專利名稱：重組彈狀病毒作為免疫缺陷病毒的活病毒疫苗的制作方法
政府對本發(fā)明的權(quán)利本發(fā)明的一部分是在國家健康學(xué)院(the National Institute of Health)授予的AI44340的贈(zèng)款的政府支持下完成的。政府對本發(fā)明有某些權(quán)利。相關(guān)申請的相互參照本申請要求的優(yōu)先權(quán)，部分是根據(jù)35U.S.C§120，以2000年1月28日提交的美國非臨時(shí)性09/494,262的申請為基礎(chǔ)的。
在發(fā)達(dá)國家，抗人HIV-1的新的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒策略引起了感染人群死亡率的顯著降低。但是一種成功的防止感染的疫苗的開發(fā)仍舊是終止HIV-1傳染病的主要目標(biāo)。平均每10秒鐘，有一個(gè)人感染HIV-1，而且在非洲嚴(yán)重感染的國家里，如贊比亞，烏干達(dá)，幾乎40％的年輕成年人是HIV-1血清陽性。(1)目前，正在研究各種HIV疫苗策略，包括重組蛋白(Goebel，F(xiàn).D.等人，European Mutinational IMMUNO AIDS Vaccine Study Group Aids，5643-50，1999；Quinnan，G.V.，Jr.，等人，AIDS Research & Human Retroviruses，15561-70，1999；Vancott，T.C.，等人，J.Virol.，734640-50，1999)，肽(Bekyakov，I.M.，等人，Journal of Clinical Investigation，1022072-81，1998；Berzofsky，J.A等人，Immunological Reviews，170151-72.1999；Pinto，L.A.等人，AIDS，132003-12，1999)，裸DNA(Bagarazzi，M.L.，等人，1999，Journal of Infections Diseases，1801351-5，1999；Barouch，D.H.等人，Science，290486-492，2000；Cafaro，A.，等人，Nature Medicine，5643-50，1999；Lu，S.，等人，AIDS Research & Human Retroviruses 14151-5，1998；Putkonen，P.，等人，Virology，250293-301，1998；Robinson，H.L.，Aids，11S109-19，1997；Weiner，D.B.和R.C.Kennedy，Scientific American，28150-7，1999。)有復(fù)制能力的與非復(fù)制的(復(fù)制子)活的病毒載體(Berglund，P.，等人，AIDS Research & Human Retroviruses，131487-95，1997；Mossman，S.P.等人，J.Virol.，701953-60，1996；Natuk，R.J.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，897777-81，1992；Ourmanov，I.，等人，J.Virol.，742740-2751，2000；Schnell，M.J.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，973544-3549，2000。)，和初次免疫-強(qiáng)化免疫聯(lián)合(參見(5)的綜述)。大量的這些疫苗策略已經(jīng)在類人猿的免疫缺陷病毒(SIV)獼猴模型系統(tǒng)中進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，但是到目前為止，盡管觀察到一些疾病的改善，但還沒有獲得有效的保護(hù)性的免疫。(Barouch，D.H.等人，Science，290486-492，2000；David，N.L.等人，J.Virol.，74371-8，2000；Ourmanov，I.，等人，J.Virol.，742740-2751，2000)。到目前為止，保護(hù)獼猴免受SIV感染僅有的有效方法是使用活的、減毒的SIV。Desrosiers和同事闡明在恒河猴中不會(huì)引起疾病的一個(gè)遺傳上修飾的，nef-缺失的SIV株系誘導(dǎo)了高滴度的抗SIV的抗體和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)活性。(Daniel，M.D.等人，Science，258，1938-1941，1992；Kestler，H.W.等人，Cell，65651-662，1991.)。隨后用一個(gè)感染劑量的病原SIV株系激發(fā)免疫的動(dòng)物產(chǎn)生了防止感染的作用。(Daniel，M.D.等人，Science，2581938-1941，1992)。應(yīng)用減毒的慢病毒疫苗方法的一個(gè)主要缺陷是即使nef-缺陷的SIV能在新生的和成年的獼猴中產(chǎn)生一個(gè)類似艾滋病的疾病。(Baba，T.W.等人，Science，2671820-5，1995；Baba，T.W.等人，Nature Medicine，5194-203，1999；Desrosiers，R.C.AIDS Research & Human Retroviruses，10331-2，1994.)。最近發(fā)現(xiàn)關(guān)于減毒的慢病毒應(yīng)用的另一個(gè)影響，即在一些情況下激發(fā)病毒與活的、減毒的SIV重組甚至產(chǎn)生致命的毒株。(Gundlach，B.R.等人，J.Virol.，743537-3542，2000.)。然而，結(jié)果表明活的病毒載體可能是一個(gè)HIV-1疫苗的優(yōu)秀疫苗候選對象。
因?yàn)樯鲜鲈?，一種當(dāng)口服或肌肉給藥時(shí)，對于廣泛的動(dòng)物物種非致病性的，同時(shí)能夠誘導(dǎo)所需要的中和抗體和CTL反應(yīng)的保護(hù)性免疫缺陷病毒疫苗的開發(fā)存在巨大的需求。
所需的抵抗HIV-1感染的免疫應(yīng)答目前是未知的，但是對HIV-1的保護(hù)性的免疫應(yīng)答可能需要免疫系統(tǒng)的兩個(gè)主要途徑。最近關(guān)于用重組HIV-1外殼蛋白的疫苗方法的報(bào)道表明一個(gè)專有的體液應(yīng)答不足以抵抗HIV-1感染，但是定向抵抗HIV-1外殼蛋白的三個(gè)單克隆抗體的被動(dòng)轉(zhuǎn)移，對于隨后用致病性的HIV-1/SIV嵌合病毒激發(fā)的獼猴產(chǎn)生了保護(hù)作用。(Mascola，J.R.等人，NatureMedicine，6207-10，2000.)。其它的研究表明，細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答在控制HIV-1感染中起了重要的作用。(Brander，C.和B.D.Walker，Current Opinion inImmunology，11451-9 1999；Goulder，P.J.等人，Anti-HIV cellularimmunityrecent advances towards vaccine design Aids，13S121-36，1999.)。暴露但沒有被感染的個(gè)體常常有特異性的HIV-1的CTLs，但沒有可檢測到的抗HIV-1的抗體。(Pinto，L.A.，等人，Journal of ClinicalInvestigation，96867-76，1995；Rowland-Jones，S.L.，等人，Journal ofClinical Investigation，1021758-65，1998。)。
在本發(fā)明中，公開了表達(dá)一個(gè)免疫缺陷病毒基因的重組的非片段性負(fù)鏈RNA病毒做為一個(gè)免疫缺陷病毒疫苗(例如，HIV-1疫苗)的能力。尤其是，闡明了誘導(dǎo)抗HIV免疫應(yīng)答的以彈狀病毒為基礎(chǔ)的重組病毒的能力。在鼠中用重組HIV-1蛋白強(qiáng)化劑(gp120)單一的強(qiáng)化免疫后，HIV-1外殼蛋白被穩(wěn)定和功能性地表達(dá)，而且誘導(dǎo)一個(gè)定向抵抗HIV-1外殼蛋白的強(qiáng)烈的體液應(yīng)答。而且，在鼠的血清中，可檢測到高的抗HIV-1的中和滴度。(Schnell，M.J.，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，973544-3549，2000.)。對彈狀病毒為基礎(chǔ)的載體表達(dá)外源蛋白的CTL應(yīng)答的誘導(dǎo)方面，幾乎沒有可用的信息。本發(fā)明完成了這個(gè)長期探索的需要，而且進(jìn)一步涉及到表達(dá)HIV-1外殼蛋白以誘導(dǎo)HIV-1特異性的CTLLs的重組RV疫苗。特別地，單一接種本發(fā)明的HIV-1病毒疫苗可誘導(dǎo)出對HIV-1蛋白特異性穩(wěn)定的和長期持久的記憶性CTL應(yīng)答。當(dāng)口服或肌肉給藥時(shí)，這個(gè)重組病毒對廣泛的動(dòng)物物種是無致病性的。在一個(gè)特定的具體實(shí)施例中，當(dāng)HIV-1 gp160(株系NL4-3 and 89.6)的編碼區(qū)被克隆到RV轉(zhuǎn)錄終止/起始信號控制下的RV糖蛋白(G)和聚合酶(L)蛋白間時(shí)，由此產(chǎn)生了表達(dá)HIV-1gp160，同時(shí)表達(dá)其它RV蛋白的重組的RVs。定義“強(qiáng)化疫苗載體”是“強(qiáng)化病毒”“強(qiáng)化病毒”是“強(qiáng)化疫苗載體”
總而言之，本發(fā)明是一種重組的非片段性負(fù)鏈RNA病毒載體，包括(a)一個(gè)修飾的負(fù)鏈RNA病毒基因組，它被修飾成有一個(gè)或更多新的限制性位點(diǎn)，或沒有被修飾而有一個(gè)或更多個(gè)以其它方式出現(xiàn)在基因組中的基因；(b)一個(gè)新的轉(zhuǎn)錄單元，它被插入到修飾的負(fù)鏈RNA病毒基因組中表達(dá)異種核酸序列；和(c)一個(gè)異種的病毒核酸序列，它被插入到新的轉(zhuǎn)錄單元中，其中重組的非片段性的負(fù)鏈RNA病毒載體是有復(fù)制能力的，而且異種的病毒核酸序列編碼一個(gè)抗原性多肽。
特別地，在本發(fā)明的一個(gè)具體的實(shí)施例中，作為活病毒疫苗的重組非片段性負(fù)鏈RNA病毒是一個(gè)重組的彈狀病毒載體。該載體包括(a)一個(gè)修飾的彈狀病毒基因組；(b)一個(gè)新的轉(zhuǎn)錄單元，它被插入到彈狀病毒基因組中表達(dá)異種核酸序列；(c)一個(gè)異種病毒核酸序列，它被插入到新的轉(zhuǎn)錄單元中，其中重組的彈狀病毒載體是有復(fù)制能力的，而且異種的病毒核酸序列編碼一個(gè)抗原性多肽。修飾的彈狀病毒基因組是，例如，修飾的狂犬病毒基因組或一個(gè)修飾的水泡性口炎病毒基因組。在彈狀病毒基因組中的修飾包括新的限制性位點(diǎn)的制造和/或一個(gè)或更多個(gè)基因，如彈狀病毒的天然的G(糖蛋白)基因，狂犬病毒的Ψ基因等的缺失。在一些情況下，修飾的彈狀病毒基因組有一個(gè)進(jìn)一步的修飾，由來源于另一種病毒的糖蛋白取代了天然的糖蛋白。來源于另一種病毒的糖蛋白是水泡性口炎病毒糖蛋白。在一些其它的情況下，修飾的狂犬病毒基因組有一個(gè)第三次修飾以和結(jié)構(gòu)基因有一個(gè)毗連，這和第二次修飾后彈狀病毒基因組的結(jié)構(gòu)基因是不同的。
用在這里的術(shù)語異種病毒核酸指的是編碼誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的抗原多肽的病毒核酸。例如，一個(gè)全長HIV外殼蛋白，HIV gp160，HIV gag，HIV gp120，和全長SIV外殼蛋白是抗原性多肽的一部分，這些抗原多肽是在本發(fā)明的重組病毒載體中被表達(dá)的。用在這里的術(shù)語異種病毒核酸在一個(gè)重組的彈狀病毒中不包括一種或更多種的彈狀病毒的天然的基因序列，如在重組的RV中的VSV G基因。
