專利名稱：一種制備環(huán)糊精溶菌酶包合物的方法及制備的飼料添加劑、及該包合物在配合飼料中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用環(huán)糊精包被技術(shù)處理溶菌酶來提高其對溫度和酶切的耐受 性的方法，通過該方法得到一種可作為飼料添加劑的產(chǎn)物，屬于酶工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
溶菌酶(Lysozyme，EC3. 2. 1. 17)是專門作用于微生物細胞壁的水解酶，又稱細胞 壁溶解酶(Muramidase)，是一種綠色、無污染、無公害、無殘留的、安全性很高的高鹽基蛋白 質(zhì)，能專一性地作用于肽聚糖的糖苷鏈使之斷裂，使細菌細胞壁變得松馳，失去對細胞的保 護作用，最后細胞溶解死亡，而對沒有細胞壁的人體細胞不會產(chǎn)生不利影響。由于其具有選 擇性抑菌的特點，目前已被許多國家和組織批準為食品防腐劑或保鮮劑使用。目前，溶菌酶 作為畜禽飼料添加劑才剛起步，僅前蘇聯(lián)、法國做了一些初步研究，但國內(nèi)有人報道運用溶 菌酶于畜禽生產(chǎn)取得了較好效果。溶菌酶對仔豬腹瀉有防治作用，它與免疫球蛋白在功能 上有著緊密的聯(lián)系，并能與其他生命活性物質(zhì)入補體，增強抗體的活性，從而殺滅細菌。另 有報道，溶菌酶可用于防治胃腸炎、消化不良、化膿等疾病，在飼喂肉仔雞、犢牛、仔豬等畜 禽上已經(jīng)證明；溶菌酶正成為一種“綠色”飼用酶制劑，在國內(nèi)外畜牧及水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中將會 具有廣闊的應(yīng)用價值和巨大的發(fā)展前景。然而，目前對于飼用酶制劑的評估主要集中在對 產(chǎn)品活性的簡單測定方面，主要是酶的活性，而對于酶制劑在動物消化道內(nèi)真正發(fā)揮作用 的有效酶活評估還很少見，由于腸道內(nèi)的復(fù)雜環(huán)境使得這部分內(nèi)容的研究非常困難。眾所 周知，在酶制劑到達動物消化道相應(yīng)位點發(fā)生作用之前，其活性會受到各種各樣形式的損 失。首先是在飼料加工過程中，高溫和濕度會造成酶制劑活性降低；之后進入動物胃中，會 受到胃酸和胃蛋白酶的切割；進入小腸之后，也會收到胰酶等蛋白酶的作用，造成酶制劑活 性的損失。因此，對于飼用酶制劑來說，其不僅要經(jīng)受飼料加工過程中高溫高濕等熱處理， 還要經(jīng)受動物胃腸道內(nèi)不同PH環(huán)境和內(nèi)源蛋白酶的影響。以往的報道對飼用酶制劑的酶 學性質(zhì)性研究較多，如最適溫度、PH和熱穩(wěn)定性等，而對其在動物腸道中的穩(wěn)定性研究較 少。一種解決酶制劑耐酸解、耐酶切的有效方法就是對產(chǎn)品進行包被處理，來提高產(chǎn)品在腸 道內(nèi)的穩(wěn)定性，充分發(fā)揮其應(yīng)有的特征。環(huán)糊精(Cyclodextrin，簡稱CD)為無毒無味的白色粉末狀固體，是直鏈淀粉在由 芽孢桿菌產(chǎn)生的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶作用下生成的一系列環(huán)狀低聚糖的總稱，由于連接 葡萄糖單元的糖苷鍵不能自由旋轉(zhuǎn)，使得環(huán)糊精形成了略呈錐形的圓環(huán)，環(huán)糊精的伯羥基 圍成了錐形的小口，其仲羥基圍成了錐形的大口?；诃h(huán)糊精本身的結(jié)構(gòu)特點，所以它具有 疏水的內(nèi)腔和親水的表面。其中β-環(huán)糊精(β-CD)作為分子載體，在醫(yī)藥工業(yè)，食品和其 它工業(yè)領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。近年來，有關(guān)用環(huán)糊精及其衍生物包合揮發(fā)油、維生素和常用 藥物等的報道已屢見不鮮，但有關(guān)溶菌酶的包合處理技術(shù)目前還未見報道。本發(fā)明就是利 用環(huán)糊精的疏水空腔生成包合物的能力，使溶菌酶與環(huán)糊精生成包合物，來達到穩(wěn)定溶菌 酶的物化性質(zhì)，減少氧化及熱敏性等目的，為溶菌酶在飼料工業(yè)中的推廣應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)，從而為溶菌酶在飼料行業(yè)中發(fā)揮更好的經(jīng)濟效益和社會效益奠定基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種制備環(huán)糊精溶菌酶包合物的方法及其 在配合飼料中的應(yīng)用，為溶菌酶在飼料工業(yè)中的推廣應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)，從而為溶 菌酶在飼料行業(yè)中發(fā)揮更好的經(jīng)濟效益和社會效益奠定基礎(chǔ)。