專利名稱：溶菌復(fù)合物及其生產(chǎn)方法和實現(xiàn)該方法所用的菌株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)，醫(yī)藥和獸醫(yī)領(lǐng)域，特別涉及一種溶菌復(fù)合物，可以用于生產(chǎn)藥品和獸藥。
具有溶菌作用的溶菌酶的制備是已知的(Egorov N.S.Bases of the doctrine ofantibiotics，1979，“Vysshaya shkola”，p.347-349)。卵清蛋白中的溶菌酶具有專效滅窄譜微生物的活性，主要是微球菌。溶菌酶是一種胞壁質(zhì)酶，對微生物細胞壁的肽聚糖具有特別的作用，也就是，使胞壁酸和葡糖胺之間的鍵溶解，并在還原端形成胞壁酸片斷。
這就是為什么溶菌酶是只專效溶解窄譜的革蘭氏陽性微生物。特別是，不能溶解葡萄球菌-革蘭氏陽性致病菌的細胞壁，它們的細胞壁要通過五甘氨酸間肽橋(pentaglycine interpeptide bridge)來區(qū)分，五肽橋的存在給細胞壁增添了硬度。此外，像大多數(shù)酶制備物一樣，溶菌酶不夠穩(wěn)定。植物或細菌來源的溶菌酶也涉及到上述所有考慮。
已知一種在溶菌的酶-溶葡萄球菌素的基礎(chǔ)上的酶的制備(Schindler C.A.，Schuchardt V.T.Lysostaphina new bacteriolytic agent for the Staphylococcus.1964，Proc.of the Nation，Acad.Sci.USA，v.51，N3，pp.415-421)。
然而，該酶不穩(wěn)定僅在實驗室應(yīng)用。
已知一種溶解細菌的酶的復(fù)合物，可以溶解革蘭氏陽性微生物，特別是溶解致病的具抗生素抗性的葡萄球菌和其他微生物，并從細菌Xanthomonascampestris VKPM B-4102(俄羅斯專利1549227，Int.class C12N 9/00，1984)的培養(yǎng)液中獲得。
從細菌Xanthomonas campestris的培養(yǎng)液獲得的溶菌的酶復(fù)合物是2種藥物的基礎(chǔ)用于醫(yī)用的命名為溶酰胺酶(lysoamidase)和用于獸藥的-lysomast.
該藥物由三種溶菌的酶組成胞壁質(zhì)酶，胞壁酰丙氨酸脒基酶(muramoylalaninemidase)，內(nèi)肽酶，多糖高聚物，蛋白酶和穩(wěn)定組份(O.A.Stepnaya，L.A.Ledova，I.S.Kulaev，Bacteriolytic enzymes，in“Uspekhibiologicheskoy khimii”，v.XXXIX，Department of scientific and technicalinformation，Pushchino Research Center of Russian Academy of Sciences，Pushchino，1999，p.341-346)。
復(fù)合物中組分的比率由作者確定，為(重量百分比％)溶菌的酶(胞壁質(zhì)酶，胞壁酰丙氨酸脒基酶(muramoylalaninemidase)，內(nèi)肽酶)- 1.0-2.0蛋白酶-0.5-1.0穩(wěn)定組份-4.0-8.0多糖- 剩余三種溶菌的酶對微生物的細胞壁的肽聚糖具有不同的底物特異性(a)胞壁質(zhì)酶在底物特異性上是溶菌酶的類似物，(b)胞壁酰丙氨酸脒基酶(muramoylalaninemidase)將肽聚糖的肽部分從多糖中切除，以及(c)內(nèi)肽酶破壞細胞壁的肽橋內(nèi)部的鍵?；谏鲜鲈?，藥物活躍溶解廣譜革蘭氏陽性微生物細胞，包括致病性鏈球菌和葡萄球菌。
由于現(xiàn)有的蛋白酶和兩種溶菌的酶溶酰胺酶-內(nèi)肽酶和胞壁酰丙氨酸脒基酶(muramoylalaninemidase)也具有蛋白水解活性，該藥物在用于壞死機體的傷口清洗上有好的效果。