在修飾的彈狀病毒基因組的G基因被刪除情況下，在克隆到修飾的彈狀病毒基因組之前，彈狀病毒G基因的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的序列和其它的序列融合。一個(gè)這樣的例子是嵌合的VSV/RV糖蛋白，其中的融合蛋白有VSV的外功能結(jié)構(gòu)域，跨膜的結(jié)構(gòu)域和RV的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。另一個(gè)這樣的例子是嵌合的HIV-1/RV糖蛋白，其中的融合蛋白有HIV-1 gp160的外功能結(jié)構(gòu)域，跨膜的結(jié)構(gòu)域和RV的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。因此，在一些情況下，異種的病毒核酸被融合到修飾的彈狀病毒基因組G基因的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的序列中，產(chǎn)生一個(gè)嵌合蛋白，以至于由此產(chǎn)生的嵌合蛋白在異種蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域和糖蛋白的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域間有一個(gè)融合。在一些情況下，重組的彈狀病毒的糖蛋白基因被刪除，而且異種的病毒核酸被融合到修飾的彈狀病毒基因組G基因的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的序列中，產(chǎn)生一個(gè)嵌合蛋白，這個(gè)嵌合蛋白在功能上取代了重組的彈狀病毒糖蛋白基因。
在本發(fā)明的另一個(gè)具體的實(shí)施例中，提供了一個(gè)表達(dá)功能性的HIV外殼蛋白的重組的彈狀病毒。重組的彈狀病毒有復(fù)制能力。彈狀病毒可以是重組的狂犬病毒或重組的水泡性口炎病毒。
重組的彈狀病毒表達(dá)的HIV外殼蛋白來源自任何一種HIV-1分離菌。
在本發(fā)明的另一個(gè)具體的實(shí)施例中，提供了一個(gè)重組的Ψ基因缺陷的彈狀病毒，它有一個(gè)編碼免疫缺陷病毒外殼蛋白或其亞基的異種的核酸片段。在這種情況下，重組的Ψ基因缺陷的彈狀病毒是狂犬病毒，而且免疫缺陷病毒外殼蛋白，或是其亞基，是來源于人類的免疫缺陷病毒或類人猿的免疫缺陷病毒。免疫缺陷外殼蛋白的亞基或一個(gè)片段包括僅含有外殼蛋白的連續(xù)核酸的一部分的片段。這些亞基或片段包括，例如，HIV gp120，HIV gp41，HIV gp40，被HIVNL4-3和HIV89.6表達(dá)的外殼蛋白，及其它免疫缺陷病毒的亞基。
而且在本發(fā)明的另一個(gè)具體的實(shí)施例中，提供了在哺乳動(dòng)物中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法。這個(gè)方法包括的步驟如下(a)將重組彈狀病毒載體遞送到哺乳動(dòng)物組織，這個(gè)重組彈狀病毒載體表達(dá)一個(gè)功能性的免疫缺陷病毒外殼蛋白，或其亞基，有效的誘導(dǎo)對外殼蛋白的免疫應(yīng)答；(b)在體內(nèi)表達(dá)外殼蛋白或其亞基；(c)通過在佐劑中遞送一個(gè)有效地劑量的分離的免疫缺陷病毒外殼蛋白或其亞基，或通過遞送一個(gè)有效的劑量的強(qiáng)化疫苗載體，強(qiáng)化動(dòng)物；和(d)誘導(dǎo)一個(gè)中和抗體應(yīng)答和/或長期持久細(xì)胞免疫應(yīng)答，以保護(hù)哺乳動(dòng)物抵抗免疫缺陷病毒。
重組的彈狀病毒有一個(gè)狂犬病毒基因組。在方法中，用的是Ψ基因缺陷的狂犬病毒基因組。在一些情況下，狂犬病毒基因組的狂犬病毒糖蛋白基因也是缺陷的或狂犬病毒基因組有一個(gè)來自于另一種彈狀病毒糖的蛋白基因，代替了狂犬病毒糖蛋白。強(qiáng)化免疫動(dòng)物可以通過給一個(gè)有效劑量的強(qiáng)化疫苗載體代替分離的免疫缺陷病毒外殼蛋白完成。
在本發(fā)明的另一個(gè)具體的實(shí)施例中，提供了一個(gè)與佐劑一起的免疫性組合物，它包括上述的重組彈狀病毒的任一個(gè)。
然而在本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施例中，提供了在哺乳動(dòng)物中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法，包括以下步驟(a)給一個(gè)非片段性的負(fù)鏈RNA病毒到哺乳動(dòng)物組織，這個(gè)病毒表達(dá)一個(gè)功能性的免疫缺陷病毒外殼蛋白，或它的一個(gè)亞基，誘導(dǎo)對于外殼蛋白的免疫應(yīng)答是有效的；(b)在體內(nèi)表達(dá)外殼蛋白或其亞基；(c)通過給在一個(gè)佐劑中的一個(gè)分離的免疫缺陷病毒外殼蛋白或其亞基的有效地劑量或通過給一個(gè)強(qiáng)化疫苗載體的有效的劑量，強(qiáng)化免疫動(dòng)物；而且(d)誘導(dǎo)一個(gè)中和抗體應(yīng)答和/或長期持久細(xì)胞免疫應(yīng)答，以保護(hù)哺乳動(dòng)物抗免疫缺陷病毒。
使用非片段性負(fù)鏈RNA病毒的方法包括狂犬病毒或水泡性口炎病毒。
本發(fā)明的進(jìn)一步的目的是提供治療被免疫缺陷病毒感染的哺乳動(dòng)物的方法。將表達(dá)功能性的免疫缺陷病毒外殼蛋白，或其亞基的一個(gè)非片段性的負(fù)鏈RNA病毒用于哺乳動(dòng)物。這個(gè)RNA病毒將表達(dá)一個(gè)功能性的免疫缺陷病毒外殼蛋白，或其亞基。通過佐劑將有效劑量的分離的免疫缺陷病毒外殼蛋白或其亞基，或?qū)⒂行┝康膹?qiáng)化疫苗載體遞送給哺乳動(dòng)物，因此誘導(dǎo)一個(gè)對于功能性的免疫缺陷病毒外殼蛋白或其亞基的中和抗體應(yīng)答和/或長期持久的細(xì)胞免疫應(yīng)答。在一個(gè)具體實(shí)施例中，免疫缺陷病毒是任一個(gè)HIV-1病毒。在另一個(gè)具體實(shí)施例中，非片段性負(fù)鏈RNA病毒是一個(gè)彈狀病毒。在一個(gè)進(jìn)一步的具體實(shí)施例中，有一個(gè)對于功能性的免疫缺陷病毒外殼蛋白或其亞基的粘膜免疫的誘導(dǎo)。在另一個(gè)具體實(shí)施例中，長期持久的細(xì)胞應(yīng)答是一個(gè)交叉反應(yīng)性CTL應(yīng)答，其中交叉反應(yīng)性CTL是定向抵抗來自于不同免疫缺陷病毒系的外殼蛋白，或其亞基。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供保護(hù)哺乳動(dòng)物抵抗免疫缺陷病毒感染的一個(gè)方法。表達(dá)功能性的免疫缺陷病毒外殼蛋白，或其亞基的一個(gè)非片段性的負(fù)鏈RNA病毒被用于藥哺乳動(dòng)物。這個(gè)RNA病毒將表達(dá)一個(gè)功能性的免疫缺陷病毒外殼蛋白，或其亞基。因此誘導(dǎo)出對功能性的免疫缺陷病毒外殼蛋白或其亞基的中和抗體應(yīng)答和/或長期持久的細(xì)胞免疫應(yīng)答。在一個(gè)具體實(shí)施例中，免疫缺陷病毒是任一個(gè)HIV-1病毒。在另一個(gè)具體實(shí)施例中，非片段性的負(fù)鏈RNA病毒是一個(gè)彈狀病毒。在一個(gè)進(jìn)一步的具體實(shí)施例中，有一個(gè)對功能性的免疫缺陷病毒外殼蛋白或其亞基的粘膜免疫的誘導(dǎo)。在另一個(gè)具體實(shí)施例中，長期持久的CTL應(yīng)答是一個(gè)交叉反應(yīng)性CTL應(yīng)答，其中交叉反應(yīng)性CTL是定向抵抗來自于不同免疫缺陷病毒系的外殼蛋白，或其亞基。
附圖的簡要說明

圖1.圖示說明重組RV基因組的構(gòu)建方法。
圖2.是一個(gè)曲線圖，表明被重組RVs(SBN，SBN-89.6和SBN-NL4-3)感染的BSR細(xì)胞的一步生長曲線。
圖3.表達(dá)HIV-1 gp160的重組狂犬病毒(RVs)的蛋白印跡(Western blot)分析。
圖4.一個(gè)合成的照片，表示這些細(xì)胞被SBN，SBN-89.6和SBN-NL4-3感染(用1 MOI)后的Sup-TI細(xì)胞。
圖5.是一個(gè)曲線圖，表示鼠的抗HIV-1 gp120血清的ELISA活性。
圖6.是對HIV-1抗原的鼠血清抗體應(yīng)答的蛋白印跡(Western blot)分析。
圖7.是外源病毒糖蛋白和以RV為基礎(chǔ)的表達(dá)載體的構(gòu)建方法的圖解表示。
圖8.是全長和表達(dá)HIV-1 gp160的缺失RVs的RV糖蛋白的構(gòu)建方法的一個(gè)圖解表示。
圖9.是來源于免疫鼠的HIV-1 gp160的CTLs誘導(dǎo)長期持久特異性的HIV-1gp160 CTLs。每組三只6-8周齡雌性BALB/c鼠(Harlan-Sprague)，用2×107個(gè)表達(dá)HIV-1NL4-3外殼蛋白的重組RV的集落形成單位腹膜接種。單一接種后105到135天，無菌切除脾臟，制備單細(xì)胞懸浮液(見下文)。制備刺激細(xì)胞(見下文)，然后以3∶1的比率加回到效應(yīng)細(xì)胞群中。通過釋放的51Cr的百分?jǐn)?shù)的測定確定培養(yǎng)的CTLs的溶細(xì)胞活性(下文)。
圖10.是表達(dá)異種HIV-1外殼蛋白的HIV-1 gp160免疫鼠的交叉滅活的靶細(xì)胞的CTLs。每組6只6-8周齡雌性BALB/c鼠，用2×107個(gè)來源于NL4-3(A)或89.6(B)株系的表達(dá)HIV-1外殼蛋白的集落形成單位的重組RV腹膜接種。單一接種后3到4周，無菌切除脾臟，在體外用表達(dá)異種HIV-1外殼蛋白(見下文)的牛痘病毒刺激脾細(xì)胞。用來源于NL4-3(vCB41)，89.6(vBD3)，JR-FL(VCB28)或Ba-L(vCB43)株系的表達(dá)HIV-1外殼蛋白的牛痘病毒感染制備靶細(xì)胞。完成了鉻釋放檢測(見下文)。結(jié)果如兩個(gè)不同的獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)所示。
圖11.溶細(xì)胞活性是被CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的。每組3只6-8周齡雌性BALB/c鼠進(jìn)，用2×107個(gè)來源于NL4-3株系的表達(dá)HIV-1外殼蛋白集落形成單位的重組RV腹膜接種。單一接種18周后，無菌切除脾臟，在體外用表達(dá)HIV-1NL4-3外殼蛋白(見下文)的牛痘病毒刺激脾細(xì)胞。體外刺激7天后，CD8+T細(xì)胞被從細(xì)胞培養(yǎng)物(CD8-)中排除，而且用Dynabeads Mouse CD8(Lyt2)富集，如制造商所說明的一樣。在CD8 T細(xì)胞的排除培養(yǎng)物(CD8-)或富集培養(yǎng)物(CD8+)，或沒有處理的培養(yǎng)物(CD8+/CD8-)中完成鉻釋放檢測(見下文)。用來源于NL4-3(vCB41)株系表達(dá)HIV-1外殼蛋白的牛痘病毒感染制備靶細(xì)胞(見下文)。背景水平相相當(dāng)于或低于特異性溶解的6％。
