專利名稱：食品和生產方法
技術領域：
本發(fā)明一般涉及包含一種或多種異黃酮的食品和藥物制劑。更具體而言，本發(fā)明涉及高純的晶體異黃酮，它們的生產方法，和高純異黃酮在食品工藝、食品、和藥物制劑中的應用。
背景技術：
植物異黃酮和它們的代謝物在醫(yī)療文獻中已經引起很大的關注，因為這些化合物產生一些有益的生物活性。人類和其它動物能從服用或攝取包含異黃酮的植物體和植物萃取物中受益。生物學的益處包括雌激素、抗雌激素、抗氧化、消炎、和抗癌作用。異黃酮的另一些益處包括血管的應變性和功能、骨質疏松癥的治療、血液脂蛋白水平的改變、減輕形成血栓過程的傾向、和穩(wěn)定或減輕絕經癥狀。幾乎只在具有最高已知量的豆科植物以及苜蓿、大豆、kudzu、和鷹嘴豆中才能找到在生物學上重要的異黃酮。有四種主要的植物異黃酮，以黃豆苷原、染料木黃酮、以及它們相應的甲基化的醚類--7-羥基-4′-甲氧異黃酮和鷹嘴豆素--為代表。認為產生有益的保健作用所需的任一種或所有這些異黃酮的量一般是每天20-100mg。
如大豆、鷹嘴豆、和扁豆等所有的食品都可以提供植物異黃酮。然而，為了獲得規(guī)定的可預測水平和比例的異黃酮，這種方法是非常不可靠的。人們廣泛認為大豆粉是非常有價值的植物異黃酮來源，其異黃酮含量一般為100-300mg/100g。然而，由于大豆包含幾乎可以忽略水平的甲基化的異黃酮--7-羥基-4′-甲氧異黃酮和鷹嘴豆素，所以異黃酮的含量中主要是染料木黃酮和黃豆苷原。鷹嘴豆和扁豆一般包含所有這四種異黃酮，但含量僅為大豆粉的約十分之一。而且，異黃酮的類型和含量的變化也是很大的，這取決于育種背景(品種和栽培)、植物年齡、環(huán)境條件和應激、植物產品的儲存條件、烹調和加工方法。因此，普通人為了特定的保健利益，依靠全部食物獲得預定量的特定異黃酮如果不是幾乎不可能的，那也是非常困難的。如果是多半不能預測，那么由于異黃酮含量的可變性和每克全部食品中異黃酮的含量較少，為了達到所希望的結果，就需要攝取大量的食物。由于這些原因，人們廣泛認為需要萃取半純形式的異黃酮，以便以食物中的保健增補劑的形式或以規(guī)定量的藥物制劑的形式給以提供。這樣，消費者就能方便地獲得確實量的異黃酮。
以濃縮的形式利用異黃酮還有另一個好處。有很強的證據說明，人類食物中的四種主要雌激素異黃酮(黃豆苷原、染料木黃酮、7-羥基-4′-甲氧異黃酮、和鷹嘴豆素)中的每一種，都具有特殊的生物性質，按指定劑量服用特定的異黃酮或它們的混合物，可以獲得所選擇的保健利益。尋求這些利益的個人，采用普通的飲食方式，獲得包含指定劑量特定異黃酮或特定比例異黃酮的膳食，是根本不可能的。因此，希望能夠制備具有規(guī)定比例或可變比例異黃酮的異黃酮萃取物。
在科學文獻中，出現大量在食品和飲料中施加植物雌激素和異黃酮類化合物的參考文獻。如前面所述，在這些添加劑中，異黃酮的濃度和異黃酮的比例是變化的，而且有澀味。
WO 00/64276(Chen等人)敘述了一種油包水型的涂抹食品，其中包含具有有益的保健作用的含鈣、和維生素的植物雌激素、異黃烷酮。涂抹食品也可以包含甾醇和甾醇酯、stanol和stanol酯、和大豆蛋白質。
專利說明書“包含植物雌激素、類似物或其代謝產物的保健補品”(Kelly WO 93/23069)提到，可以從豆科等植物中萃取異黃酮，使其成為干粉末的形式，這種形式能很方便地配制到面包、甜食或飲料等食品中，或配制到如片劑或膠囊等藥物組合物中。
Crank等人的美國專利5,858,449敘述了含異黃酮豐富的大豆蛋白質產品和它們的制造方法。Crank的產品具有所希望的香味，并可放在嬰兒處方、營養(yǎng)飲料、牛奶代替物、bologna、人造干酪涂抹食品、酸奶和冷凍甜食等奶制品和肉基食品中。
Kelly和Joannou的WO 98/08503公開一種適合各種條件使用的異黃酮類型化合物的服用。它也可以用作飲料和保健巧克力糖的食品添加劑。
Gorbach等人的美國專利5,498,631敘述了一種通過服用有效量的異類黃酮治療絕經癥、經前綜合癥、或產生降低雌激素水平的條件。所述的異類黃酮可以以甜食巧克力糖、餅干、谷類食品或飲料的形式食用獲得。
Gorbach的美國專利5,733,926敘述了一種治療早老性癡呆或與年齡有關的認識功能喪失的方法，其中包括特定的異類黃酮?？梢砸蕴菈K、餅干、谷類食品、或飲料等食品的形式供給。
