專(zhuān)利名稱(chēng)：通過(guò)pcr產(chǎn)物不同長(zhǎng)度測(cè)定snp的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及檢測(cè)與分析多態(tài)性(SNP)。
背景技術(shù)：
最近人類(lèi)基因組測(cè)序的基本完成，以及單核苷酸多態(tài)性(SNP)標(biāo)記的出現(xiàn)，被公認(rèn)將極大地加快確認(rèn)導(dǎo)致復(fù)雜疾病如糖尿病、癌癥和心血管疾病的遺傳變異的過(guò)程。結(jié)果之一就是將開(kāi)發(fā)出更準(zhǔn)確全面的診斷和預(yù)測(cè)，以及對(duì)于疾病的更安全有效的治療。SNP指的是在同一物種不同個(gè)體之間，在同一DNA位點(diǎn)上的核苷酸的不同(多態(tài)性)。SNP是最常見(jiàn)的遺傳變異，在所有物種中都存在，目前在人類(lèi)中的研究最為深入。在人類(lèi)基因組中SNP的發(fā)生頻率大約為1/1300堿基對(duì)。SNP是能引發(fā)人類(lèi)疾病的穩(wěn)定突變，與藥物的有效性和毒理性有關(guān)，而且不同族裔的SNP也不相同。另外最新的研究表明SNP可以作為遺傳標(biāo)記有效地發(fā)現(xiàn)疾病基因。具體來(lái)說(shuō)，在有三十億個(gè)堿基對(duì)的人類(lèi)基因組中掃描一個(gè)或一些與疾病易感性、藥物毒性、藥物有效性等有關(guān)的遺傳標(biāo)記，就象大海撈針一樣。目前公認(rèn)有效的是一個(gè)三階段使用SNP標(biāo)記逐步定位的方法。第一步是使用低分辨率連鎖圖譜確認(rèn)與目標(biāo)疾病有高連鎖的一個(gè)1至3分摩根長(zhǎng)度的遺傳區(qū)間。第二步是利用高分辨率SNP通過(guò)疾病相關(guān)性研究在所述遺傳區(qū)間內(nèi)確認(rèn)與目標(biāo)疾病相關(guān)的基因。第三步則是對(duì)這些基因內(nèi)的SNP的超細(xì)定位，確定可以用于疾病診斷的SNP及以其為基礎(chǔ)的進(jìn)一步研發(fā)。
因?yàn)镾NP有廣泛的用途，它的發(fā)現(xiàn)(discovery)、鑒定(validation)和測(cè)定(detection)就成為一種普遍需要。由于有無(wú)數(shù)多的病人和樣品，對(duì)于多達(dá)幾萬(wàn)個(gè)甚至幾十萬(wàn)個(gè)SNP進(jìn)行測(cè)定，如何簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、大規(guī)模、高通量地發(fā)現(xiàn)、鑒定和測(cè)定SNP就成為最近幾年研究者們努力解決的問(wèn)題，關(guān)于這方面的新方法和專(zhuān)利也不斷涌現(xiàn)。下面我們對(duì)一些主要的方法做一個(gè)簡(jiǎn)單介紹(參考了美國(guó)專(zhuān)利5,952,174的一些描述)。
1)DNA測(cè)序最明顯的方法莫過(guò)于對(duì)于包含SNP位點(diǎn)本身及其臨近區(qū)域的DNA序列直接進(jìn)行測(cè)序。這種測(cè)序可以通過(guò)兩種方法來(lái)實(shí)現(xiàn)，即“雙脫氧核苷酸鏈?zhǔn)街兄狗ā?，也稱(chēng)作“山格Sanger法”(Sanger，F(xiàn).，et al.，J.Mol.Biol.94441(1875))，和“化學(xué)降解法”，也稱(chēng)作“馬克西姆-基爾伯特Maxam-Gilbert法”(Maxam，A.M.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)74560(1977))。對(duì)于特定基因組序列的擴(kuò)增放大，例如多聚酶鏈合反應(yīng)，可以幫助對(duì)于目標(biāo)多聚核苷酸鏈的收集及其測(cè)序。不過(guò)這類(lèi)方法相對(duì)來(lái)說(shuō)費(fèi)用較高，通量較低。