發(fā)明的詳細(xì)說明彈狀病毒，如狂犬病毒和水泡性口炎病毒，是彈狀病毒屬家族的成員?？袢《居幸粋€(gè)大約12kb的負(fù)鏈RNA基因組。這個(gè)基因組被有標(biāo)準(zhǔn)的組織，和水泡性病毒(VSV)基因組相似。這些彈狀病毒編碼5個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白。編碼病毒結(jié)構(gòu)蛋白的5個(gè)開放閱讀框架是核蛋白(N)，磷蛋白(P)，基質(zhì)蛋白(M)，糖蛋白(G)和聚合酶(L)。感染后，病毒的聚合酶-復(fù)合物(P和L)在衣殼化基因組的3’末端開始轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生了一個(gè)短的前導(dǎo)RNA，它的后面接著是5個(gè)病毒RNAs的序列合成。核蛋白(N)，磷蛋白(P)，病毒聚合酶(L)，和基因組RNA形成了一個(gè)螺旋形的核糖核酸蛋白復(fù)合物(RNP)。核糖核酸蛋白復(fù)合物(RNP)被宿主細(xì)胞衍生的外殼膜和跨膜糖蛋白(G)所包圍，其中，這個(gè)外殼膜在細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)含有基質(zhì)蛋白(M)，這個(gè)跨膜糖蛋白介導(dǎo)病毒結(jié)合到在細(xì)胞膜上的特定的受體上。
發(fā)明人曾經(jīng)報(bào)道了非片段性負(fù)鏈RNA病毒的產(chǎn)生完全是來源于cDNA。(Schnell等人，EMBO，134195-4203，1994)。這個(gè)方法涉及到在細(xì)胞中抗基因組RNA的細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，也表達(dá)對一個(gè)活性的RNP復(fù)合物形成所需的病毒蛋白，即，核蛋白(N)，磷蛋白(P)，病毒聚合酶(L)。這個(gè)方法避免了當(dāng)表達(dá)非衣殼化的負(fù)鏈基因組的RNAs，和正鏈mRNAs時(shí)遇到的反義問題，而且同樣的方法后來也成功地用于另一個(gè)彈狀病毒，VSV的恢復(fù)。(Lawso等人，PNAS，USA，924477-81，1995)。
在本發(fā)明中，產(chǎn)生大量的重組的彈狀病毒載體，并被用于表達(dá)功能性基因，包括全長HIV-1外殼蛋白。從本發(fā)明的重組彈狀病毒載體中，所有的對于中和抗體，細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)及抗體依賴性細(xì)胞的細(xì)胞毒性的主導(dǎo)抗原決定簇是一次被表達(dá)的。以下章節(jié)說明表達(dá)HIV或SIV或其它病毒基因的不同的重組彈狀病毒的構(gòu)建。
重組彈狀病毒表達(dá)載體構(gòu)建表達(dá)異種基因或基因序列的以彈狀病毒為基礎(chǔ)和具有復(fù)制能力的幾個(gè)不同的重組表達(dá)載體。在本發(fā)明的一個(gè)方面中，構(gòu)建一個(gè)帶有自身的糖蛋白的表達(dá)載體。這個(gè)重組表達(dá)載體基因組可以表示如3’-N-P-M-G-X-L-5’，其中X是外源基因(例如HIV-1 160gp，HIV-1 gag，或任何其它的HIV-1基因，任何SIV，IIIV-2，肝炎C基因，或任何其它病毒抗原)(參看圖1)。X可以被克隆在不同的基因位點(diǎn)以調(diào)節(jié)表達(dá)水平。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面，構(gòu)建了含有來源于另一個(gè)病毒或另一個(gè)病毒血清型的糖蛋白的表達(dá)載體(參看圖7，有VSV糖蛋白的RV載體示例)。這個(gè)載體被用做強(qiáng)化病毒誘導(dǎo)更強(qiáng)的免疫應(yīng)答。這個(gè)重組表達(dá)載體的基因組表示如下3’-N-P-M-G(來源于另一個(gè)病毒或病毒血清)-X-L-5’(例如，來源于印第安納州VSV血清型的3’-NP-M-G)-X-L-5’)，其中X是特異性的外源基因(例如，HIV-1 gp160，HIV-1 gag，或任何其它的HIV-1基因，任何SIV或HIV-2基因或任何其它病毒抗原)。X可以被克隆在不同的基因位點(diǎn)以調(diào)節(jié)表達(dá)水平。本發(fā)明涉及表達(dá)HIV-1gp160的重組RVs(狂犬病毒)的構(gòu)建，其中RV糖蛋白(G)用嵌合的水泡性口炎病毒(VSV)G/RV-細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域(印地安那或新澤西的血清型)的糖蛋白代替。需要指出的是，這個(gè)方法不限定于VSV糖蛋白。因?yàn)閺棤畈《驹谒牟《绢w粒上僅有一個(gè)單一的表面蛋白，嵌合的RV/VSV病毒沒有被抗RV G的體液應(yīng)答中和，因此允許一個(gè)第二次生產(chǎn)性的感染。重組嵌合RV/VSV的用途在于可以被用于顯示在感染細(xì)胞表面合適地折疊的HIV-1外殼蛋白。另外，RV核蛋白的重復(fù)的表達(dá)，以前被表明是一個(gè)外源的超抗原(Lafon等人，Nature，358，507-10，1992；Lafon，M.Research in Immunology，144209-13，1993)，可能有助于增強(qiáng)抗HIV-1外殼蛋白的免疫應(yīng)答。對于狂犬病毒(RV)，RV糖蛋白的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域被融合到外源的糖蛋白中。
應(yīng)該指出的是，在重組基因組中的所有的基因可以被重新安排以便對病毒減毒或增強(qiáng)外源基因的轉(zhuǎn)錄。例如，一個(gè)帶有重新安排基因組的重組RV，VSV糖蛋白，和HIV-1 gp160(X)可以被構(gòu)建成3’-X-N-P-G(VSV血清型NJ)-M-L-5’。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面，構(gòu)建了一個(gè)重組表達(dá)載體(或是RVs，或是VSVs)，它含有一個(gè)取代了自身糖蛋白的外源性糖蛋白，進(jìn)入特定的宿主細(xì)胞，例如，為了誘導(dǎo)一個(gè)更強(qiáng)的免疫應(yīng)答而模擬其它病毒(例如，HIV-1，肝炎C)的嗜性(圖8)。這種構(gòu)建可以被表示成3’-N-P M-HIV-1-gp160-L.另外，可選擇地，這些構(gòu)建可以有它們自己的糖蛋白(例如，3’-N-P-M-HIV-1-gp160-G-L.)。而且，應(yīng)該指出的是，在重組基因組內(nèi)的所有的基因可以重新安排以使病毒減毒或增強(qiáng)外源基因的轉(zhuǎn)錄。產(chǎn)生了表達(dá)人CD4和CXCR4的轉(zhuǎn)基因的鼠，以分析在體內(nèi)表達(dá)HIV-1gp160/RVG的與G相關(guān)的RVs的免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面，構(gòu)建了有多個(gè)抗原和多個(gè)轉(zhuǎn)錄終止/起始信號的重組表達(dá)載體(或是RV，或是VSV)。這種構(gòu)建被表示成3’-N-P-M-G-X-Y-L-5’，其中X和Y是異種基因。例如，X可以是HIV-1 gp160而且Y可以是HIV-1 gag。一個(gè)可選的構(gòu)建可以是3’-N-Z-P-M-G-X-Y-L-5’，其中，例如，X可以是HIV-1gp160，Y可以是HIV-1 gag，而且Z可以是HIV-1 tat。
HIV-1病毒疫苗在一個(gè)優(yōu)選的具體實(shí)施例中，描述以重組狂犬病毒載體為基礎(chǔ)的一種免疫缺陷病毒疫苗。狂犬病毒(RV)是彈狀病毒屬家族的負(fù)鏈RNA病毒，它有一個(gè)編碼5個(gè)結(jié)構(gòu)基因蛋白的相對簡單的，可調(diào)節(jié)的基因組織(見上文和Conzelmann，等人，Virology，175485-99，1990.)。本發(fā)明涉及一種以RV疫苗株系為基礎(chǔ)的載體，當(dāng)口服或肌肉給藥時(shí)，這種載體對廣泛的的動(dòng)物物種是無致病性的。這種載體顯示出的優(yōu)于其它病毒載體的優(yōu)點(diǎn)有幾個(gè)原因。首先，它的可調(diào)節(jié)基因組組織使得它的遺傳修飾比大多數(shù)較復(fù)雜DNA和正鏈RNA病毒更容易。其次，彈狀病毒有一個(gè)細(xì)胞質(zhì)復(fù)制循環(huán)，而且沒有重組和/或整合進(jìn)宿主細(xì)胞基因組的證據(jù)。(Rose，等人，Rhabdovirus genomes and their products，Plenum PublishingCorp.，New York，1997)。和大多數(shù)其它的病毒載體比較，人群對RV僅存在一個(gè)可忽略不計(jì)的血清陽性，而且用抗HIV-1以RV為基礎(chǔ)的載體免疫將不會(huì)干擾對載體自身的免疫。另外，RV在各種細(xì)胞系中可生長到109集落形成單位(FFU)的高滴度，而不殺死細(xì)胞，同一個(gè)致細(xì)胞病變的載體比較，這可能引起HIV-1基因更長的表達(dá)。
重組載體的產(chǎn)生下面構(gòu)建不同的重組狂犬病毒載體。構(gòu)建一個(gè)新的感染性的狂犬病毒(RV)載體，它有一個(gè)Ψ基因缺失(融合到G RNA的長a～400堿基的非編碼序列)和包含一個(gè)短的轉(zhuǎn)錄終止/起始信號(表達(dá)外源基因)和兩個(gè)單一的位點(diǎn)(BsiWI和NheI)的新的轉(zhuǎn)錄單元，以引入外源基因。這個(gè)載體也包含有RV糖蛋白的上游的一個(gè)SmaI位點(diǎn)，用于刪除RV糖蛋白基因(G)。這個(gè)載體被命名為RV-SBN。構(gòu)建了融合到RV G細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域(HIV-1gp160-RVG)的表達(dá)HIV-1gp160外功能和跨膜結(jié)構(gòu)域的RVs。嵌合的gp160/RVG蛋白被RV表達(dá)，而且結(jié)合到RV病毒顆粒中。在重組病毒的表面顯示一個(gè)外源外殼蛋白的重組病毒將誘導(dǎo)一個(gè)強(qiáng)烈的對該抗原的免疫應(yīng)答。
也產(chǎn)生了另一個(gè)RV載體，它和RV-SBN相同，但在RV G蛋白下游有一個(gè)另外的單一的PacI位點(diǎn)。這個(gè)載體被用于功能性地用VSV G或其它的病毒糖蛋白替代RV G。這個(gè)載體被命名為RV-SPBN和被用作一個(gè)強(qiáng)化疫苗載體或一個(gè)強(qiáng)化病毒。
如圖7所示，構(gòu)建了含有外源病毒糖蛋白的以狂犬病毒為基礎(chǔ)的表達(dá)載體，而且重組病毒被恢復(fù)。對于這個(gè)構(gòu)建，在M/G轉(zhuǎn)錄終止/起始序列的下游引入一個(gè)SmaI限制性酶切位點(diǎn)，而且在合成的轉(zhuǎn)錄終止/起始序列上游引入用于表達(dá)來源于RV載體的外源基因的PacI位點(diǎn)。這兩個(gè)位點(diǎn)(SamI/Pac)可以被用于用來源于其它病毒的糖蛋白代替RV糖蛋白。在圖7中，所示的一個(gè)嵌合VSV/RV糖蛋白(VSV外功能結(jié)構(gòu)域和跨膜結(jié)構(gòu)域，RV細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域)結(jié)合HIV-1是一個(gè)例子。然而，應(yīng)該指出的是，這個(gè)方法可以被應(yīng)用到在不同的彈狀病毒中的每個(gè)糖蛋白和外源抗原，如同一圖所示(糖蛋白是X，外源蛋白是Y)。
在另一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，產(chǎn)生了表達(dá)嵌合的gp160/RV G，而不表達(dá)RV G的重組RVs(缺失G的RVs)。這些缺失G的RVs同野生型的RV(感染宿主細(xì)胞)比較有一個(gè)不同的嗜性，而且僅能特異性地感染表達(dá)HIV-1受體人的CD4和HIV-1復(fù)合受體(例如，CXCR4或CCR5)中的細(xì)胞。