復(fù)合物的多糖組分為溶菌的酶提供了穩(wěn)定性(O.A.Stepnaya，L.A.Ledova，I.S.Kulaev，Biochemistry[in Russian]，v.58，10，1993，p.1523-1528)。多糖結(jié)構(gòu)是由N-乙酰葡糖胺(N-acetyglucosamine)，N-乙酰甘露糖醛(N-acetylmannuric)和N-乙酰半乳糖醛酸(N-acetylgalacturonic acids)組成的重復(fù)單元(L.M.Likhosherstov，S.N.Senchenkova，Y.A.Knirel，et al.FEBS Letters，N 368，1995，P.113-116)。
該復(fù)合物的缺陷是其溶菌活性不夠高，是由于現(xiàn)有的穩(wěn)定組分和將近一半的溶菌的酶的變性所致。此外，穩(wěn)定組分沒有治療作用但可能導(dǎo)致過敏反應(yīng)。
已知一種溶解酶的復(fù)合物的生產(chǎn)方法(俄羅斯專利1774658，Int.Class C12N9/36，1990)，包括在液體營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)生產(chǎn)菌株Xanthomonas campestrisVKPM B-4102，培養(yǎng)基包括葡萄糖，細菌用蛋白胨，用量為2.5-6.0g/l的蛋白-維生素濃縮物(PVC)，和礦質(zhì)鹽，在通風(fēng)和攪拌條件下，隨后分離靶產(chǎn)物，將一部分PVC添加到起始的培養(yǎng)基中。溶菌的酶在培養(yǎng)液中的容量按溶菌活性單位計為40-60U/ml。
分離是采用俄羅斯專利17755581(Int.Class C12N 9/36，1990)所描述的溶菌的酶復(fù)合物的分離方法實現(xiàn)的，包括將冷卻的培養(yǎng)液過濾，通過有機溶劑沉淀靶產(chǎn)物，冷卻并分離沉淀物，透析并凍干。沉淀之前，過濾物被冷卻，酸化到pH3.5-5.0然后加入2.5-3.5倍體積的冷卻的乙醇，無需攪拌并置于冷卻處。
在制備物中溶菌的酶的含量按溶菌活性單位計不超過50U/mg制備物。
在培養(yǎng)液中最終產(chǎn)物產(chǎn)量為溶菌復(fù)合物含量的40-60％。
在該方法實踐中培養(yǎng)液中溶菌的酶的含量和最終制備物的產(chǎn)量都不高。
綜合考慮方法的顯著特點和所取得的效果，與本發(fā)明建議的方法最接近的方法是生產(chǎn)溶菌的酶復(fù)合物的方法(俄羅斯專利1549227，Int.Class C12N 9/00，1984)，提供了培養(yǎng)細菌Xanthomonas campestris VKPM B-4102的含有下列組分的營養(yǎng)培養(yǎng)基(g/l)葡萄糖 2.0-12.0細菌用蛋白胨 2.0-6.0蛋白-維生素濃縮物2.5-6.0Na2HPO4×12H2O 0.5-4.0KH2PO40.1-1.0
NaCl 0.35-1.0MgSO4×7H2O 0.2-3.0FeSO4×7H2O 0.01-0.1水 定容至11當(dāng)培養(yǎng)液達到了穩(wěn)定的溶菌活性時該過程停止。生物質(zhì)通過離心被分離，現(xiàn)有溶液中的溶菌的酶復(fù)合物通過硫酸銨沉淀，沉淀物被溶解，溶液被透析和凍干。
在培養(yǎng)液中溶菌的酶的含量按溶菌活性單位計不超過63U/ml。
終產(chǎn)物的產(chǎn)量不夠高-大約為培養(yǎng)液中溶菌復(fù)合物含量的20％。
上述方法的缺陷是蛋白-維生素濃縮物現(xiàn)在不能由國內(nèi)工業(yè)生產(chǎn)，因為它的生產(chǎn)在生態(tài)學(xué)上是不安全的；使用昂貴的進口細菌用蛋白胨Difco(USA)作為培養(yǎng)基組分是不實用的，因為它將明顯增加終產(chǎn)物的成本。
此外，使用乙醇(俄羅斯專利1755581)和丙酮(俄羅斯專利1549227)使酶從生產(chǎn)培養(yǎng)液中沉淀，導(dǎo)致大約一半的決定藥物治療效果的溶菌的酶不可逆地變性，溶菌的酶是在現(xiàn)有培養(yǎng)液中(依照溶菌活性測量和電泳分析結(jié)果)，因此，結(jié)果是，產(chǎn)物產(chǎn)量有相當(dāng)大的減低(

