專利名稱：新的人輪狀病毒株和疫苗的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明主要涉及病毒疫苗株及其相關疫苗組合物和方法。更具體地，本發(fā)明涉及引起受試者體內(nèi)對輪狀病毒A的免疫反應的人輪狀病毒A疫苗株、疫苗組合物和使用方法。
背景技術(shù)：
在多種引起兒童嚴重腹瀉的腸道病原性病毒中，輪狀病毒是最常見的，它導致每年平均611，000例死亡。幾乎所有兒童在5歲前都會被輪狀病毒感染。所述病毒被認為是高度傳染性的，并被描述為“平等”病毒，因為其感染的影響沒有特別的社會經(jīng)濟或地理群的差異。盡管大部分兒童能夠得到足夠的支持性和緩解性醫(yī)療護理，挺過感染而不出現(xiàn)明顯的長期后果，然而與嚴重腹瀉、嘔吐、脫水和休克有關的死亡數(shù)目是不能接受的，并且在可能的情況下需要預防性干預。輪狀病毒A是一種具有特有輻射狀形態(tài)的呼腸孤病毒科(reoviridae)的二十面體病毒。具體輪狀病毒根據(jù)病衣殼蛋白的特征按群(group)、亞群(subgroup)和血清型分類。輪狀病毒顆粒含有圍繞病毒基因組的3個蛋白層，所述病毒基因組由11段雙鏈RNA組成，每段編碼一個蛋白。所述病毒蛋白包括稱為VP的結(jié)構(gòu)蛋白和稱為NSP的非結(jié)構(gòu)蛋白。若干結(jié)構(gòu)蛋白對引發(fā)宿主體內(nèi)的免疫反應特別重要，因為這些蛋白位于所述病毒顆粒的最外層上。具體而言，蛋白VP7和VP4均在很大程度上參與宿主免疫反應，并因此還在輪狀病毒疫苗的開發(fā)中起中心作用。VP7和VP4結(jié)構(gòu)蛋白的變體可表征不同的輪狀病毒A血清型。具體而言，人VP7的變體被確定為“G”血清型，至少包括血清型Gl、G2、G3、G4以及較少見的G5、G6、G8、G9、G10、Gil、G12、G13和G14。VP4結(jié)構(gòu)蛋白的變體被確定為“P”血清型，包括P1A、P1B、P2A、P3、P4、P5、P6和P8。由于完整的輪狀病毒同時為VP7蛋白和VP4蛋白所表征，因此各個病毒血清型根據(jù)具體病毒中包含的這兩種蛋白的變體特性而命名。例如，常見的輪狀病毒A同時包含Gl和P [8]變體，它們分別是VP7和VP4的變體。輪狀病毒A的G1，P [8]血清型是在全世界引起疾病的最常見病毒形式之一。輪狀病毒A的Gl血清型是在全世界與人疾病有關的最常見血清型。已經(jīng)開發(fā)出若干使用輪狀病毒A Gl株的疫苗，目的是在宿主中形成對輪狀病毒A Gl株以及具有其他血清型的輪狀病毒A株的免疫性。然而，此方法受到Gl和G2血清型之間重大不同的限制。具體而言，輪狀病毒A G2株來源于與大多數(shù)其他輪狀病毒株不同的世系。這被核酸雜交實驗證明，所述實驗顯示被稱為DS-I遺傳組的G2株的11個基因區(qū)段的標記轉(zhuǎn)錄物不與包括G1、G3、G4和G9的被稱為Wa遺傳組的輪狀病毒A株中的相應核酸雜交。這些同源基因無法雜交表明例如外衣殼蛋白VP4和VP7以及內(nèi)衣殼蛋白VP6的編碼蛋白的差異是顯著的。這些遺傳差別支持以下觀點使用Gl株感染或免疫的個體不太可能表現(xiàn)出對Wa遺傳組的其他病毒株那樣的對G2株的交叉保護。除了常見的Gl和G2輪狀病毒A株以外，人們逐漸認識到人輪狀病毒類型的多樣性是造成全世界急性嚴重腹瀉疾病的原因。這種多樣性突出了對能夠?qū)θ舾芍戤a(chǎn)生免疫性的強效疫苗的要求。最近，美國食品和藥物管理局因其制品中有污染物而暫停了 R0TARIX疫苗的使用。因此，當輪狀病毒感染仍是一個嚴重的世界性問題的時候，可用的輪狀病毒疫苗的數(shù)量卻減少了。另一種疫苗RotaTeq 對于防止中、高收入國家兒童腹瀉似乎是安全和有效的，目前已被授權(quán)并推薦用于全世界的嬰幼兒。然而，此疫苗在亞非低收入國家的功效降低。因此，仍需要針對常見和不太常見類型的人輪狀病毒A的疫苗。