本發(fā)明所需要解決的技術(shù)問題，可以通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)本發(fā)明主要內(nèi)容包括三個方面，第一個方面，將一定量的溶菌酶與環(huán)糊精混合，控 制溫度和時間即得成品，通過飼料加工過程中高溫高濕條件對包合處理后溶菌酶活的影 響，來評價包合處理后溶菌酶的穩(wěn)定性。(1)溶菌酶包合物的制備采用密封加熱法，將溶菌酶樣品和環(huán)糊精混合，溫度控制在40-90°C，包合時間為 l-3h。其中，溶菌酶的用量為5-90%，環(huán)糊精的用量為10-95% (按重量百分比計)，制得 溶菌酶包合物。(2)溶菌酶包合物的酶活精密稱取包合物0. Olg溶于PBS(pH6. 2)的緩沖溶液中，充分搖勻后稀釋100倍備 用；同時以溶菌酶與環(huán)糊精直接混合后的混合物作為對照組，按照溶菌酶酶活的測定方法， 檢測包合物的酶活。溶菌酶直接與環(huán)糊精混合后的酶活隨著溫度的升高逐漸下降，在100°C時，殘留酶 活為20%左右，說明未包合的溶菌酶結(jié)構(gòu)受到了破壞；而環(huán)糊精包合的溶菌酶在高溫下仍 然保持著較高的酶活，在100°C時保留20min后，殘留酶活在83%以上。結(jié)果說明使用環(huán)糊 精包合的溶菌酶的穩(wěn)定性明顯提高。(3)溶菌酶包合物在飼料制粒過程中的耐熱性能實驗酶是具有生物活性的蛋白質(zhì)，大多數(shù)酶制劑不具有耐受90°C以上高溫的性質(zhì)。飼 料在生產(chǎn)過程中，粉碎、預(yù)混、制粒等過程都會造成酶制劑活性損失甚至不可逆失活。為分 析包合物的熱穩(wěn)定性，準確稱取一定量的溶菌酶樣品于試管中，分別置于不同溫度的蒸汽 (即濕法)和熱空氣(即干法)中保溫一定的時間后，按照溶菌酶酶活的檢測方法檢測各自 酶活。溶菌酶樣品在干法的不同溫度條件下保溫后酶活下降不明顯。保溫3min后，相對 酶活全部都在92%以上；保溫5min后，相對酶活全部都在91%以上；濕法保溫對溶菌酶的 酶活影響比干法明顯。保溫3min后，相對酶活全部都在90%以上，酶活損失較小，這與干法 保溫的結(jié)果相似；5min后相對酶活在88% -93%之間。綜合干法保溫和濕法保溫對包合物 溶菌酶酶活的影響結(jié)果可知，無論干法或濕法，在75°C _90°C高溫下保持3min后，溶菌酶的 酶活損失均較小，這些條件足以滿足飼料在制粒過程中所經(jīng)受的溫度和時間，說明飼料制 粒過程中的高溫不會明顯的影響到包合后溶菌酶的酶活，即溶菌酶包合處理后完全能夠承 受一般制粒工藝中的高溫和高濕處理過程。本發(fā)明的第二方面，將未包合的溶菌酶和溶菌酶包合物按照一定的比例混合組成 一種飼用添加劑。
在畜禽的體內(nèi)，由于食糜在胃中的停留時間為兩小時左右，其強酸環(huán)境(pH2-3) 外加胃蛋白酶的作用等會使很多的酶制劑變性，從而降低酶的生物利用率。本部分的內(nèi)容 就是針對這些問題和缺點加以改進，提供一種溶菌酶在配合飼料中的應(yīng)用方法，使其能夠 順利通過胃的強酸環(huán)境，提高對胃蛋白酶的耐受性，從而降低酶活的損失，而達到小腸后能 較快的發(fā)揮作用，最大限度地提高酶制劑的利用率。將溶菌酶樣品與溶菌酶包合物以1 1 3的比例混合均勻，即得一種飼用添加 劑樣品，、攪拌均勻。所述溶菌酶與溶菌酶包合物的重量比為1 2。本發(fā)明的第三方面，一種環(huán)糊精溶菌酶包合物在配合飼料中的應(yīng)用，其特征在于， 將溶菌菌酶與溶菌酶包合物以重量比1 1-3的比例混合均勻，即得一種飼用添加劑，分別 按照0. 05% -0. 5%的添加量混入到配合飼料中，攪拌均勻。將溶菌酶樣品與溶菌酶包合物以1 1 3的比例混合均勻，即得一種飼用添加 劑樣品，分別按照0. 5%,0. 25%和0. 05%的添加量混入到配合飼料(未添加任何抗生素) 中，攪拌均勻。將溶菌酶樣品與溶菌酶包合物分別以1 1，1 2，1 3的比例混合均勻，即得 一種飼用添加劑樣品，通過對胃蛋白酶的耐受性實驗，確定溶菌酶和溶菌酶包合物合適的 組成比例。準確稱取一定量的胃蛋白酶，溶解于5mL檸檬酸-磷酸鹽緩沖溶液中(1. Omg/ mL, pH2. 0)，然后分別取溶菌酶和溶菌酶包合物不同比例組成的飼用添加劑樣品，于37°C， IOOrpm振蕩溶解2h后，取一定量上清液，用緩沖溶液稀釋100倍后，按照溶菌酶活力的測 定方法，檢測各樣品的酶活，同時設(shè)立對照組，即以未經(jīng)胃蛋白酶處理的添加劑的酶活為 100%，其余經(jīng)過處理的酶活力與之相比得到的百分比即為該樣品的相對剩余酶活。