2)核苷酸外切酶抗性法(Exonuclease Resistance)曼迪Mundy，C.R.(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,656,127)的方法使用了對(duì)于核苷酸外切酶具有特別抗性的核苷酸衍生物。首先從一個(gè)特定動(dòng)物、人類(lèi)或其他個(gè)體獲得目標(biāo)DNA，然后一個(gè)與目標(biāo)DNA互補(bǔ)，并且其3’端正好位于目標(biāo)SNP位點(diǎn)的前一個(gè)核苷酸的引物被使用與目標(biāo)DNA進(jìn)行雜交。如果目標(biāo)SNP點(diǎn)的核苷酸與某種特定的具核苷酸外切酶抗性的核苷酸衍生物互補(bǔ)，那么這種核苷酸衍生物就會(huì)在多聚酶的作用下被接合在所述雜交上的引物末端。這種接合可以使得雜交上的引物對(duì)核苷酸外切酶具有抗性，從而被檢測(cè)到。由于具體使用的具核苷酸外切酶抗性的核苷酸衍生物的種類(lèi)已知，那么如果一個(gè)引物在某種核苷酸衍生物的作用下具有核苷酸外切酶抗性，那么就可以揭示目標(biāo)SNP點(diǎn)的核苷酸正好與使用的核苷酸衍生物具有互補(bǔ)關(guān)系。曼迪方法的優(yōu)點(diǎn)在于它不需要測(cè)定大量額外的序列。其缺點(diǎn)則在于擴(kuò)增的目標(biāo)DNA和未結(jié)合的引物都將被核苷酸外切酶所破壞，以及該方法對(duì)于特定的具核苷酸外切酶抗性的核苷酸衍生物在多聚酶作用下的接合反應(yīng)的速率的極其敏感性。
3)微測(cè)序法(Microsequencing Methods)近年來(lái)，以引物來(lái)引導(dǎo)的核苷酸結(jié)合方式來(lái)分析DNA多態(tài)位點(diǎn)的幾種方法相繼出現(xiàn)(Komher，J.S.et al.，Nucl.Acids Res.177779-7784，(1989)；Sokolov，B.P.，Nucl.Acids Res.183671(1990)；Syvanen，A.-C.，et al.，Genomics 81143-1147(1991)；Prezant，T.R.，et al.，Hum.Mutat.1159-164(1992)；Ugozzoll，L.et al.，GATA 9107-112(1992)；Nyren，P.et al.，Anal.Biochem.208171-175(1993))。這些方法要么依賴(lài)于帶放射標(biāo)記的單個(gè)脫氧核苷酸的結(jié)合以及特殊的磁珠，要么依賴(lài)于雙脫氧核苷酸的使用。其共同點(diǎn)是在一個(gè)末端正好位于測(cè)定位點(diǎn)前的引物上結(jié)合單個(gè)核苷酸，并測(cè)定該結(jié)合核苷酸的種類(lèi)從而推斷出測(cè)定位點(diǎn)的核苷酸。
4)液相雙脫氧核苷酸延伸法科恩等人(Cohen，D.et al.)(法國(guó)專(zhuān)利號(hào)2,650,840；PCT申請(qǐng)?zhí)朩O91/02087)討論了一種液相測(cè)定一個(gè)多態(tài)位點(diǎn)堿基的方法。該方法與前述的曼迪方法(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,656,127)非常類(lèi)似，不過(guò)不是使用對(duì)于核苷酸外切酶具抗性的核苷酸衍生物，而是帶標(biāo)記的雙脫氧核苷酸衍生物。
科恩方法有一個(gè)顯著的缺陷在于它是一個(gè)使用帶標(biāo)記三磷酸雙脫氧核苷酸的液相延伸反應(yīng)。通常目標(biāo)DNA模版要經(jīng)過(guò)一步擴(kuò)增反應(yīng)，例如PCR，而這一過(guò)程要使用高濃度的DNA聚合酶天然底物即三磷酸脫氧核苷酸。這些單體將會(huì)在接下來(lái)的延伸反應(yīng)中和三磷酸雙脫氧核苷酸進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)。因此，在PCR之后，需要一個(gè)額外的步驟來(lái)將目標(biāo)DNA模版與未結(jié)合的三磷酸脫氧核苷酸分開(kāi)，亦即清除掉多余的三磷酸脫氧核苷酸單體，而這一步在液相中很難實(shí)現(xiàn)，也因此該方法不適用于大容量測(cè)試。