圖IA是電子顯微照片的復本，示出了完整的分離輪狀病毒A病毒粒子，該病毒粒子被確定為具有血清型P [8]，Gl的病毒株CDC-9。圖IB是電子顯微照片的復本，示出了完整的分離輪狀病毒A病毒粒子，該病毒粒子被確定為具有血清型P [4]，G2的病毒株⑶C-66。圖2是聚丙烯酰胺凝膠圖像的副本，示出了從糞便樣本(S)和VeiO細胞(V)分離的輪狀病毒A株CDC-9的RNA譜，并示出了該輪狀病毒株的典型長RNA的電泳型。圖3是聚丙烯酰胺凝膠圖像的復本，示出了從糞便樣品(S)和VeiO細胞(V)分離的輪狀病毒A株CDC-66的RNA譜，并示出了該輪狀病毒株的典型短RNA的電泳型。圖4A示出了 CsCl純化的輪狀病毒A株⑶C_9的輪狀病毒顆粒的帶。圖4B示出了輪狀病毒A株⑶C-9的確定結(jié)構(gòu)病毒蛋白，通過SDS-PAGE分析，與分子量標記對比。圖5A是柱形圖，示出了對照和接種小鼠中對熱滅活的輪狀病毒的總抗體滴度。圖5B是柱形圖，示出了對照和接種小鼠中對熱滅活的輪狀病毒的中和抗體滴度。圖6是柱形圖，示出了在對照和接種小鼠中對與Al (0!1)3配制的熱滅活的輪狀病毒的總血清抗體滴度。圖7A示出了用無抗原的750微克磷酸鋁接種的4只小豬的糞便樣品中的病毒脫落。圖7B示出了用無佐劑的抗原免疫的小豬的糞便樣品中的病毒脫落。圖7C示出了用抗原和佐劑免疫的小豬的糞便樣品中的病毒脫落。圖7D示出了在只用緩沖液免疫的小豬的糞便樣品中測得的病毒脫落。圖8A是柱形圖，示出了在用無抗原的600微克磷酸鋁(實心柱)接種的小豬或者用50微克抗原和600微克磷酸鋁(陰影柱)接種的小豬的血清中的輪狀病毒特異性IgG抗體反應。圖8B是柱形圖，示出了在用無抗原的600微克磷酸鋁接種的小豬或者用50微克抗原和600微克磷酸鋁接種的小豬的血清中的中和抗體反應。
圖9A示出了用無抗原的600微克磷酸鋁接種的小豬的糞便樣品中的病毒脫落。圖9B示出了用50微克抗原和600微克磷酸鋁接種的小豬的糞便樣品中的病毒脫落。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種疫苗組合物，包括一種或多種分離輪狀病毒株例如株CDC-9或CDC-66和可藥用載體。本發(fā)明的疫苗任選包括佐劑。本發(fā)明疫苗中的CDC-9或CDC-66株任選是減毒活輪狀病毒或者滅活輪狀病毒。應理解，本發(fā)明的疫苗任選包括至少兩種分離輪狀病毒株。所述至少兩種分離輪狀病毒株各自獨立地具有61、62、63、64、65、66、67、68、69、610、611、612、613或614 的 G 群血清型。任選地，所述至少兩種分離輪狀病毒株各自獨立地具有P1A、P1B、P2A、P3、P4、P5、P6、P8、P11或P12的P群血清型。 本發(fā)明的疫苗任選非經(jīng)腸給藥或經(jīng)口給藥。本發(fā)明還提供分離的輪狀病毒株，例如⑶C-9或⑶C-66株。本發(fā)明提供了一種疫苗，其包含與可藥用載體混合的特征在于具有Gl群血清型的分離輪狀病毒株和特征在于具有G2群血清型的輪狀病毒株。所述Gl或G2群血清型病毒株任選各自獨立地具有P1A、P1B、P2A、P3、P4、P5、P6、P8、Pll或P12的P群血清型。在某些實施方案中，所述特征在于具有Gl群血清型的人輪狀病毒株是CDC-9，所述特征在于具有G2群血清型的人輪狀病毒株是⑶C-66。本發(fā)明提供了一種誘導受試者體內(nèi)對輪狀病毒的免疫反應的方法，包括給予疫苗組合物，所述疫苗組合物包含與可藥用載體混合的分離人輪狀病毒株CDC-9或CDC-66。本發(fā)明提供了一種誘導受試者體內(nèi)對輪狀病毒的免疫反應的方法，其包括給予疫苗組合物，所述疫苗組合物包含與可藥用載體混合的特征在于具有Gl群血清型的分離人輪狀病毒株和特征在于具有G2群血清型的分離人輪狀病毒株。本發(fā)明還提供了一種疫苗，所述疫苗包含與可藥用載體混合的分離人輪狀病毒的一部分。