專利名稱：一種檢測(cè)多種肝炎的檢測(cè)型基因芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明所涉及的技術(shù)領(lǐng)域是一種肝炎基因芯片，特別是一種檢測(cè)肝炎突變的基因芯片。
生物芯片在生物檢測(cè)、醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)、藥物篩選和基因序列分析上有著極其重要的意義。例如在生物學(xué)中，隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，特別是舉世矚目的人類基因組計(jì)劃實(shí)施以酸、蛋白質(zhì)序列和結(jié)構(gòu)的數(shù)據(jù)呈指數(shù)增長(zhǎng)。而下世紀(jì)最富挑戰(zhàn)性的工作就是人劃完成后，即在后基因時(shí)代，我們?nèi)绾芜\(yùn)用大量的生物分子信息服務(wù)于人類社會(huì)，并使醫(yī)學(xué)、治療產(chǎn)生根本革命。在醫(yī)學(xué)中，“系統(tǒng)、器官、組織、細(xì)胞層次上的第二階段醫(yī)學(xué)”正在向“基因水平上的，DNA-RNA-蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)與核酸相互作用，以及它們與環(huán)境相互作用水平上的第三階段醫(yī)學(xué)”轉(zhuǎn)化。這種在分子層次上進(jìn)行的基因診斷與基因臺(tái)療，將根本地認(rèn)識(shí)疾病產(chǎn)生的根源，并將有希望根本認(rèn)識(shí)和治療包括癌癥在內(nèi)的重大疾病。這些生物學(xué)、醫(yī)學(xué)的根本變革，一個(gè)根本的前提是基因序列的測(cè)定和分析。能否有效快速地進(jìn)行基因測(cè)序與分析，將影響到人類基因組計(jì)劃的實(shí)施，從而影響生物學(xué)、醫(yī)學(xué)的進(jìn)一步發(fā)展。傳統(tǒng)基因測(cè)序所采用的方法包括化學(xué)反應(yīng)、凝膠電泳法、圖像處理等一系列繁雜的步驟，這些方法花費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng)，且操作繁復(fù)，尤其在大規(guī)模測(cè)序方面費(fèi)時(shí)，并且不適宜便攜化快速測(cè)序。在對(duì)傳統(tǒng)基因測(cè)序方法進(jìn)行改進(jìn)的過(guò)程中，以基因芯片為代表的生物芯片技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。生物芯片技術(shù)是將生命科學(xué)研究中所涉及的許多不連續(xù)的分析過(guò)程，如樣品制備，化學(xué)反應(yīng)和分析檢測(cè)等通過(guò)采用微電子，微機(jī)械等工藝集成到芯片中，使之連續(xù)化，集成化，微型化和自動(dòng)化。這一技術(shù)的成熟和應(yīng)用將在下世紀(jì)的疾病診斷和治療、新藥開(kāi)發(fā)、司法鑒定、食品和環(huán)境監(jiān)測(cè)等生命科學(xué)相關(guān)領(lǐng)域帶來(lái)一場(chǎng)革命，為生物信息的獲取及分析提供雖有力的手段。
生物芯片(基因芯片)近年來(lái)一直是國(guó)際上的一個(gè)研究熱點(diǎn)，并正以驚人的速度向前發(fā)展。國(guó)際上已經(jīng)有多家公司進(jìn)入生物芯片領(lǐng)域，研究出把PCR與DNA陣列集成的生物芯片。這些系統(tǒng)通常在芯片上制備出一個(gè)PCR微反應(yīng)池，通過(guò)控制微反應(yīng)的溫度循環(huán)，進(jìn)行基因擴(kuò)增，接著將擴(kuò)增后的基因引入雜交池中，與固相微陣列探針雜交，進(jìn)行檢測(cè)。Affymetrix公司則把PCR微反應(yīng)池進(jìn)一步制成微流體通道。盡管已有將PCR技術(shù)芯片檢測(cè)合為一體的報(bào)導(dǎo)，但其特點(diǎn)是整個(gè)PCR過(guò)程在一個(gè)微反應(yīng)池中進(jìn)行。因而需對(duì)器件的同一部位反復(fù)地升溫、降溫，這將無(wú)法對(duì)PCR結(jié)合進(jìn)行動(dòng)態(tài)跟蹤和定量分析。而且目前升溫、降溫需一定時(shí)間，延長(zhǎng)了工作時(shí)間。