圖1)。
通過已知方法生產(chǎn)的溶酰胺酶制備物終產(chǎn)物含有明顯量的輔助組分-穩(wěn)定蛋白(圖1)方法完成溶酰胺酶的沉淀產(chǎn)物，它沒有治療作用但可能產(chǎn)生過敏反應(yīng)。
已知復(fù)合物生產(chǎn)菌株細菌Xanthomonas campestris VKPM B-4102。
該生產(chǎn)菌株的缺陷是，由于生產(chǎn)復(fù)合物中的輔助組分的存在導(dǎo)致溶菌活性不夠高。
實施本發(fā)明獲得的技術(shù)結(jié)果，增加含生產(chǎn)細菌的培養(yǎng)液中溶菌的酶的數(shù)量和含量，增加了產(chǎn)品的產(chǎn)量，優(yōu)化了終末產(chǎn)物的組成(減少了終產(chǎn)物中非活性蛋白的含量)，加速了最終產(chǎn)物生產(chǎn)的過程。
這樣，降低了產(chǎn)品價格和加速了產(chǎn)品生產(chǎn)過程。
建議的溶菌復(fù)合物是通過細菌菌株Xanthomonas campestris XL1產(chǎn)生的，除了溶菌的酶如胞壁質(zhì)酶，胞壁酰丙氨酸脒基酶(muramoylalaninemidase)，內(nèi)肽酶，多糖和蛋白酶，還包含分子量為大約22kDa的溶菌的酶。
復(fù)合物含有下列組分，重量百分比％溶菌的酶(胞壁質(zhì)酶，胞壁酰丙氨酸脒基酶(muramoylalaninemidase)，內(nèi)肽酶，分子量為大約22kDa的溶菌的酶) 2-5蛋白酶 1-2無活性組分 2-4多糖 剩余被建議的制備物-溶菌的酶復(fù)合物破壞革蘭氏陽性微生物的細胞壁，包括廣泛抗生素抗性的病原性微生物(表1)。
本發(fā)明制備物中的添加的溶菌的酶的存在增加了制備物的溶菌活性。復(fù)合物含有大約降低一半的非活性組分，該結(jié)論可由圖1的電泳分析結(jié)果所證明，復(fù)合物的溶菌活性是60-90le/mg。
溶菌復(fù)合物的建議生產(chǎn)方法實質(zhì)是在營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)生產(chǎn)菌Xanthomonas campestris XL1，培養(yǎng)基按下列比例含有葡萄糖，蛋白胨，酵母提取物或酵母自溶物，鈉和鉀的磷酸鹽，硫酸鎂，氯化鉀，硫酸鐵和水(g/L)葡萄糖 2.0-6.0蛋白胨 1.5-6.0酵母提取物或酵母自溶物 1.0-6.0440-490mg/L氮40-300mlNa2HPO4·12H2O 4.0-5.0KH2PO41.0-2.0MgSO4·7H2O 4.0-6.0KCl 0.4-1.6
FeSO4·7H2O 0.05-0.20水 定容至11當(dāng)培養(yǎng)液的溶菌活性穩(wěn)定時該過程結(jié)束。生物質(zhì)通過離心收集，用硫酸銨(70-85％飽和度)使酶復(fù)合物從培養(yǎng)液中沉淀，沉淀物被溶解，溶液被透析并凍干。
用所建議的方法的工藝效果是在營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)細菌菌株Xanthomonascampestris XL1，培養(yǎng)基按下列比例含有葡萄糖，蛋白胨，酵母提取物或酵母自溶物，鈉和磷酸鉀，硫酸鎂，氯化鉀，硫酸鐵和水(g/L)葡萄糖 2.0-6.0蛋白胨 1.5-6.0酵母提取物或酵母自溶物 1.0-6.0440-490mg/L氮40-300mlNa2HPO4·12H2O 4.0-5.0KH2PO41.0-2.0MgSO4·7H2O 4.0-6.0KCl 0.4-1.6FeSO4·7H2O 0.05-0.20水 定容至11復(fù)合物用硫酸銨直接從培養(yǎng)液中沉淀出來。
所建議的營養(yǎng)培養(yǎng)基組分和其比率，培養(yǎng)基的價格較低，而且培養(yǎng)液中的溶菌的酶的含量從30-60LE/ml(按已知的方法)增加到70-90LE/ml，而且培養(yǎng)基中非活性蛋白的容量減少(圖1)。