在pH 2.0 5.0的酸性范圍內(nèi)，經(jīng)胃蛋白酶處理2h后，溶菌酶樣品與溶菌酶包合 物按照不同比例組成的飼用添加劑對胃蛋白酶表現(xiàn)出較好的耐受性，相對剩余酶活均始終 保持在80%以上；尤其是按照1 2比例組成的飼用添加劑，在pH 2. 0保溫2h后相對剩余酶活為 98%，說明溶菌酶包合物對胃蛋白酶具有較強的耐受性，穩(wěn)定性得到了明顯提高。所述溶菌酶樣品與溶菌酶包合物按照1 2比例組成的飼用添加劑，分別按照 0. 05% -0. 5%的添加量混入到配合飼料中，攪拌均勻。說明此比例組成的飼用添加劑能夠順利通過胃的強酸環(huán)境，酶活損失減少，酶的 作用時間得到延長，可以在腸道內(nèi)發(fā)揮作用，提高生物利用率。
具體實施例方式為了使本發(fā)明的技術(shù)手段、創(chuàng)作特征、達成目的與功效易于明白了解，下面結(jié)合具 體實施例，進一步闡述本發(fā)明。(一 )溶菌酶包合物的制備及穩(wěn)定性(1)溶菌酶包合物的制備采用密封加熱法，將溶菌酶樣品和環(huán)糊精混合，溫度控制在40-90°C，包合時間為 l-3h。其中，溶菌酶的用量為5-90%，環(huán)糊精的用量為10-95% (按重量計)，即得成品包合物。(2)溶菌酶包合物的酶活精密稱取包合物0. Olg溶于PBS (pH6. 2)的緩沖溶液中，充分搖勻后，取一定量溶 液用PBS緩沖液稀釋100倍備用；同時以溶菌酶與環(huán)糊精直接混合后的混合物作為對照組， 按照溶菌酶酶活的測定方法，檢測包合物的酶活。表1溶菌酶包合物穩(wěn)定性的實驗結(jié)果
權(quán)利要求
一種制備環(huán)糊精溶菌酶包合物的方法，其特征在于，將溶菌酶與環(huán)糊精混合，采用密封加熱法，將溶菌酶和環(huán)糊精混合，溫度控制在40 90℃，包合時間為1 3h，制得溶菌酶包合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種制備環(huán)糊精溶菌酶包合物的方法，其特征在于，按重量 百分比計，所述溶菌酶的用量為5-90%，環(huán)糊精的用量為10-95%，制得溶菌酶包合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種制備環(huán)糊精溶菌酶包合物的方法，其特征在于，所述溶 菌酶包合物高溫下仍然保持著較高的酶活，在100°C時保留20min后，殘留酶活在83%以 上。
4.一種環(huán)糊精溶菌酶包合物制備的飼料添加劑，其特征在于，將溶菌酶與溶菌酶包合 物以重量比1 1-3的比例混合均勻制得。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的飼料添加劑，其特征在于，所述溶菌酶與溶菌酶包合物的重 量比為1 2。
6.一種環(huán)糊精溶菌酶包合物在配合飼料中的應(yīng)用，其特征在于，將溶菌菌酶與溶菌酶 包合物以重量比1 1-3的比例混合均勻，即得一種飼用添加劑，分別按照0.05%-0.5% 的添加量混入到配合飼料中，攪拌均勻。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述溶菌酶與溶菌酶包合物的重量比為 1 2。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述飼用添加劑在pH2.0保溫2h后相對 剩余酶活為98%，對胃蛋白酶具有較強的耐受性。
全文摘要
一種制備環(huán)糊精溶菌酶包合物的方法及制備的飼料添加劑、及該包合物在配合飼料中的應(yīng)用。包合物的制備方法為將5-90％的溶菌酶和10-95％的環(huán)糊精(按重量計)混合，40-90℃，包合1-3h即得；經(jīng)環(huán)糊精包合后的溶菌酶的耐熱性得到了顯著提高。該方法溶菌酶包合物制備過程中加入極少量或根本不加水；不需加入任何有機溶劑，無溶劑殘留，后處理方便；工藝簡便，包合速度快。然后將溶菌酶和溶菌酶的包合物按照1∶1-3的比例組成一種飼用添加劑；該溶菌酶和包合物組成的飼用添加劑對胃蛋白酶都有較好的耐受性，且按照0.05％-0.5％的添加量混入到配合飼料中，攪拌均勻后，體外抑菌效果非常明顯。
文檔編號A23K1/165GK101988054SQ200910055869
公開日2011年3月23日 申請日期2009年8月4日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月4日
發(fā)明者季春源, 方華, 李旺軍 申請人:上海源耀生物科技有限公司