所述分離人輪狀病毒的一部分是肽或多肽，所述肽或多肽包括SEQ ID No. 2 ；SEQID No. 5 ；SEQ ID No. 8 ；SEQ ID No. 11 ；SEQ ID No. 14 ；SEQ ID No. 17 ；SEQ ID No. 20 ；SEQ IDNo. 23 ；SEQ ID No. 26 ；SEQ ID No. 29 ；SEQ ID No. 32 ；SEQ ID No. 3 ；SEQ ID No. 6 ；SEQ IDNo. 9 ；SEQ ID No. 12 ；SEQ ID No. 15 ；SEQ ID No. 18 ；SEQ ID No. 21 ；SEQ ID No. 24 ；SEQ IDNo. 27 ；SEQ ID No. 30 ；SEQ ID No. 33 ；SEQ ID No. 71 ；SEQ ID No. 77 ；SEQ ID No. 83 ；SEQ IDNo. 89 ；SEQ ID No. 95 ；SEQ ID No. 101 ；SEQ ID No. 107 ；SEQ ID No. 113 ；SEQ ID No. 119 ；SEQID No. 125 ；SEQ ID No. 131 ；SEQ ID No. 72 ；SEQ ID No. 78 ；SEQ ID No. 84 ；SEQ ID No. 90 ；SEQ ID No. 96 ；SEQ ID No. 102 ；SEQ ID No. 108 ；SEQ ID No. 114 ；SEQ ID No. 120 ；SEQ IDNo. 126 ；SEQ ID No. 132的氨基酸序列；其同源物或其片段。
具體實施例方式根據(jù)本發(fā)明的實施方案，提供了新的分離人輪狀病毒A株、包含人輪狀病毒A株的疫苗、包含人輪狀病毒A多肽和/或其免疫原性片段的疫苗、抗輪狀病毒A抗體和接種人對抗輪狀病毒A疾病的方法。
本文使用的科技術(shù)語意圖具有本領域技術(shù)人員通常理解的含義。這些術(shù)語在多本教科書/參考書的上下文中有定義并被使用，包括例如，這些J. Samtoookand D. ff. Russell, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring HarborLaboratory Press ；3rd Ed. ,2001 ；F. M. Ausubel, Ed. , Short Protocols in MolecularBiology, Current Protocols ；5th Ed. ,2002 ；B.Alberts et al. , Molecular Biologyof the Cell,4th Ed. , Garland,2002 ；D. L. Nelson and M. M. Cox, Lehninger Principlesof Biochemistry,4th Ed. , ff. H. Freeman & Company, 2004 ;WiId, D. , The ImmunoassayHandbook,3rd Ed. , Elsevier Science, 2005 ；Gosling, J. P., Immunoassays A PracticalApproach, Practical Approach Series, Oxford University Press,2005 ；AntibodyEngineering, Kontermann, R. and Dijbel S. (Eds.), Springer, 2001 ；Harlow, E. and Lane,D. , Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press,1988 ；Ausubel, F. et al. , (Eds.), Short Protocols in Molecular Biology, Wiley,2002 ；J. D. Pound(Ed. ) Immunochemical Protocols, Methods in Molecular Biology, HumanaPress ；2nd ed. ,1998 ；B.K. C. Lo(Ed. ), Antibody Engineering Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, Humana Press, 2003 ;和 Kohler, G. and Milstein, C,Nature，256 :495-497 (1975)，這些教科書/參考書的內(nèi)容均以引用的方式納入本文。