。第一步是使用低分辨率連鎖圖譜確認(rèn)與目標(biāo)疾病有高連鎖的一個1至3分摩根長度的遺傳區(qū)間。第二步是利用高分辨率SNP通過疾病相關(guān)性研究在所述遺傳區(qū)間內(nèi)確認(rèn)與目標(biāo)疾病相關(guān)的基因。第三步則是對這些基因內(nèi)的SNP的超細定位，確定可以用于疾病診斷的SNP及以其為基礎(chǔ)的進一步研發(fā)。
因為SNP有廣泛的用途，它的發(fā)現(xiàn)(discovery)、鑒定(validation)和測定(detection)就成為一種普遍需要。由于有無數(shù)多的病人和樣品，對于多達幾萬個甚至幾十萬個SNP進行測定，如何簡單、經(jīng)濟、大規(guī)模、高通量地發(fā)現(xiàn)、鑒定和測定SNP就成為最近幾年研究者們努力解決的問題，關(guān)于這方面的新方法和專利也不斷涌現(xiàn)。下面我們對一些主要的方法做一個簡單介紹(參考了美國專利5,952,174的一些描述)。
1)DNA測序最明顯的方法莫過于對于包含SNP位點本身及其臨近區(qū)域的DNA序列直接進行測序。這種測序可以通過兩種方法來實現(xiàn)，即“雙脫氧核苷酸鏈?zhǔn)街兄狗ā保卜Q作“山格Sanger法”(Sanger，E.，et al.，J.Mol.Biol.94441(1875))，和“化學(xué)降解法”，也稱作“馬克西姆-基爾伯特Maxam-Gilbert法”(Maxam，A.M.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)74560(1977))。對于特定基因組序列的擴增放大，例如多聚酶鏈合反應(yīng)，可以幫助對于目標(biāo)多聚核苷酸鏈的收集及其測序。不過這類方法相對來說費用較高，通量較低。
2)核苷酸外切酶抗性法(Exonuclease Resistance)曼迪Mundy，C.R.(美國專利號4,656,127)的方法使用了對于核苷酸外切酶具有特別抗性的核苷酸衍生物。首先從一個特定動物、人類或其他個體獲得目標(biāo)DNA，然后一個與目標(biāo)DNA互補，并且其3’端正好位于目標(biāo)SNP位點的前一個核苷酸的引物被使用與目標(biāo)DNA進行雜交。如果目標(biāo)SNP點的核苷酸與某種特定的具核苷酸外切酶抗性的核苷酸衍生物互補，那么這種核苷酸衍生物就會在多聚酶的作用下被接合在所述雜交上的引物末端。這種接合可以使得雜交上的引物對核苷酸外切酶具有抗性，從而被檢測到。由于具體使用的具核苷酸外切酶抗性的核苷酸衍生物的種類已知，那么如果一個引物在某種核苷酸衍生物的作用下具有核苷酸外切酶抗性，那么就可以揭示目標(biāo)SNP點的核苷酸正好與使用的核苷酸衍生物具有互補關(guān)系。曼迪方法的優(yōu)點在于它不需要測定大量額外的序列。其缺點則在于擴增的目標(biāo)DNA和未結(jié)合的引物都將被核苷酸外切酶所破壞，以及該方法對于特定的具核苷酸外切酶抗性的核苷酸衍生物在多聚酶作用下的接合反應(yīng)的速率的極其敏感性。
3)微測序法(Microsequencing Methods)近年來，以引物來引導(dǎo)的核苷酸結(jié)合方式來分析DNA多態(tài)位點的幾種方法相繼出現(xiàn)(Komher，J.S.et al.，Nucl.Acids Res.177779-7784，(1989)；Sokolov，B.P.，Nucl.Acids Res.183671(1990)；Syvanen，A.-C.，et al.，Genomics 81143-1147(1991)；Prezant，T.R.，et al.，Hum.Mutat.1159-164(1992)；Ugozzoll，L.et al.，GATA 9107-112(1992)；Nyren，P.et al.，Anal.Biochem.208171-175(1993))。這些方法要么依賴于帶放射標(biāo)記的單個脫氧核苷酸的結(jié)合以及特殊的磁珠，要么依賴于雙脫氧核苷酸的使用。其共同點是在一個末端正好位于測定位點前的引物上結(jié)合單個核苷酸，并測定該結(jié)合核苷酸的種類從而推斷出測定位點的核苷酸。