5)固相雙脫氧核苷酸延伸法另一種可選擇的方法，被稱(chēng)為GBA法，是格列特等人(Goelet，P.et al.)所發(fā)明的(PCT申請(qǐng)?zhí)?2/15712)。在一個(gè)更可取的實(shí)施方案中，格列特等人的方法使用了帶標(biāo)記的終止物的混合體，以及一個(gè)與目標(biāo)DNA互補(bǔ)并且其3’端正好位于目標(biāo)多態(tài)位點(diǎn)的前一個(gè)核苷酸的引物。這樣能夠與引物結(jié)合的終止物就由被測(cè)定位點(diǎn)的核苷酸所決定，而且實(shí)際上是與其互補(bǔ)。與前述科恩方法(法國(guó)專(zhuān)利號(hào)2,650,840；PCT申請(qǐng)?zhí)朩O91/02087)相反，格列特等人的方法的更可取之處在于它是一種多相方法，其中引物或者目標(biāo)DNA是固定在一個(gè)固相上。因此該方法更容易操作，也比科恩方法更精確。
6)寡核苷酸鏈連接反應(yīng)法另一種固相測(cè)定SNP的方法使用了不同的酶學(xué)方法，稱(chēng)作“寡核苷酸鏈連接反應(yīng)法”(Oligonucleotide Ligation Assay，簡(jiǎn)稱(chēng)OLA方法)(Landegren，U.et al.，Science2411077-1080(1988))。OLA方法使用了與一個(gè)目標(biāo)DNA的單鏈上的兩個(gè)毗連序列可以雜交的兩個(gè)寡核苷酸鏈。其中一個(gè)寡核苷酸鏈經(jīng)過(guò)生物素處理，另一個(gè)則加有可檢測(cè)的標(biāo)記。如果在目標(biāo)DNA上有一個(gè)完全互補(bǔ)的序列，這兩個(gè)寡核苷酸鏈將與目標(biāo)DNA雜交，并且它們的末端將毗連從而形成一個(gè)連接反應(yīng)的底物。接下來(lái)的連接反應(yīng)就使得帶標(biāo)記的寡核苷酸鏈能被阿維丁(avidin)或者另一種生物素配體結(jié)合在另一個(gè)寡核苷酸鏈上，并從而被檢測(cè)到。尼科松等人(Nickerson，D.A.et al.)描述了一種結(jié)合PCR和OLA的檢測(cè)核苷酸的方法(Nickerson，D.A.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)878923-8927(1990))。在這個(gè)方法里，目標(biāo)DNA首先用PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增，然后再用OLA方法來(lái)檢測(cè)。這種分析要求對(duì)于目標(biāo)多態(tài)位點(diǎn)的每個(gè)dNTP都要用與其配套的一對(duì)寡核苷酸鏈來(lái)分開(kāi)檢查。OLA方法的主要缺點(diǎn)在于連接反應(yīng)不是一個(gè)具有高識(shí)別率的過(guò)程，因而非特異性的信號(hào)是一個(gè)大問(wèn)題。
目前所需要的是開(kāi)發(fā)一個(gè)更有選擇性的方式來(lái)分辨多態(tài)位點(diǎn)。我們這里報(bào)告的發(fā)明是為了滿(mǎn)足這方面的要求。
發(fā)明的描述本發(fā)明公開(kāi)了一種通過(guò)將核苷酸分子與三個(gè)寡核苷酸引物，在聚合酶的作用下進(jìn)行PCR反應(yīng)，最后通過(guò)檢測(cè)PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度的方法來(lái)測(cè)定所述DNA分子上單個(gè)預(yù)先選定位點(diǎn)SNP兩種不同核苷酸的方法，包括以下幾個(gè)步驟a)將一份或多份所述核苷酸分子與所述三個(gè)寡核苷酸引物在聚合酶的作用下進(jìn)行PCR反應(yīng)；此處所述核苷酸分子包含有所述單個(gè)預(yù)先選定位點(diǎn)，并且在所述預(yù)先選定位點(diǎn)的3’端有18或以上個(gè)核苷酸，同時(shí)所述第一個(gè)和第二個(gè)寡核苷酸引物長(zhǎng)度為20個(gè)左右，其3’端除頂端核苷酸外都與所述核苷酸分子在所述單個(gè)預(yù)先選定位點(diǎn)前的片斷互補(bǔ)，但第一個(gè)引物比第二個(gè)引物在長(zhǎng)度上短1個(gè)以上核苷酸，而且第一個(gè)引物的3’端頂端本身與要測(cè)定的SNP的第一種核苷酸互補(bǔ)，第二個(gè)引物的3’端頂端本身則與要測(cè)定的SNP的第二種核苷酸互補(bǔ)，同時(shí)所述第三個(gè)引物長(zhǎng)度為20個(gè)左右，與所述DNA在所述預(yù)先選定位點(diǎn)的下游部分互補(bǔ)，并且其3’端位于所述單個(gè)預(yù)先選定位點(diǎn)的下游；b)檢測(cè)所述PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度和數(shù)量以確定所述核苷酸分子中存在所述SNP中兩種核苷酸的哪幾種，及其相對(duì)比例。