人輪狀病毒本發(fā)明的新的人輪狀病毒A株例如被確定為⑶C-9和⑶C-66、其片段或其同源物。0)09輪狀病毒A株從Providence, Rhode Island的5月齡男孩的糞便樣品中分離。人輪狀病毒株CDC-9通過使用G-和P-型特異性引物的RT-PCR表征。RT-PCR分析表明分離的病毒株CDC-9是具有基因型(genotype)P[8], Gl的病毒株。Esona, MD, et al.,Human Vaccines, 2010 ；6 :1_7描述了 CDC-9的具體特征，其鑒定、分離和在Vero細胞中的傳代，該文獻的全部內(nèi)容以引用的方式納入本文。從糞便樣品分離后，使分離輪狀病毒株⑶C-9適應在MA104細胞中生長，MA104細胞在1980年之前制備和冷凍并有完備的記錄。然后，使⑶C-9病毒株適應在可用于疫苗生產(chǎn)的VeiO細胞中生長。將⑶C-9通過進行3輪有限稀釋純化，并且在VeiO細胞中擴增后通過進行3輪噬菌斑測定進一步純化。所分離的病毒株⑶C-9分別在MA104和Vero細胞中傳7和38代(共45代)。所述適應和全部傳代都是使用標準操作方法和合格原材料及試劑并在Good Laboratory Practice Guidelines指導下完成。與其他參考病毒株或?qū)嶒炇也《局瓴煌?，所分尚的病毒株CDC-9具有完整的傳代史和記錄。傳代的人輪狀病毒株CDC-9的滴度為約107ffu/ml。使用從感染的Vero細胞培養(yǎng)物的培養(yǎng)基分離的CDC-9病毒粒子通過電子顯微術(shù)研究分離的人輪狀病毒株CDC-9。圖IA示出了分離CDC-9病毒粒子的電子顯微照片。所述顯微照片顯示所述病毒粒子具有人輪狀病毒A病毒粒子的典型形態(tài)。使用從人輪狀病毒株CDC-9分離的RNA的聚丙烯酰胺凝膠電泳進一步檢測所述分離的人輪狀病毒株。如圖2所示，CDC-9具有典型的長RNA電泳型，并且來自糞便的原始分離株和VeiO傳代的輪狀病毒的RNA譜是相同的。圖2還示出了比較用標準品，包括Wa基因群(genogroup)人輪狀病毒的RNA譜。通過全基因組的序列分析分析了在糞便和Vero細胞(第27代)中的分離的人輪狀病毒株⑶C_9。從糞便樣品分離的核酸編碼的蛋白的⑶C9氨基酸序列⑶C9 NSPl aa_糞便是SEQ ID No. 2 ；CDC9 NSP2 aa_ 糞便是 SEQ ID No. 5 ；CDC9 NSP3 aa_ 糞便是 SEQ ID No. 8 ；CDC9 NSP4 aa-糞便是 SEQ ID No. 11 ；CDC9 NSP5 aa_ 糞便是 SEQ ID No. 14 ；CDC9 VPlaa-糞便是 SEQ ID No. 17 ；CDC9 VP2 aa-糞便是 SEQ ID No. 20 ；CDC9 VP3 aa-糞便是 SEQID No. 23 ；CDC9 VP4 aa-糞便是 SEQ ID No. 26 ；CDC9 VP6 aa-糞便是 SEQ ID No. 29 ；CDC9VP7 aa-糞便是 SEQ ID No. 32。從糞便樣品分離的核酸的CDC9核苷酸序列CDC9 NSPl nt_糞便是SEQ ID No. 35 ；CDC9 NSP2 nt-糞便是 SEQ ID No. 38 ；CDC9 NSP3 nt_ 糞便是 SEQ ID No. 41 ；CDC9 NSP4nt-糞便是 SEQ ID No.44;CDC9 NSP5 nt-糞便是 SEQ ID No. 47 ;CDC9 VPlnt-糞便是 SEQID No. 50 ；CDC9 VP2 nt-糞便是 SEQ ID No. 53 ；CDC9 VP3 nt-糞便是 SEQ ID No. 56 ；CDC9VP4 nt-糞便是 SEQ ID No. 59 ；CDC9 VP6 nt-糞便是 SEQ ID No. 62 ；CDC9 VP7 nt-糞便是SEQ ID No. 65。