專利名稱：一種蠟狀芽孢桿菌及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及蘇云金桿菌(Bacillus thuringiensis，Bt)類生物農(nóng)藥的增效劑的篩選，特別是涉及一種能對Bt增效的蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus，Bc)，還涉及該菌的制備方法。
背景技術：
蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis，Bt)制劑是當前應用最廣，最有效的微生物殺蟲劑。屬于革蘭氏陽性菌，其毒效主要來源于芽孢形成期間產(chǎn)生的伴孢晶體，1938年在法國首次成為商品。自商品化以來，Bt產(chǎn)品就以其高效安全、對目標害蟲的特異性而備受青睞，并逐漸成為研究最深入、應用最廣泛的生物殺蟲劑。盡管Bt有諸多優(yōu)點，但它在田間應用時也存在殺蟲效果不理想、對某些目標害蟲不敏感等問題。解決這一問題的主要途徑之一是大力發(fā)展各種增效劑和增效因子，提高現(xiàn)有高毒菌株的殺蟲活性。如張循浩等(1996)用Bt與棉鈴蟲NPV加適量助劑復配，明顯提高了Bt的殺蟲效果；溫志強等(1999)在Bt制劑中添加無機鹽，也能提高其對小菜鵝的殺蟲效果；林開春等(1998)通過調查篩選得到了三株對Bt制劑有明顯增效作用的細菌菌株34-16、30-3和C16。所有這些增效因子，都能在一定程度上提高Bt制劑的對目標害蟲的防治效果，但卻不能顯著提高其殺蟲活性。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供了一種蠟狀芽孢桿菌，采用該菌使該生物殺蟲劑的殺蟲活性得到顯著提高。
本發(fā)明的另一個目的在于提供一種制備蠟狀芽孢桿菌的方法。
為達到以上目的，本發(fā)明采用如下技術措施菌種名稱蠟狀芽孢桿菌Bacillus cereus，Bc，Ym-2102，保藏單位中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號CCTCC No.M202011。其步驟是1、將采集的土樣少許放入裝有4.5ml的營養(yǎng)培養(yǎng)液試管中，經(jīng)75～78℃，水浴14～20分鐘后，28～30℃振蕩培養(yǎng)48～52小時；2、將營養(yǎng)培養(yǎng)液稀釋至10-8～10-9倍，涂布到LB培養(yǎng)基上，28～30℃恒溫箱中倒置培養(yǎng)3天，鏡檢挑選產(chǎn)生芽孢但無伴孢晶體的單菌落；3、將單菌落在LB培養(yǎng)基上純化，接種于發(fā)酵培養(yǎng)基進行搖瓶發(fā)酵，至芽孢脫落，從發(fā)酵8～10小時開始到芽孢完全脫落的不同階段間隔兩小時分別取樣；4、將不同階段的發(fā)酵液與搖瓶發(fā)酵至芽孢脫落15～20％的蘇云金芽孢桿菌DL5789(已保藏，保藏單位中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號CCTCC No.M202003.)發(fā)酵液按不同比例混合，進行生物測定；5、菌株形態(tài)學觀察細胞桿狀，兩端園。菌體長鏈狀，八字形排列，生長過程中產(chǎn)生芽孢；菌落灰白，不透明，干燥，園，邊緣不整齊；6、理化特性革蘭氏染色陽性；美藍染色陽性；不能水解淀粉；能利用葡萄糖發(fā)酵；能在含7％NaCl培養(yǎng)基上生長；能利用甘露糖；吲哚試驗陰性；VP試驗陽性，VP培養(yǎng)物PH＜6；能厭氧生長，有硝酸鹽還原活性；7、增效活性通過上述途徑得到對Bt菌株DL5789增效的一株蠟狀芽孢桿菌Ym-2102。以DL5789發(fā)酵液單獨進行生物測定，以甜菜夜蛾初孵幼蟲為供試蟲，LC50為1.047ml/g飼料；將DL5789與Ym-2102分別進行發(fā)酵后，將發(fā)酵液按體積比以4∶1的比例混合后對甜菜夜蛾進行生物測定，其LC50為0.58ml/g飼料；增效效果為80.52％。
