專利名稱：一種預(yù)防流感病毒dna疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于一種生物制品，具體涉及一種預(yù)防流感病毒疫苗。
背景技術(shù)：
現(xiàn)有流感生物預(yù)防制品及制備方法有如下種類(一)、流感病毒滅活疫苗。全病毒滅活疫苗是在完整病毒的基礎(chǔ)上，將致病毒粒應(yīng)用物理或化學(xué)的方法使之完全滅活(失去感染性)而制成的病毒疫苗。流感滅活疫苗相較其他疫苗有生產(chǎn)方法比較簡(jiǎn)單，生產(chǎn)過(guò)程容易控制等優(yōu)勢(shì)，但也有其明顯的缺點(diǎn)。由于制備疫苗用的流感病毒需在雞胚的尿囊腔中培養(yǎng)生長(zhǎng)，制備周期長(zhǎng)，免疫原性會(huì)被降低或改變。流感的滅活疫苗不具長(zhǎng)效性。由它誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答甚至對(duì)同源病毒株的效果也很短暫，因此需要每年一次或一年兩次接種。(二)、流感亞單位疫苗。流感亞單位疫苗是指由野生流感病毒株經(jīng)培養(yǎng)、裂解、純化后得到的有效的病毒表面抗原成分，主要是HA和NA疫苗。但亞單位疫苗的傳統(tǒng)制備方法生產(chǎn)工藝相對(duì)繁瑣，難以大量獲取抗原，因此導(dǎo)致亞單位疫苗價(jià)格昂貴，難于推廣應(yīng)用。(三)、流感減毒活疫苗。在小鼠中已經(jīng)證明，流感減毒活疫苗有更為廣譜的免疫應(yīng)答。作為一個(gè)有效的疫苗，基因重配的冷適應(yīng)株必須擁有來(lái)源于野生株的編碼HA和NA的2個(gè)RNA節(jié)段，而另外6個(gè)片斷則必須來(lái)源于冷適應(yīng)供體株。從獲得野生病毒株的克隆到制備出減毒活疫苗株大約需要5周時(shí)間。在接種人群之前，還必須將疫苗株在特殊的無(wú)菌雞蛋尿囊腔中培養(yǎng)，進(jìn)一步檢測(cè)其毒性。對(duì)流感減毒活疫苗的減毒處理只是經(jīng)驗(yàn)性的，且其毒力依然存在回復(fù)突變的可能性。尤其對(duì)于冷適應(yīng)疫苗株來(lái)說(shuō)，由于需要多次傳代，時(shí)間很長(zhǎng)，當(dāng)病毒流行時(shí)，將流行毒株進(jìn)行冷適應(yīng)性傳代并不現(xiàn)實(shí)。(四)、流感合成肽疫苗。人工合成的與流感病毒保護(hù)性抗原(HA、NA等)決定簇的氨基酸序列相同的肽段，經(jīng)制備成免疫原后對(duì)動(dòng)物或人體進(jìn)行接種，可以促使機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性抗體，這種多肽就是流感的合成肽疫苗。合成肽疫苗存在著一些理論和實(shí)際上的困難一是如何找到及構(gòu)建最佳抗原決定簇的多肽；二是合成肽的免疫原性較弱，使用時(shí)必須配用佐劑。由于弗氏佐劑不能在人體使用，故合成肽的臨床評(píng)價(jià)急需研制一種有效、可在人體使用的佐劑。(五)、流感基因工程亞單位疫苗。將編碼誘導(dǎo)保護(hù)性免疫應(yīng)答的流感抗原決定簇(HA、NA等)基因插入到表達(dá)載體DNA中，然后將載體導(dǎo)入酵母、昆蟲(chóng)或哺乳動(dòng)物細(xì)胞，使之表達(dá)病毒抗原蛋白，產(chǎn)物純化后即得流感的基因工程亞單位疫苗。基因工程亞單位疫苗的不足之處在于陽(yáng)性表達(dá)克隆篩選的工作量大。表達(dá)的蛋白有時(shí)不能正確折疊或修飾，從而影響免疫原性。重組蛋白分離純化的工藝有時(shí)相對(duì)復(fù)雜。(六)、流感病毒DNA疫苗。DNA疫苗(DNA Vaccine)是將編碼某種抗原蛋白的外源基因直接導(dǎo)入動(dòng)物體細(xì)胞內(nèi)，并通過(guò)宿主細(xì)胞的表達(dá)系統(tǒng)合成抗原蛋白，誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生對(duì)該抗原蛋白的免疫應(yīng)答，以達(dá)到預(yù)防和治療疾病的目的。