基因芯片(DNA Chip)是生物技術(shù)與微電子芯片融合的結(jié)晶，是由固定于固相載體(如硅片、玻璃、塑料等)表面的核苷酸陣列構(gòu)成的一種新型微型器件。它集成了基因探針，通過(guò)與被檢測(cè)基因的堿基序列進(jìn)行互補(bǔ)匹配，實(shí)現(xiàn)核酸序列的分子識(shí)別。由于其快速、微量、準(zhǔn)確的應(yīng)用優(yōu)點(diǎn)，正在成為新一代的自動(dòng)化醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)工具。肝炎病毒的高突變率導(dǎo)致藥物療效不高，并且使病情加重。通過(guò)設(shè)計(jì)針對(duì)突變基因的探針，與被檢測(cè)基因的堿基序列進(jìn)行互補(bǔ)匹配，可快速、微量、準(zhǔn)確地檢測(cè)到突變基因，指導(dǎo)臨床診斷和治療。美國(guó)affymetrix公司于二十世紀(jì)八十年代術(shù)至90年代初，率先開(kāi)展了這方面的研究。1992年，該公司運(yùn)用半導(dǎo)體照相平板技術(shù)，在1cm2左右的玻片上原位合成寡聚核苷酸片段，誕生了世界上第一塊基因芯片.同時(shí)，探針的熒光標(biāo)記，激光共聚焦掃描和計(jì)算機(jī)分析等技術(shù)也隨之發(fā)展。1995年，第一塊以玻璃為載體的基因芯片(微矩陣)在美國(guó)Stanford大學(xué)誕生，這標(biāo)志著基因芯片技術(shù)步入了廣泛研究和應(yīng)用的時(shí)期。東南大學(xué)吳健雄實(shí)驗(yàn)室成功地開(kāi)發(fā)了分子印章原位合成高密度基因芯片技術(shù)，標(biāo)志著國(guó)內(nèi)高密度基因芯片研究和應(yīng)用的開(kāi)端。
病毒性肝炎是我國(guó)感染率和發(fā)病率最高的傳染病。據(jù)估計(jì)，乙型肝炎病毒攜帶者有1.2億，其中有癥狀者約占1/10，約1/4患者轉(zhuǎn)為慢性，3％患者轉(zhuǎn)變?yōu)楦窝缀蟾斡不?。原發(fā)性肝癌中90％以上由病毒性肝炎所引起。本病至今尚缺乏特效治療方法，因此早期診斷和病情監(jiān)測(cè)就尤為重要。
傳統(tǒng)檢測(cè)乙型肝炎通過(guò)兩對(duì)半檢測(cè)，檢測(cè)五項(xiàng)指標(biāo)后判定是否有乙型肝炎感染，檢測(cè)肝功能五項(xiàng)指標(biāo)判定肝損傷程度。乙型肝炎治療相關(guān)基因位點(diǎn)突變無(wú)法檢測(cè)，從而影響了具體用藥；在另一方面，對(duì)于乙型肝炎流行病調(diào)查及其流行病學(xué)研究缺乏足夠的證據(jù)，如果采用測(cè)序方法對(duì)多位點(diǎn)突變進(jìn)行乙型肝炎流行病調(diào)查，不僅費(fèi)用高，而且在國(guó)內(nèi)無(wú)法進(jìn)行推廣。
PCR技術(shù)主要是作為一種選擇性體外基因擴(kuò)增方法，由于在經(jīng)25～35輪循環(huán)后就可使DNA擴(kuò)增106倍，多年來(lái)在科研和醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中得到廣泛的應(yīng)用。但由于PCR存在假陽(yáng)性等缺陷，自98年6月起已被國(guó)家衛(wèi)生部禁止用于臨床診斷。其主要原因有其一是，PCR過(guò)程中諸多實(shí)驗(yàn)條件(引物的設(shè)計(jì)與選擇，材料配比，反應(yīng)時(shí)間，溫度，循環(huán)周期)等造成的不穩(wěn)定因素導(dǎo)致產(chǎn)生PCR的錯(cuò)誤擴(kuò)增；其二是，PCR過(guò)程的后續(xù)電泳檢測(cè)方法可判斷是不是得到特定長(zhǎng)度的片段，而無(wú)法確定其具體序列；其三，PCR反應(yīng)產(chǎn)物形成氣溶膠中所含有的DNA在擴(kuò)增后極易在電泳凝膠形成假陽(yáng)性條帶，從而導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果的不可靠性。
感染性病原體診斷芯片就是將待測(cè)病原體的特征基因片段(靶基因)固定于玻片上制成芯片，將從病人血清中抽提出病原體的DNA或RNA經(jīng)擴(kuò)增標(biāo)記螢光后與芯片進(jìn)行雜交，雜交信號(hào)由掃描儀掃描，再經(jīng)計(jì)算機(jī)分析，判斷陰陽(yáng)性。診斷芯片區(qū)別于其他檢測(cè)手段的優(yōu)越性在于(1)檢測(cè)樣品為各類致病基因片段，提高了檢測(cè)效率；(2)因無(wú)需機(jī)體免疫反應(yīng)，能及早診斷，且待測(cè)樣品用量較少；(3)診斷芯片技術(shù)是DNA雜交技術(shù)和熒光標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合的分子診斷方法，有極高的靈敏度、特異性和可靠性；(4)自動(dòng)化程度高，利于大規(guī)模推廣應(yīng)用。
在疾病診斷方面，已有一些單一疾病基因診斷芯片產(chǎn)品上市，例如美國(guó)的Affymetrix公司已利用基因芯片進(jìn)行愛(ài)滋病(HIV)的研究工作，并有商業(yè)化的GeneChipHIVPRT診斷芯片上市，用于愛(ài)滋病的早期診斷。但芯片技術(shù)在疾病診斷上的應(yīng)用尚處于起步階段，還未大面積推廣，原因主要有(1)基因芯片技術(shù)是一項(xiàng)全新的技術(shù)，對(duì)人才、技術(shù)、資金的要求很高，目前只有一小部分的科研機(jī)構(gòu)和高科技公司完全掌握了該項(xiàng)技術(shù)。
(2)現(xiàn)有芯片通常只能診斷一種疾病，芯片檢測(cè)成本較貴，目前很難取代常規(guī)檢測(cè)方法。