本發(fā)明與其他增效方法相比，具有如下優(yōu)點1方法簡便易操作；2增效效果明顯，能顯著提高蘇云金桿菌殺蟲劑的殺蟲活性；3成本低廉，對殺蟲劑的生產(chǎn)成本增加不大，適用于工業(yè)生產(chǎn)。
具體實施例方式
實施例1菌種分離培養(yǎng)將采集的土樣少許放入裝有有4.5ml的營養(yǎng)培養(yǎng)液試管中，營養(yǎng)培養(yǎng)液為蛋白胨1％牛肉膏0.3％NaCl 0.5％PH7.5，經(jīng)76℃，水浴15分鐘后，30℃振蕩培養(yǎng)51小時。將培養(yǎng)培養(yǎng)液稀釋至10-8倍，涂布到分離培養(yǎng)基上，分離培養(yǎng)基為蛋白胨1％牛肉膏0.3％NaCl 0.5％瓊脂2％PH7.5，30℃恒溫箱中倒置培養(yǎng)3天，鏡檢挑選產(chǎn)生芽孢但無伴孢晶體的單菌落，得到一株蠟狀芽孢桿菌菌株Ym-2102。將其單菌落在LB培養(yǎng)基上純化，LB培養(yǎng)基為NaCl 1％，蛋白胨1％，酵母粉0.5％，瓊脂1.5％，PH7.0，然后接種于發(fā)酵培養(yǎng)基進行搖瓶發(fā)酵，發(fā)酵培養(yǎng)基為淀粉2％，豆粉4％，酵母粉0.5％，蛋白胨0.5％，KH2PO40.1％，K2HPO40.2％，PH8.5，從分離培養(yǎng)基上刮取一環(huán)菌，加入裝有5ml蒸餾水的試管中搖勻，76℃水浴15分鐘，取出冷卻至常溫；取上述同步化的菌懸液1ml接種于500ml大三角瓶中，其中裝培養(yǎng)基40ml。LB培養(yǎng)基斜面保藏的蘇云金桿菌菌株DL5789按同樣方法操作處理，30℃，200rpm發(fā)酵培養(yǎng)。從發(fā)酵10小時開始到芽孢完全脫落的不同階段間隔兩小時分別取樣觀察，至48小時芽孢脫落停止培養(yǎng)。
生物測定將不同階段的發(fā)酵液與搖瓶發(fā)酵至芽孢脫落15～20％的蘇云金芽孢桿菌DL5789發(fā)酵液按不同比例混合，以甜菜夜蛾初孵幼蟲為供試進行生物測定。芽孢脫落10％的Ym-2102發(fā)酵液與芽孢脫落15％的蘇云金芽孢桿菌DL5789按體積比1∶4混合后對甜菜夜蛾進行生物測定，其LC50為0.58ml/g飼料；而作為對照的DL5789發(fā)酵液單獨進行生物測定，LC50為1.047ml/g飼料，增效效果為80.52％。
實施例2菌種分離培養(yǎng)將采集的土樣少許放入裝有有4.5ml的營養(yǎng)培養(yǎng)液試管中，經(jīng)78℃，水浴12分鐘，振蕩培養(yǎng)48小時。將培養(yǎng)培養(yǎng)液稀釋至10-9倍，涂布到分離培養(yǎng)基上，29℃恒溫箱中倒置培養(yǎng)3天，鏡檢挑選產(chǎn)生芽孢但無伴孢晶體的單菌落，得到一株蠟狀芽孢桿菌菌株Ym-2102。將其單菌落在LB培養(yǎng)基上純化，接種于發(fā)酵培養(yǎng)基進行搖瓶發(fā)酵從分離培養(yǎng)基上刮取一環(huán)菌，加入裝有5ml蒸餾水的試管中搖勻，76℃水浴12分鐘，取出冷卻至常溫；取上述同步化的菌懸液1ml接種于500ml大三角瓶中，其中裝培養(yǎng)基40ml。LB培養(yǎng)基斜面保藏的蘇云金桿菌菌株DL5789按同樣方法操作處理，30℃，200rpm搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，從發(fā)酵9小時開始到芽孢完全脫落的不同階段間隔兩小時分別取樣觀察，至50小時芽孢脫落停止培養(yǎng)。