DNA疫苗由病原體(包括病毒和細(xì)菌等)的保護(hù)性抗原基因和載體質(zhì)粒兩部分組成。質(zhì)粒DNA必須具備以下條件①帶有細(xì)菌復(fù)制子(Ori)，保證質(zhì)粒能在大腸桿菌中復(fù)制；②帶有用于篩選的抗性基因，篩選基因可以選用卡那霉素，氨芐青霉素或新霉素等抗性基因；③真核生物的啟動(dòng)子(有的含有增強(qiáng)子)，如CMV、SV40啟動(dòng)子；④帶有PolyA序列，能保證mRNA在體內(nèi)的穩(wěn)定性，這種穩(wěn)定性因PolyA來(lái)源不同而異。目前認(rèn)為較好的PolyA是來(lái)自牛生長(zhǎng)激素基因(BGH)。DNA疫苗的導(dǎo)入方式多樣，有肌肉注射、皮內(nèi)注射、鼻內(nèi)滴注或鼻腔噴霧、脂質(zhì)體法以及新發(fā)展起來(lái)的基因槍免疫和活體電擊免疫等。流感病毒至今仍是引起人類死亡的主要病因之一，因?yàn)榱鞲胁《疽淄蛔?，所以人類至今仍無(wú)法征服流感。疫苗接種是預(yù)防流感的一種有效方法，DNA疫苗(DNA vaccine)為我國(guó)提供了一種新的選擇。1993年，UlmerJB等將編碼流感病毒A/PR/8/34的NP基因的質(zhì)粒注入BALB/c小鼠的股四頭肌內(nèi)，產(chǎn)生了強(qiáng)烈而特異的CTL應(yīng)答，能夠提供交叉保護(hù)作用，開(kāi)創(chuàng)了核酸疫苗用于預(yù)防流感病毒的研究[Ulmer JB et al Science.1993 Mar 19；259(5102)1745-9.]；陳則等將HA編碼基因克隆入小雞的β肌動(dòng)蛋白表達(dá)載體中，以3周間隔接種2次，采用基因槍或者活體電擊免疫接種的方式，接種劑量為基因槍每只小鼠1μgDNA，活體電擊免疫方法每只小鼠30μgDNA。加強(qiáng)免疫后的第七天，用同源病毒株攻擊。結(jié)果顯示，接種HA DNA疫苗的小鼠能有效抵抗病毒感染[Chen Z et al Vaccine.1998Oct；16(16)1544-9；Chen Z et al Vaccine.1999 Feb 26；17(7-8)653-9.]，因此HA基因應(yīng)該作為流感DNA疫苗的重要組成部分。DNA疫苗在免疫應(yīng)答中能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫，DNA疫苗應(yīng)用于小鼠、綿羊、雞、貓、牛、豬、馬、猴和黑猩猩等動(dòng)物身上均獲得成功，但它在誘導(dǎo)免疫應(yīng)答中的效率相對(duì)較低，影響了它的實(shí)際應(yīng)用，因此尋找其它DNA分子以提高核酸疫苗的免疫效率則是需要解決的問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在研制一種預(yù)防流感病毒用高效DNA疫苗，以提高DNA疫苗的免疫效率。
上述發(fā)明目的是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。本發(fā)明疫苗是用CD40L作佐劑的預(yù)防流感病毒的DNA疫苗，HA DNA疫苗與CD40L以1∶1的質(zhì)量比共同免疫。
下面進(jìn)一步詳述本發(fā)明。


圖1為病毒攻擊小鼠體重丟失(g)和感染后恢復(fù)結(jié)果圖。
圖2為病毒特異性的血清IgG滴定結(jié)果圖。
圖3為共同免疫HA和CD40L(加強(qiáng)免疫后)后小鼠中IgG抗體亞型的水平結(jié)果圖。
CD40L是腫瘤壞死因子超家庭的成員之一，含有261個(gè)氨基酸，為II型跨膜糖蛋白，定位于Xq24上，其相對(duì)分子量(Mr)為39000。[Eur J Immunol.1992Dec；22(12)3191-4]本發(fā)明的預(yù)防流感用高效DNA疫苗是通過(guò)如下步驟制備的流感病毒抗原HA和CD40L基因的獲得，HA和CD40L DNA疫苗的構(gòu)建，HA和CD40L DNA疫苗的鑒定。