(3)芯片技術(shù)，特別是在多疾病檢測(cè)的質(zhì)量保證和檢測(cè)監(jiān)控方面有待于發(fā)展和創(chuàng)新。多疾病診斷芯片是一種多基因的反應(yīng)系統(tǒng)，因此對(duì)傳統(tǒng)的PCR擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)在檢出率方面提出了更高的要求；由于多疾病診斷芯片反應(yīng)系統(tǒng)的復(fù)雜化，對(duì)反應(yīng)結(jié)果的檢測(cè)監(jiān)控也提出了新的技術(shù)要求。
在威脅人類健康的各種疾病中，感染性疾病一直占有重要位置。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)99年報(bào)告，98年全球共計(jì)5390萬(wàn)人死亡，其中死于感染性疾病計(jì)130055′人，占總?cè)藬?shù)的25％，相當(dāng)于平均每小時(shí)就有1500人死于該類疾病，僅次于死于心血管疾病的31％，遠(yuǎn)高于死于癌癥的13％。這1300萬(wàn)人中有50％發(fā)生在發(fā)展中國(guó)家。各種肝炎一直是威脅人類生命健康的常見(jiàn)病、多發(fā)病。
現(xiàn)知?dú)W美國(guó)家多數(shù)HCV-I型感染，而亞洲國(guó)家以II型為主，III型次之。Okomoto報(bào)告日本慢性丙型肝炎患者和健康獻(xiàn)血員主要為II型感染，分別占59.3％和82.4％，而血友病人約50％為I型感染，原因是應(yīng)用輸入美國(guó)進(jìn)口凝因子VIII。Wang氏報(bào)告我國(guó)北京慢性丙型肝炎患者86.2％為II型感染，III型感染為13.8％。而新疆病人III型感染卻占50％，說(shuō)明不同型HCV具有一定的地區(qū)和人群分布特征。此外不同基因型感染引起臨床過(guò)程和干擾素治療反應(yīng)亦表現(xiàn)不同，如III型感染臨床癥狀較重，有引起嚴(yán)懲肝病傾向II型(Simmonds 1b)感染對(duì)干擾素治療不敏感效果差。III型感染(Simononds 2a)用干擾素治療效果好。
在鑒定肝損傷后又檢測(cè)不到乙型肝炎后，醫(yī)學(xué)診斷要求對(duì)其它肝炎病毒進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)于多種肝炎病毒檢測(cè)方法是不同的，一般使用的是酶聯(lián)免疫反應(yīng)檢測(cè)病毒特異性蛋白的抗體，依賴病毒基因翻譯的病毒特異性蛋白滯后于病毒的體內(nèi)感染與復(fù)制，不能反映真實(shí)的病毒生存狀態(tài)，另一方面，在病毒停止復(fù)制或體內(nèi)的清除過(guò)程中，這些病毒特異性蛋白往往還要生存一段時(shí)間，這種診斷結(jié)果的滯后性給臨床治療帶來(lái)不利影響。由此給診斷提出了新的課題，我們針對(duì)酶聯(lián)免疫反應(yīng)檢測(cè)及PCR檢測(cè)的缺點(diǎn)及不足提出了使用基因芯片檢測(cè)多種肝炎病毒及其突變，使之能夠直接檢測(cè)到肝炎病毒的種類和突變類型，以指導(dǎo)臨床治療。
在血站的血液檢測(cè)，肝炎病毒是血液檢測(cè)的常規(guī)項(xiàng)目，但現(xiàn)有的檢測(cè)手段無(wú)法在同一時(shí)間內(nèi)通過(guò)一次實(shí)驗(yàn)確診上述四種疾病，檢測(cè)成本高而效率比較低。為此，開(kāi)發(fā)研究一種用于多種感染性疾病診斷的基因芯片，對(duì)多種感染性疾病的進(jìn)行準(zhǔn)確、高效的早期診斷已成為當(dāng)務(wù)之急。
隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，近年來(lái)人們發(fā)現(xiàn)許多HBV感染的病人體內(nèi)存在著不同的HBV基因株(即多樣性或異質(zhì)性)，并證明它們?cè)趥鞑ヅc臨床肝炎的發(fā)病有著密切的關(guān)系。不同株的病毒復(fù)制水平，免疫原性和傳播性等均不同，因此對(duì)疾病的發(fā)展和轉(zhuǎn)歸的影響也不同。因此對(duì)于本發(fā)明的肝炎基因芯片在臨床檢驗(yàn)和治療上均具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。
在肝炎病毒檢測(cè)、診斷、傳染病流行性監(jiān)測(cè)，病毒性肝炎的發(fā)病原因快速檢測(cè)，查明感染病毒，肝炎基因突變檢測(cè)與鑒定中的運(yùn)用。
本發(fā)明的基因芯片檢測(cè)是分為三個(gè)檢測(cè)層次a.檢測(cè)病毒有無(wú)；b.對(duì)病毒進(jìn)行分亞型；c.檢測(cè)有意義的突變(如抗藥性、免疫逃逸、癌變性等)。
本發(fā)明的另一目的是由于基因突變檢測(cè)與乙型肝炎傳播途徑有密切相關(guān)性，此類相關(guān)各種基因突變亞種、亞型的檢測(cè)與鑒定。
本基因芯片的設(shè)計(jì)原理及其相關(guān)技術(shù)如

