專(zhuān)利名稱(chēng)：目標(biāo)誘導(dǎo)鏈釋放和限制性?xún)?nèi)切酶酶切循環(huán)的信號(hào)放大技術(shù)建立及赭曲霉素a的檢測(cè)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于化學(xué)發(fā)光檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種信號(hào)放大技術(shù)的研制和一種化學(xué)發(fā)光探針的制備，在其應(yīng)用上涉及赭曲霉素A(Ochratoxin A, 0ΤΑ)含量的檢測(cè)。
背景技術(shù)：
根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)統(tǒng)計(jì)報(bào)告表明，食源性疾病已經(jīng)成為當(dāng)今世界上分布最廣泛、最常見(jiàn)的疾病之一。食源性相關(guān)疾病的發(fā)病率居各類(lèi)疾病總發(fā)病率的前列，并成為當(dāng)前國(guó)際上最突出的公共衛(wèi)生問(wèn)題。造成食源性相關(guān)疾病的食品安全問(wèn)題主要集中在生物毒素危害、化學(xué)危害、食品微生物危害、寄生蟲(chóng)危害等幾個(gè)方面。在糧食供應(yīng)中，毒素可由許多途徑產(chǎn)生，如農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、工業(yè)加工以及儲(chǔ)藏運(yùn)輸活動(dòng)等；這些有害物質(zhì)在ng/g pg/g、甚至更低的水平上對(duì)人類(lèi)的身體有害。食品中霉菌毒素污染是一個(gè)特殊問(wèn)題，這是由于 真菌感染的谷物豆類(lèi)、水果干、花生、啤酒和葡萄汁等加工后還會(huì)存在于食品中。每年都有很多人由于食品中有害物質(zhì)而感染疾病[Ligler F S，Taitt C R，Shriver-Lake L C，Sapsford K E，Shubin Y，Golden J P.2003. Analytical and Bioanalytical Chemistry,377 :469-477] 0例如，最常見(jiàn)的疾病胃腸炎，其就是由于攝入受金黃色葡萄球菌腸毒素(SEs)污染的食物所引起的。赭曲霉毒素A是天然存在的霉菌衍生代謝產(chǎn)生的一種真菌毒素，能使人的腎臟受損、動(dòng)物的產(chǎn)蛋率下降，并有致畸、致癌作用，而且赭曲霉毒素A還可通過(guò)母親的血液轉(zhuǎn)入到乳汁中嬰兒攝取[張藝兵，鮑蕾，褚慶華.2006.北京化學(xué)工業(yè)出版社；Duarte S C, Pena A, Lino C Μ. 2010. Food Microbiology, 27 187-198 ；EekekogluP, Sabuncuoglu S, Sydin S, Sahin G. 2010.Belma Giray Toxicon, 55 :507-513 ;DuarteS, Bento J, Pena A, Lino C M, Delerue-Matos C, Oliva-Teles T, Morais S, Correia M,Oliveira MBP P,Alves M R, Pereira J A. 2010. Science of the Total Environment,408 :1195-1198]。因此，很多國(guó)家都對(duì)食品中的OTA含量都有限制。OTA檢測(cè)技術(shù)已經(jīng)得到長(zhǎng)足的發(fā)展?，F(xiàn)在OTA檢測(cè)方法主要是色譜技術(shù)，包括薄層色譜(TLC)，氣相色譜(GC)，高效液相色譜(HPLC)，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)，固相萃取-液相色譜-電噴霧質(zhì)譜聯(lián)用(SPE-LC-ESI-MS)，毛細(xì)管電泳法(CE)等。此外，固相微萃取-液相色譜-熒光檢測(cè)也已經(jīng)報(bào)道過(guò)了。自從Cruz-Aguado和Penner在2008年發(fā)現(xiàn)了具有選擇性識(shí)別OTA的DNA適體后，科研人員相繼研究出了一系列基于OTA適體的檢測(cè)OTA的新方法。這開(kāi)辟了一種 OTA 真菌毒素檢測(cè)的新局面[Wang Z P, Duan N, Hun X, Wu S J. 2010. Analytical andBioanalytical Chemistry. 