構(gòu)建和恢復(fù)全長的和RV糖蛋白缺失的重組的狂犬病RVs(圖8)。SamI和BsiWI限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)被用于刪除RV糖蛋白和將M/G轉(zhuǎn)錄終止/起始序列融合到HIV-1/RV嵌合糖蛋白中(HIV-1 gp160外功能結(jié)構(gòu)域和跨膜結(jié)構(gòu)域，RV細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域)。恢復(fù)的RV載體同HIV-1病毒復(fù)合是類似的，對于表達(dá)人CD4和適合的HIV-1復(fù)合受體的細(xì)胞是特異性的。應(yīng)該指出的是，這個(gè)方法可以應(yīng)用于支持被彈狀病毒感染的某些細(xì)胞型的每個(gè)糖蛋白。它也被用于表達(dá)另外的外源抗原(HIV-1 Gag，HIV蛋白酶，SIV蛋白，肝炎A，B或C蛋白，和其它病毒及非病毒的蛋白)。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面，構(gòu)建了含有所有上面聯(lián)合的重組具有復(fù)制能力的狂犬病毒表達(dá)載體。例如，有其它糖蛋白(特別是構(gòu)建強(qiáng)化疫苗)而無或有它自己的G，有基因組的重新安排，且表達(dá)來源于相同或不同病毒(例如，HIV-1 gp160和肝炎B)的多個(gè)病毒抗原的重組狂犬病毒載體。
產(chǎn)品，方法和組合物本發(fā)明提供了產(chǎn)品、組合物和治療病毒性疾病，尤其是HIV(AIDS)的評估方法和將本發(fā)明的重組彈狀病毒給予物體以提高其抵抗浸入病毒的免疫應(yīng)答，尤其是抵抗免疫缺陷病毒感染的方法。
誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法本發(fā)明的另一方面涉及在一個(gè)個(gè)體，尤其是哺乳動(dòng)物中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法，該方法包括用本發(fā)明的重組病毒接種和隨后用合適的重組蛋白強(qiáng)化個(gè)體，以產(chǎn)生足夠的抗體和/或T細(xì)胞免疫應(yīng)答保護(hù)個(gè)體抵抗感染，尤其是抵抗免疫缺陷感染，更優(yōu)選抵抗HIV-1和2的感染。也提供了可以減慢HIV復(fù)制的免疫應(yīng)答的方法。
本發(fā)明的另一個(gè)方面也涉及在一個(gè)個(gè)體中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法，這個(gè)方法包括將核酸載體，序列或核酶遞送給個(gè)體，以指導(dǎo)HIV外殼多肽，或片段和它的變異體的表達(dá)，以便在體內(nèi)表達(dá)HIV外殼多肽，或片段和它的變異體，達(dá)到誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，如產(chǎn)生抗體和/或T細(xì)胞免疫應(yīng)答的目的?？贵w和/或T細(xì)胞應(yīng)答包括，例如，不管疾病在個(gè)體內(nèi)已經(jīng)存在或不存在，都產(chǎn)生細(xì)胞因子T細(xì)胞或細(xì)胞毒性T細(xì)胞以保護(hù)個(gè)體，尤其是人類，抵抗病毒性疾病。應(yīng)用基因的一個(gè)例子是通過顆粒的包被或其它的方式促進(jìn)其進(jìn)入目標(biāo)細(xì)胞。這樣的核酸載體可以包括DNA、RNA，核酶，修飾的核酸，DNA/RNA雜交體，DNA蛋白復(fù)合物或RNA蛋白復(fù)合物。
誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的組合物本發(fā)明的進(jìn)一步的方面涉及一種免疫組合物，當(dāng)被引入個(gè)體，優(yōu)選人類時(shí)，具有誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的能力。被誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答是對于一個(gè)多聚核苷酸和/或由此編碼的多肽的，其中這個(gè)組合物包括本發(fā)明的重組彈狀病毒，它編碼和表達(dá)外源病毒蛋白的抗原，如HIV外殼蛋白或多肽。特別地，外源多肽包括抗原性和免疫性多肽。免疫應(yīng)答被用于治療或預(yù)防，而且采用了抗體免疫和/或細(xì)胞免疫，如由CTL或CD4+T細(xì)胞引起的細(xì)胞免疫的形式。
在本發(fā)明的進(jìn)一步的方面中，提供了可用于單細(xì)胞或多細(xì)胞有機(jī)體的包括本發(fā)明的彈狀病毒載體的組合物。
藥劑組合物本發(fā)明的彈狀病毒載體可以與沒有滅菌或滅菌的載體，或同細(xì)胞，組織或有機(jī)體一起使用的載體聯(lián)合使用，如適合于個(gè)體使用的藥物載體。這樣的組合物包括，例如，介質(zhì)添加劑或有效治療劑量的本發(fā)明的重組病毒和可藥用的載體或賦形劑。這樣的載體包括，但不限于，鹽，緩沖鹽、葡萄糖、水、甘油、乙醇和它們的組合物。處方應(yīng)適合給藥方式。本發(fā)明進(jìn)一步涉及診斷的和藥用的包裝和包括一個(gè)或更多個(gè)裝有一個(gè)或更多個(gè)本發(fā)明的上述組合物組分的容器的試劑盒。
本發(fā)明的重組載體可以單獨(dú)使用或和其它化合物，如治療用化合物聯(lián)合使用。
用藥方法藥用的組合物可以以任何有效、方便的方法給藥，包括，例如，靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)或皮內(nèi)的方法以及其它方法。用于治療或作為預(yù)防，活性因子以可注射組合物形式用于個(gè)體，例如以無菌水的分散體形式，優(yōu)選等滲分散。本發(fā)明的藥用組合物優(yōu)選通過注射給藥，以取得抵抗相關(guān)病毒病原體的系統(tǒng)的效果。
對于哺乳動(dòng)物的給藥，尤其是人類，本發(fā)明的活性組合物預(yù)期每日劑量水平為組合物中102FFU到108FFU病毒，或以體重計(jì)10μg/kg-10mg/kg重組蛋白。在任何情況下，醫(yī)生將確定最適合于個(gè)體的實(shí)際的劑量和治療期間，而且可能隨著年齡、體重和特定的個(gè)體的應(yīng)答而變化。上面的劑量是平均情況的一個(gè)例注。當(dāng)然可能存在一些個(gè)體的例子，較高或較低的劑量范圍是可取的，這些情況都屬于本發(fā)明的范圍。
疫苗組合物以可注射的形式使用是方便的。傳統(tǒng)的佐劑可以用于增強(qiáng)免疫應(yīng)答。免疫接種的合適單位劑量優(yōu)選每日給藥，而且可以有或無至少1周的間隔。用所示的劑量范圍，用本發(fā)明的組合物沒有觀察到妨礙給藥于合適的個(gè)體的毒理學(xué)副作用。
表達(dá)HIV-1外殼蛋白的重組RV載體在一個(gè)優(yōu)選的具體實(shí)施例中，說明了表達(dá)HIV-1外殼蛋白的重組RVs。為了產(chǎn)生表達(dá)HIV-1gp160的RV重組病毒，以前述感染的RV cDNA克隆的pSAD-L16(Schnell，等人，EMBO Journal，134195-4203，1994)為基礎(chǔ)構(gòu)建一個(gè)新的載體。利用定向的誘變位點(diǎn)和PCR策略，從RV基因組刪除Ψ基因，而且包括一個(gè)RV終止/起始信號和兩個(gè)單一位點(diǎn)(BsiWI和NheI)的新的轉(zhuǎn)錄單元被引入RV基因組(參見重組載體的產(chǎn)生，見上文)。由此產(chǎn)生的質(zhì)粒被命名為pSBN(圖1)。SBN RV載體通過報(bào)道的方法被恢復(fù)，而且顯示了同樣的生長特性，而且和SAD-L16相似的病毒滴度，表明Ψ基因的缺失和新的轉(zhuǎn)錄單元兩者都不影響RV載體(缺失的)。通過PCR產(chǎn)生從SBN中表達(dá)的HIV-1外殼基因(NL4-3和89.6)被克隆到BsiWI和NheI位點(diǎn)間，產(chǎn)生了pSBN-NL4-3和pSBN-89.6質(zhì)粒(圖1)。通過DNA測序檢查所有的構(gòu)建。應(yīng)該指出的是，外源基因在RV基因組中達(dá)到至少4kb是穩(wěn)定的，而且重組RVs表達(dá)一個(gè)全長的HIV-1外殼蛋白。
表達(dá)HIV-1NL4-3，或是HIV-189.6外殼蛋白的重組RVs通過細(xì)胞的轉(zhuǎn)染恢復(fù)，這些細(xì)胞穩(wěn)定地表達(dá)T7-RNA-聚合酶，有編碼RV N，P和L蛋白的質(zhì)粒，同時(shí)有編碼各自的RV全長抗基因組的RNA的質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染后3天，轉(zhuǎn)染細(xì)胞的懸浮液被轉(zhuǎn)移到新鮮細(xì)胞，3天后，通過間接的免疫熒光顯微術(shù)分析HIV-1 gp160的表達(dá)。在用重組的SBN-NL4-3和SBN-89.6感染的細(xì)胞中g(shù)p160一個(gè)陽性的信號證實(shí)表達(dá)HIV外殼蛋白的重組RVs的成功恢復(fù)。也枸建了表達(dá)HIV-1 gag的重組RVs并通過表達(dá)HIV-1外殼蛋白的重組RVs相同的過程恢復(fù)。
重組RVs的生長特性檢測了表達(dá)HIV-1外殼蛋白的重組RVs的生長特性。注意到同野生型SBN比較，對于SBN-NL4-3有一個(gè)3倍滴度的降低及對于SBN-89.6有一個(gè)10倍滴度的減少。為了詳細(xì)地檢測病毒復(fù)制的差異，進(jìn)行了重組RVs的一步生長曲線。用一個(gè)10MOI感染BSR細(xì)胞以允許所有的細(xì)胞同步感染。用新鮮的培養(yǎng)基取代了病毒接種物后，在所示的時(shí)間點(diǎn)確定病毒的滴度(圖2)。同野生型RV比較，表達(dá)HIV-1 gp160的兩個(gè)重組RVs僅以稍微減少的比率復(fù)制，同時(shí)最終的滴度減少2.3(SBN-NL4-3)或8倍。重組RVs的長于20％的基因組的大小不能解釋這些病毒的較慢的生長。表達(dá)1.9kb基因(螢火蟲熒光素酶)的重組RV生長到野生型RV的滴度。(Mebatsion，等人，Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America，937310-4，1996)。
通過重組RVs的外源糖蛋白表達(dá)也檢測了通過重組RVs的HIV-1gp160的表達(dá)。為了保證通過重組病毒HIV-1gp160的表達(dá)，來源于重組RV感染的細(xì)胞的細(xì)胞裂解通過用定向抵抗RV(圖3，α-RV狂犬病)或抗HIV-1gp120(圖3，α-gp120)的抗體的蛋白免疫印跡(Western immunoblotting)進(jìn)行了分析。檢測到了來自于被SBN-89.6或SBN-NL4-3感染的細(xì)胞裂解物中的所期望大小的HIV-1gp160和gp120兩條帶(泳道3和4)，但是在模擬感染或SBN感染的細(xì)胞的細(xì)胞裂解物中沒有觀察到(泳道1和2)。用一個(gè)αRV抗體做為探針的蛋白印跡(Western blot)證實(shí)了所有的病毒(2，3和4泳道)感染了靶細(xì)胞。
在重組RVs中表達(dá)的外殼蛋白是有功能的為了確定是否RV中表達(dá)的HIV-1外殼蛋白是有功能地被表達(dá)，在人的T細(xì)胞系中(Sup-T1)的一個(gè)融合檢測中分析了重組RVs。這個(gè)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了野生型的RV能夠感染和在T細(xì)胞系中復(fù)制。因?yàn)橐吧偷腞V通過受體介導(dǎo)的胞吞作用感染細(xì)胞，所以RV糖蛋白(G)僅能在一個(gè)低的PH值引起感染細(xì)胞的融合。(Whitt，等人，Virology，185681-8，1991)。同野生型的RV比較，用SNB-89.6或SBN-NL4-3感染后24小時(shí)，在Sup-T1細(xì)胞中檢測到大的多核原生質(zhì)團(tuán)形成(圖4)。這些結(jié)果表明表達(dá)的HIV-1外殼蛋白被正確地折疊，轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞表面，而且被HIV-1受體和復(fù)合受體CD4和CXCR4識別。