4)液相雙脫氧核苷酸延伸法科恩等人(Cohen，D.et al.)(法國專利號2,650,840；PCT申請?zhí)朩O91/02087)討論了一種液相測定一個多態(tài)位點堿基的方法。該方法與前述的曼迪方法(美國專利號4,656,127)非常類似，不過不是使用對于核苷酸外切酶具抗性的核苷酸衍生物，而是帶標(biāo)記的雙脫氧核苷酸衍生物。
科恩方法有一個顯著的缺陷在于它是一個使用帶標(biāo)記三磷酸雙脫氧核苷酸的液相延伸反應(yīng)。通常目標(biāo)DNA模版要經(jīng)過一步擴增反應(yīng)，例如PCR，而這一過程要使用高濃度的DNA聚合酶天然底物即三磷酸脫氧核苷酸。這些單體將會在接下來的延伸反應(yīng)中和三磷酸雙脫氧核苷酸進行競爭。因此，在PCR之后，需要一個額外的步驟來將目標(biāo)DNA模版與未結(jié)合的三磷酸脫氧核苷酸分開，亦即清除掉多余的三磷酸脫氧核苷酸單體，而這一步在液相中很難實現(xiàn)，也因此該方法不適用于大容量測試。
5)固相雙脫氧核苷酸延伸法另一種可選擇的方法，被稱為GBA法，是格列特等人(Goelet，P.et al.)所發(fā)明的(PCT申請?zhí)?2/15712)。在一個更可取的實施方案中，格列特等人的方法使用了帶標(biāo)記的終止物的混合體，以及一個與目標(biāo)DNA互補并且其3’端正好位于目標(biāo)多態(tài)位點的前一個核苷酸的引物。這樣能夠與引物結(jié)合的終止物就由被測定位點的核苷酸所決定，而且實際上是與其互補。與前述科恩方法(法國專利號2,650,840；PCT申請?zhí)朩O91/02087)相反，格列特等人的方法的更可取之處在于它是一種多相方法，其中引物或者目標(biāo)DNA是固定在一個固相上。因此該方法更容易操作，也比科恩方法更精確。
6)寡核苷酸鏈連接反應(yīng)法另一種固相測定SNP的方法使用了不同的酶學(xué)方法，稱作“寡核苷酸鏈連接反應(yīng)法”(Oligonucleotide Ligation Assay，簡稱OLA方法)(Landegren，U.et al.，Science2411077-1080(1988))。OLA方法使用了與一個目標(biāo)DNA的單鏈上的兩個毗連序列可以雜交的兩個寡核苷酸鏈。其中一個寡核苷酸鏈經(jīng)過生物素處理，另一個則加有可檢測的標(biāo)記。如果在目標(biāo)DNA上有一個完全互補的序列，這兩個寡核苷酸鏈將與目標(biāo)DNA雜交，并且它們的末端將毗連從而形成一個連接反應(yīng)的底物。接下來的連接反應(yīng)就使得帶標(biāo)記的寡核苷酸鏈能被阿維丁(avidin)或者另一種生物素配體結(jié)合在另一個寡核苷酸鏈上，并從而被檢測到。尼科松等人(Nickerson，D.A.et al.)描述了一種結(jié)合PCR和OLA的檢測核苷酸的方法(Nickerson，D.A.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)878923-8927(1990))。在這個方法里，目標(biāo)DNA首先用PCR方法進行擴增，然后再用OLA方法來檢測。這種分析要求對于目標(biāo)多態(tài)位點的每個dNTP都要用與其配套的一對寡核苷酸鏈來分開檢查。OLA方法的主要缺點在于連接反應(yīng)不是一個具有高識別率的過程，因而非特異性的信號是一個大問題。
值得肯定的是，絕大多數(shù)所述的方法都要求有聚合酶來將一個核苷酸衍生物結(jié)合到引物的末端。目前所需要的是開發(fā)一個更有選擇性的方式來分辨多態(tài)位點。我們這里報告的發(fā)明是為了滿足這方面的要求。