本發(fā)明使用了兩種長(zhǎng)度不同，而分別針對(duì)SNP不同核苷酸的引物來(lái)進(jìn)行PCR反應(yīng)，并從PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度來(lái)測(cè)定SNP的核苷酸種類(lèi)。技術(shù)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單有效，檢測(cè)簡(jiǎn)便。
本發(fā)明的優(yōu)選方案是同時(shí)測(cè)定多個(gè)SNP位點(diǎn)。一方面每個(gè)SNP內(nèi)部的兩個(gè)PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度有異，同時(shí)不同SNP之間的PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度也互不相同，這樣可以大規(guī)模、高通量測(cè)定SNP。這里的技術(shù)關(guān)鍵有二一是在同一容器里能有效地進(jìn)行的PCR產(chǎn)物的個(gè)數(shù)有限，目前一般為13個(gè)左右，因此需要將所有反應(yīng)適當(dāng)分開(kāi)，而檢測(cè)PCR反應(yīng)長(zhǎng)度的時(shí)候又可以合并起來(lái)進(jìn)行；二是引物的設(shè)計(jì)，要求同樣做到大規(guī)模、高通量并準(zhǔn)確可靠，同時(shí)要配合上述第一項(xiàng)中的反應(yīng)分類(lèi)，這就要求有生物信息學(xué)的專(zhuān)長(zhǎng)。
由于只需測(cè)定PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度，所以反應(yīng)不需要使用標(biāo)記，而且只需走agrose膠或一般的測(cè)序膠或毛細(xì)管電泳即可；但也可以使用標(biāo)記以在不同的檢測(cè)條件下方便地得到數(shù)據(jù)，這些標(biāo)記可選自熒光標(biāo)記，放射性標(biāo)記，生物發(fā)光標(biāo)記，化學(xué)發(fā)光標(biāo)記，核苷酸標(biāo)記，半抗原標(biāo)記和酶標(biāo)記。
本發(fā)明也可以用來(lái)檢測(cè)從多個(gè)個(gè)體中取得的混合樣品，而且這些樣品可以是來(lái)自于基因組DNA(genomic DNA)，環(huán)形DNA，cDNA，EST，或?qū)ζ溥M(jìn)行擴(kuò)增的結(jié)果；或者是來(lái)自于對(duì)RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增的結(jié)果。更有意義的是，本發(fā)明可以通過(guò)PCR反應(yīng)的產(chǎn)量計(jì)算SNP兩種核苷酸的相對(duì)比例，這對(duì)于集合樣品(pooled sample)的SNP檢測(cè)意義重大。
本發(fā)明可以大規(guī)模操作，如用來(lái)同步測(cè)定多達(dá)數(shù)千個(gè)甚至數(shù)十萬(wàn)個(gè)位點(diǎn)的序列和SNP，并且可以實(shí)現(xiàn)高通量操作。
權(quán)利要求