圖1。
下表列舉的是乙型肝炎具有臨床意義的突變位點(diǎn)，在下表的基礎(chǔ)上我們根據(jù)GENEBANK(http//www.ncbi.nlm.nih.gov)上所列舉的192條乙型肝炎全基因進(jìn)行分類，共有6個(gè)基因型，在此基礎(chǔ)上選取了部分長(zhǎng)度在15～35個(gè)堿基的核苷酸序列作為探針(見(jiàn)圖2)，合成后固定的玻片的制成肝炎基因芯片中檢測(cè)乙型肝炎的探針。
丙型肝炎分類標(biāo)準(zhǔn)尚未統(tǒng)一，Simmonds將丙型肝炎分為1a、1b、2a、2b、3a、3b、4a、5a、6a型，Okomoto將丙型肝炎分為I、II、III、IV、V等型。我們根據(jù)上述分型將GENEBANK(http//www.ncbi.nlm.nih.gov)對(duì)丙型肝炎全基因進(jìn)行分類，分別設(shè)計(jì)探針，在此基礎(chǔ)上選取了部分長(zhǎng)度在15～35個(gè)堿基的核苷酸序列作為探針，能夠分別代表Okomoto的I、II、III、IV、V其中一型的共有序列，合成后固定的玻片的制成肝炎基因芯片中檢測(cè)丙型肝炎的探針。
同樣對(duì)丁型肝炎、戊型肝炎、庚型肝炎、TTV分別尋找其共有序列，分別設(shè)計(jì)探針，合成后固定的玻片的制成肝炎基因芯片中檢測(cè)丙型肝炎的探針。
一般來(lái)說(shuō)，每個(gè)病毒靶基因選擇有2-4個(gè)核酸保守區(qū)序列，每個(gè)突變區(qū)、基因型及亞型決定區(qū)根據(jù)診斷和鑒定需要選擇適當(dāng)數(shù)量的探針，其中每個(gè)突變區(qū)至少要有兩個(gè)探針，即一個(gè)是野生型，一個(gè)是突變型；所有合成的探針用點(diǎn)樣緩沖液溶解后使用點(diǎn)樣儀將納升級(jí)的溶液點(diǎn)到固相基片的，在一定的條件下，寡核酸探針5′端有基團(tuán)能與固相基片上的化學(xué)官能團(tuán)形成共價(jià)鍵連接。
一種檢測(cè)多種肝炎的檢測(cè)型基因芯片，包括(1)多種檢測(cè)寡核酸探針和質(zhì)量控制寡核酸探針，(2)寡核酸探針通過(guò)手臂分子以共價(jià)鍵連接在固相基片上形成的探針陣列。
所謂的寡核酸探針是指能與目的基因雜交的多聚核苷酸，長(zhǎng)度在幾個(gè)堿基到幾十個(gè)堿基；所謂的檢測(cè)寡核酸探針是指化學(xué)合成的多種肝炎的保守區(qū)、與疾病相關(guān)的突變區(qū)、基因型及亞型的互補(bǔ)的寡聚核苷酸，突變區(qū)的探針包括野生型和突變型探針，基因型及亞型決定區(qū)的探針包括多種基因型和多種亞型探針；所謂的手臂分子是指具有雙活性基團(tuán)的長(zhǎng)鏈有機(jī)化合物；所謂的質(zhì)量控制探針至少包括二種探針，即陽(yáng)性對(duì)照，陰性對(duì)照；陰性對(duì)照用于檢測(cè)雜交信號(hào)錯(cuò)誤或污染，陽(yáng)性對(duì)照用于檢測(cè)是否正常雜交；所謂的寡核酸探針固定為寡聚核苷酸的末端有一特定基團(tuán)，固定在固體基質(zhì)表面時(shí)，與表面修飾的手臂分子的末端基團(tuán)形成共價(jià)鍵。
一種檢測(cè)多種肝炎的檢測(cè)型基因芯片，在設(shè)計(jì)時(shí)對(duì)每個(gè)病毒靶基因選擇有2-4個(gè)核酸保守區(qū)序列，每個(gè)突變區(qū)、基因型及亞型決定區(qū)根據(jù)診斷和鑒定需要選擇適當(dāng)數(shù)量的探針，其中每個(gè)突變區(qū)至少要有兩個(gè)探針，即一個(gè)是野生型，一個(gè)是突變型。
一種檢測(cè)多種肝炎的檢測(cè)型基因芯片，使用的固相基片包括多種方法處理的玻片、硅片、陶瓷片、塑料片、硝酸纖維膜、尼龍膜等。固相基片以雙活性基團(tuán)的長(zhǎng)鏈有機(jī)化合物進(jìn)行表面修飾，常用的雙活性基團(tuán)的長(zhǎng)鏈有機(jī)化合物試劑有N，N-二乙氧基氨基丙基三乙氧基硅烷、三羥甲基氨基硅烷(APTES)、戊二醛、多聚賴氨酸，可采用它們中的一種或者它們的二種組合。
一種檢測(cè)多種肝炎的檢測(cè)型基因芯片，配備有多組針對(duì)芯片所需診斷、檢測(cè)、流行病調(diào)查的感染性疾病病毒靶基因的高特異性的擴(kuò)增引物，其設(shè)計(jì)原則為每一個(gè)引物必須在人肝炎病毒靶基因的高特異性部位，而每對(duì)引物擴(kuò)增產(chǎn)物常常包含一個(gè)或多個(gè)突變部位。同時(shí)，每一特異性引物能夠擴(kuò)增GENEBANK中所有同種病毒的基因片斷。
一種檢測(cè)多種肝炎的檢測(cè)型基因芯片，其使用的引物標(biāo)記生物素、地高辛、熒光素，或在基因擴(kuò)增時(shí)加入生物素、地高辛、熒光素標(biāo)記的dUTP；雜交后檢測(cè)方法分別是使用納米金標(biāo)記的地高辛抗體與地高辛充分結(jié)合、使用納米金標(biāo)記親合素(streptavidin or avidin)與生物素充分結(jié)合、基因芯片掃描儀進(jìn)行掃描；對(duì)于納米金標(biāo)記的地高辛抗體和納米金標(biāo)記親合素(streptavidin or avidin)可直接觀察或用普通掃描儀進(jìn)行掃描。