流感病毒抗原HA和CD40L基因的獲得病毒RNA是從在10日齡雞胚中增殖得到的病毒中提取。RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到單鏈cDNA。以cDNA為模板，對(duì)HA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。正向引物為5’AACCTC GAGAAT GAA GGC AAA CCT ACT GGT CC-3’，反向引物為5’AACCCC GGGTCT CAG ATG CATATT CTG CAC TGC A-3’。正向引物含有XhoI酶切位點(diǎn)，反向引物含有SmaI酶切位點(diǎn)。
以小鼠脾臟細(xì)胞的cDNA文庫(kù)(Clontech公司)為模板，用PCR方法克隆出CD40L基因，正向引物為5’TTC CTC GAG CAT GAT AGA AAC ATA CAG-3’，反向引物為5’TGA CCC GGG GTA TAG GGA AGA CTG CCA-3’。正向引物含有Xho I酶切位點(diǎn)，反向引物含有Sma I酶切位點(diǎn)。
HA和CD40L DNA疫苗的構(gòu)建低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物，連入pGEM-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，通過(guò)質(zhì)粒提取和酶切鑒定來(lái)確定HA、CD40L基因是否已經(jīng)連入T載體。然后大量擴(kuò)增鑒定的重組子，純化回收。帶有HA、CD40L基因的T載體用Xho I-Sma I消化，低熔點(diǎn)回收從T載體上切下來(lái)的HA、CD40L片段，克隆入經(jīng)同樣酶切處理的表達(dá)載體pCAGGSP7中，獲得重組質(zhì)粒pCAGGSP7/HA、pCAGGSP7/CD40L。HA、CD40L基因核苷酸序列經(jīng)377DNA測(cè)序儀(Applied Biosystem.U.S.A.)測(cè)序證實(shí)。
真核表達(dá)載體pCAGGSP7來(lái)源于由Niwa et al構(gòu)建的pCAGGSP7[Niwa H et al.Gene 1991，108103-200.]，是將多克隆位點(diǎn)Kpn1，Xho1，Cla1，EcoRV，Sma1，Not1和Sac1插入pCAGGS的EcoR1位點(diǎn)得到pCAGGSP7。質(zhì)粒pCAGGS含雞的β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子成分，SV40的復(fù)制起始部位(Ori)，氨芐青霉素抗性基因，CMV瞬時(shí)增強(qiáng)子，牛生長(zhǎng)激素基因(BGH)多聚A。
HA和CD40L DNA疫苗的鑒定編碼HA和CD40L的質(zhì)粒分別在Escherichia coli XL1-blue中擴(kuò)增，用QIAGEN純化試劑盒(QIAGEN，Tip500)純化。用紫外分光光度法測(cè)定質(zhì)粒的濃度和純度，DNA的濃度和純度通過(guò)OD260、OD280確定，選取OD260/OD280比值在1.8～2.0的質(zhì)粒DNA去免疫小鼠。
HA與CD40L質(zhì)粒分別于-20℃低溫凍存，免疫小鼠前解凍并根據(jù)用量將HA與CD40L質(zhì)?；旌?。
免疫實(shí)驗(yàn)步驟及實(shí)驗(yàn)結(jié)果免疫實(shí)驗(yàn)使用的HA是來(lái)自于H1N1亞型的流感病毒株(A/PR/8/34)，其全稱是hemagglutinin。
A/PR/8/34 HA(hemagglutinin)的生理化學(xué)特性該病毒株的主要表面糖蛋白是血凝素(HA)。它具有凝集多種動(dòng)物紅細(xì)胞的性質(zhì)。