Barnes等人的美國專利5,506,211敘述了為抑制破骨細胞的酸分泌作用和減少骨吸收，以包括大豆等食品在內的各種形式供給染料木黃酮/葡糖苷的共軛物。
Feuer等人的美國專利4,163,746敘述了用作重量增加促進劑的5-甲基烷氧基異黃酮。這種產品組合物可以是液體的或固體的形式，并可以包含維生素和氨基酸等其它有益的添加劑。
Jackson等人的美國專利5,654,011公開了一種增加絕經前后(perimenopausal)婦女營養(yǎng)的營養(yǎng)強化劑，其中包含8-＜50mg的植物雌激素，以及各種維生素和礦物質。這種補品可以以片劑、膠囊、粉末、凝膠或液體、或食療糖塊的形式供給。
Kuznicki等人的美國專利5,464,619敘述了一種組合物，優(yōu)選制成飲料的形式，其中包含固體的綠茶、黃酮醇、鈉和鉀離子、以及碳水化合物。
Zilliken的美國專利4,157,984敘述了在食品組合物中用作抗氧化劑的基于甜醅的產品。這種產品可以單獨使用，也可以與異黃酮或其它化合物組合使用。Zilliken的美國專利4,390,559采用異黃酮作為抗氧化劑，穩(wěn)定食用脂肪和油類。
Shylankevich的美國專利5,424,331公開一種治療和預防骨質疏松癥的材料，其中包括一種或多種植物雌激素化合物和其它礦物質?？梢砸允澄镅a充劑或以藥物的形式提供。
Potter等人的美國專利5,855,892公開了能使膽甾醇水平發(fā)生有益變化的食物補充劑或藥物形式的黃豆苷原給藥。
Shylankevich的美國專利5,569,459敘述了應用植物雌激素化合物調節(jié)雌激素的分泌。
Schouten Industries的WO 9610341公開采用大豆下胚軸作為異黃酮的來源。可以在飲料、奶制品、各種面包、保健茶和其它產品中使用這種材料。Schouten美國有限責任公司目前生產一種從大豆分離的產品，稱作SoyLife，在各種食品和食譜飲料中可以包括這種材料。此外，Archer Daniels Midland(ADM)生產一種稱作Novasoy的食物補充劑，其中含有豐富的染料木苷和黃豆苷。
Internutria WO 9821947敘述了包含植物雌激素和褪黑激素的食品或飲料，減緩持續(xù)再現性的夜間癥狀。
上面的許多參考文獻都敘述了在促進攝取異黃酮萃取物和濃縮物方面遇到的困難，因為它們往往具有由異黃酮萃取物的性質和組合物引起的令人討厭的味道和不愉快的口感，和因為它們存在的形式。
有許多方法普遍用于制備富含異黃酮的萃取物(例如，參見BarnesS，Kirk M和Coward L的大豆食品中的異黃酮和它們的共軛物萃取條件和HPLC-質譜分析。(農業(yè)食品化學雜志(JAgric Food Chem)1994，422466-74)。具體方法在很大程度上取決于在原料中是否以苷或苷元的形式包含異黃酮。植物中天然形式的異黃酮是以苷的形式存在，即結合到如葡萄糖的糖的部分上，這些化合物既可以以簡單的苷形式存在，也可以以不常見的丙二酸單?；蛞阴１釂熙５男问酱嬖凇８鞣N苷形式的異黃酮都非常易溶于水，但在有機溶劑中溶解得很差。相反，游離的苷元形式，水溶性差，但非常易溶于大多數的極性有機溶劑。從如紅色苜蓿葉子、kudzu或大豆等植物原料中，或從如大豆糖漿或大豆乳清等食品工業(yè)的副產品中萃取異黃酮，一般包括使原料與水、有機溶劑、或水與有機溶劑的混合物接觸。任何或所有的這些萃取方法都存在萃取方法沒有選擇性的缺點。如果采用水介質萃取苷，則數百種其它水溶性的植物成分也同樣被萃取。同樣，如果以有機溶劑相萃取苷元，則數百種其它極性的有機植物化合物如皂草苷、甾醇、和黃酮也隨著異黃酮無選擇性地進入溶劑相。這些各種各樣的萃取方法，一般生產異黃酮含量為5-40％的最終產品，但更通常為約10-20％。這些高含量的非異黃酮污染物的存在，通常造成最終產品具有令人不愉快的味道，使產品作為食品成分沒有吸引力。為了制備可口的混合物，通常必須采用蔗糖等掩蔽劑。至于藥用，雖然該材料松散的性質往往使最終配方具有不能接受的大體積，但在該材料裝在膠囊等中的情況下，這種澀味通常是不成問題的。
其中包括選擇性的應用各種有機溶劑和色譜法的若干其它步驟，是公認適合提高異黃酮純度的方法。這些方法的缺點是，(a)它們一般生產的異黃酮產量低，(b)方法貴，和(c)對于工業(yè)規(guī)模，在經濟上它們是沒有生命力的。而且沒有提到任何一種方法適合工業(yè)規(guī)模，也沒有提到任何一種方法能選擇性地優(yōu)先分離特定的異黃酮。由于這個原因，在文獻中沒有提到分離包含規(guī)定比例異黃酮的制劑。