一種檢測(cè)多種肝炎的檢測(cè)型基因芯片，在肝炎病毒檢測(cè)、診斷、傳染病流行性監(jiān)測(cè)，病毒性肝炎的發(fā)病原因快速檢測(cè)，查明感染病毒，肝炎基因突變檢測(cè)與鑒定中的運(yùn)用。可用于一種或多種肝炎病毒的檢測(cè)，包括甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、戊型肝炎、庚型肝炎、TTV及其它們的組合?？捎糜诜N或多種肝炎病毒突變的檢測(cè)，包括甲型肝炎HAV、乙型肝炎HBV、丙型肝炎HCV、丁型肝炎HDV、戊型肝炎HEV、庚型肝炎HGV、TTV及其它們的組合。
按照此法設(shè)計(jì)制作的基因芯片，可用于一種或幾種感染性病毒的診斷、檢測(cè)、流行病調(diào)查，可用于快速檢測(cè)病毒性肝炎的發(fā)病原因，查明感染病毒及與疾病相關(guān)的基因突變，以便臨床醫(yī)生能夠及時(shí)得到治療、監(jiān)測(cè)病情的目的。在另一方面，由于此類芯片可用檢測(cè)基因突變，因此，對(duì)臨床治療有直接的指導(dǎo)作用。
一種檢測(cè)多種肝炎的檢測(cè)型基因芯片，配備有多組針對(duì)芯片所需診斷、檢測(cè)、流行病調(diào)查的感染性疾病病毒靶基因的高特異性的擴(kuò)增引物，其設(shè)計(jì)原則為每一個(gè)引物必須在人肝炎病毒靶基因的高特異性部位，而每對(duì)引物擴(kuò)增產(chǎn)物常常包含一個(gè)或多個(gè)突變部位；每一特異性引物必定能夠擴(kuò)增GENEBANK中所有同種病毒的基因片斷。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)(1)檢測(cè)樣品為各類致病基因片段，提高了檢測(cè)效率；(2)因無(wú)需機(jī)體免疫反應(yīng)，能及早診斷，且待測(cè)樣品用量較少；(3)診斷芯片技術(shù)是DNA雜交技術(shù)和熒光標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合的分子診斷方法，有極高的靈敏度、特異性和可靠性；(4)自動(dòng)化程度高，利于大規(guī)模推廣應(yīng)用。
(5)肝炎是多種原因發(fā)病，僅致病病毒就有八種之多，要確定患者的致病原因，常規(guī)方法要使用多種檢測(cè)手段，而基因芯片方法不僅簡(jiǎn)單方便，而且所需儀器設(shè)備數(shù)量少。
(6)一種檢測(cè)多種肝炎的檢測(cè)型基因芯片，可用于一種或幾種感染性病毒的診斷、檢測(cè)、流行病調(diào)查，可用于快速檢測(cè)病毒性肝炎的發(fā)病原因，查明感染病毒及與疾病相關(guān)的基因突變，以便臨床醫(yī)生能夠及時(shí)得到治療、監(jiān)測(cè)病情的目的。在另一方面，由于此類芯片可用檢測(cè)基因突變，因此，對(duì)臨床治療有直接的指導(dǎo)作用。
圖1是基因芯片的設(shè)計(jì)原理及相關(guān)技術(shù)示意2是一種檢測(cè)多種肝炎的檢測(cè)型基因芯片的結(jié)構(gòu)圖3是部分乙型肝炎病毒基因排列圖，從中可以找出乙型肝炎的共有序列，再到GENEBANK中進(jìn)行對(duì)庫(kù)比較，從而可以找到乙型肝炎的專一性高又能將各種肝炎病毒進(jìn)行擴(kuò)增的引物序列。
具體實(shí)施例方式
參照附圖2一種檢測(cè)多種肝炎的檢測(cè)型基因芯片包括固體基片1，如玻片、硅片等；固體基片表面修飾了手臂分子2，如N，N-乙氧基氨基丙基三乙氧基硅烷、APTES，戊二醛，手臂分子2是以共價(jià)鍵結(jié)合到固體基片1上；在點(diǎn)樣后，氨基修飾的寡核酸探針3固定在修飾了手臂分子的固體基片上，圖中表示兩個(gè)點(diǎn)固定了不同的探針，寡核酸探針3是以共價(jià)鍵結(jié)合到手臂分子2上；寡核酸探針3包括檢測(cè)寡核酸探針和質(zhì)量控制寡核酸探針。
實(shí)施例11、引物序列其中HBV primerl序列如下5′-GTTTTATCATATTCCTCT-3′5′-GGTTTTATTAGGGTTCAA-3′其中HBV primer2序列如下5′-GAGGCTGTAGGCATAAAT-3′5′-GGGCATTTGGTGGTCTG-3′HCV擴(kuò)增引物一共設(shè)計(jì)了兩對(duì)引物，其中HCV primerl序列如下HCVi5′-GCCTTGTGGTACTGC-3′HCVlC5′-5ACCGCTCGGAAGTC-3′其中HCV primer21序列如下HCV25′-GGCTTTACCGGCGAC-3′HCV2C5′-GCTCATACCAiGCAC-3′2、血清樣品DNA、RNA抽提在10μl DEPC-乙醇溶液(10％為焦碳酸二乙酯(DEPC)，90％為無(wú)水乙醇)中加100μl血清室溫靜置10分鐘后，沸水浴10分鐘后，管子蓋子65℃烘干15分鐘，離心5分鐘(12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心10分鐘)，備用。