HA由流感病毒RNA片段4編碼，是典型的I型糖蛋白，它含有4個(gè)結(jié)構(gòu)域信號(hào)肽(前導(dǎo)序列)、胞漿域、跨膜域和胞外域。HA大約由562-566個(gè)氨基酸組成，在HA的氨基端有一由16個(gè)疏水氨基酸組成的信號(hào)肽。緊接信號(hào)肽的是由328個(gè)氨基酸殘基組成的HA1部分，羧基端由221個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成HA2。在HA1和HA2之間有一精氨酸殘基。HA2羧基端(185-211氨基酸區(qū)域)主要由疏水氨基酸殘基組成。最末端的10個(gè)氨基酸殘基大多是親水性的。
HA的三維結(jié)構(gòu)流感病毒的HA蛋白以三聚體(trimer)的形式存在于雙層類脂膜上，即HA纖突由三個(gè)HA單體分子組成，單體全長(zhǎng)13.4nm。它可分為兩部分，一部分是呈球狀的頭部，由HA1組成，含有受體結(jié)合位點(diǎn)和抗原決定族；另一部分為柄，由HA2和部分HA1組成，與囊膜相連，長(zhǎng)約7.6nm。HA2氨基末端與HA1羧基末端相距2.1nm。HA2氨基末端位于分子的三聚體交界面，與病毒膜相距3nm，它富含有甘氨酸殘基，形成一個(gè)不同尋常的螺旋結(jié)構(gòu)延伸出三聚體的交界面。
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選取8周齡BALB/c雌性小鼠。
腹腔注射麻醉藥(鹽酸氯胺酮、鹽酸洛貝林混合物)使小鼠全身麻醉，用酒精擦拭小鼠右后腿股四頭肌，然后用一次性注射器吸取溶于TE(1M Tris，0.5M EDTA)的DNA溶液，將針垂直插入股四頭肌，慢慢注入DNA。一組BALB/c小鼠混合免疫30μgHA(1μg/μl)和30μg CD40L(1μg/μl)，總體積30μl；一組BALB/c小鼠免疫30μgHA(1μg/μl)，總體積30μl；用未插入外源基因的空載體免疫小鼠作為陰性對(duì)照。在肌肉注射針孔的兩側(cè)插入電擊儀的兩根電極，相距0.5cm，然后電擊(電壓100v，電擊時(shí)間50ms，電擊正負(fù)各三次，間隔1s)，完成一次免疫。免疫后第3周用相同劑量和成分的DNA加強(qiáng)免疫。
用氯仿麻醉小鼠，從心臟采血。使小鼠背臥于實(shí)驗(yàn)桌面，在劍狀軟骨下方微偏左處以15～20度角插入注射器針頭，緩慢的抽取心血直至血流停止。收集的血液置于室溫1小時(shí)左右。凝固后析出血清。4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘。在無(wú)菌條件下吸出血清，-20度冰箱保存。
用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)測(cè)HA特異性IgG抗體。用10μg/mL的滅活疫苗包被96孔酶標(biāo)板，37℃2小時(shí)；PBS-T(1升溶液中含有NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na2HPO41.15g，KH2PO40.2g，Tween-20 0.454ml)洗三次后加入封閉液(1升溶液中含有NaCl8.0g，KCl 0.2g，Na2HPO41.15g，KH2PO40.2g，10g牛血清白蛋白)，4℃過(guò)夜。用封閉液以2的倍數(shù)稀釋抗血清后，加入酶標(biāo)板，37℃溫育1小時(shí)。PBS-T洗三次后，加入用生物素(Biotin)標(biāo)記的山羊抗鼠IgG二抗，用于抗體分型的是山羊抗鼠IgG1、IgG2a二抗(γ-chain specific，Southern Biotechnology Associates，Inc.USA)，37℃溫育1小時(shí)。PBS-T洗三次后，加入堿性磷酸酶標(biāo)記的鏈菌蛋白(SouthernBiotechnology Associates，Inc.USA)，37℃溫育1小時(shí)。最后，PBS-T洗三次后，加入10mg/ml PNPP(Southern Biotechnology Associates，Inc.USA)顯色。在30分鐘內(nèi)，用酶標(biāo)儀(Labsystems Multiskan Ascent芬蘭產(chǎn))利用雙波長(zhǎng)(414nm-405nm)測(cè)出OD值，最終確定抗體IgG的最高稀釋度，以此來(lái)確定抗體量的高低。