398，2125-2132.]。盡管這些OTA檢測(cè)方法自身有很多優(yōu)勢(shì)，但仍然需要尋找一些新方法來(lái)提高測(cè)定的靈敏度和選擇性。提高生物傳感器靈敏度的有效方法之一就是建立新的信號(hào)放大技術(shù)。一些信號(hào)放大技術(shù)如聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，滾環(huán)放大(RCA)，環(huán)介導(dǎo)等溫放大(LAMP)和限制性?xún)?nèi)切酶信號(hào)放大都已經(jīng)見(jiàn)諸報(bào)道了。在這些方法中，限制性?xún)?nèi)切酶信號(hào)放大方法是借助切口酶為工具，以循環(huán)利用為原理，使一個(gè)待測(cè)目標(biāo)物產(chǎn)生多個(gè)信號(hào)單元。這種切口酶的酶切循環(huán)信號(hào)放大技術(shù)在分析檢測(cè)中取得了高的靈敏度，開(kāi)辟了新的信號(hào)放大原理和分析測(cè)定技術(shù)，這種方法測(cè)定的靈敏度較普通方法(沒(méi)有經(jīng)過(guò)切口酶的酶切循環(huán)信號(hào)放大過(guò)程)提高了許多[Jia H X,Li Z P, Liu C H,Cheng Y Q. 2010. Angewandte Chemie International Edition,49 :5498-5501]。本發(fā)明的目的是利用DNA聚合酶聚合作用和切口酶酶切作用原理構(gòu)建以一個(gè)目標(biāo)待測(cè)物產(chǎn)生多個(gè)信號(hào)單元的信號(hào)放大技術(shù)，以功能化的納米粒子為標(biāo)記物，實(shí)現(xiàn)高靈敏度對(duì)OTA行進(jìn)測(cè)定。本發(fā)明所提供的方法包括以下步驟(I)制備功能化的納米粒子。所述的方法，其所述的納米粒子為表面具有活性基團(tuán)的二氧化硅納米粒子、金納 米粒子、磁性納米粒子、量子點(diǎn)、聚合物納米粒子、脂質(zhì)體以及沒(méi)有活性基團(tuán)的金納米粒子。(2)利用化學(xué)發(fā)光試劑對(duì)功能化的納米粒子進(jìn)行修飾，制備化學(xué)發(fā)光納米粒子。所述的方法，其所述的化學(xué)發(fā)光試劑為魯米諾、魯米諾衍生物；光澤精、洛粉堿、過(guò)氧化草酸酯類(lèi)以及吖啶酯類(lèi)及其衍生物。(3)利用識(shí)別作用DNA5對(duì)化學(xué)發(fā)光納米粒子進(jìn)行修飾，得化學(xué)發(fā)光納米粒子探針。(4)利用適體DNAl和互補(bǔ)DNA2對(duì)磁性微珠進(jìn)行修飾制備功能化的磁性微珠(FMBl)。(5)利用DNA4對(duì)磁性微珠進(jìn)行修飾制備另外一種用于捕獲后續(xù)DNA的功能化的磁性微珠FMB2。(6)利用OTA與適體DNAl的作用，將(4)中制備的功能化磁性微珠表面的DNA2置換下來(lái)，釋放DNA2 ;將釋放出的DNA2與模板DNA3反應(yīng)，生成部分互補(bǔ)的雙鏈，在DNA聚合酶和切割酶的作用下，實(shí)現(xiàn)生長(zhǎng)于切割的循環(huán)，生成大量的短鏈DNA。(7)所述的方法，其所述的對(duì)短鏈DNA產(chǎn)生作用的酶為聚合酶Phi29，進(jìn)行切割的酶為限制性?xún)?nèi)切酶Nb. BbvCI。(8)以化學(xué)發(fā)光納米粒子為探針，利用功能化磁性微珠表面DNA3捕獲作用連接
(6)生成的短鏈DNA，引起功能化磁性微珠表面化學(xué)發(fā)光試劑濃度的變化。(9)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。將(8)中捕獲有化學(xué)發(fā)光探針的磁性微珠進(jìn)行化學(xué)發(fā)光測(cè)定，據(jù)此實(shí)現(xiàn)對(duì)OTA的檢測(cè)。


圖I為本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)原理示意圖。圖2不同目標(biāo)物的檢測(cè)結(jié)果圖。圖3為化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度與OTA濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
