專利名稱：具有堿性α－淀粉酶活性的多肽及其編碼核酸的制作方法
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及具有α-淀粉酶活性的分離的多肽和編碼所述多肽的核酸序列。此外，本發(fā)明涉及本發(fā)明α-淀粉酶的變體。本發(fā)明還涉及含有所述核酸序列的核酸構(gòu)建體、載體和宿主細(xì)胞以及生產(chǎn)和利用所述多肽的方法。另外，本發(fā)明還涉及用于洗衣、洗碗碟和/或硬表面清潔的組合物。
現(xiàn)有技術(shù)描述多年來(lái)以將α-淀粉酶用于各種不同的目的，其中最重要的是淀粉液化、織物脫漿、在造紙和漿工業(yè)中的淀粉改性，以及用于釀酒和烤面包。α-淀粉酶的另一用途，而且是越來(lái)越重要的用途是在堿性pH下與洗滌劑一起在洗滌過(guò)程中除去淀粉樣斑跡。
商業(yè)化的α-淀粉酶產(chǎn)品有Termamyl_、DuramylTM、Natalase_、BAN_和Fungamyl_，所有這些產(chǎn)品均出自丹麥的Novo Nordisk A/S。這些以及來(lái)自其他公司的類似產(chǎn)品都具有酸性至中性的最佳pH，通常為pH5-pH7.5，因此在堿性pH的洗滌劑溶液中不能表現(xiàn)出最佳活性。
WO95/26397公開(kāi)了一種來(lái)自芽孢桿菌菌株的α-淀粉酶。
WO96/23873描述了在洗滌條件下具有改善的性能的芽孢桿菌淀粉酶變體。
US 5,147,796描述了具有α-淀粉酶活性的堿性支鏈淀粉酶。該文獻(xiàn)的圖2b表明最佳淀粉酶活性在pH8-8.5。
M.Takagi等在發(fā)酵生物工程雜志(J.Ferment.Bioeng.，vol 81，No.6，557-559(1996))上描述了一種來(lái)自芽孢桿菌屬的親堿性的α-淀粉酶-支鏈淀粉酶。該酶的最佳淀粉酶活性在pH9，但在較高pH活性迅速降低，在pH10的活性比在pH7的活性低。
WO97/00324(KAO)公開(kāi)了編碼適用于洗滌劑的芽孢桿菌屬菌株KSMAP1378堿性液化α-淀粉酶的基因，該菌株的保藏號(hào)為FERM BP-3048。
本發(fā)明的目的是提供一種在堿性溶液，特別是在pH9-11的堿性洗滌劑溶液中具有改善的性能的新α-淀粉酶。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及具有α-淀粉酶活性的分離的多肽，該多肽具有選自下列的一種或多種特征或特性(a)與SEQ ID NO2或SEQ ID NO4的成熟多肽氨基酸1-485有至少85％同一性的多肽；(b)由在中度嚴(yán)謹(jǐn)條件下與(i)SEQ ID NO1或SEQ ID NO3的核酸序列，(ii)SEQ ID NO1或SEQ ID NO3的cDNA序列，(iii)(i)或(ii)的至少100個(gè)核苷酸的亞序列，或(iv)(i)、(ii)或(iii)的互補(bǔ)鏈雜交的核酸序列編碼的多肽；(c)(a)或(b)的等位基因變體；(d)(a)、(b)或(c)的具有α-淀粉酶活性的片段；(e)在堿性洗滌劑溶液，特別是在pH9-11左右，最佳pH9-10.5左右的堿性洗滌劑溶液中具有改善的洗滌性能的多肽；(f)用Phadebas方法(pH9.0)確定的最佳溫度為55-65℃的多肽；和(g)用等電聚焦(Pharmacia，Ampholine，pH3.5-9.3)確定的pI為7-8的多肽。
應(yīng)理解本發(fā)明的α-淀粉酶具有上述一種或多種特征。
此外，本發(fā)明還涉及本發(fā)明α-淀粉酶的變體。本發(fā)明還涉及編碼所述多肽的分離的核酸序列和含所述核酸序列的核酸構(gòu)建體、載體和宿主細(xì)胞以及生產(chǎn)和利用所述多肽的方法。
附圖簡(jiǎn)述進(jìn)一步參考


本發(fā)明，其中圖1是各種芽孢桿菌α-淀粉酶的排列。
圖2是α-淀粉酶AAI-6和AAI-10與α-淀粉酶SP722和SP690進(jìn)行比較的pH圖譜。所述活性是以Abs650/mg表示的絕對(duì)值。pH圖譜是在37℃測(cè)量的。
圖3是α-淀粉酶AAI-6和AAI-10在pH9.0時(shí)與對(duì)照α-淀粉酶SP722和SP690進(jìn)行比較的溫度圖譜。
圖4是在AP型洗滌劑97(AP Model Detergent 97)中AAI-6和AAI-10與SP722、SP690和Termamyl_相比的洗滌性能。
圖5是在Omo Multi Acao中AAI-6和AAI-10與SP722、SP690和Termamyl_相比的洗滌性能。
圖6是在Omo Concentrated中AAI-6和AAI-10與SP722、SP690和Termamyl_相比的洗滌性能。
圖7是在Ariel Futur液體中AAI-6和AAI-10與SP722、SP690和Termamyl_相比的洗滌性能。