取出小鼠的氣管和肺，PBS(含0.1％BSA)注洗三次。漂洗液離心去細(xì)胞碎片用于測(cè)病毒滴度。將肺洗液作10倍系列稀釋，取每個(gè)稀釋度0.1ml與吸附在6孔板上的MDCK細(xì)胞共培養(yǎng)1小時(shí)，讓細(xì)胞和病毒充分吸附，用2ml瓊脂粉培養(yǎng)基覆蓋6個(gè)孔，在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)兩天，噬斑形成，計(jì)算噬斑的數(shù)目，以每ml病毒液中噬斑形成單位表示病毒量的多少。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組病毒滴度是用每個(gè)實(shí)驗(yàn)組所有小鼠每毫升病毒滴度的mean±SD來(lái)表示。
小鼠加強(qiáng)免疫后1周用致死量流感病毒(40LD50)通過(guò)滴鼻法(17μl病毒懸液)攻擊小鼠。在三周內(nèi)用小鼠的存活率來(lái)判定新型DNA疫苗的保護(hù)效果。
混合免疫HA和CD40L能保護(hù)小鼠抗致死量流感病毒攻擊小鼠用致死量流感病毒攻擊，攻擊后3周統(tǒng)計(jì)死亡小鼠和存活小鼠，以此確定小鼠的存活率。如表1所示，結(jié)果顯示混合HA和CD40L免疫小鼠的存活率達(dá)到100％，只免疫HA DNA疫苗小鼠的存活率也能達(dá)到100％。
表1.致死量病毒攻擊后小鼠的存活率保護(hù)效果免疫質(zhì)粒存活數(shù)/攻擊總數(shù)HA+CD40L5/5*HA 5/5*空載體 0/5*顯著差異(P＜0.05)CD40L能夠提高小鼠抗致死量流感病毒的攻擊小鼠用致死量流感病毒攻擊后，小鼠的保護(hù)率沒(méi)有區(qū)別，然而小鼠攻擊后體重變化有不同，如圖1所示。供試小鼠共免疫兩次，間隔三周。加強(qiáng)免疫后一周，用致死量流感病毒攻擊。在0～14天監(jiān)視小鼠的體重變化和死亡。圖中體重丟失為小鼠的平均體重。其中對(duì)照組小鼠在第7天全部死亡，免疫HA組和HA+CD40L組小鼠全部存活。結(jié)果表明與單獨(dú)免疫HA相比，共同免疫HA和CD40L組小鼠體重丟失明顯減少且體重恢復(fù)加速。雖然在我們以前的實(shí)驗(yàn)中已得到證明，30μgHA已經(jīng)能夠完全提供保護(hù)，但是病毒攻擊后，小鼠的體重下降較多，而共同免疫HA和CD40L后，小鼠的體重減輕很少，且體重恢復(fù)很快，而體重丟失是A型流感病毒感染小鼠后一個(gè)非常明顯的臨床癥狀。這說(shuō)明共同免疫HA和CD40L DNA疫苗組小鼠體內(nèi)的病毒量要低于只免疫了HA DNA疫苗的實(shí)驗(yàn)小鼠。
共同免疫HA和CD40L DNA疫苗提高了IgG抗體的滴度用ELISA法測(cè)血清中的IgG抗體。我們發(fā)現(xiàn)與單獨(dú)免疫HA相比，無(wú)論是初免還是加強(qiáng)免疫后，共同免疫HA和CD40L明顯的提高了抗HA的IgG抗體產(chǎn)生(圖2)，且加強(qiáng)免疫后的抗體水平高于初免后的抗體水平。
(圖2A)小鼠初免后三周通過(guò)斷尾法從尾部取血，測(cè)血清中的抗HA的IgG抗體，血清以1∶200稀釋；(圖2B)加強(qiáng)免疫后通過(guò)心臟取血，測(cè)血清中的抗HA的IgG抗體，血清以1∶4096稀釋。共同免疫HA和CD40L后增強(qiáng)了小鼠抗HA的特異性抗體。豎條和豎線分表代表同型抗原光吸收值的平均值和SD。
*顯著差異p＜0.05，使用Student t test。