如果用CD4和CCR5共表達(dá)，來自于dual-tropic HIV-1株系的外殼蛋白(89.6)將誘導(dǎo)細(xì)胞融合，而NL4-3 gp160將僅僅誘導(dǎo)表達(dá)CD4和HIV-1復(fù)合受體CXCR4的細(xì)胞融合。不管所用的重組RV，表達(dá)人CD4的3T3鼠細(xì)胞的感染不會(huì)引起細(xì)胞融合，而在用SBN-NL4-3或SBN-89.6感染后，在表達(dá)CD4和CXCR4的3T3細(xì)胞中，檢測到了多核原生質(zhì)團(tuán)形成。正如所期望的，在表達(dá)CD4和CCR5的3T3細(xì)胞中，僅有HIV-189.6外殼蛋白的表達(dá)引起了這些細(xì)胞的融合。
在鼠中體液免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)也分析了用表達(dá)HIV-1 gp160的RV感染的鼠中抗gp120的抗體應(yīng)答。對于一個(gè)成功的HIV-1疫苗的一個(gè)可能的要求是誘導(dǎo)強(qiáng)的抗HIV-1蛋白gp160體液應(yīng)答的能力。為了確定是否重組RV表達(dá)的重組gp160蛋白能誘導(dǎo)抗HIV-1免疫應(yīng)答，每組5只BALB/C鼠在兩個(gè)后腳掌用106FFU的SBN，SBN-89.6或105FFU的SBN-NL4-3皮下接種。用RV初始感染后11，24，和90天后從鼠中取血，通過ELISA分析血清。
在免疫動(dòng)物的血清中沒有檢測到對HIV-1外殼蛋白的應(yīng)答，但是用RV糖蛋白代替HIV-1gp120做為抗原的ELISA證實(shí)了RV感染，而且早在感染后11天，檢測到高水平的抗RV的抗體。對表達(dá)HIV-1gp160的病毒載體的幾個(gè)研究表明一個(gè)強(qiáng)化劑量的感染或用重組蛋白的強(qiáng)化免疫對誘導(dǎo)可檢測到的抗HIV-1外殼蛋白的血清抗體是必要的。在RV的ELISA中檢測到的高抗體滴度表明用重組RV的另外的感染是沒有前途的，因此每組3/5的鼠在一個(gè)弗式完全佐劑中被用10μg重組gp120和gp41強(qiáng)化免疫。亞基強(qiáng)化免疫后12天后，從鼠中取血，而且通過HIV-1gp120 ELISA分析免疫應(yīng)答。結(jié)果證明HIV-1外殼蛋白的亞基的強(qiáng)化免疫僅在以前被SBN-89.6或SBN-NL4-3感染的鼠中誘發(fā)抗HIV-1gp120的強(qiáng)的免疫應(yīng)答(圖5)。野生型RV(SBN)感染的鼠強(qiáng)化免疫后，僅在最低的血清稀釋(1∶160)中應(yīng)答。即使在用重組HIV-1 gp120/gp41強(qiáng)化免疫后，對HIV-1gp41特導(dǎo)性的ELISA對所有的鼠的血清是陰性的。這些數(shù)據(jù)通過蛋白印跡(Westernblot)分析被確定(圖6)。僅僅來源于被SBN-89.6或SBN-NL4-3感染的及隨后被重組蛋白強(qiáng)化免疫的鼠的血清能和gp120應(yīng)答，而所有的其它的血清不能檢測到任何HIV-1蛋白。即使用gp41亞基免疫，也沒有一個(gè)血清有g(shù)p41特異性的帶。
中和抗體的誘導(dǎo)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)觀察是否初次病毒感染后用重組蛋白強(qiáng)化免疫可誘導(dǎo)抗HIV-1的中和抗體。在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，通過用HIV-1NL4-3的必須的染料染色檢測確定了在MT-2細(xì)胞中的HIV-1中和抗體(NA)的滴度。在用SBN-NL4-3和重組gp120(IIIB株系)的一個(gè)外殼亞基強(qiáng)化注射免疫后，鼠血清能在1∶800稀釋的血清中中和組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室改造(TCLA)HIV-1NL4-3株，而用HIV-1NL4-3免疫后不能誘導(dǎo)可檢測到的中和抗體。這些結(jié)果在兩個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)中被證實(shí)了。接受重組gp120強(qiáng)化的野生型RV(SBN)感染的鼠血清僅僅顯示了非常低的1∶50 NA滴度(表1)。這些結(jié)果表明在用表達(dá)HIV-1gp160的重組RV初次免疫后，用重組gp120強(qiáng)化免疫注射誘發(fā)了高滴度的NA。
表1用不同的RVs感染后，通過重組HIV-1gp120/gp41強(qiáng)化免疫注射的鼠血清的中和抗體滴度
這里所顯示的結(jié)果證明產(chǎn)生了表達(dá)全長HIV-1外殼蛋白的重組RV。外源基因通過具有復(fù)制能力的RV穩(wěn)定表達(dá)，而且在用重組RV感染和隨后的HIV-1gp120蛋白單一的強(qiáng)化免疫后，在鼠的體內(nèi)誘導(dǎo)出抗HIV-1外殼蛋白的強(qiáng)的體液應(yīng)答。被表達(dá)HIV-1gp160的重組RV感染的鼠引起了免疫系統(tǒng)的強(qiáng)的初次免疫，如同通過HIV-1gp120蛋白或gp41的單一強(qiáng)化后的強(qiáng)的體液應(yīng)答所表明的一樣。因此，用另外的含有不同病毒糖蛋白的重組RV強(qiáng)化感染鼠或表達(dá)HIV-1gp160的重組VSV強(qiáng)化免疫，能檢測到一個(gè)更強(qiáng)的應(yīng)答。
長期持久HIV-1gp160特異性的CTL的誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)室改造的HIV-1株系(NL4-3)的表達(dá)HIV-1外殼蛋白的重組RV和初級的HIV-1的分離菌表明以RV為基礎(chǔ)的載體對B細(xì)胞的初次免疫是極好的(見上文)。(Schnell，M.J.，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，973544-3549，2000)。本發(fā)明進(jìn)一步涉及通過減毒的以RV為基礎(chǔ)的載體表達(dá)的抗HIV-1外殼蛋白的記憶CTL反應(yīng)。如所指出的，日益增加的證據(jù)表明強(qiáng)的，長期持久的CTL反應(yīng)的誘導(dǎo)對于成功的HIV-1疫苗是重要的特征。
為了分析以RV為基礎(chǔ)的載體誘導(dǎo)抗HIV-1的細(xì)胞毒性應(yīng)答的效力，用表達(dá)HIV-1NL4-3外殼蛋白(SBN-NL4-3)的重組的RV的2×107集落形成單位(FFU)免疫6只鼠(見上文和下文)。感染后105或135天后殺死3只鼠，取出脾臟。脾臟細(xì)胞培養(yǎng)物的1/3用1MOI(感染復(fù)數(shù))的表達(dá)HIV-1NL4-3gp160的重組牛痘病毒感染16小時(shí)，用補(bǔ)骨脂素和UV處理滅活，而且作為提呈細(xì)胞加回到培養(yǎng)物中。活化后7天對刺激的效應(yīng)細(xì)胞殺死P815靶細(xì)胞能力進(jìn)行分析，這些靶細(xì)胞是被牛痘野生型病毒，表達(dá)HIV-1NL4-3gp160或HIV-1Gag的重組牛痘病毒感染的。如在圖9中觀察的一樣，僅僅觀察到對于表達(dá)HIV-1外殼蛋白的重組牛痘病毒感染的P815靶細(xì)胞的強(qiáng)的細(xì)胞毒性應(yīng)答。被其它的兩個(gè)牛痘病毒感染的P815靶細(xì)胞僅僅觀察到低百分比的溶解。需要指出的是，用表達(dá)HIV-1外殼蛋白的重組RV單一接種后，達(dá)到了這些應(yīng)答，這表明在單一的接種以后，以RV為基礎(chǔ)的載體能誘導(dǎo)長期持久CTLs。
來源于表達(dá)異種HIV-1外殼蛋白的HIV-1gp160免疫鼠的交叉滅活靶細(xì)胞的CTLs盡管HIV-1外殼氨基酸序列中存在顯著的不同，但是分歧病毒間的交叉保護(hù)對于保護(hù)性疫苗將有可能是需要的。為了分析候選的疫苗誘導(dǎo)抵抗不同HIV-1株系的gp160的交叉反應(yīng)性CTLs的效力，從表達(dá)HIV-1gp160的重組RV免疫的鼠的脾臟細(xì)胞篩選抵抗表達(dá)同種和異種HIV-1外殼蛋白的P815靶細(xì)胞。對于這個(gè)方法，兩組6只鼠用2×107的重組RV腹膜免疫，該重組RV表達(dá)實(shí)驗(yàn)室改造的CXCR4-topic(NL4-3)，或dua1-tropic(CXCR4和CCR5)分離菌(89.6)的HIV-1gp160。
免疫3-5周后，每組中的3只鼠被殺死，取出脾臟，混合的脾臟細(xì)胞用表達(dá)同種的HIV-1外殼蛋白(NL4-3或89.6)的重組牛痘病毒刺激。刺激后7天，分析效應(yīng)細(xì)胞溶解P815靶細(xì)胞能力，該P(yáng)815靶細(xì)胞是被來源于實(shí)驗(yàn)室改造的CXCR4-topic的HIV-1株系(NL4-3)，dual-tropic株系(89.6)，和兩個(gè)主要的CCR5-topic HIV-1株系(Ba-L和JR-FL)的表達(dá)HIV-1外殼蛋白的重組牛痘病毒感染的。從兩個(gè)不同的，獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)中得到的結(jié)果如圖10A和圖10B所示，其中圖10A所示的是用表達(dá)HIV-1NL4-3外殼蛋白RV免疫的鼠的結(jié)果，圖10B所示的是用表達(dá)HIV-189.6外殼蛋白RV免疫的鼠的結(jié)果。如所預(yù)期的一樣，在兩個(gè)組中都觀察到了表達(dá)同種抗原的P815細(xì)胞的強(qiáng)的，特異性的溶解。更明顯地，這些效應(yīng)細(xì)胞能交叉殺死表達(dá)異種HIV-1外殼蛋白的P815靶細(xì)胞。來源于SBN-NL4-3免疫鼠的有活力的脾臟細(xì)胞達(dá)到了使表達(dá)gp 160JR-FL的P815靶細(xì)胞特異性溶解，或89.6株使P815靶細(xì)胞在40％的范圍中，以效應(yīng)細(xì)胞靶細(xì)胞(E∶T)50∶1的比率特異性的溶解，而且也能交叉殺死表達(dá)HIV-1Ba-Lgp160的靶細(xì)胞。在來源于SBN-89.6初次免疫的鼠的效應(yīng)細(xì)胞中觀察到了交叉滅活。P815靶細(xì)胞的溶解與用SBN-NL4-3免疫鼠的有活力的脾臟細(xì)胞中觀察到的范圍相同，但是溶解僅大約20％表達(dá)HIV-1NL4-3的P815細(xì)胞。這些數(shù)據(jù)表明基于RV的載體誘導(dǎo)的抗HIV-1gp160的CTLs可以定向抵抗HIV-1外殼蛋白中不同的抗原決定簇。
被CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的HIV-1特異性的CTL活性介導(dǎo)細(xì)胞溶性活性的T細(xì)胞亞群的表現(xiàn)型是通過選擇性的缺失確定的。3只鼠用2×107FFU的表達(dá)HIV-1NL4-3外殼蛋白的重組RV免疫，18周后取出脾臟。脾臟細(xì)胞用表達(dá)同種的HIV-1外殼蛋白的重組牛痘病毒再刺激7天。完成來自于活躍的脾臟細(xì)胞培養(yǎng)物中的缺失型和分離的陽性CD8+T-細(xì)胞的免疫磁珠細(xì)胞分離。用排除CD8+T-細(xì)胞(CD8-)培養(yǎng)物，分離的CD8細(xì)胞(CD8+)培養(yǎng)物或未處理的培養(yǎng)物(CD8+/CD8-)完成絡(luò)釋放檢測。