從分離自Vero細胞的第27代⑶C9輪狀病毒分離的核酸編碼的蛋白的⑶C9氨基酸序列CDC9 NSPl aa-Vero 是 SEQ ID No. 3 ;CDC9 NSP2 aa-Vero 是 SEQ ID No. 6 ;CDC9NSP3 aa-Vero 是 SEQ ID No. 9 ;CDC9 NSP4 aa-Vero 是 SEQ ID No. 12 ;CDC9 NSP5 aa-Vero是 SEQ ID No. 15 ;CDC9 VPl aa-Vero 是 SEQ ID No. 18 ;CDC9 VP2 aa-Vero 是 SEQ IDNo. 21 ；CDC9 VP3 aa-Vero 是 SEQ ID No. 24 ;CDC9 VP4 aa-Vero 是 SEQ ID No. 27 ;CDC9 VP6aa-Vero 是 SEQ ID No. 30 ;CDC9 VP7 aa-Vero 是 SEQ ID No. 33。從分離自Vero細胞的第27代⑶C9輪狀病毒分離的核酸的⑶C9核苷酸序列CDC9 NSPl nt-Vero 是 SEQ ID No. 36 ;CDC9NSP2 nt-Vero 是 SEQ ID No. 39 ;CDC9 NSP3nt-Vero 是 SEQ ID No. 42 ;CDC9 NSP4 nt-Vero 是 SEQ ID No. 45 ;CDC9 NSP5nt_Vero 是 SEQID No.48;CDC9 VPl nt-Vero 是 SEQ ID No. 51 ;CDC9 VP2 nt-Vero 是 SEQ ID No. 54 ;CDC9VP3 nt-Vero 是 SEQ ID No. 57 ;CDC9 VP4 nt-Vero 是 SEQ ID No. 60 ;CDC9VP6 nt-Vero 是SEQ ID No. 63 ;CDC9 VP7 nt-Vero 是 SEQ ID No. 66。如本文所示的，將從糞便和感染的培養(yǎng)物分離的CDC-9輪狀病毒的全基因組的核苷酸和氨基酸序列與從輪狀病毒A的參考KU病毒株或其他G1P8病毒株的全基因組的氨基酸和核苷酸序列進行比較。此外，如表2所示，⑶C-9基因(除了區(qū)段3)與原型P [8]，Gl人KU病毒株的相應
基因具有聞度序列同一性。表2.輪狀病毒株⑶C-9基因區(qū)段與原型輪狀病毒株KU的同族基因序列(cognategene sequence)相比的核苷酸(NT)和推定氨基酸(AA)的同一'丨生百分比
權(quán)利要求
1.ー種用于誘導受試者體內(nèi)對輪狀病毒的免疫反應的疫苗組合物，包含 與可藥用載體混合的分離輪狀病毒株⑶C-9或⑶C-66。
2.權(quán)利要求I的疫苗組合物,還包括佐劑。
3.權(quán)利要求I的疫苗組合物，其中所述分離人輪狀病毒株是減毒活輪狀病毒。
4.權(quán)利要求I的疫苗組合物，其中所述分離人輪狀病毒株是滅活輪狀病毒。
5.權(quán)利要求I的疫苗組合物，包含至少兩種分離輪狀病毒株。
6.權(quán)利要求5的疫苗組合物，其中所述至少兩種分離輪狀病毒株各自獨立地具有G1、G2、G3、G4、G5、G6、G7、G8、G9、G10、G11、G12、G13 或 G14 的 G 群血清型。
7.權(quán)利要求5或6的疫苗組合物，其中所述至少兩種分離輪狀病毒株各自獨立地具有P1A、P1B、P2A、P3、P4、P5、P6、P8、P11 或 P12 的 P 群血清型。
8.權(quán)利要求I的疫苗組合物，其被配制用于對受試者非經(jīng)腸給藥。
9.權(quán)利要求I的疫苗組合物，其被配制用于對受試者經(jīng)ロ給藥。