因此目前需要能用作食品添加劑并具有下列優(yōu)點的異黃酮萃取物和組合物(a)有足夠高的純度，具有可口的或可以忽視的味道，和(b)混合物具有所需要的結構特征和溶混性，以便很容易地將它們加入種類繁多的食品中。在藥物制劑中應用這些萃取物和組合物時，這些性質也具有顯著的工業(yè)和實用優(yōu)點。對這些異黃酮萃取物和組合物還有另一個要求，即具有所規(guī)定的異黃酮比例。
發(fā)明概述本發(fā)明人意外地發(fā)現，可以以可加工的數量并以高純晶體的形式分離高純形式的植物異黃酮?？蓪⑻峒兊漠慄S酮配制在具有適宜味道、結構和口感的食品和保健補品中?？蓪⒏叨燃兓漠慄S酮方便地加入一般的食品中，以便在通常的飲食過程中攝取這些重要的異黃酮。例如涂抹食品、人造奶油、油類、調味醬、早餐的谷類食品等食品，可以包含有效量所需的植物異黃酮，同時又不損害食品的香味和口感。
根據本發(fā)明的方法，一般包括采用含水的有機溶劑混合物萃取如苜蓿葉子和磨碎的大豆等包含異黃酮的植物原料，使其通過細徑過濾器，除去大分子量的化合物，通過蒸發(fā)縮減有機溶劑相進行選擇性的異黃酮結晶，最后回收結晶的異黃酮。獲得的異黃酮產品，最優(yōu)選呈α-晶形，這種晶形的純度高，實際上是無色無嗅的，且具有適宜的味道、結構和口感。
根據本發(fā)明的第一個方面，提供一種生產α-晶形異黃酮的方法，其中包括從包含異黃酮的植物體中萃取異黃酮的步驟，即使包含異黃酮的植物體與含水的有機溶劑混合物接觸，獲得萃取溶液；將萃取溶液過濾，減少分子量大于異黃酮的植物體量；縮減濾液中的溶劑進行異黃酮α-結晶；回收α-晶體異黃酮。
根據本發(fā)明的第二個方面，提供一種生產α-晶形異黃酮的方法，其中包括從包含異黃酮的植物體中萃取異黃酮的步驟，即使包含異黃酮的植物體與含水的有機溶劑混合物接觸，獲得萃取溶液；將萃取溶液過濾，減少分子量大于異黃酮的植物體量；縮減濾液中的溶劑進行異黃酮α-結晶；回收α-晶體異黃酮；將回收的異黃酮晶體溶解在有機溶劑中；逐漸縮減有機溶劑的體積進行異黃酮選擇性的α-結晶；回收選擇性結晶的α-晶體異黃酮。
根據本發(fā)明的第三個方面，提供采用本發(fā)明第一或第二個方面的方法制備的α-晶體異黃酮。α-晶體異黃酮的異黃酮含量＞50％，更優(yōu)選＞65％。選擇性結晶的α-晶體異黃酮的異黃酮含量＞80％，更優(yōu)選＞90％。
根據本發(fā)明的第四個方面，提供一種α-晶形的異黃酮。在配制到食品和制劑中時，α-晶形是無色、無嗅、和實際上無味的。α-晶形的異黃酮，一般基本上是純的。
根據本發(fā)明的第五個方面，提供包含一種或多種高純異黃酮的食品或藥物制劑。
根據本發(fā)明的第六個方面，提供一種制作食品和藥物制劑的方法，其中包括將α-晶形的異黃酮與所述食品或藥物制劑中的一種或多種成分制成混合物的步驟。在配制到所述的食品或藥物制劑中時，α-晶形基本上是無色、無嗅、和實際上無味的。優(yōu)選在配制到所述的食品和藥物制劑中之前，將α-晶體異黃酮磨碎或粉化。
除非正文另有要求，在整個本說明書和隨后的權利要求中，“包括”一詞及其變化形式“包含”，都應理解為系指所述的整體或步驟的內含物、或整體或步驟的一部分，但不排斥任何其它的整體或步驟、或整體或步驟的一部分。
發(fā)明詳述在本發(fā)明的方法和組合物中使用的異黃酮，可來源于所有的植物原料，合成的或衍生的異黃酮，或異黃酮母體和前體藥物。容易獲得的異黃酮來源來自整個苜蓿植物原料，其中異黃酮大部分包含在這種植物的葉子中。
適宜的苜蓿包括紅色苜蓿(T.pratense)，地下苜蓿(T.subterranean)、或白色苜蓿(T.repens)。其它適宜的包含異黃酮的植物原料包括kudzu、大豆、和鷹嘴豆等其它豆科植物范圍。選擇不同類型和數量的包含異黃酮的植物原料，可以控制從其中分離的萃取物的異黃酮含量。采用某些類型的苜蓿，例如含7-羥基-4′-甲氧異黃酮高的苜蓿，或選擇另一種包含鷹嘴豆素等不同的異黃酮為主的苜蓿，都是可行的。