用表達(dá)HIV-1NL4-3gp160或HIV-1gag的牛痘病毒感染P815靶細(xì)胞。如圖11所示，排除CD8+T-細(xì)胞的培養(yǎng)物沒有顯示出活性，而在25∶1和12.5∶1的E∶T比率時(shí)，富集的CD8+T-細(xì)胞和未處理的培養(yǎng)物分別顯示出了高的特異溶解。實(shí)際上，富集的CD8+T-細(xì)胞種群在溶解單原方面也是富集的，因?yàn)榕c沒有選擇的種群相比，CTL活性在一個(gè)平臺期時(shí)仍舊是12.5∶1。這些數(shù)據(jù)表明溶解細(xì)胞的活性是被CD8+T細(xì)胞亞群介導(dǎo)的。而且，這些結(jié)果意味著除了抗體外，重組RV載體也產(chǎn)生長期活性的抗CD8+T細(xì)胞應(yīng)答。
討論本發(fā)明涉及表達(dá)HIV-1外殼蛋白的以RV為基礎(chǔ)的載體。這些載體在單一免疫，隨后用重組HIV-1gp120強(qiáng)化注射后能誘導(dǎo)抗HIV-1gp160的體液免疫應(yīng)答。(Schnell，M.J.，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，973544-3549，2000)。擴(kuò)大的證據(jù)表明CTL反應(yīng)在抗HIV-1的抗病毒免疫應(yīng)答中起了重要的作用。(Brander，C.and B.D.Walker，Current Opinion in Immunology，11451-9，1999.)。因此有效的預(yù)防性的HIV-1疫苗的開發(fā)需要具有誘導(dǎo)長期持久和廣泛活性的CTL反應(yīng)能力的HIV-1抗原的篩選。本發(fā)明進(jìn)一步涉及誘導(dǎo)這種應(yīng)答的以RV為基礎(chǔ)的載體。
同觀察到的體液應(yīng)答相比較，用表達(dá)HIV-1外殼蛋白的重組的RV單一接種的鼠引起了抗HIV1外殼蛋白的強(qiáng)的CTL反應(yīng)。另外，在免疫后至少135天，這些應(yīng)答是穩(wěn)定的。對這種強(qiáng)的應(yīng)答的一個(gè)解釋是RV在不能殺死細(xì)胞的各種細(xì)胞系中生長，與一個(gè)細(xì)胞病變的病毒載體比較，這引起了HIV-1基因的較長的表達(dá)。此外，RV核蛋白的表達(dá)，以前被表明是一個(gè)外源的超抗原(Lafon，M.Research inImmunology，144209-13，1993；Lafon，M.，等人，Nature，358，507-10，1992；)，可能有助于增強(qiáng)單一的免疫后的抗HIV-1外殼蛋白的總的免疫應(yīng)答。
本發(fā)明的重組RVs能誘導(dǎo)抗各種不同HIV-1外殼蛋白的交叉反應(yīng)性CTLs。以前的研究表明單一的氨基酸交換能取消CTL的交叉活性，而其它的實(shí)驗(yàn)表明單一的，甚至雙的氨基酸取代通常不能取消交叉滅活。(Cao，H.，等人，J.Virol.，718615-23，1997；Johnson，R.P.，等人，Journalof Experimental Medicine，175961-71，1992；Johnson，R.P.，等人，Journal of Immunology，1471512-21，1991.)。因此，是否重組的RVs誘導(dǎo)的CTLs定向抵抗不同的抗原決定簇仍存在疑問。然而，幾個(gè)研究表明了來源于HIV-1感染的，即使不同HIV-1分化枝的個(gè)體顯示了交叉活性；表明了廣泛的交叉活性對于HIV-1疫苗是一個(gè)重要的要求。(Cao，H.，等人，J.Virol.，718615-23，1997；Rowland-Jones，S.L.，etal，Journal of Clinical Investigation，1021758-65，1998.)。目前僅有一個(gè)研究表明用金絲雀痘為基礎(chǔ)的HIV-1疫苗在一個(gè)未被感染的志愿者中誘導(dǎo)出交叉分化枝的CTLs活性。(Ferrari，G.，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，941396-401，1997.)本發(fā)明的發(fā)明人目前正在分析是否通過重組的RV誘導(dǎo)的對HIV-1gp160的CTLs對B以外的其它分化枝的HIV-1外殼蛋白也是交叉反應(yīng)性。
總而言之，本發(fā)明證實(shí)了鼠血清的中和HIV-1株系的能力。因此本發(fā)明表明了重組的RVs是B細(xì)胞初次免疫的優(yōu)良的載體。本發(fā)明也表明了用表達(dá)HIV-1外殼蛋白的重組RV的單一的接種誘發(fā)了抗HIV-1蛋白的強(qiáng)的，長期持久的CTL特異性的應(yīng)答，例如不同HIV-1株系的外殼蛋白。這些結(jié)果進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了RV做為HIV-1疫苗的用途。
同多數(shù)其它的病毒載體相比較，在人的種群中對于RV僅僅有一個(gè)可以忽略不計(jì)的血清陽性存在，用抗HIV-1的以RV為基礎(chǔ)的載體免疫不會(huì)和對抗載體自身的免疫相互干擾。因?yàn)樵诤谛尚芍?，用RV疫苗株系抵抗RV的口服的免疫是成功和無致病性的(Report of the forth WHO Consultion on oral immunization ofdogs against rabies.unpublished document WHO/Rab.Res/93.42.1993.)，所以以RV為基礎(chǔ)的載體在誘導(dǎo)抵抗HIV-1粘膜免疫中也將是有前景的。因此，本發(fā)明完成了一個(gè)長期困惑，但沒有完成的對治療HIV-1感染的方法的需要。用本發(fā)明的重組RVs，所有的用于中和抗體的主要的抗原決定簇，細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞及依賴于細(xì)胞細(xì)胞毒性的抗體同時(shí)被表達(dá)，從而誘發(fā)抗HIV-1的體液和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫。
實(shí)施例1質(zhì)粒的構(gòu)建圖1所示是構(gòu)建重組RV基因組方法的圖解說明。在上部所示的是有5個(gè)開放閱讀框架的野生型RV基因組(SAD L16)。用PCR方法和位點(diǎn)定向誘變，整個(gè)Ψ基因被刪除，而且一個(gè)新的含有兩個(gè)單一位點(diǎn)的微小的RV的轉(zhuǎn)錄單元被導(dǎo)入G和L基因間(SBN)。編碼HIV-189.6或HIV-1NL4-3gp160的cDNA序列用BsiWI和NheI位點(diǎn)插入，產(chǎn)生了質(zhì)粒pSBN-89.6或pSBN-NL4-3(底部)。
兩個(gè)單一的位點(diǎn)通過用引物RP11 5’-CCTCAAAAGACCCCGGGAAAGATGGTTCCTCAG-3’(SEQ ID NO1)和引物RP12 5’-GACTGTAAGGACYGGCTAGCCTTTCAACGATCCAAG-3’(SEQ ID NO2)位點(diǎn)定向誘變(GeneEditorTMPromega Inc.)被引入在以前說明的G(SmaI)和Ψ基因(NheI)的RV cDNA pSAD L16上游，產(chǎn)生了質(zhì)粒pSN。pSN是用于引入一個(gè)新的轉(zhuǎn)錄終止/起始序列的靶，同時(shí)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)方法引入一個(gè)單一BsiWI位點(diǎn)。首先，用Vent聚合酶(New England Biolabs Inc.)和正向引物RP1 5’TTTTGCTAGCTTATAAAGTGCTGGGTCATCTAAGC-3’(SEQ ID NO3)或RP10 5’-CACTACAAGTCAGTCGAGACTTGGAATGAGATC-3’(SEQ ID NO4)從pSN通過PCR擴(kuò)增兩個(gè)片段。反向引物是RP18 5’-TCTCGAGTGTTCTCTCTCCAACAA-3’(SEQ ID NO5)和RP17 5’-AAGCTAGCAAAACGTACGGGAGGGGTGTTAGTTTTTTTCATGGACTTGGATCGTTGAAAGGACG-3’(SEQ ID NO6)。RP17含有一個(gè)RV轉(zhuǎn)錄終止/起始序列(下劃線的)和一個(gè)BsiWI和NheI位點(diǎn)(斜體所示)。用NheI消化PCR產(chǎn)物，連接，從瓊脂糖凝膠上洗脫3.5kb的帶。凝膠洗脫反，這條帶用ClaI/MluI消化，且連接到先前用ClaI/MluI消化過的pSN上。質(zhì)粒被命名為pSBN。
編碼HIV-1株系89.6和NL4-3株系的外殼蛋白的HIV-1gp160的基因用Vent聚合酶通過PCR擴(kuò)增，正向引物5’-GGGCTGCAGCTCGAGCGTACGAAAATGAGAGTGAAGGAGATCAGG-3’(SEQ ID NO7)含有PstI/XhoI/BsiWI位點(diǎn)(斜體)，而且反向引物5’-CCTCTAGATTATAGCAAAGCCCTTTCCAAG-3’(SEQ ID NO8)含有一個(gè)XbaI位點(diǎn)(斜體)。PCR產(chǎn)物用PstI和XbaI酶切，克隆到pBluescript II SK+(Stratagene)。序列形成后，用BsiWI和XbaI酶切HIV-1 gp160基因，連接到已被BsiWI和NheII酶切的pSBN上，得到的質(zhì)粒被命名為pSBN-89.6和pSBN-NL4-3。
實(shí)施例2來源于cDNA的RV感染的恢復(fù)對于重組RVs的援救實(shí)驗(yàn)，利用了以前所說明的沒有RV恢復(fù)系統(tǒng)的牛痘病毒(見Finke，等人，Journal of Virology，733818-25，1999)。簡而言之，利用一個(gè)Ca2PO4轉(zhuǎn)染的試劑盒(Stratagene)，按照商家的說明，用5μg全長RV cDNA及分別編碼RV的N-，P-和L-蛋白的質(zhì)粒(2.5μg，1.25μg和1.25μg)轉(zhuǎn)染穩(wěn)定表達(dá)T7 RNA聚合酶(a generous gift of Drs.S.Finke and K.-K.Conzelmann)的BSR-T7細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后3天，組織培養(yǎng)的懸浮液被轉(zhuǎn)移到新鮮的BSR細(xì)胞上，3天后，通過抗RV的N蛋白的免疫染色(Centocor)檢測到了感染的RV。
實(shí)施例3一步生長曲線如圖2所示，是表示用重組RVs(SBN，SBN-89.6，和SBN-NL4-3)感染的重組RV BSR細(xì)胞的一步生長曲線圖。在所表示的時(shí)間點(diǎn)上，確定了雙樣病毒的滴度。
BSR細(xì)胞(一個(gè)BHK-21克隆)在60mm的平皿中涂板，16小時(shí)后用總計(jì)2ml體積的感染復(fù)數(shù)(MOI)5的SBN，SBN-89.6，或SBN-NL4-3感染它。在37℃溫育1小時(shí)后，除去接種物，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗細(xì)胞4次除去任何未被吸附的病毒。再加回3ml的完全的培養(yǎng)基，感染后4，16，24和48小時(shí)，除去100μl組織培養(yǎng)懸浮液。病毒等分在BSR細(xì)胞上被雙樣滴定。在圖3中所示的是表達(dá)HIV-1gp160的重組RVs的蛋白印跡(Western blot)分析。用2MOI的SBN，SBN-89.6，或SBN-NL4-3感染Sup-T1細(xì)胞，溶解24小時(shí)以上。通過SDS-PAGE分離蛋白，通過蛋白印跡(Western blotting)分析。在用SBN-89.6或SBN-NL4-3感染溶解的細(xì)胞中，一個(gè)定向抵抗gp120的抗體在預(yù)期的位置檢測到HIV-1gp160和gp120兩條帶(α-gp120，第3和第4泳道)。在模擬的或SBN感染的細(xì)胞中沒有檢測到信號(α-gp120，第1和第2泳道)。用定向抵抗RV的一個(gè)多克隆抗體證實(shí)了被重組RVs成功感染的細(xì)胞(α-狂犬病，第2、第3、第4泳道)。