在培養(yǎng)和在沉淀過程中酶復(fù)合物的溶菌活性用如下方法測定將0.1ml樣品加入到含有2ml金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)209P凍干細胞的懸浮物的0.01M Tris-HCl緩沖液，pH8.4-8.5，濃度為0.5-0.6單位的光密度，在37℃升溫10分鐘，混合物再在37℃培養(yǎng)5分鐘。
用下列等式計算活性E(units/ml)=----------t×0.01×0.1(Do-D)×P]]>這里D為樣品培養(yǎng)后的光密度；Do為對照的光密度；t為培養(yǎng)時間，分鐘；P為樣品稀釋度；0.01為對應(yīng)于一個單位活性的光密度；0.1為樣品體積，毫升(俄羅斯專利1549227)增加營養(yǎng)培養(yǎng)基中的硫酸鎂刺激溶菌的酶的產(chǎn)生。
改變沉淀程序，也就是排除了用丙酮(俄羅斯專利1549227)或乙醇(俄羅斯專利1755581)從純化過程中排除部分沉淀物，縮短了獲得的終產(chǎn)物工藝的時間和將培養(yǎng)液含量中靶產(chǎn)物的產(chǎn)量從20-50％(用已知方法)增加到80-100％。
細菌菌株Xanthomonas campestrisXL1，溶菌復(fù)合物的產(chǎn)生菌，在被建議的方法中采用。
細菌菌株Xanthomonas campestrisXL1被保藏在俄羅斯科學(xué)院斯克利雅賓微生物生物化學(xué)和生理學(xué)研究所全俄羅斯微生物保存中心(莫斯科州普希諾科學(xué)大街5號)[ALL-Russian collection of microorganisms at G.K.Skryabin Institute ofBiochemistry and Physiology of Microorganisms，Russian Academy of Sciences(Pushchino，Moscow region，Prospect Nauki5)]并給予保藏號VKM B-2249D。
該菌株是從細菌菌株Xanthomonas campestrisVKPM B-4102中通過在選擇性培養(yǎng)基上選擇獲得。
菌株的培養(yǎng)形態(tài)特征不動的直桿狀(無鞭毛)，0.6-0.7×2.0μm，單個或成對。
在標(biāo)準(zhǔn)營養(yǎng)培養(yǎng)基(MPA，BBL，Becton Dickinson)上菌株形成2μm和更大直徑的圓形菌落，凸起，光滑，反光的，粘稠的，整齊的黃色邊緣和不透明狀。分泌性的黑色和褐色色素滲入營養(yǎng)培養(yǎng)基；色素出現(xiàn)的時間和濃度依靠培養(yǎng)基的組成決定。在含5％葡萄糖的瓊脂培養(yǎng)基生長時為黏液狀。通過Gregersen(1978)方法革蘭氏染色是革蘭氏陰性菌。
生物化學(xué)特征厭氧型，化學(xué)有機營養(yǎng)菌，需生長因子。
氧化酶和過氧化氫酶陽性。
最佳生長溫度為+25-30℃，也可在+4℃生長和在+15-37℃微弱生長。
無反硝化作用。在有氧條件下從葡萄糖形成酸。
水解明膠，七葉苷，和酪蛋白。
從蛋白胨中形成H2S。
在含有大于4％NaCl的培養(yǎng)基上生長。
在系統(tǒng)細菌學(xué)伯捷氏手冊(Bergay’s Manual of Systematic Bacteriology)的基礎(chǔ)上(Eds.Noel R.Krieg，John G.Holt，Baltimore；London Williams & Wilkins.1984，v.1)鑒定，該菌參照于Xanthomonas campestries菌種或Lysobacter屬。通過全面考慮所獲得的特征，該培養(yǎng)菌種被認定為Xanthomonas campestries菌種。