具體實(shí)施例方式下面的實(shí)例將具體說(shuō)明本發(fā)明的操作方法，但本發(fā)明的實(shí)施方法不限于此。I本發(fā)明所用的試劑
4-氧-4-[[3-(三乙氧硅基)丙基]氨基]-2-丁酸(OTSPAB)從上海信達(dá)化學(xué)工業(yè)有限公司(上海，中國(guó))購(gòu)進(jìn)。四乙氧基硅烷(TEOS)，正己醇，曲拉通X-100 (TX-100)和環(huán)己烷都是從上海化工廠購(gòu)進(jìn)(上海，中國(guó))。N-羥基丁二酰亞胺(NHS)和I-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺(EDC)是從Sigma (St. Louis, USA)購(gòu)進(jìn)的。N-(4-氨基丁基)-N-乙基異魯米諾(ABEI)是從 Tokyo Chemical Industry Co. Ltd. (Tokyo, Japan)買(mǎi)進(jìn)的。DNA聚合酶Phi29(10Ul·! L—1)(包含Phi29聚合酶反應(yīng)緩沖溶液)和三磷酸脫氧單核苷酸混合溶液(dNTPs) (IOmM)和 Nb. BbvCI (10U μ Γ1)(包含緩沖液 2)都是從 New England BiolabsCo. Ltd. (Ipswich,MA, USA)買(mǎi)進(jìn)。OTA 是從 Sigma-Aldrich (USA)購(gòu)進(jìn)。(注意:0ΤΑ 是一種具有很強(qiáng)的致癌作用的藥品，因此特別注意的是盡量避免與它接觸。受污染的OTA原料，赭曲霉毒素和法華林必須妥善處理。)輕基化磁性微珠(MBl) (I μ m-1. 5 μ m, IOmg ml/1)和輕基化磁性微珠(MB2) (100-200nm, 5mg mL—1)是從天津貝思樂(lè)色譜技術(shù)開(kāi)發(fā)中心買(mǎi)進(jìn)的(天津，中國(guó))。所有的試劑都是分析純并且使用前不需要進(jìn)一步進(jìn)行純化。結(jié)合緩沖液(BB)(IOmM Tris, pH8. 5,120mM NaCl，5mM KCl，和 20mM CaCl2)用于在適體和 OTA 之間的結(jié)合反應(yīng)。2本發(fā)明所用的DNA由賽百盛基因技術(shù)有限公司(北京，中國(guó))合成，序列如下 2. I DNAl 5/ -NH2-GAT CGG GTG TGG GTG GCG TAA AGG GAG CAT CGG ACA-3'2. 2 DNA2 5/ -CAC CCA CAC CCG ATC-3'2. 3 DNA3 5'-ACT CCC CGG ATT CCTCAGC GAT CGG GTG TGG GTG-3'2.4 DNA4 :5'-NH2_AAC TTA ACT CCC CGG-3'2. 5 DNA5 :5'-ATT CCT CAG AGG TAC-3'。3化學(xué)發(fā)光納米粒子探針的制備3. I功能化二氧化硅納米粒子的合成。將I. 77mL表面活性劑TX-100，7. 5mL環(huán)己燒和I. 8mL助表面活性劑正己醇用磁力攪拌器混合30min.。然后，加入0. 48mL水，并持續(xù)攪拌至混合物形成均勻的油包水微乳液體系。加入IOOyL TE0S，然后加入60yLNH3 · H20(28-30wt. % )開(kāi)始水解反應(yīng)。持續(xù)攪拌12h，然后加入100 μ L OTSPAB和60 μ LΝΗ3·Η20并繼續(xù)攪拌。12h后，加入25mL丙酮破乳。在8000rpm下，離心IOmin.，收集產(chǎn)物。用乙醇和水超聲、離心洗滌數(shù)次，室溫干燥。3. 2 ABEI標(biāo)記二氧化硅納米粒子。將三滴0. IM HCl滴入0. 0980g ABEI中，然后用水稀釋至IOmL獲得0. 036M濃度的ABEI溶液。然后取I. OmL準(zhǔn)備好的功能化二氧化硅納米粒子分散于3. OmL的磷酸鹽緩沖液中，加入IOmg NHS和20mg EDC，在37攝氏度下反應(yīng)60分鐘。最后加入ABEI溶液，在室溫下輕輕晃動(dòng)反應(yīng)12小時(shí)。所得ABEI標(biāo)記二氧化硅納米粒子保存在4攝氏度的環(huán)境中。3. 3 DNA修飾的ABEI標(biāo)記二氧化硅納米粒子制備。首先,將2mg的ABEI標(biāo)記二氧化硅納米粒子加入到0. IM磷酸鹽緩沖液中。然后加入90mg的NHS和180mg的EDC，在37攝氏度下反應(yīng)一小時(shí)。生成的產(chǎn)物用2. OmL的0. IM磷酸鹽緩沖液沖洗3次。最后，往上述所得溶液里加入5. O X IO-7M DNA5，在37攝氏度下恒溫反應(yīng)12小時(shí)，得化學(xué)發(fā)光納米粒子探針。然后用2. OmL的0. IM磷酸鹽緩沖液沖洗3次，分散在2. OmL磷酸鹽緩沖液中，在4攝氏度下保存。4功能化磁性微珠(FMB)的制備。