如在圖4中所示的是用1MOI的SBN，SBN-89.6，或SBN-NL4-3感染的Sup-T1細(xì)胞。感染后24小時(shí)，在用表達(dá)HIV-1gp160的重組RV(SBN-89.6組和SBN-NL4-3組)感染的細(xì)胞培養(yǎng)物中檢測合胞體形成，表明功能性的HIV-1外殼蛋白的表達(dá)。在被野生型的RV(SBN實(shí)驗(yàn)組)感染的培養(yǎng)物中沒有檢測到細(xì)胞融合。
實(shí)施例4免疫每組5只從Jackson實(shí)驗(yàn)室得到的4-6周齡的BALB/C雌鼠用106集落形成單位(FFU)的SBN，SBN-89.6或在DMEM+10％FBS(牛胎血清)中105NL4-3在兩個(gè)后腳掌皮下接種。感染后3個(gè)月，每組5只鼠中的3只用10μg的重組gp41(IIIB，Intracel Inc.)和10μg重組gp120(IIIB，Intracel Inc.)在100μl弗式完全佐劑中腹膜強(qiáng)化免疫。
實(shí)施例5酶聯(lián)免疫吸附檢測(ELISA)在200ng/ml的濃度的包被緩沖液中(50mM Na2CO3，pH9.6)重懸浮重組HIV-1gp120(IIIB株系，Intracel)，每孔100μl平涂在96孔ELISA Maxisorp板中。在4℃溫育過夜，洗板3次(PBS pH7.4，0.1％Tween-20)，在室溫下用封閉緩沖液(PBS，pH7.4，5％的干的奶粉)封閉30分鐘，用系列稀釋的血清溫育1小時(shí)。洗板3次，接著加結(jié)合山羊抗鼠IgG(H+L)第二抗體的辣根過氧化物酶(HRP)(1∶5000，Jackson ImmunoResearch Laboratories)。在37℃溫育30分鐘后，洗板3次，每個(gè)孔中加200μl的OPD-底物(o-苯二胺雙氫氯，Sigma)。通過每孔加50μl 3M H2SO4終止反應(yīng)。確定的可見光的密度是490nm。如圖5所示的是描述抗HIV-1gp120鼠血清的ELISA活性的一個(gè)曲線圖。5只鼠中的每一個(gè)用重組RVs免疫(SBN，SBN-89.6或SBN-NL4-3)，初次感染后3個(gè)月，每組中的3只鼠用重組HIV-1gp120和gp41(SBN*，SBN-89.6*或SBN-NL4-3*)強(qiáng)化免疫。在曲線上每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)表示在三個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)中每組的鼠的平均數(shù)。SBN-89.6組的一只鼠對強(qiáng)化免疫注射沒有反應(yīng)，而且不包括在曲線中。誤差條表示標(biāo)準(zhǔn)偏差。
實(shí)施例6蛋白印跡(Western blotting)人的T-淋巴細(xì)胞的細(xì)胞(Sup-T1)用2MOI感染24小時(shí)，在50mM Tris pH7.4150mM NaCl，1％ NP-40，0.1％SDS，和1×蛋白酶抑制劑混合劑(Sigma)的溶解緩沖液中重懸浮5分鐘。蛋白懸浮液被轉(zhuǎn)到一個(gè)微型管中，10,000×g旋轉(zhuǎn)1分鐘除去細(xì)胞殘余物。用10％SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)移到一個(gè)加PVDF(聚偏氟乙烯)膜上(Osmonics)。封閉1小時(shí)后(在pH7.4的PBS中5％的干的奶粉)，印跡與綿羊α-gp120抗體(ARRRP)(1∶1000)或人的α-狂犬病血清(1∶500)在封閉緩沖液中溫育1小時(shí)。加入山羊α-人或驢α-綿羊的第二抗體，結(jié)合抗體(1∶50000)的辣根過氧化物酶(HRP)(Jackson ImmunoResearchLaboratories)，印跡溫育1小時(shí)。接著每個(gè)溫育的抗體用WB-洗液緩沖液(PBSpH7.4，0.1％Tween-20)洗三次。按照制造商的指導(dǎo)進(jìn)行(NEN)化學(xué)熒光。
除了鼠血清中α-人的IgG結(jié)合物被以1∶5000稀釋度的結(jié)合山羊抗鼠的IgG(H+L)的堿性磷酸酶取代外(Jackson ImmunoResearch Laboratories)，其余的是按照制造商的說明，用一個(gè)市售蛋白印跡試劑盒(Western Blot Kit)(QualiCode HIV-1/2 Kit，Immunetics)進(jìn)行蛋白印跡(Western Blot)分析以檢測抗HIV-1抗體。如圖6所示是鼠血清抗體對HIV-1抗原反應(yīng)的蛋白印跡(Western Blot)分析。用RVs(α-SBN，α-SBN-89.6或α-SBN-NL4-3)免疫的或用重組gp120和gp41(α-SBN*，α-SBN-89.6*或α-SBN-NL4-3*)免疫和強(qiáng)化注射的每組中(SBN，SBN-89.6，和SBN-NL4-3)一只鼠的血清以1∶100稀釋度檢測。高陽性的和弱陽性的人對照血清被用于檢測HIV-1蛋白的位置。SC表示的是對照血清。
實(shí)施例7病毒中和檢測。
HIV-1株系在293T細(xì)胞中恢復(fù)，在MT-2細(xì)胞中(HIV-1 NL4-3)擴(kuò)展保藏的病毒，冷凍在-75℃，在MT-2細(xì)胞上滴定。中和檢測是根據(jù)Montefiori等的(Journal of Clinical Microbiology，26，231-5，1998.)。簡而言之，大約5000TCID50(半數(shù)組織培養(yǎng)感染量)的HIV-1NL4-3用系列稀釋的鼠血清溫育1小時(shí)。加MT-2細(xì)胞，37℃，5％CO2溫育4-5天。轉(zhuǎn)移100μl的細(xì)胞到多聚-L-亮氨酸平板上，用中性紅染料(Netral Red，ICN)染色75分鐘。用PBS洗細(xì)胞，用酸性的乙醇溶解，用比色劑在550nm分析。估算至少50％病毒抑制時(shí)的保護(hù)。
在說明書中引用的所有出版物和參考文獻(xiàn)，包括但不限定于專利申請，通過參考文獻(xiàn)被收編在這里，如同每個(gè)單獨(dú)的出版物或參考文獻(xiàn)被特定地和單獨(dú)地說明通過參考文獻(xiàn)收編在這里。
然而對于特定的具體實(shí)施例，用一個(gè)參考文獻(xiàn)說明本發(fā)明，對于普通的本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，所用的方法和組合物方面的變化是顯然的，而且表明除了在這里特定地說明外，本發(fā)明可以被實(shí)踐。因此，本發(fā)明包括如權(quán)利要求所限定的所有的包含在本發(fā)明宗旨和范圍內(nèi)的修改。
實(shí)施例8脾臟細(xì)胞制備無菌切除脾臟細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸浮液。用ACK溶解緩沖液(Bio Whitaker)溶解紅細(xì)胞，保持脾臟細(xì)胞在含有10％的胎牛血清的RPMI-10培養(yǎng)基中洗2次。脾臟細(xì)胞分裂為效應(yīng)和刺激細(xì)胞。通過用表達(dá)HIV-1的外殼蛋白的重組牛痘病毒(MOI＝10)以感染復(fù)數(shù)(MOI)1感染1小時(shí)制備刺激細(xì)胞。用PBS洗細(xì)胞1次以除去多余的病毒，在37℃，溫育16小時(shí)。溫育后，用補(bǔ)骨脂素(Sigma)滅活牛痘病毒(見下文)。刺激細(xì)胞以3∶1的比率被加回到效應(yīng)細(xì)胞群中，而且10％T-STIM(Collaborative Biomedical Products)被作為一種白細(xì)胞介素-II(IL-2)來源添加。
用補(bǔ)骨脂素滅活病毒隨后用牛痘病毒溫育脾臟細(xì)胞，用補(bǔ)骨脂素滅活病毒(Sigma)。補(bǔ)骨脂素加入到細(xì)胞，直到最終濃度5g/ml。隨后在37℃，溫育10分鐘，用長波UV(365nm)處理細(xì)胞4分鐘，用PBS洗兩次。
鉻標(biāo)記的靶細(xì)胞的制備用10MOI表達(dá)HIV-1的外殼蛋白(見特定蛋白的特定的圖的圖例)的重組牛痘病毒感染1小時(shí)制備靶細(xì)胞(P815)，洗靶細(xì)胞除去多余的病毒，在37℃，溫育16小時(shí)。為了測量背景值，用表達(dá)HIV-1Gag(vP1287)或野生型的牛痘(vP1170)感染靶細(xì)胞。在PBS中洗靶細(xì)胞1次，用100μCi51Cr標(biāo)記細(xì)胞1小時(shí)，在PBS中洗兩次，以各種E∶T比率(見圖)加到效應(yīng)細(xì)胞中，37℃，4小時(shí)。特定的百分比的51Cr的釋放以100X計(jì)算(實(shí)驗(yàn)的釋放-自發(fā)的釋放)/(最大的釋放-自發(fā)地釋放)。最大釋放是通過加5％的Triton X-100溶解的細(xì)胞懸浮液確定。自發(fā)的釋放是通過沒有被添加效應(yīng)細(xì)胞的被溫育的靶細(xì)胞確定的。
CD8+排除的T-細(xì)胞的制備體外刺激幾天后，CD8+T細(xì)胞從細(xì)胞培養(yǎng)物中排除(CD8-)，而且如制造商所說明的，用DynabeadsMouse CD8(Lyt2)富集(CD8+)。
序列表序列表<110>托馬斯杰斐遜大學(xué)<120>重組彈狀病毒作為免疫缺陷病毒的活病毒疫苗<130>P02US06731<140>PCT/US01/01989<141>2001-01-22<150>US 09/494,262<151>2000-01-28<160>8<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>1cctcaaaaga ccccgggaaa gatggttcct cag 33<210>2<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>2gactgtaagg acyggctagc ctttcaacga tccaag 36<210>3<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>3ttttgctagc ttataaagtg ctgggtcatc taagc 35<210>4<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>4cactacaagt cagtcgagac ttggaatgag atc 33<210>5<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>5tctcgagtgt tctctctcca acaa 24<210>6<211>64<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>6aagctagcaa aacgtacggg aggggtgtta gtttttttca tggacttgga tcgttgaaag60gacg 64<210>7<211>45<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>7gggctgcagc tcgagcgtac gaaaatgaga gtgaaggaga tcagg45<210>8<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>8cctctagatt atagcaaagc cctttccaag 30
權(quán)利要求