生物測定將不同階段的發(fā)酵液與搖瓶發(fā)酵至芽孢脫落20％的蘇云金芽孢桿菌DL5789發(fā)酵液按不同比例混合，以甜菜夜蛾初孵幼蟲為供試進行生物測定。芽孢脫落15％的Ym-2102發(fā)酵液與芽孢脫落20％的蘇云金芽孢桿菌DL5789按體積比1∶4混合后對甜菜夜蛾進行生物測定，其LC50為0.58ml/g飼料；而作為對照的DL5789發(fā)酵液單獨進行生物測定，LC50為1.047ml/g飼料，增效效果為80.52％。營養(yǎng)培養(yǎng)液、分離培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基配方比例與實施例1相同。
權利要求
1.一種蠟狀芽孢桿菌，其特征在于蠟狀芽孢桿菌Bacillus cereus，BcYm-2102，CCTCC No.M202011。
2.一種實現(xiàn)權利要求1所述的一種蠟狀芽孢桿菌桿菌的制備方法，包括下列步驟A、將土樣放入營養(yǎng)培養(yǎng)液試管中，經(jīng)75～78℃，水浴14～20分鐘，28～30℃振蕩培養(yǎng)48～52小時；B、將營養(yǎng)培養(yǎng)液稀釋至10-8～10-9倍，涂布到LB培養(yǎng)基上，28～30℃恒溫箱中倒置培養(yǎng)3天，鏡檢單菌落；C、將單菌落在LB培養(yǎng)基上純化，接種于發(fā)酵培養(yǎng)基進行搖瓶發(fā)酵，至芽孢脫落。
3.根據(jù)權利要求2所述的一種蠟狀芽孢桿菌的制備方法，其特征是營養(yǎng)培養(yǎng)液蛋白胨1％牛肉膏0.3％NaCl 0.5％PH7.5分離培養(yǎng)基蛋白胨1％牛肉膏0.3％NaCl 0.5％瓊脂2％PH7.5LB培養(yǎng)基NaCl 1％，蛋白胨1％，酵母粉0.5％，瓊脂1.5％，PH7.0發(fā)酵培養(yǎng)基淀粉2％，豆粉4％，酵母粉0.5％，蛋白胨0.5％，KH2PO40.1％，K2HPO40.2％，PH8.5。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種蠟狀芽孢桿菌及制備方法,蠟狀芽孢桿菌Bacillus cereus,Bc,YM－2102,CCTCCNO:M202011。首先是將土樣放入營養(yǎng)培養(yǎng)液試管中,經(jīng)75～78℃,水浴,振蕩培養(yǎng)一定時間;其次是將營養(yǎng)培養(yǎng)液稀釋,涂布到LB培養(yǎng)基上,恒溫箱中倒置培養(yǎng)一定時間,鏡檢單菌落;再次是將單菌落在LB培養(yǎng)基上純化,接種于發(fā)酵培養(yǎng)基進行搖瓶發(fā)酵,至芽孢脫落。本發(fā)明方法簡便,易操作,成本低,能顯著提高蘇云金桿菌殺蟲劑的殺蟲活性,適用于工業(yè)生產(chǎn)。
文檔編號C12N1/20GK1374399SQ0211570
公開日2002年10月16日 申請日期2002年4月11日 優(yōu)先權日2002年4月11日
發(fā)明者袁志明, 劉銘, 蔡全信, 劉海舟, 閻建平 申請人:中國科學院武漢病毒研究所