10.⑶C-9或⑶C-66的分離輪狀病毒株。
11.ー種用于誘導受試者體內(nèi)對輪狀病毒的免疫反應的疫苗組合物，包含 與可藥用載體混合的特征在于具有Gl群血清型的分離輪狀病毒株和特征在于具有G2群血清型的分尚輪狀病毒株。
12.權(quán)利要求11的疫苗組合物，其中所述特征在于具有Gl群血清型的人輪狀病毒株和所述特征在于具有G2群血清型的人輪狀病毒株各自獨立地具有P1A、P1B、P2A、P3、P4、P5、P6、P8、P11或P12的P群血清型。
13.權(quán)利要求11的疫苗組合物，其中所述特征在于具有Gl群血清型的人輪狀病毒株是CDC-9。
14.權(quán)利要求11的疫苗組合物，其中所述特征在于具有G2群血清型的人輪狀病毒株是CDC-66。
15.ー種用于誘導受試者體內(nèi)對輪狀病毒的免疫反應的方法，包括 給予包含與可藥用載體混合的分離人輪狀病毒株CDC-9或CDC-66的疫苗組合物。
16.ー種用于誘導受試者體內(nèi)對輪狀病毒的免疫反應的方法，包括 給予包含與可藥用載體混合的特征在于具有Gl群血清型的分離人輪狀病毒株和特征在于具有G2群血清型的分離人輪狀病毒株的疫苗組合物。
17.ー種用于誘導受試者體內(nèi)對輪狀病毒的免疫反應的疫苗組合物，包含 與可藥用載體混合的分離人輪狀病毒的一部分。
18.權(quán)利要求17的疫苗組合物，其中所述分離的人輪狀病毒的一部分是肽或多肽，所述肽或多肽包含 SEQ ID No. 2 ；SEQ ID No. 5 ；SEQ ID No. 8 ；SEQ ID No. 11 ；SEQ ID No. 14 ；SEQID No. 17 ; SEQ ID No. 20 ；SEQ ID No. 23 ；SEQ ID No. 26 ；SEQ ID No. 29 ；SEQ ID No. 32 ；SEQ IDNo. 3 ；SEQ ID No. 6 ；SEQ ID No. 9 ；SEQ ID No. 12 ；SEQ ID No. 15 ；SEQ ID No. 18 ；SEQ ID No. 21 ；SEQ ID No. 24 ；SEQ ID No. 27 ；SEQ ID No. 30 ；SEQ ID No. 33 ；SEQ ID No. 71 ；SEQ ID No. 77 ；SEQID No. 83 ；SEQ ID No. 89 ；SEQ ID No. 95 ；SEQ ID No. 101 ；SEQ ID No. 107 ；SEQ ID No. 113 ；SEQID No. 119 ；SEQ ID No. 125 ；SEQ ID No. 131；SEQ ID No. 72 ；SEQ ID No. 78 ；SEQ ID No. 84 ；SEQID No. 90 ；SEQ ID No. 96 ；SEQ ID No. 102 ；SEQ ID No. 108 ；SEQ ID No. 114 ；SEQ ID No. 120 ；SEQ ID No. 126 ；SEQ ID No. 132的氨基酸序列；其同源物；或其片段。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用于針對輪狀病毒免疫受試者的疫苗組合物和免疫方法。所述疫苗包含輪狀病毒株CDC-9和CDC-66、其片段、其同源物或它們的結(jié)合物。本發(fā)明的疫苗可包含CDC-9、CDC-66的片段、其同源物、或其結(jié)合物。本發(fā)明還提供了通過給予本發(fā)明的疫苗誘導免疫反應的方法。
文檔編號A61K39/12GK102695522SQ201080031412
公開日2012年9月26日 申請日期2010年5月12日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月12日
發(fā)明者J·根奇, R·I·格拉斯, 江保明, 王玉環(huán) 申請人:美國政府(由衛(wèi)生和人類服務部、疾病控制和預防中心的部長所代表)