4. I功能化磁性微珠(FMBl)的制備。將150 μ L KT7M的DNAl和2000 μ L O. IM的咪唑緩沖液(pH為6. 8)混合，37°C下反應(yīng)30min，再加入1000 μ L O. IM的EDC和50 μ L磁珠，繼續(xù)反應(yīng)12h，得DNAl修飾的磁性微珠。然后用PBS洗三次，定容至500 μ L。于I. 5mL樣品管加入50 μ L的DNAl修飾的磁性微珠，再加入50 μ L，IO^7M的DNA2，37°C下雜交4h，用PBS緩沖液洗三次，稀釋至50 μ L制得功能化的磁性微珠。4. 2 功能化磁性微珠(FMB2)的制備。將 150 μ L 的 DNA4 (I(T7M)和 2000 μ L O. IM的咪唑(pH為6. 8)混合，37°C下反應(yīng)30min，再加入1000 μ L O. IM的EDC和50 μ L磁珠繼續(xù)反應(yīng)12小時(shí)。用PBS洗三次，然后稀釋至500 μ L，得DNA4修飾的磁性微珠。50ΤΑ含量的檢測(cè)。5. I取含OTA的樣品溶液50 μ L加入到200 μ L的FMBl溶液，37攝氏度反應(yīng)大約50分鐘，然后混合物在磁力架上分離。5. 2將上述5. I的上清液轉(zhuǎn)移到裝有DNA3溶液的試管中。然后加入Phi29緩沖溶 液(6yL),1.25mM dNTPs (6 μ L)，Phi29 (O. 5 μ L)，在37攝氏度下反應(yīng)大約10分鐘，再加入Nb. BbvCl (O. 5 μ L)和緩沖液2。在37攝氏度下放置一段時(shí)間后，加入FMB2和化學(xué)發(fā)光納米粒子探針，反應(yīng)30分鐘。然后磁力分離，進(jìn)行檢測(cè)。5. 3四個(gè)輸送管路中兩個(gè)用來(lái)輸送樣品和載流-緩沖溶液，另兩個(gè)輸送CoCl2和H2O2溶液。用六通閥采樣品進(jìn)行注射，每次采樣體積為100 μ L，所注射的樣品隨著載流在第一個(gè)交匯處混合，然后該混合物再在第三個(gè)交匯處與CoC12+H202混合溶液在流通池前段混合，發(fā)生化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光，利用光電倍增管檢測(cè)發(fā)光信號(hào)，從而根據(jù)化學(xué)發(fā)光信號(hào)的強(qiáng)度來(lái)確定所測(cè)溶液的濃度。6樣品制備。從農(nóng)產(chǎn)品市場(chǎng)里選取12個(gè)小麥樣品，樣品先經(jīng)過(guò)粉碎機(jī)粉碎，然后再用試驗(yàn)篩篩分(Imm孔徑)。然后取20g研細(xì)樣品和5g NaCl倒入到IOOmL燒瓶里，再加入提取液(甲醇和水，體積比為8 2)。待完全混合后轉(zhuǎn)入均質(zhì)機(jī)中，高速攪拌2分鐘。然后過(guò)濾，將所得溶液IOmL轉(zhuǎn)移到50mL燒瓶里混勻。將所得溶液再進(jìn)一步用玻璃纖維濾紙過(guò)濾直到所得濾液澄清。濾液用BB稀釋后按上述檢測(cè)方法進(jìn)行分析檢測(cè)。7結(jié)果與討論7. I標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與樣品的測(cè)定。7. 2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。配制不同濃度的OTA標(biāo)準(zhǔn)溶液，測(cè)定其化學(xué)發(fā)光信號(hào)，發(fā)光信號(hào)與OTA濃度成良好的線性關(guān)系，線性范圍為1.0X10_12mol L—1 I. OX 10_1(lmOl L_S檢測(cè)限為 4. I X 10-13moI I/1 (如圖 3)。7. 3在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，對(duì)提取好的小麥樣品上清液進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)定結(jié)果如表I所