3、反轉(zhuǎn)錄制備模板DNA向步驟2制備含的DNA、RNA沉淀的eppendorf管內(nèi)，依次加入下列試劑Milli-Q H2O(超純水)11μl、15μmol/LHCV、HCV、反轉(zhuǎn)錄引物2μl并充分溶解沉淀，混勻樣品，短時(shí)離心使溶液集中于管底，置于70℃水浴鍋內(nèi)保溫5min。后將eppendorf置于冰上1min，加入以下試劑0.1mol/1DTT(二硫蘇糖醇)2μl、逆轉(zhuǎn)錄緩沖液(buffer)4μl、10mmol/1dNTPS 1μl，短時(shí)離心使溶液集中于管底。置于42℃水浴鍋內(nèi)保溫2分鐘。向該eppendorf管內(nèi)加入0.5μl SuperScript反轉(zhuǎn)錄酶，短時(shí)離心使溶液集中于管底。置于42℃水浴鍋內(nèi)保溫20分鐘。從水浴鍋內(nèi)取出eppendorf管，備用。
4、吸取5pl步驟2中制備的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，并依次加入下列試劑ddH2O 28.5μl10×PCR Buffer 5μl25nunol/1 MgCl2 4μl10mmol/1 dNTP混合物1μl1mmol/1 dTTP 1μl1mmol/1 spectrum-red-dUTP 0.2μl15pmol/1 HBV、HCV引物混合物1μlTaq酶0.5μl短時(shí)離心使溶液集中于管底，在PCR儀中PCR反應(yīng)，95℃變性3min后進(jìn)行95℃ 30sec，55℃ 30sec，72℃ 30sec循環(huán)30次，再在72℃ 5min延伸。最后在4℃待機(jī)。
5、步驟4的產(chǎn)物加入雜交液后點(diǎn)到檢測(cè)芯片上，蓋上蓋玻片，在37℃下保溫20分鐘。
6、用雜交清洗液I和II分別清洗雜交芯片各5分鐘。用N2吹干。
7、用scanligh掃描儀掃描基因芯片。Imagene軟件分析雜交結(jié)果。掃描結(jié)果顯示正對(duì)照有熒光信號(hào)；負(fù)對(duì)照沒(méi)有熒光信號(hào)，根據(jù)信號(hào)的有無(wú)來(lái)判斷待測(cè)樣品是陰性還是陽(yáng)性，由此可知被檢血清是否感染有隨檢的病毒及其是否存在有意義的基因突變，同時(shí)也可檢測(cè)到其中的基因分型。
實(shí)施例21、設(shè)計(jì)下列探針用于對(duì)病毒進(jìn)行分亞型檢測(cè)


乙型肝炎具有臨床意義的突變位點(diǎn)


根據(jù)上表中的有意義突變位置設(shè)計(jì)下列探針用于對(duì)病毒進(jìn)行突變類型檢測(cè)

2、將上述探針合成并在5′端標(biāo)記氨基，用點(diǎn)樣緩沖液稀釋，用點(diǎn)樣儀將樣品點(diǎn)到修飾好手臂分子的玻片上，固定。
血清樣品DNA、RNA抽提在10μlDEPC-乙醇溶液(10％為焦碳酸二乙酯(DEPC)，90％為無(wú)水乙醇)中加100μl血清室溫靜置10分鐘后，沸水浴10分鐘后，管子蓋子65℃烘干15分鐘，離心5分鐘(12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心10分鐘)，備用。
3、反轉(zhuǎn)錄制備模板DNA
向步驟2制備含的DNA、RNA沉淀的eppendorf管內(nèi)，依次加入下列試劑Milli-Q H2O(超純水)11μl、15μmol/LHCV、HCV、反轉(zhuǎn)錄引物2μl并充分溶解沉淀，混勻樣品，短時(shí)離心使溶液集中于管底，置于70℃水浴鍋內(nèi)保溫5min。后將eppendorf置于冰上1min，加入以下試劑0.1 mol/1DTT(二硫蘇糖醇)2μl、逆轉(zhuǎn)錄緩沖液(buffer)4μl、10mmol/1dNTPS 1μl，短時(shí)離心使溶液集中于管底。置于42℃水浴鍋內(nèi)保溫2分鐘。向該eppendorf管內(nèi)加入0.5μl SuperScript反轉(zhuǎn)錄酶，短時(shí)離心使溶液集中于管底。置于42℃水浴鍋內(nèi)保溫20分鐘。從水浴鍋內(nèi)取出eppendorf管，備用。
4、吸取5pl步驟2中制備的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，并依次加入下列試劑ddH2O 28.5μl10×PCR Buffer 5μl25nunol/1 MgCl2 4μl10mmol/1 dNTP混合物1μl1mmol/l dTTP 1μl1mmol/l spectrum-red-dUTP 0.2μl15pmol/1 HBV、HCV引物混合物1μl(僅加入反向引物)HOT START Taq酶0.5μl短時(shí)離心使溶液集中于管底。
5、將步驟4中的混合液加在芯片表面，置一塊GENE FRAME，再加上一塊蓋玻片，將芯片置于MJ芯片PCR儀中進(jìn)行PCR反應(yīng)，95℃變性5min后進(jìn)行95℃ 30sec，55℃ 30sec，72℃ 30sec循環(huán)30次，再在72℃ 5min延伸。最后在4℃待機(jī)。
6、用雜交清洗液I和II分別清洗雜交芯片各5分鐘。用N2吹干。