在采用苜蓿等多葉植物原料的情況下萃取植物異黃酮，一般是在溶劑萃取過程之前，將葉子粉碎或切碎。優(yōu)選以它們苷元的形式萃取異黃酮。在粉碎、切碎或磨碎葉片之后，植物體釋放出包含在植物中的葡糖苷酶，使異黃酮苷發(fā)生酶解，生成相應的苷元。在如大豆粉或大豆加工的廢液材料等材料惰性較大的情況下，采用本領域的技術人員已知的暴露于熱和/或酸中進行水解，或采用酶處理等技術，可使苷鍵破裂。
磨碎或切碎的植物體采用溶劑進行萃取，溶劑一般是水和有機溶劑，優(yōu)選能與水溶混的有機溶劑。水與有機溶劑的比例一般可為1∶10-10∶1，例如可以包括等比例的水和溶劑?？梢圆捎萌魏斡袡C溶劑或這些溶劑的混合物。有機溶劑可優(yōu)選是C2-10，更優(yōu)選C1-4的有機溶劑(例如甲醇、乙醇、異丙醇、丁醇、丁二醛基、丙二醇、赤蘚醇、氯仿、二氯甲烷、三氯乙烷、乙腈、乙二醇、乙酸乙酯、乙酸甲酯、甘油二羥基丙酮、四氫呋喃、乙醚或丙酮)，最優(yōu)選是如乙醇的C1-4的醇類?？刹捎帽绢I域眾所周知的方法，使植物原料與水-溶劑的混合物接觸，制備這種萃取物?；旌衔镞€可包括酶，酶有助于將異黃酮苷分解成苷元的形式。可以劇烈地攪拌這種混合物，以便生成乳狀液。也可以放置混合物，使其進行酶解?；旌衔锏臏囟?，例如可以為環(huán)境溫度至溶劑的沸點。接觸時間可以為1小時至幾周?？梢圆捎靡恍┏Ｒ姷姆椒?，例如過濾、離心、或澄清、或其它標準的方法，將萃取物與未溶解的植物原料進行物理分離。
發(fā)明人意外地發(fā)現，在獲得的溶劑中的苷元異黃酮，在有機溶劑中出現與眾不同的圖案的行為，這取決于分子量較高的化合物的存在或不存在?，F已發(fā)現，在使所得到的水漿液通過過濾器以除去粒狀的未溶解的植物原料以及溶解的或懸浮的分子量大于異黃酮的植物原料時，異黃酮出現的行為，與分子量較高的化合物的存在量基本上完全沒有減少或除去時截然不同。特別是發(fā)現，在不存在高分子量的植物化合物時，能誘發(fā)異黃酮生成α-晶體。不局限于理論，相信在過濾步驟能夠獲得所需要的從包含異黃酮的有機溶劑濃縮物中沉淀的α-晶體異黃酮。
強制含水的有機溶劑混合物通過細徑的物理分離阻擋層進行過濾。這一般是超濾裝置，其中包括塑料或紙過濾層，它阻擋分子量大于約500的化合物通過。這種方法能除去大部分的蛋白質、碳水化合物、類脂、油類、樹脂、和葉綠素，從裝置流出的一般是無色透明的液體。
然后處理獲得的含水的有機溶劑混合物經縮減混合物中的有機溶劑量。在旋轉式蒸發(fā)器中非常容易進行這種處理。在含水的混合物中有機溶劑量達到臨界點時，異黃酮出現引人注意的α-晶形沉淀。沉淀一般出現在水有機溶劑的比例很窄的范圍內。在這一點可以停止蒸發(fā)，通過簡單的沉降或過濾收集晶體。在干燥箱中或就在環(huán)境溫度下干燥以后，異黃酮的純度一般為65-75％，是相對無色無嗅的，只有輕微的澀味，從原料異黃酮的回收率＞90％，產品異黃酮的比例與原料混合物相似?？蓪⑦@種異黃酮產品看成是加入食品或藥物制劑中的最終產品。
此外，可能需要對最終產品中的異黃酮進行更大程度的純化，或分離選擇性結晶的異黃酮。為了獲得這兩種結果，需要進行進一步結晶。為此目的，將第一次結晶的晶體溶解在有機溶劑中。該溶劑優(yōu)選是與水不溶混的溶劑，例如C1-4的酯或醚。選擇的溶劑是乙酸乙酯。再將溶液加入旋轉式蒸發(fā)器中，溶劑的體積逐漸縮減。在該過程的臨界點上，出現第一次結晶，接著在溶劑量進一步縮減以后，出現第二次結晶。仔細地控制溶劑的蒸發(fā)速率，使得容易將第一和第二次結晶分開。發(fā)現第一次晶體主要是7-羥基-4′-甲氧異黃酮和黃豆苷原，其中包含約8-12％的鷹嘴豆素和染料木黃酮，還發(fā)現第二次晶體主要是鷹嘴豆素和染料木黃酮，其中包含5-25％的7-羥基-4′-甲氧異黃酮和黃豆苷原。收集每一次晶體，并單獨干燥。發(fā)現在每一種情況下，干材料中的異黃酮含量都為90-95％。采用另一種方案，不將最后的二個結晶步驟分開?？蓪⒔Y晶當作一個過程進行，只在第二次結晶后才回收晶體。
將采用過濾收集的晶體進行空氣干燥，采用如錘磨機或球磨機等本領域眾所周知的方法將晶體粉碎成細粉末。特別是在配制到食品和藥劑中時，所得到的細粉末幾乎是無色無嗅和實際上無味的。這使結晶的產品特別適合用作食品添加劑，而不需掩蔽異黃酮產品晶體的味道。此外，已經發(fā)現本發(fā)明細粉末狀的α-晶體異黃酮在各種食品加工方法中都能很好地摻合。加入富含異黃酮的晶體，不會明顯地增加食品和藥物制劑的體積，而且能迅速地加入所述的制劑中。