/Jn ο7. 4利用加標(biāo)回收法對(duì)方法的的可行性進(jìn)行了考察。將不同濃度的OTA加入小麥樣品中?；厥章实膶?shí)驗(yàn)結(jié)果列于表I。上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所做的改變、修飾、代替、組合、簡(jiǎn)化，較為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.基于目標(biāo)誘導(dǎo)鏈釋放和限制性?xún)?nèi)切酶酶切循環(huán)的信號(hào)放大技術(shù)建立及其在赭曲霉素A超靈敏度檢測(cè)中的應(yīng)用，其特征包括以下步驟 (a)首先，將適體和適體互補(bǔ)序列固定在磁珠表面，在有目標(biāo)物存在時(shí)，適體互補(bǔ)序列從磁珠表面脫落。經(jīng)磁性分離后，將適體互補(bǔ)序列與模版DNA雜交，在DNA聚合酶的作用下，適體互補(bǔ)序列會(huì)沿著模版生長(zhǎng)，形成完全互補(bǔ)雙鏈DNA。
(b)將步驟(a)的生成的雙鏈DNA用切割酶切割，得到一條短鏈DNA，同時(shí)得到新的生長(zhǎng)位點(diǎn)，在聚合酶酶和切割酶的作用下，生長(zhǎng)和切割會(huì)不斷進(jìn)行產(chǎn)生大量短鏈DNA。
(c)將(b)所得短鏈DNA用化學(xué)發(fā)光探針進(jìn)行測(cè)定，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物的檢測(cè)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于步驟(a)中的適體為赭曲霉素A適體(DNAl)。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于步驟(a)中適體互補(bǔ)序列為赭曲霉素A適體互補(bǔ)序列(DNA2)，其與赭曲霉素A適體(DNAl)部分互補(bǔ)。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于步驟(a)中的模版DNA為聚合模版DNA3，其與赭曲霉素A適體互補(bǔ)序列部分互補(bǔ)。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于步驟(a)中的酶為DNA聚合酶Phi29。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于步驟(b)中的酶為限制性?xún)?nèi)切酶Nb.BbvCI0
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于步驟(c)中探針為DNA和ABEI標(biāo)記的羧基化的二氧化硅化學(xué)發(fā)光納米粒子。
全文摘要
本發(fā)明實(shí)施例公開(kāi)了一種基于目標(biāo)誘導(dǎo)鏈釋放和限制性?xún)?nèi)切酶酶切循環(huán)的新型信號(hào)放大技術(shù)和化學(xué)發(fā)光檢測(cè)赭曲霉素A的方法。將赭曲霉素A適體(DNA1)和赭曲霉素A適體互補(bǔ)序列(DNA2)固定于磁珠表面，在赭曲霉素A存在時(shí)，DNA1與赭曲霉素A作用，導(dǎo)致DNA2從磁珠表面脫落；經(jīng)過(guò)磁性分離后，將DNA2與聚合模板DNA3雜交，形成部分互補(bǔ)DNA雙鏈，在DNA聚合酶Phi29的作用下，DNA2沿著模板DNA3生長(zhǎng)，從而形成完全互補(bǔ)的雙鏈DNA；生成的雙鏈DNA的一條鏈被限制性?xún)?nèi)切酶Nb.BbvCI切割，從而生成一條短鏈DNA；被切割的DNA形成一個(gè)新的生長(zhǎng)點(diǎn)，并在聚合酶Phi29和限制性?xún)?nèi)切酶Nb.BbvC的作用下，繼續(xù)進(jìn)行生長(zhǎng)和切割，由于生長(zhǎng)和切割的不斷進(jìn)行，從而產(chǎn)生大量的短鏈DNA；再利用DNA和化學(xué)發(fā)光試劑標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光納米粒子為探針對(duì)該短鏈DNA進(jìn)行測(cè)定，實(shí)現(xiàn)赭曲霉素A的測(cè)定。
文檔編號(hào)G01N21/76GK102830113SQ201210208159
公開(kāi)日2012年12月19日 申請(qǐng)日期2012年6月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月14日
發(fā)明者混旭, 劉芳 申請(qǐng)人:青島科技大學(xué)