7、用scanligh掃描儀掃描基因芯片。Imagene軟件分析雜交結(jié)果。掃描結(jié)果顯示正對(duì)照有熒光信號(hào)；負(fù)對(duì)照沒(méi)有熒光信號(hào)，根據(jù)信號(hào)的有無(wú)來(lái)判斷待測(cè)樣品是陰性還是陽(yáng)性，由此可知被檢血清是否感染有隨檢的病毒及其是否存在有意義的基因突變，同時(shí)也可檢測(cè)到其中的基因分型。
實(shí)施例31、設(shè)計(jì)探針用于對(duì)HBV、HCV、HDV、HGV、TTV等病毒進(jìn)行病毒檢測(cè)；設(shè)計(jì)探針用于對(duì)HBV、HCV分亞型檢測(cè)；設(shè)計(jì)下列探針用于對(duì)HBV病毒進(jìn)行突變類型檢測(cè)。
2、將上述探針合成并在5′端標(biāo)記氨基，用點(diǎn)樣緩沖液稀釋，用點(diǎn)樣儀將樣品點(diǎn)到修飾好手臂分子的玻片上，固定。
血清樣品DNA、RNA抽提在10μl DEPC-乙醇溶液(10％為焦碳酸二乙酯(DEPC)，90％為無(wú)水乙醇)中加100μl血清室溫靜置10分鐘后，沸水浴10分鐘后，管子蓋子65℃烘干15分鐘，離心5分鐘(12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心10分鐘)，備用。
3、反轉(zhuǎn)錄制備模板DNA向步驟2制備含的DNA、RNA沉淀的eppendorf管內(nèi)，依次加入下列試劑Milli-Q H2O(超純水)11μl、15μmol/L HCV、HDV、HGV、TTV反轉(zhuǎn)錄引物2μl并充分溶解沉淀，混勻樣品，短時(shí)離心使溶液集中于管底，置于70℃水浴鍋內(nèi)保溫5min。后將eppendorf置于冰上1min，加入以下試劑0.1mol/lDTT(二硫蘇糖醇)2μl、逆轉(zhuǎn)錄緩沖液(buffer)4μl、10mmol/l dNTPS 1μl，短時(shí)離心使溶液集中于管底。置于42℃水浴鍋內(nèi)保溫2分鐘。向該eppendorf管內(nèi)加入0.5μl SuperScript反轉(zhuǎn)錄酶，短時(shí)離心使溶液集中于管底。置于42℃水浴鍋內(nèi)保溫20分鐘。從水浴鍋內(nèi)取出eppendorf管，備用。
4、吸取5pl步驟2中制備的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，并依次加入下列試劑ddH2O 28.5μl10×PCR Buffer 5μl25 nunol/1 MgCl2 4μl10 mmol/l dNTP混合物1μl1 mmol/l dTTP 1μl1 mmol/l spectrum-red-dUTP 0.2μl15pmol/l HBV、HCV引物混合物1μl(僅加入反向引物)HOT START Taq酶0.5μl短時(shí)離心使溶液集中于管底。
5、將步驟4中的混合液加在芯片表面，置一塊GENE FRAME，再加上一塊蓋玻片，將芯片置于MJ芯片PCR儀中進(jìn)行PCR反應(yīng)，95℃變性5 min后進(jìn)行95℃30 sec，55℃30 sec，72℃30 sec循環(huán)30次，再在72℃5 min延伸。最后在4℃待機(jī)。
6、用雜交清洗液I和II分別清洗雜交芯片各5分鐘。用N2吹干。
7、用scanligh掃描儀掃描基因芯片。Imagene軟件分析雜交結(jié)果。掃描結(jié)果顯示正對(duì)照有熒光信號(hào)；負(fù)對(duì)照沒(méi)有熒光信號(hào)，根據(jù)信號(hào)的有無(wú)來(lái)判斷待測(cè)樣品是陰性還是陽(yáng)性，由此可知被檢血清是否感染有隨檢的病毒及其是否存在有意義的基因突變，同時(shí)也可檢測(cè)到其中的基因分型。
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)多種肝炎的檢測(cè)型基因芯片，其特征在于芯片包括(1)多種檢測(cè)寡核酸探針和質(zhì)量控制寡核酸探針，(2)寡核酸探針通過(guò)手臂分子以共價(jià)鍵連接在固相基片上形成的探針陣列。所謂的寡核酸探針是指能與目的基因雜交的多聚核苷酸，長(zhǎng)度在幾個(gè)堿基到幾十個(gè)堿基；所謂的檢測(cè)寡核酸探針是指化學(xué)合成的多種肝炎的保守區(qū)、與疾病相關(guān)的突變區(qū)、基因型及亞型的互補(bǔ)的寡聚核苷酸，突變區(qū)的探針包括野生型和突變型探針，基因型及亞型決定區(qū)的探針包括多種基因型和多種亞型探針；所謂的手臂分子是指具有雙活性基團(tuán)的長(zhǎng)鏈有機(jī)化合物；所謂的質(zhì)量控制探針至少包括二種探針，即陽(yáng)性對(duì)照，陰性對(duì)照；陰性對(duì)照用于檢測(cè)雜交信號(hào)錯(cuò)誤或污染，陽(yáng)性對(duì)照用于檢測(cè)是否正常雜交；所謂的寡核酸探針固定為寡聚核苷酸的末端有一特定基團(tuán)，固定在固體基質(zhì)表面時(shí)，與表面修飾的手臂分子的末端基團(tuán)形成共價(jià)鍵。