發(fā)明的描述本發(fā)明公開了一種通過將DNA分子與一個附著在固相的寡核苷酸引物，及另一個在液相的引物，在聚合酶的作用下使用帶不同標(biāo)記的三磷酸脫氧核苷酸(dNTP)進行PCR反應(yīng)，最后利用一種通用限制性內(nèi)切酶處理的方法來測定所述DNA分子上單個預(yù)先選定位點序列的方法，包括以下幾個步驟a)將一份或多份所述DNA分子與附著在固相的所述寡核苷酸引物，及另一個所述在液相的引物，在聚合酶的作用下使用帶不同標(biāo)記的三磷酸脫氧核苷酸(dNTP)進行PCR反應(yīng)；此處所述DNA分子包含有所述單個預(yù)先選定位點，并且在所述預(yù)先選定位點的3’端有18或以上個核苷酸，同時所述附著在固相的寡核苷酸引物長度為25個左右(設(shè)定為N個堿基)，在3’端有20個左右核苷酸與所述DNA在所述預(yù)先選定位點的上游部分互補，并且其3’端互補處正好位于所述單個預(yù)先選定位點的前一個核苷酸，同時其5’端存在所述通用限制性內(nèi)切酶的識別片斷，而其酶切位點則在3’端的下一個堿基的位置，同時所述在液相的引物長度為20個左右，與所述DNA在所述預(yù)先選定位點的下游部分互補，并且其3’端位于所述單個預(yù)先選定位點的下游；b)將所述PCR產(chǎn)物用一種在DNA雙鏈從5’端第N+1個核苷酸位置作用的通用限制性內(nèi)切酶處理，這樣只有一個帶標(biāo)記的核苷酸會留在附著在固相的引物上；c)在約95攝氏度高溫洗滌附有引物的固相，以使得其只帶有酶切后的引物單鏈DNA；
d)測定所述附著在固相上的引物單鏈DNA上的標(biāo)記以決定何種dNTP在PCR反應(yīng)中被結(jié)合在所述預(yù)先選定位點，從而確定所述預(yù)先選定位點的序列。
本發(fā)明使用了一個附著在固相，3’端有約20個核苷酸與目標(biāo)DNA互補，并且其3’端頂點正好位于目標(biāo)SNP位點的前一個核苷酸；同時在5’端有一個酶切位點位于3’端下一個核苷酸的的限制性核苷酸內(nèi)切酶的識別片斷的引物。在將目標(biāo)DNA擴增，并用該引物與目標(biāo)DNA雜交后，用聚合酶來將帶標(biāo)記的三磷酸脫氧核苷酸(dNTP)結(jié)合到引物的末端進行延伸。在使用所述限制性核苷酸內(nèi)切酶作用，并高溫處理后，附著在固相的引物將帶有單個延伸核苷酸，并由于其帶有標(biāo)記而被檢測到其種類，從而檢測到在多態(tài)位點的核苷酸。
不同種類的核苷酸是使用不同的標(biāo)記，但卻可以混合在一起進行這種結(jié)合反應(yīng)，對于每個延伸反應(yīng)只有一個帶標(biāo)記的核苷酸會連接到引物上，因此只需關(guān)注所檢測到的標(biāo)記信號的種類，從而使得檢測非常簡單。
對于絕大部分SNP檢測來說，只需要使用兩種不同的三磷酸脫氧核苷酸(dNTP)。顯然，如果使用所有四種dNTP，本發(fā)明的方法可以用來測定一個位點的核苷酸序列。因此，本發(fā)明并不局限于測定SNP。
在另一個實施方案中，對于三磷酸脫氧核苷酸的標(biāo)記不只是限于通常的熒光標(biāo)記，而可以是任何可檢測到的標(biāo)記如放射性標(biāo)記，生物發(fā)光標(biāo)記，化學(xué)發(fā)光標(biāo)記，核苷酸標(biāo)記，半抗原標(biāo)記和酶標(biāo)記。
本發(fā)明也可以用來檢測從多個個體中取得的混合樣品，而且這些樣品可以是來自于基因組DNA(genomic DNA)，環(huán)形DNA，cDNA，EST，或?qū)ζ溥M行擴增的結(jié)果；或者是來自于對RNA進行反轉(zhuǎn)錄擴增的結(jié)果。
本發(fā)明可以大規(guī)模操作，如用來同步測定多達數(shù)千個甚至數(shù)十萬個位點的序列和SNP，并且可以實現(xiàn)高通量操作。一般來說這是通過生物芯片來實施。
權(quán)利要求