CD40L與HA共同免疫后IgG抗體亞型的變化為了檢測(cè)CD40L質(zhì)粒是否影響IgG抗體亞型的變化，加強(qiáng)免疫后我們檢測(cè)了抗HA的特異性血清IgG中IgG1和IgG2a的相對(duì)數(shù)量，如圖3所示，每組小鼠10只，免疫兩次，間隔三周，每組劑量為30μg HA，30μg HA+30μg CD40L。加強(qiáng)免疫后一周用致死量流感病毒攻擊，三天后，每組小鼠取五只從心臟取血。以1∶2048倍稀釋時(shí)測(cè)光吸收值。豎條和豎線分表代表同型抗原光吸收值的平均值和SD。
*顯著差異p＜0.05，使用Student t test。
結(jié)果表明共同免疫HA和CD40L后，稍微提高了抗HA特異性的IgG1抗體，但I(xiàn)gG2a抗體顯著提高，表明CD40L偏向于Th1型免疫應(yīng)答，Th1型免疫應(yīng)答在抗病毒作用中扮演非常重要的角色。
本發(fā)明所采用流感病毒DNA疫苗佐劑與傳統(tǒng)用于傳染病預(yù)防的疫苗及其佐劑相比，有以下特點(diǎn)(1)、本發(fā)明使用免疫佐劑可減少核酸疫苗的使用量，減少核酸疫苗的安全性隱患。
(2)、本發(fā)明不僅增強(qiáng)了免疫動(dòng)物的肌體體液應(yīng)答反應(yīng)，同時(shí)增強(qiáng)了細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，而后者是提高DNA疫苗效率的重要前提條件。
(3)、本發(fā)明的DNA疫苗容易生產(chǎn)，穩(wěn)定性強(qiáng)，較安全。干燥的DNA小粒在室溫下相對(duì)穩(wěn)定，不需要冷藏設(shè)備，因此對(duì)邊遠(yuǎn)地區(qū)的使用也較為方便。DNA疫苗在接種前即刻加水就能簡(jiǎn)單地恢復(fù)原狀，這在經(jīng)濟(jì)上和公共衛(wèi)生方面都是有利的。
(4)本發(fā)明的制備方法簡(jiǎn)便，價(jià)格低廉。DNA疫苗僅需在細(xì)菌中生產(chǎn)，構(gòu)建高效表達(dá)質(zhì)粒，與普通疫苗相比，DNA疫苗的制作省去了抗原提取和純化等繁瑣耗時(shí)的過(guò)程，使得制備周期大大縮短。
(5)本發(fā)明免疫應(yīng)答持久，由于外源基因可以在體內(nèi)存在較長(zhǎng)時(shí)間，并不斷表達(dá)外源蛋白，它可以持續(xù)地給免疫系統(tǒng)提供刺激，因此，很微量的抗原即可刺激機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)而持久的免疫應(yīng)答。
總的來(lái)說(shuō)，CD40L與HA共同免疫能夠增強(qiáng)流感病毒表面抗原HA基因的免疫應(yīng)答，能夠更有效的保護(hù)動(dòng)物抗致死量流感病毒的攻擊，是一種有廣闊應(yīng)用前景的流感病毒DNA疫苗。
權(quán)利要求
1.一種預(yù)防流感病毒的DNA疫苗，其特征在于該疫苗是用CD40L作佐劑的預(yù)防流感病毒的DNA疫苗，HA DNA疫苗與CD40L以1∶1的質(zhì)量比共同免疫。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種預(yù)防流感病毒DNA疫苗。本發(fā)明采用CD40L與流感病毒DNA共同免疫動(dòng)物，誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生的免疫應(yīng)答能很好的保護(hù)小鼠抗致死量流感病毒攻擊，抗流感效果好于不加CD40L的DNA疫苗。本發(fā)明DNA疫苗免疫動(dòng)物，制備方法簡(jiǎn)便、價(jià)格低廉，使用方便，免疫效果好，克服了已知流感預(yù)防制品的不足，提供了一種較為安全、有效的流感預(yù)防制品。
文檔編號(hào)A61K48/00GK1544089SQ200310110549
公開(kāi)日2004年11月10日 申請(qǐng)日期2003年11月21日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月21日
發(fā)明者陳則, 則 陳 申請(qǐng)人:湖南師范大學(xué)