菌株Xanthomonas campestries XL1對人和動物無致病性。菌株產(chǎn)生的溶菌復(fù)合物包括溶菌的酶(胞壁質(zhì)酶，胞壁酰丙氨酸脒基酶(muramoylalaninemidase)，內(nèi)肽酶，分子量為大約22kDa的溶菌的酶)，蛋白酶，酸性高分子多糖和穩(wěn)定組分。
具體實施例方式
通過下列實施例表明本方法實現(xiàn)的可能性，但這些實施例不限制本發(fā)明。
實施例1將含有150ml由下列組分組成的營養(yǎng)培養(yǎng)基(g/l)放入750ml燒瓶中葡萄糖 5.0蛋白胨 2.0酵母提取物 2.5Na2HPO4×12H2O 4.0KH2PO41.0KCl 0.5MgSO4×7H2O 3.0FeSO4×7H2O 0.1水 定容至1升用10％NaOH溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH為7.0。含培養(yǎng)基的燒瓶滅菌。含10％細菌Xanthomonas campestries XL1的接種體接種到已滅菌的含培養(yǎng)基的燒瓶中，并在搖床上(200rpm)29℃下培養(yǎng)24h。細菌細胞通過離心被分離。
通過24小時的培養(yǎng)，培養(yǎng)液的溶菌活性為72LU/ml。
實施例2如實施例1所述在下列組成的培養(yǎng)基上培養(yǎng)菌株Xanthomonas campestriesXL1，g/l葡萄糖5.0蛋白胨2.0酵母自溶物100mlNa2HPO4×12H2O 4.2KH2PO41.0KCl 0.6MgSO4×7H2O 5.0FeSO4×7H2O 0.1水 定容至1升通過24小時的培養(yǎng)，培養(yǎng)液的溶菌活性為70LU/ml。
300ml在上述培養(yǎng)基上生長的接種體被轉(zhuǎn)入已滅菌的發(fā)酵罐中。在29℃，每1體積培養(yǎng)基每1分鐘通風(fēng)量為0.3體積的條件下培養(yǎng)，這樣培養(yǎng)基的氧分壓不會降到30％飽和度以下。
培養(yǎng)基的pH維持在6.3-7.5的范圍內(nèi)，當(dāng)pH降低或升高時用10％NaOH溶液或10％HCl溶液分別加入培養(yǎng)基中。通過24小時的培養(yǎng)，培養(yǎng)液的活性為70LU/ml。
用硫酸銨補充到冷卻的培養(yǎng)液中(5.61)使飽和度達80％，放置12小時，通過離心將沉淀分離。沉淀物在水中溶解，透析，透析產(chǎn)生500ml含溶菌復(fù)合物的溶液。
溶液被凍干獲得大約5g的制備物，該制備物活性為72LU/ml。
培養(yǎng)液的總的溶菌活性為355320LU；終產(chǎn)物的總活性為360000LU。最后產(chǎn)物的產(chǎn)量為100％的培養(yǎng)液含量。
通過已知的和建議的方法獲得的溶酰胺酶制備物的電泳分析結(jié)果如圖1所示。
實施例5生產(chǎn)菌株Xanthomonas campestries XL1在如實施例2所述的培養(yǎng)基上和如實施例4所述的Ankum發(fā)酵罐中生長。通過24小時，培養(yǎng)液的活性為65LU/ml。通過如實施例4所述的方案，當(dāng)制備物的溶菌活性為60LU/mg時獲得終產(chǎn)物。終產(chǎn)物的產(chǎn)量是100％。
電泳分析終產(chǎn)物顯示了通過已知方法獲得的復(fù)合物時，終產(chǎn)物含有大量的穩(wěn)定蛋白，它們中的許多出現(xiàn)在制備過程中，和溶菌的酶具有同樣的量。
通過所建議的方法獲得的終產(chǎn)物含有少得多的穩(wěn)定蛋白并富含溶菌的酶。
表1中的數(shù)據(jù)表明建議的制備物，作為和已知方法的比較，添加裂解了七個種的10個菌株和直接從患者分離取得的18個金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的臨床菌株。
表1溶菌復(fù)合物活性作用的微生物范圍

這樣，在所建議的方法中增加了生產(chǎn)菌株-Xanthomonas campestries XL1的培養(yǎng)液的溶菌的酶的含量，增加了終產(chǎn)物的產(chǎn)量，減少了終產(chǎn)物中穩(wěn)定蛋白的含量。(圖1)此外，該方法降低了終產(chǎn)物的生產(chǎn)時間和終產(chǎn)物的成本。