1.本發(fā)明公開(kāi)了一種通過(guò)將核苷酸分子與三個(gè)寡核苷酸引物，在聚合酶的作用下進(jìn)行PCR反應(yīng)，最后通過(guò)檢測(cè)PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度的方法來(lái)測(cè)定所述DNA分子上單個(gè)預(yù)先選定位點(diǎn)SNP兩種不同核苷酸的方法，包括以下幾個(gè)步驟a)將一份或多份所述核苷酸分子與所述三個(gè)寡核苷酸引物在聚合酶的作用下進(jìn)行PCR反應(yīng)；此處所述核苷酸分子包含有所述單個(gè)預(yù)先選定位點(diǎn)，并且在所述預(yù)先選定位點(diǎn)的3’端有18或以上個(gè)核苷酸，同時(shí)所述第一個(gè)和第二個(gè)寡核苷酸引物長(zhǎng)度為20個(gè)左右，其3’端除頂端核苷酸外都與所述核苷酸分子在所述單個(gè)預(yù)先選定位點(diǎn)前的片斷互補(bǔ)，但第一個(gè)引物比第二個(gè)引物在長(zhǎng)度上短1個(gè)以上核苷酸，而且第一個(gè)引物的3’端頂端本身與要測(cè)定的SNP的第一種核苷酸互補(bǔ)，第二個(gè)引物的3’端頂端本身則與要測(cè)定的SNP的第二種核苷酸互補(bǔ)，同時(shí)所述第三個(gè)引物長(zhǎng)度為20個(gè)左右，與所述DNA在所述預(yù)先選定位點(diǎn)的下游部分互補(bǔ)，并且其3’端位于所述單個(gè)預(yù)先選定位點(diǎn)的下游；b)檢測(cè)所述PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度和數(shù)量以確定所述核苷酸分子中存在所述SNP中兩種核苷酸的哪幾種，及其相對(duì)比例。
2.權(quán)利要求1的方法，其中同時(shí)測(cè)定多個(gè)SNP，一方面每個(gè)SNP內(nèi)部的兩個(gè)PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度有異，同時(shí)不同SNP之間的PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度也互不相同，這樣可以大規(guī)模、高通量測(cè)定SNP。
3.權(quán)利要求1的方法，其中反應(yīng)不需要使用標(biāo)記，而且只需走agrose膠或一般的測(cè)序膠或毛細(xì)管電泳即可。
4.權(quán)利要求1的方法，其中反應(yīng)使用標(biāo)記并選自熒光標(biāo)記，放射性標(biāo)記，生物發(fā)光標(biāo)記，化學(xué)發(fā)光標(biāo)記，核苷酸標(biāo)記，半抗原標(biāo)記和酶標(biāo)記。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述DNA分子是來(lái)源于同一個(gè)體的不同染色體，或者是來(lái)源于不同個(gè)體的染色體。
6.權(quán)利要求1或4的方法，其中所述DNA分子是經(jīng)過(guò)了以另一個(gè)單鏈或雙鏈核酸模板進(jìn)行擴(kuò)增。
7.權(quán)利要求6的方法，其中用于擴(kuò)增的核酸模板選自基因組DNA(genomic DNA)、環(huán)形DNA、cDNA、EST。
8.權(quán)利要求6的方法，其中用于擴(kuò)增的核酸模板是RNA，使用的聚合酶是反轉(zhuǎn)錄酶。
9.權(quán)利要求6的方法，其中用于擴(kuò)增的DNA或RNA模板來(lái)自一個(gè)或多個(gè)個(gè)體。
全文摘要
本發(fā)明涉及測(cè)定脫氧核糖核酸(DNA)序列中單個(gè)堿基的序列，特別是應(yīng)用于檢測(cè)與分析多態(tài)性(SNP)。本發(fā)明公開(kāi)了一種通過(guò)將核苷酸分子與三個(gè)寡核苷酸引物，在聚合酶的作用下進(jìn)行PCR反應(yīng)，最后通過(guò)檢測(cè)PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度的方法來(lái)測(cè)定所述DNA分子上單個(gè)預(yù)先選定位點(diǎn)SNP兩種不同核苷酸的方法。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1451762SQ0211685
公開(kāi)日2003年10月29日 申請(qǐng)日期2002年4月12日 優(yōu)先權(quán)日2002年4月12日
發(fā)明者劉湘軍 申請(qǐng)人:劉湘軍