應用膜技術，能使本發(fā)明人以高產率和高純度回收異黃酮，同時又保持其生理活性和功能。在本發(fā)明之前，分離和回收異黃酮的通用方法包括從有機/水的溶劑混合物中蒸發(fā)有機溶劑，沉淀粗異黃酮，隨后進行回收。可將回收的異黃酮重新萃取到有機溶劑中，用水洗滌，除去水溶性的雜質，并重新沉淀，獲得粗異黃酮萃取物。本發(fā)明人發(fā)現，可以采用超濾膜，方便地對最初的異黃酮萃取物進行異黃酮萃取物的純化。對于除掉大量分子量大于異黃酮本身分子量的異黃酮的雜質，應用F4膜特別有效。
超濾過程的作用，是在采用蒸發(fā)、接著是有機再萃取、和沉淀依次回收固體之前，純化粗萃取物。除掉的雜質一般是天然的生物高分子樹膠，發(fā)現它干擾下游操作的加工預測和產品的質量控制。而且，樹膠成分能顯著降低產品的活性、增加顏色(棕色和綠色)、與異黃酮共沉淀、特別是溶解在有機溶劑中。
超濾器的作用是防止大于一定尺寸的分子通過過濾器。對本發(fā)明最有效的超濾器是選擇攔截尺寸比生物高分子雜質小，但又比有價值的異黃酮大的超濾器。正如從

圖1-6所看到的，膜F4能提供純度非常高且濃度也比實驗過的其它膜高得多的異黃酮。
超濾對產品活性的影響示于附圖1-8，并列在下面的表1中。表1包括經過各種超濾膜的異黃酮萃取物(3#給料)的分析結果，這些膜是以膜攔截尺寸降低的順序列出的。
“濾液”的結果表明，前6種濾液的異黃酮含量(0.069±10.005％)和比例(0.85±0.06)完全沒有改變，這表明異黃酮很容易通過膜。膜Y3和F4引起異黃酮濃度的降低，是因為膜的攔截尺寸非常接近于異黃酮分子的大小。即使如此，膜Y3和F4也沒有發(fā)生異黃酮比例的變化。
“固體產品”的數據說明了采用從濾液中沉淀的方法回收的固體的組成。膜過濾的主要作用是提高產品的活性。對比例(不過濾)產生的活性為47.1％，采用每一種膜處理，都顯著地超過了該值。膜Y3和F4產生的活性全都超過目標范圍40-70％。
提高活性的原因是，超濾除掉了一些生物高分子雜質，這些雜質與異黃酮一起，從15％的醇中共沉淀，又被共-萃取到乙酸乙酯中。調節(jié)膜F4的產品活性(76.5％對85.2％)因為與不受阻礙通過的雜質--鹽和糖相比，異黃酮通過得緩慢而受調整。
在表1的最后一欄中，對比例產生的比例為0.755，該值在一定程度上低于進料范圍，因為鷹嘴豆素在15％醇中的剩余溶解度較高。由于該溶解度的作用，除F4(0.85)以外，所有膜產品的比例都在預定的范圍0.69-0.81。
表1超濾試樣的分析
上面的表1突出了超濾產品與微濾產品相比所具有的優(yōu)點。預料微濾的固體產品與不采用膜的上述對比例固體產品相當，即其中異黃酮萃取物的活性為約47％，比例為約0.75。這表明粗異黃酮萃取物水漿液的微濾，僅僅是一種方法的改進，而粗萃取物的超濾，則導致產品的改進。
超濾的作用是除掉絮凝的雜質，這意味著異黃酮能夠結晶，優(yōu)選以它們的α-晶形結晶，而不是通過絮凝強制下沉。因此在不降低產率的情況下，從產品活性的觀點來看，超過濾顯著地提高了處理能力。通過除掉能引起絮凝和增加顏色的葉綠素和生物高分子，超濾步驟可以從原料苜蓿萃取物中脫樹膠，并能濃集到所需的任何純度。重要的是，經過超濾步驟的異黃酮萃取物，特別是在配制到食品和制劑中以后，基本上是無色、無嗅和實際上無味的。
本發(fā)明的晶體異黃酮產品，顯著優(yōu)于從前已知的植物雌激素萃取物。例如，Chen等人(WO 00/64276)所述的油包水型涂抹食品，包括一種植物雌激素萃取物，其中包含其它植物成分和雜質。在本發(fā)明的結晶異黃酮中，這些污染物如大豆蛋白質、甾醇和甾醇的酯類、stanol和stanol的酯類、植物樹膠、葉綠素、和生物高分子或不存在，或以顯著減少的量存在。這些污染物一般使包含它們的食品具有不希望有的顏色、澀味、和令人不愉快的口感。
因此，α-晶形的異黃酮產品在涂抹食品、人造奶油、奶油制品、油類、調味醬、早餐的谷類食品、各種面包、和飲料等食品中作為重要成分獲得了應用。本領域的技術人員，可以采用已知的標準方法，將結晶的異黃酮摻入各種類型的食品中。本發(fā)明異黃酮晶體產品的存在，不會損害食品的香味和口感。使得能夠根據需要，在通常的飲食過程中，將有益的異黃酮供給一般公眾。選擇具體的食品或藥物制劑的α-晶體異黃酮就可以獲得攝入植物異黃酮的益處，而不需特意致力于用包含異黃酮萃取物的丸劑和膠囊來補足飲食。