工業(yè)適用性溶菌復(fù)合物可以被用為治療由致病性的具有抗生素抗性的微生物導(dǎo)致的感染疾病的藥物，特別地，應(yīng)用于外科，婦科，口腔科，耳喉科，整容方面，和在治療葡萄球菌感染的家禽和牛的乳腺炎的獸藥中。
此外，溶菌復(fù)合物可以被用于獲得細胞培養(yǎng)，原生質(zhì)體，分離基因工程的細胞內(nèi)含物研究試驗，微生物細胞壁結(jié)構(gòu)的研究。建議的溶菌復(fù)合物的生產(chǎn)菌株和生產(chǎn)方法可以被用于生物技術(shù)領(lǐng)域生產(chǎn)復(fù)合物制備物。
權(quán)利要求
1.一種通過Xanthomonas campestris菌種細菌生產(chǎn)溶菌復(fù)合物，其中包括溶菌的酶胞壁質(zhì)酶，胞壁酰丙氨酸脒基酶(muramoylalaninemidase)，內(nèi)肽酶，蛋白酶和多糖，具有顯著特點它是由細菌菌株Xanthomonas campestris VKMB-2249 D產(chǎn)生并添加含有分子量大約為22kDa的溶菌的酶。
2.一種生產(chǎn)溶菌復(fù)合物的方法，包括在營養(yǎng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)菌種Xanthomonascampestris的一種菌株，通過離心分離培養(yǎng)液中的生物質(zhì)，用硫酸銨沉淀復(fù)合物，透析溶解的沉淀物并凍干終產(chǎn)物，該方法特征地描述為培養(yǎng)細菌菌株Xanthomonas campertrisVKM B-2249 D以及使用的營養(yǎng)培養(yǎng)基含有葡萄糖，蛋白胨，酵母提取物或酵母自溶物，鈉和鉀的磷酸鹽，硫酸鎂，氯化鉀，硫酸鐵和水，各組成按如下含量(g/l)葡萄糖 2.0-6.0蛋白胨 1.5-6.0酵母提取物或胺誘1.0-6.0導(dǎo)的酵母自溶物含440-490mg/l的氮 40-300mlNa2HPO4×12H2O 4.0-5.0KH2PO41.0-2.0MgSO4×7H2O 4.0-6.0KCl 0.4-1.60FeSO4×7H2O 0.05-0.20水 定容至1升復(fù)合物被硫酸銨直接從培養(yǎng)液中沉淀。
3.一種細菌菌株Xanthomonas campestris VKM B-2249 D是溶菌復(fù)合物的生產(chǎn)菌株。
全文摘要
本發(fā)明涉及藥物，獸藥和生物技術(shù)領(lǐng)域，可以用于生產(chǎn)醫(yī)用或獸用目的的藥物。建議用細菌Xanthomonas campestris XL1(該菌株保藏號為VKMB－2249 D)生產(chǎn)的溶菌復(fù)合物，該復(fù)合物含有溶菌的酶(胞壁質(zhì)酶，胞壁酰丙氨酸脒基酶(muramoylalaninemidase)，內(nèi)肽酶，和分子量大約為22kDa的溶菌的酶)，蛋白酶，多糖和穩(wěn)定組分。生產(chǎn)溶菌復(fù)合物的方法包括在含有葡萄糖，蛋白胨，酵母提取物或酵母自溶物，鈉和鉀的磷酸鹽，硫酸鎂，氯化鉀，硫酸鐵和水的營養(yǎng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)生產(chǎn)菌株。
文檔編號C12N9/36GK1396952SQ01804247
公開日2003年2月12日 申請日期2001年11月28日 優(yōu)先權(quán)日2000年11月29日
發(fā)明者伊戈爾·斯捷潘諾維奇·庫拉耶夫, 奧利加·安德列耶夫娜·斯捷潘娜亞, 伊利娜·馬特維耶夫娜·茨法斯曼, 塔伊斯尼亞·謝爾蓋耶夫娜·切爾門斯卡亞, 拉利薩·阿列克山德洛夫娜·列多娃, 柳德米格·格里高里耶夫娜·朱勃里茨卡亞, 瓦西里·康斯坦丁諾維奇·阿基門科 申請人:俄羅斯科學(xué)院斯克利雅賓微生物生物化學(xué)和生理學(xué)研究所