1.一種通過將DNA分子與一個附著在固相的寡核苷酸引物，及另一個在液相的引物，在聚合酶的作用下使用帶不同標(biāo)記的三磷酸脫氧核苷酸(dNTP)進行PCR反應(yīng)，最后利用一種通用限制性內(nèi)切酶處理的方法來測定所述DNA分子上單個預(yù)先選定位點序列的方法，包括以下幾個步驟a)將一份或多份所述DNA分子與附著在固相的所述寡核苷酸引物，及另一個所述在液相的引物，在聚合酶的作用下使用帶不同標(biāo)記的三磷酸脫氧核苷酸(dNTP)進行PCR反應(yīng)；此處所述DNA分子包含有所述單個預(yù)先選定位點，并且在所述預(yù)先選定位點的3’端有18或以上個核苷酸，同時所述附著在固相的寡核苷酸引物長度為25個左右(設(shè)定為N個堿基)，在3’端有20個左右核苷酸與所述DNA在所述預(yù)先選定位點的上游部分互補，并且其3’端互補處正好位于所述單個預(yù)先選定位點的前一個核苷酸，同時其5’端存在所述通用限制性內(nèi)切酶的識別片斷，而其酶切位點則在3’端的下一個堿基的位置，同時所述在液相的引物長度為20個左右，與所述DNA在所述預(yù)先選定位點的下游部分互補，并且其3’端位于所述單個預(yù)先選定位點的下游；b)將所述PCR產(chǎn)物用一種在DNA雙鏈從5’端第N+i個核苷酸位置作用的通用限制性內(nèi)切酶處理，這樣只有一個帶標(biāo)記的核苷酸會留在附著在固相的引物上；c)在約95攝氏度高溫洗滌附有引物的固相，以使得其只帶有酶切后的引物單鏈DNA；d)測定所述附著在固相上的引物單鏈DNA上的標(biāo)記以決定何種dNTP在PCR反應(yīng)中被結(jié)合在所述預(yù)先選定位點，從而確定所述預(yù)先選定位點的序列。
2.權(quán)利要求1的方法，其中通用限制性內(nèi)切酶及其酶切位點選自Mmel，TCCRAC(20/18)(指Mmel酶識別的片斷為TCCRAC，其酶切位點則位于該片斷下游第20個核苷酸，在互補鏈上的酶切位點則位于該片斷下游第18個核苷酸)；Eco57I，CTGAAG(16/14)；Eco57MI，CTGRAG(16/14)；Bce83I，CTTGAG(16/14)。
3.權(quán)利要求1的方法，其中用于標(biāo)記三磷酸脫氧核苷酸的標(biāo)記選自放射性標(biāo)記、熒光標(biāo)記、生物發(fā)光標(biāo)記、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記、核苷酸標(biāo)記、半抗原標(biāo)記或酶標(biāo)記。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述DNA分子是來源于同一個體的不同染色體，或者是來源于不同個體的染色體。
5.權(quán)利要求1或4的方法，其中所述DNA分子是經(jīng)過了以另一個單鏈或雙鏈核酸模板進行擴增。
6.權(quán)利要求5的方法，其中用于擴增的核酸模板選自基因組DNA(genomic DNA)、環(huán)形DNA、cDNA、EST。
7.權(quán)利要求5的方法，其中用于擴增的核酸模板是RNA，使用的聚合酶是反轉(zhuǎn)錄酶。
8.權(quán)利要求5的方法，其中用于擴增的DNA或RNA模板來自一個或多個個體。
全文摘要
本發(fā)明涉及測定脫氧核糖核酸(DNA)序列中單個堿基的序列，特別是應(yīng)用于檢測與分析多態(tài)性(SNP)。本發(fā)明公開了一種通過將DNA分子與一個附著在固相的寡核苷酸引物，及另一個在液相的引物，在聚合酶的作用下使用帶不同標(biāo)記的三磷酸脫氧核苷酸(dNTP)進行PCR反應(yīng)，最后利用一種通用限制性內(nèi)切酶處理的方法來測定所述DNA分子上單個預(yù)先選定位點序列的方法。
文檔編號C12Q1/68GK1451761SQ0211685
公開日2003年10月29日 申請日期2002年4月12日 優(yōu)先權(quán)日2002年4月12日
發(fā)明者劉湘軍 申請人:劉湘軍