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)多種肝炎的檢測(cè)型基因芯片，其特征在于每個(gè)病毒靶基因選擇有2-4個(gè)核酸保守區(qū)序列，每個(gè)突變區(qū)、基因型及亞型決定區(qū)根據(jù)診斷和鑒定需要選擇適當(dāng)數(shù)量的探針，其中每個(gè)突變區(qū)至少要有兩個(gè)探針，即一個(gè)是野生型，一個(gè)是突變型。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種檢測(cè)多種肝炎的檢測(cè)型基因芯片，其特征在于固相基片包括多種方法處理的玻片、硅片、陶瓷片、塑料片、硝酸纖維膜、尼龍膜等。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種檢測(cè)多種肝炎的檢測(cè)型基因芯片，其特征在于配備有多組針對(duì)芯片所需診斷、檢測(cè)、流行病調(diào)查的感染性疾病病毒靶基因的高特異性的擴(kuò)增引物，其設(shè)計(jì)原則為每一個(gè)引物必須在人肝炎病毒靶基因的高特異性部位，而每對(duì)引物擴(kuò)增產(chǎn)物常常包含一個(gè)或多個(gè)突變部位。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種檢測(cè)多種肝炎的檢測(cè)型基因芯片，其特征在于每一特異性引物能夠擴(kuò)增GENEBANK中所有同種病毒的基因片斷。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種檢測(cè)多種肝炎的檢測(cè)型基因芯片，其特征在于固相基片以雙活性基團(tuán)的長(zhǎng)鏈有機(jī)化合物進(jìn)行表面修飾，常用的雙活性基團(tuán)的長(zhǎng)鏈有機(jī)化合物試劑有N，N-二乙氧基氨基丙基三乙氧基硅烷、三羥甲基氨基硅烷(APTES)、戊二醛、多聚賴氨酸，可采用它們中的一種或者它們的二種組合。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種檢測(cè)多種肝炎的檢測(cè)型基因芯片，其特征在于可引物標(biāo)記生物素、地高辛、熒光素，或在基因擴(kuò)增時(shí)加入生物素、地高辛、熒光素標(biāo)記的dUTP；雜交后檢測(cè)方法分別是使用納米金標(biāo)記的地高辛抗體與地高辛充分結(jié)合、使用納米金標(biāo)記親合素(streptavidin or avidin)與生物素充分結(jié)合、基因芯片掃描儀進(jìn)行掃描；對(duì)于納米金標(biāo)記的地高辛抗體和納米金標(biāo)記親合素(streptavidin or avidin)可直接觀察或用普通掃描儀進(jìn)行掃描。
8.權(quán)利要求1或2所述的一種檢測(cè)多種肝炎的檢測(cè)型基因芯片，在肝炎病毒檢測(cè)、診斷、傳染病流行性監(jiān)測(cè)，病毒性肝炎的發(fā)病原因快速檢測(cè)，查明感染病毒，肝炎基因突變檢測(cè)與鑒定中的運(yùn)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求1或8所述的一種檢測(cè)多種肝炎的檢測(cè)型基因芯片，其特征在于可用于一種或多種肝炎病毒的檢測(cè)，包括甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、戊型肝炎、庚型肝炎、TTV及其它們的組合。
10.根據(jù)權(quán)利要求1或8所述的一種檢測(cè)多種肝炎的檢測(cè)型基因芯片，其特征在于可用于種或多種肝炎病毒突變的檢測(cè)，包括甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、戊型肝炎、庚型肝炎、TTV及其它們的組合。
全文摘要
本發(fā)明一種檢測(cè)多種肝炎的檢測(cè)型基因芯片。公開(kāi)了一種用于感染性疾病人多種肝炎診斷的基因芯片，并提供了用于診斷基因芯片的適合各種亞型擴(kuò)增的高檢出率的新引物。該基因芯片包括檢測(cè)質(zhì)量控制系統(tǒng)和疾病診斷系統(tǒng)兩個(gè)系統(tǒng)。由于所說(shuō)的芯片可以同時(shí)對(duì)多個(gè)乙型、丙型肝炎病毒位點(diǎn)及丁型肝炎、戊型肝炎、庚型肝炎、TTV同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，并設(shè)有檢測(cè)監(jiān)控系統(tǒng)，不僅大大縮短了診斷時(shí)間，且大大提高了診斷的準(zhǔn)確性，降低了診斷成本，尤其可以用于流行病調(diào)查、肝炎基因型鑒定的血液檢測(cè)，將具有十分深遠(yuǎn)的意義。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1392268SQ0211314
公開(kāi)日2003年1月22日 申請(qǐng)日期2002年6月11日 優(yōu)先權(quán)日2002年6月11日
發(fā)明者趙偉, 劉全俊, 劉偉, 陸祖宏 申請(qǐng)人:趙偉, 劉全俊, 陸祖宏