采用下列實施例進一步說明和解釋本發(fā)明。而這些實施例不是對本發(fā)明的限制。實施例1 異黃酮的α-晶形在收割的2小時內，浸漬和壓榨新收割的紅色苜蓿(100kg)。將浸漬的苜蓿在環(huán)境溫度下放置6小時，提供酶解過程，將異黃酮從它們的苷轉化成苷元的形式。然后在連續(xù)攪拌和攪動下，使浸漬的苜蓿在室溫下與1000升含50％乙醇的水接觸4小時。然后通過格柵壓榨或采用開槽的轉鼓，將浸漬液與剩下的植物原料分離。
然后浸漬液經過超濾步驟，使液體通過一系列裝有聚乙烯過濾層的濾筒。初級過濾器攔截孔的大小為1,000-10,000MW，第二級過濾器攔截孔的大小為500-1000MW。在約2000kPa的壓力下，強制液體通過這些過濾器。
經過超濾的浸漬液在減壓下蒸餾，溶劑從水中約50％的乙醇縮減到約10％的乙醇。在蒸發(fā)過程的這一點附近，異黃酮大量結晶。降低蒸發(fā)速率，溶劑中的乙醇含量進一步縮減約1-2％，這時觀察到不再有大量的晶體生成。這時停止蒸餾過程，排出溶劑和晶體懸浮液，用紙過濾器分離晶體和溶劑，空氣干燥，錘磨成細粉末。采用高壓液體色譜法測定產品的異黃酮含量。
這種產品的特征如下物理外觀 淺黃到無色，無嗅，略有澀味異黃酮含量78％的純度52％的鷹嘴豆素；29％的7-羥基-4′-甲氧異黃酮；10％的染料木黃酮；9％的黃豆苷原實施例2 包含α-晶體異黃酮的人造黃油由包括葵花/低芥酸菜子油和硬漿的人造黃油脂肪，制作人造黃油涂抹食品，硬漿由充分硬化的棕櫚仁油和充分硬化的棕櫚油隨意進行酯交換的混合物組成。根據本領域已知的標準技術，將人造黃油脂肪配制成人造黃油涂抹食品，其中使人造黃油脂肪和其它成分一道，與采用根據實施例1制備的粉末狀α-晶體異黃酮摻合，其它成分包括鹽、乳皮和乳清粉末、乳化劑、色素、香料、維生素、和水。配制人造黃油涂抹食品，使人造黃油涂抹食品中含0.1％(重量/重量)的粉末狀異黃酮晶體。包含異黃酮的涂抹食品，其味道、外觀、和口感與不加任何異黃酮晶體制作的對比涂抹食品沒有明顯的差別。相比之下，不經過超濾步驟制備的紅色苜蓿萃取物，卻使所配制的包含這種萃取物的涂抹食品具有令人不愉快的味道、顏色、和質地。實施例3同異黃酮比例的制劑將根據實施例1制備的α-晶體異黃酮制劑(1200g)溶解在乙酸乙酯中(50升)。將溶液加入旋轉式蒸發(fā)器中，加熱和施加真空。當乙酸乙酯的體積縮減到約30升時，出現第一次結晶。在這一點釋放真空，停止旋轉蒸發(fā)，使晶體沉降。取出晶體和溶劑，通過紙過濾器，收集晶體。然后將過濾的溶劑返回旋轉蒸發(fā)器，進一步加熱和施加真空。當再蒸餾出約10升乙酸乙酯時，出現第二次結晶。采用過濾收集這些晶體。將這二批晶體干燥并磨成粉末。
這二種產品的特征如下第一次晶體產品第二次晶體產品物理外觀無色、無嗅、無味 無色、無嗅、無味異黃酮含量 92％94％7-羥基-4′-甲氧異黃酮82％20％鷹嘴豆素 11％75％黃豆苷原 5％ 1％染料木黃酮 2％ 4％實施例4 α-晶體異黃酮的X-射線粉末衍射數據使實施例1分離的α-晶體異黃酮經過X-射線粉末衍射。圖6示出X-射線粉末衍射圖。為了對比，使“粗”紅色苜蓿萃取物經過同樣的X-射線粉末衍射，其結果示于圖7和圖8，在圖中已經除去了噪聲。目前在生產Promensil(Novogen)時，采用粗紅色苜蓿萃取物。圖7和8表明，粗紅色苜蓿萃取物是無定形的物質混合物。相反，圖6所示的α-晶體異黃酮具有格外高度有序的晶體結構。實施例5 分子量和異黃酮的分析一般方法采用尺寸排阻色譜法在50％的乙醇中分析試樣，以說明生物大分子雜質分子大小的分布。由于碰巧有一部分類似，還同時分析了異黃酮的分布。
分子量范圍是標示性的，而不是絕對的，因為醇對柱子的校準有影響，而且沒有密切相關的MW標準。
用四種異黃酮的混合標準增敏苜蓿萃取物試樣(3#進料)(圖1)，在色譜圖上鑒別異黃酮峰。異黃酮對該柱呈現親和力，因此在它們的實際大小250-300Dalton(道爾頓)后被洗提(即它們在較小的Log MW值0-1.7出現)。
圖2表明，在一組四個不同的苜蓿萃取物中，在Log MW＝0-2.5有許多其它少量的成分，它們可能與異黃酮有密切的關系，因為它們具有類似的親和力，這種親和力使它們在Log MW＝2.5通過尺寸排阻分離柱的末端。在四個不同的苜蓿萃取物的范圍內，主要吸收UV的少量雜質出現在Log MW＝1.5-2.5。