1.種重組彈狀病毒載體，包括a)一個(gè)修飾的彈狀病毒基因組；b)一個(gè)新的轉(zhuǎn)錄單元，它被插入彈狀病毒基因組中表達(dá)異種的核酸序列；及c)一個(gè)異種的病毒的核酸序列，它被插入到所述的新的轉(zhuǎn)錄單元，其中重組彈狀病毒載體是有復(fù)制能力的，而且所述的異種的病毒的核酸序列編碼一個(gè)抗原性多肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組彈狀病毒載體，其中所述的修飾的彈狀病毒基因組是一個(gè)修飾的狂犬病毒基因組。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組彈狀病毒載體，其中所述的修飾的狂犬病毒基因組有一個(gè)第二次修飾，這樣就有一個(gè)來源于其它種病毒的糖蛋白代替了狂犬病毒的糖蛋白。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組彈狀病毒載體，其中所述的來源于其它種病毒的糖蛋白是水泡性口炎病毒的糖蛋白。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組彈狀病毒載體，其中所述的修飾的狂犬病毒基因組有一個(gè)第三次修飾，這樣，在所述的第二次修飾后，就有一個(gè)不同于所述的修飾的彈狀病毒基因組中的結(jié)構(gòu)基因的毗連。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組彈狀病毒載體，其中所述的異種病毒的核酸序列編碼一個(gè)抗原性多肽，它選自于一組由全長的HIV-1外殼蛋白，HIVgp160，HIV gp120，和全長的SIV外殼蛋白組成的蛋白組。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組彈狀病毒載體，其中所述的異種的病毒的核酸被融合到所述的修飾的彈狀病毒基因組的糖蛋白基因的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的序列中，產(chǎn)生了一個(gè)嵌合蛋白，因此所述的嵌合蛋白在所述的異種蛋白的一個(gè)跨膜的結(jié)構(gòu)域和所述的糖蛋白的一個(gè)細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域間有一個(gè)融合。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組彈狀病毒載體，進(jìn)一步包括一個(gè)重組彈狀病毒基因的一個(gè)缺失，而且其中所述的異種的病毒的核酸被融合到所述的修飾的彈狀病毒基因組的糖蛋白的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的序列中，產(chǎn)生了一個(gè)嵌合蛋白，這個(gè)嵌合蛋白在功能上代替了所述的重組彈狀病毒糖蛋白基因。
9.一種重組的彈狀病毒，它表達(dá)一個(gè)功能性的HIV外殼蛋白，其中所述的重組的彈狀病毒是有復(fù)制能力的。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的重組彈狀病毒，其中所述的彈狀病毒是一個(gè)重組狂犬病毒或一個(gè)重組水泡性口炎病毒。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的重組彈狀病毒，其中所述的HIV外殼蛋白來源于任何HIV-1分離菌。
12.一種免疫原性組合物，包括如權(quán)利要求1-9中的任一個(gè)重組彈狀病毒載體和佐劑。
13.一種Ψ基因缺陷的重組狂犬病毒，包括編碼一個(gè)免疫缺陷病毒外殼蛋白，或其亞基的一個(gè)異種核酸片段。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的Ψ基因缺陷的重組狂犬病毒，其中所述的彈狀病毒是一個(gè)狂犬病毒。
15.根據(jù)權(quán)利要求13所述的Ψ基因缺陷的重組狂犬病毒，其中所述的免疫缺陷病毒外殼蛋白，或其亞基是來源于人免疫缺陷病毒。
16.根據(jù)權(quán)利要求13所述的Ψ基因缺陷的重組狂犬病毒，其中所述的免疫缺陷病毒外殼蛋白，或其亞基是來源于一個(gè)類人猿的免疫缺陷病毒。
17.一種誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物免疫應(yīng)答的方法，包括(a)將表達(dá)一個(gè)功能性的免疫缺陷病毒的外殼蛋白或其亞基的重組彈狀病毒載體遞送給所述的哺乳動(dòng)物組織，而且它可以有效地誘導(dǎo)對所述的外殼蛋白的免疫應(yīng)答。(b)在體內(nèi)表達(dá)所述的外殼蛋白或其亞基；(c)通過在佐劑中遞送一個(gè)有效劑量的分離的免疫缺陷病毒外殼蛋白或其亞基，或通過遞送一個(gè)有效劑量的強(qiáng)化疫苗載體強(qiáng)化免疫所述的哺乳動(dòng)物；及(d)誘導(dǎo)一個(gè)中和抗體應(yīng)答和/或長期持久的細(xì)胞免疫應(yīng)答，以保護(hù)所述的哺乳動(dòng)物抵抗免疫缺陷病毒。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述的重組彈狀病毒包括一個(gè)狂犬病毒基因組。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述的狂犬病毒基因組是Ψ基因缺陷型。
20.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述的狂犬病毒基因組是一個(gè)狂犬病毒的糖蛋白基因缺陷型。
21.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述的狂犬病毒基因組中，有一個(gè)代替了狂犬病毒糖蛋白的來源于其它種彈狀病毒的糖蛋白基因。
22.一種誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物免疫應(yīng)答的方法，包括(a)將表達(dá)一個(gè)功能性的免疫缺陷病毒的外殼蛋白或其亞基的非片段性負(fù)鏈RNA遞送給所述的哺乳動(dòng)物組織，而且它可以有效地誘導(dǎo)對所述的外殼蛋白的免疫應(yīng)答。(b)在體內(nèi)表達(dá)所述的外殼蛋白或其亞基；(c)通過在佐劑中遞送一個(gè)有效劑量的分離的免疫缺陷病毒外殼蛋白或其亞基，或通過遞送一個(gè)有效劑量的強(qiáng)化疫苗載體強(qiáng)化免疫所述的哺乳動(dòng)物；及(d)誘導(dǎo)一個(gè)中和抗體應(yīng)答和/或長期持久的細(xì)胞免疫應(yīng)答，以保護(hù)所述的哺乳動(dòng)物抵抗免疫缺陷病毒。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中所述的非片段性負(fù)鏈RNA病毒是狂犬病毒或水泡性口炎病毒。
24.一種重組非片段性負(fù)鏈RNA病毒載體，包括a)一個(gè)Ψ基因缺陷型的修飾的負(fù)鏈RNA病毒基因組；b)一個(gè)新的轉(zhuǎn)錄單元，它被插入到所述的修飾的負(fù)鏈RNA病毒基因組中表達(dá)異種核酸序列；和c)一個(gè)異種的病毒核酸序列，它被插入到新的轉(zhuǎn)錄單元中，其中所述的重組的非片段性的負(fù)鏈RNA病毒載體是有復(fù)制能力的，而且所述的異種的病毒核酸序列編碼一個(gè)抗原性多肽。
25.一種治療免疫缺陷病毒感染的哺乳動(dòng)物的方法，包括a)將非片段性的負(fù)鏈RNA病毒給予所述的哺乳動(dòng)物，這個(gè)非片段性的負(fù)鏈RNA病毒表達(dá)一個(gè)功能性的免疫缺陷病毒外殼蛋白，或其亞基；b)表達(dá)所述的功能性的免疫缺陷病毒外殼蛋白，或其亞基；c)通過在佐劑中遞送一個(gè)有效劑量的分離的免疫缺陷病毒外殼蛋白或其亞基，或通過遞送一個(gè)有效劑量的強(qiáng)化疫苗載體強(qiáng)化免疫所述的哺乳動(dòng)物；及d)誘導(dǎo)對所述的功能性免疫缺陷病毒外殼蛋白或其亞基的中和抗體應(yīng)答和/或長期持久的細(xì)胞免疫應(yīng)答。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中所述的免疫缺陷病毒是任何一種HIV-1病毒。
27.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中所述的非片段性負(fù)鏈RNA病毒是一個(gè)彈狀病毒。
28.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，進(jìn)一步包括對所述的功能性的免疫缺陷病毒外殼蛋白，或其亞基的粘膜免疫性的誘導(dǎo)。
29.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中所述的長期持久的細(xì)胞應(yīng)答進(jìn)一步包括一個(gè)交叉反應(yīng)性CTL應(yīng)答，其中所述的交叉活性CTLs是定向抵抗來源于不同免疫缺陷病毒株系的外殼蛋白，或其亞基的。
30.一種保護(hù)哺乳動(dòng)物抵抗免疫缺陷病毒感染的方法，包括a)將非片段性的負(fù)鏈RNA病毒給予所述的哺乳動(dòng)物，這個(gè)非片段性的負(fù)鏈RNA病毒表達(dá)一個(gè)功能性的免疫缺陷病毒外殼蛋白，或其亞基；b)表達(dá)所述的功能性的免疫缺陷病毒外殼蛋白，或其亞基；c)通過在佐劑中遞送一個(gè)有效劑量的分離的免疫缺陷病毒外殼蛋白或其亞基，或通過遞送一個(gè)有效劑量的強(qiáng)化疫苗載體強(qiáng)化免疫所述的哺乳動(dòng)物；及d)誘導(dǎo)對所述的功能性免疫缺陷病毒外殼蛋白或其亞基的中和抗體應(yīng)答和/或長期持久的細(xì)胞免疫應(yīng)答。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中所述的免疫缺陷病毒是任何一種HIV-1病毒。
32.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中所述的非片段性負(fù)鏈RNA病毒是一種彈狀病毒。
33.據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，進(jìn)一步包括對所述的功能性的免疫缺陷病毒外殼蛋白，或其亞基的粘膜免疫性的誘導(dǎo)。
34.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中所述的長期持久的細(xì)胞應(yīng)答進(jìn)一步包括一個(gè)交叉反應(yīng)性CTL反應(yīng)，其中所述的交叉活性CTLs是定向抵抗來源于不同免疫缺陷病毒株系的外殼蛋白，或其亞基的。
全文摘要
本發(fā)明提供了重組的、具有復(fù)制能力的以彈狀病毒疫苗株為基礎(chǔ)的表達(dá)載體，它表達(dá)異種病毒的抗原性多肽，如免疫缺陷病毒外殼蛋白或其亞基。插入一個(gè)彈狀病毒基因組內(nèi)的另外的轉(zhuǎn)錄終止/起始單元以表達(dá)異種抗原性多肽。象通過重組RVs感染后與人T－細(xì)胞系融合所顯示的一樣，HIV－1gp160蛋白被穩(wěn)定地和功能性地表達(dá)。用一個(gè)分離的重組HIV－1gp120蛋白進(jìn)行單一的強(qiáng)化免疫后，用表達(dá)HIV－1 gp160的重組狂犬病毒接種小鼠誘導(dǎo)出強(qiáng)烈的針對HIV－1外殼蛋白的體液應(yīng)答。而且，在鼠血清中檢測到的抗HIV－1的中和滴度高達(dá)1∶800。這些表達(dá)病毒抗原性多肽的重組病毒載體提供了可產(chǎn)生病毒特異性免疫應(yīng)答的有用的和有效的藥劑組合物。
文檔編號C12N15/86GK1416471SQ01804229
公開日2003年5月7日 申請日期2001年1月22日 優(yōu)先權(quán)日2000年1月28日
發(fā)明者馬提亞·J·施奈爾 申請人:托馬斯杰斐遜大學(xué)