注意，異黃酮標準與苜蓿萃取物中異黃酮的峰位置不相重。根據親和力，它們的洗提受其它成分的類型和數量的影響，這些其它成分競爭發(fā)生作用或競爭通過柱子。
樹膠或生物高分子的大小范圍，為約1,000-40,000Dalton。綠色葉綠素的尖銳峰出現在Log MW＝3附近。在Log MW為3.5-4.0的高級聚合物呈黃、棕、紅棕、或黑色，視濃度而定。生物高分子的吸收度一般比小的芳香族有機分子低，這意味著這里所示的MW分布將試樣中存在的生物高分子的比例估計得過低。粗異黃酮沉淀物的微濾采用微濾回收從15％的醇中沉淀的粗異黃酮。將最后排出的生成的稀懸浮液濃縮成仍能流動的濃稠漿體。漿體的濃縮有助于異黃酮沉淀的純化，除掉仍留在濾液中的水溶性成分。
在長時間的過濾實驗中，在最高壓力下，提供最大通過量的微濾器是AF500，其通過量為在100kPa下的68L·m-2·h-1至在200kPa下的45L·m-2·h-1。在較高的壓力下通過量下降，是由于形成濾餅和濾餅經壓實所致。在適當選擇的低尺寸范圍內，并采用低進料壓力，濾液是完全透明的，沒有任何濁霧跡象。采用微濾步驟獲得的異黃酮回收率為95％。進行第二次微濾，收集第一次過濾后生成的沉淀，二段微濾異黃酮的總回收率為99％。在50％的醇中溶解的異黃酮的超濾在順序進行旋轉蒸發(fā)-固體回收-乙酸乙酯再萃取之前，采用超濾方法純化粗異黃酮萃取物。已經發(fā)現，超濾能除掉下游操作中干擾加工預測和產品質量的聚合雜質(即脫樹膠)。樹膠成分能顯著地降低產品活性，增加顏色(棕色和綠色)，在15％的醇中與異黃酮共沉淀，并部分地溶解在有機溶劑中。作為藥物成分，這一部分樹膠也引起了異議，因為它是沒有藥物作用的。最簡單和最理想的解決辦法，是除掉它。
采用尺寸排阻色譜法分析粗萃取物，確定分子的大小和質量分布，利用這些信息選擇適宜的超濾器。超濾器的作用是防止大于一定大小的分子通過過濾器，過濾器與血液透析和腎機能以及與植物細胞壁在防止其遺傳材料釋放方面的操作和生化機能完全相似。
通過孔的大小來區(qū)分超濾器，孔的大小決定了被攔截分子的大小，選擇孔的大小小于生物高分子，但大于有價值的小分子。采用進行純化要求的致密膜，在400kPa及1-10L·m-2·h-1的條件下，對苜蓿萃取物進行超濾。這種類型的膜，通常在1000-2000kPa的壓力下操作，在這種情況下預期通過量為5-25L·m-2·h-1。
當發(fā)現所有的進料都通過了50kD的超濾器時(圖3，膜＝HZ20P，其中P＝滲透或濾液試樣)，就用實驗證實了上限MW為約40kD(圖1和2)的色譜法結果。圖3中所有的滲透分析，是采用不同的逐漸致密的膜由同一種進料(3#進料)進行的。如圖3中的一系列曲線所示，隨著膜變得更加致密，除掉的生物高分子遞增。
可以看到，膜F4能使葉綠素大大降低。F4是唯一能在LogMW＝1.8-2.5的情況下顯著影響異黃酮材料的膜。雖然異黃酮濃度的降低使異黃酮通過該過程的質量遷移變慢，但在除去雜質方面的巨大收益比這個問題更為重要。圖3中的處理K1K1，是3#進料通過二段膜K1串聯進行處理的。在圖4中更清楚地示出，采用一段(K1)和二段(K1K1)超濾對除去生物高分子的改善。異黃酮仍然不受影響，但葉綠素和生物高分子卻顯著減少。采用K1K1獲得的純化作用，優(yōu)于采用0ml，即使0ml是比K1更致密的膜(這種現象對多段膜過程在基本原理上是合理的)。
至于膜HZ20、GR61和YW3，脫樹膠的性能不夠。
超濾的目的之一是改善產品的質量。為了論證這一點，使3#進料在50％的醇中進行超濾，(對比例＝不超濾)。用水將濾液稀釋到含15％的醇，用微濾器收集異黃酮產品，從其中將異黃酮重新萃取到50％的醇中。產品分析表明，在這二種采用超濾的情況下，產品萃取物比對比例包含較高的異黃酮濃度和較低的生物高分子濃度。
此外，圖5示出一種滯留物試樣，該試樣是采用超濾將進料的初始體積縮減28.8倍產生的。與圖2的進料試樣相比，生物高分子的峰顯著增強，而異黃酮的峰卻仍保持不變。損失到這種滯留廢物流中的異黃酮產量，為滯留物體積與進料體積成比例。當濃集因數為28.8時，產量損失為3.5％。設計甚至更高的濃集因數或重新萃取(膜過濾(diafiltration))滯留物，可進一步降低這種損失。
本說明書中涉及的任何現有技術不應看作是對該技術的認可或任何形式的建議，在所致力的領域內，這些現有技術已經成為普通常識的一部分。
本領域的技術人員會理解，除了特別加以說明的以外，這里所述的本發(fā)明，是可以變動和改進的。應當理解為本發(fā)明包括所有這些變動和改進。本發(fā)明還包括在說明書中涉及或指出的所有步驟、特征、組合物、和化合物，無論是單獨的還是整體的，以及任何二個或多個所述步驟或特征的任何和一切組合。
權利要求
1.一種生產α-晶形異黃酮的方法，其中包括下列步驟(a)從包含異黃酮的植物體中萃取異黃酮，使包含異黃酮的植物體與含水的有機溶劑混合物接觸，獲得萃取液；(b)過濾萃取液，減少分子量大于異黃酮的植物體量；(c)縮減濾液中的溶劑，使異黃酮發(fā)生α-結晶；和(d)回收α-晶體異黃酮。
2.權利要求1的方法，其中含水的有機溶劑混合物的水∶有機溶劑的比例為1∶10-10∶1。
3.權利要求2的方法，其中水∶有機溶劑的比例為約1∶1。
4.權利要求1-3任一項的方法，其中有機溶劑是C1-4的有機溶劑，它們選自醇類、氯代烷、二醇類、烷基酯、和烷基醚。
5.權利要求4的方法，其中有機溶劑是乙醇。
6.前述權利要求任一項的方法，其中α-晶體異黃酮的異黃酮含量＞50％。
7.權利要求6的方法，其中α-晶體異黃酮的異黃酮含量＞65％。
8.一種生產α-晶形異黃酮的方法，其中包括下列步驟(a)從包含異黃酮的植物體中萃取異黃酮，使包含異黃酮的植物體與含水的有機溶劑混合物接觸，獲得萃取液；(b)過濾萃取液，減少分子量大于異黃酮的植物體量；(c)縮減濾液中的溶劑，使異黃酮發(fā)生α-結晶；(d)回收α-晶體異黃酮；(e)將從步驟(d)中回收的異黃酮晶體溶解在有機溶劑中；(f)逐漸縮減有機溶劑的體積，使異黃酮產生選擇性的α-結晶；和(g)分離選擇性結晶的α-晶體異黃酮。
9.權利要求8的方法，其中含水的有機溶劑混合物的水∶有機溶劑的比例為1∶10-10∶1。
10.權利要求9的方法，其中水∶有機溶劑的比例為約1∶1。
11.權利要求8-10任一項的方法，其中有機溶劑是C1-4的有機溶劑，它們選自醇類、氯代烷、二醇類、烷基酯、和烷基醚。
12.權利要求11的方法，其中有機溶劑是乙醇。
13.前述權利要求任一項的方法，其中α-結晶異黃酮的異黃酮含量＞50％。
14.權利要求13的方法，其中α-結晶異黃酮的異黃酮含量＞65％。
15.權利要求8的方法，其中步驟(e)的有機溶劑是C1-4的酯或醚。
16.權利要求15的方法，其中有機溶劑是乙酸乙酯。
17.權利要求8的方法，其中選擇性結晶的α-晶體異黃酮的異黃酮含量＞80％。
18.權利要求17的方法，其中選擇性結晶的α-晶體異黃酮的異黃酮含量＞90％。
19.前述權利要求任一項的方法，其中選擇性結晶的α-晶體異黃酮主要包含7-羥基-4′-甲氧異黃酮和黃豆苷原。
20.前述權利要求任一項的方法，其中選擇性結晶的α-晶體異黃酮，主要包含鷹嘴豆素和染料木黃酮。
21.采用前述權利要求任一項的方法制備的α-晶體異黃酮。
22.α-晶形的異黃酮。
23.權利要求22的α-晶體異黃酮，其中α-晶形在配制到食品和藥物制劑中時，基本上是無色、無嗅、和實際上無味的。
24.權利要求23的α-晶體異黃酮，其中α-晶形包含的異黃酮超過50％。
25.權利要求24的α-晶體異黃酮，其中α-晶形包含的異黃酮超過90％。
26.權利要求25的α-晶體異黃酮，其中α-晶形基本上是純的。
27.一種食品或藥物制劑，其中包含一種或多種高純的異黃酮。
28.權利要求27的食品或藥物制劑，其中高純的異黃酮是α-晶形的。
29.一種制備食品或藥物制劑的方法，其中包括使α-晶形異黃酮與所述食品或藥物制劑中的一種或多種成分形成混合物的步驟，其中α-晶形在配制在所述的食品或藥物制劑中時，基本上是無色、無嗅、和實際上無味的。
30.權利要求29的方法，其中在配制到所述的食品或藥物制劑中之前，將α-晶體異黃酮磨碎或粉化。
全文摘要
本發(fā)明敘述了包含一種或多種異黃酮的食品和藥物制劑。本發(fā)明特別涉及高純晶體異黃酮和生產高純晶體異黃酮的方法，在配制到食品和藥物制劑中時，高純晶體異黃酮具有適宜的味道、特征和口感。
文檔編號A23L1/30GK1395574SQ01804008
公開日2003年2月5日 申請日期2001年1月22日 優(yōu)先權日2000年1月21日
發(fā)明者A·J·胡斯班德, G·E·凱利 申請人:諾沃根研究股份有限公司