發(fā)明詳述微生物來(lái)源本發(fā)明的堿性α-淀粉酶來(lái)源于芽孢桿菌屬的菌株。優(yōu)選的菌株是芽孢桿菌DSM 12650(AAI-6α-淀粉酶)或DSM 12651(AAI-10α-淀粉酶)。根據(jù)有關(guān)用于專利程序的微生物保藏的布達(dá)佩斯條約的規(guī)定，本發(fā)明人于1999年1月25日將這些菌株保藏在德意志微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(DSMZ)，Mascheroder Weg 1b，D-38124 Braunschweig DE。
根據(jù)有關(guān)用于專利程序的微生物保藏的布達(dá)佩斯條約的規(guī)定，本發(fā)明人已于1999年4月7日將分別含質(zhì)粒pLiH1300(AAI-6)和pLiH1298(AAI10)中的α-淀粉酶基因的大腸桿菌菌株NN049469和NN049468保藏在德意志微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(DSMZ)，Mascheroder Weg 1b，D-38124Braunschweig DE，保藏號(hào)分別為DSM12763和DSM12762。上述被保藏的芽孢桿菌屬供體生物是1997年在冰島收集的。
具有α-淀粉酶活性的多肽α-淀粉酶(α-1，4葡聚糖-4-葡聚糖水解酶，EC3.2.1.1)構(gòu)成一組酶，其催化淀粉和其它線性和支鏈1，4-糖苷寡-和多糖的水解。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，采用下面“材料和方法”部分中描述的Phadebas分析方法或pNPG7分析方法測(cè)定α-淀粉酶的活性。
酶的同系物在第一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及分離的多肽，所述多肽含有與SEQ IDNO2或SEQ ID NO4(即成熟多肽)的氨基酸1-485有至少約85％，優(yōu)選至少約90％，優(yōu)選至少約93％，更優(yōu)選至少約95％，更優(yōu)選至少97％，最佳99％同源性的具有α-淀粉酶活性的氨基酸序列(下文稱為同源多肽)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述同源多肽具有與SEQ ID NO2或SEQ ID NO4的氨基酸1-485有5個(gè)氨基酸，優(yōu)選4個(gè)氨基酸，更優(yōu)選3個(gè)氨基酸，更優(yōu)選2個(gè)氨基酸，最佳一個(gè)氨基酸不同的氨基酸序列。
氨基酸序列同源性可以根據(jù)兩個(gè)序列間的同一性程度確定，其表明第一序列衍生自第二序列。同源性可通過(guò)現(xiàn)有技術(shù)中已知的計(jì)算機(jī)程序來(lái)適當(dāng)?shù)販y(cè)定。因此，可用GCG第8版中的GAP(Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.，(1970)，分子生物學(xué)雜志，48，443-453)以默認(rèn)設(shè)置進(jìn)行序列的成對(duì)(pairwise)對(duì)比排列和相同程度或同源程度的計(jì)算。并可將GCG第9版的Gap與翻譯的第8版的肽評(píng)分矩陣，即利用ntol’s矩陣(Http//plasmid/-bioweb/matrix/)而不用末端缺口罰分的缺口創(chuàng)建罰分30和缺口延伸罰分1一起使用。
與已知芽孢桿菌α-淀粉酶的同源性已知序列的同源檢索表明按上述確定的本發(fā)明序列與許多芽孢桿菌淀粉酶有67-81％的氨基酸同源。
具體地說(shuō)，與本發(fā)明序列(即SEQ ID NO2和SEQ ID NO4)同源的α-淀粉酶是SP690(美國(guó)專利5856164的SEQ ID NO1，約有81％同源)，SP722(美國(guó)專利5856164的SEQ ID NO2，約有81％同源)以及與本發(fā)明序列有81％同源性的WO 97/00324公開(kāi)的SEQ ID NO2，該序列是得自芽孢桿菌KSM-AP1378的α-淀粉酶的成熟部分(氨基酸31-516)。
優(yōu)選，本發(fā)明的多肽含有SEQ ID NO2或SEQ ID NO4的氨基酸序列或其等位基因變體；或者其具有α-淀粉酶活性的片段。SEQ ID NO2或SEQ ID NO4是本發(fā)明堿性α-淀粉酶的成熟部分。
SEQ ID NO2或SEQ ID NO4的片段是從該氨基酸序列的氨基和/或羧基末端缺失了一個(gè)或多個(gè)氨基酸的多肽。
等位基因變體指相同染色體座位上一個(gè)基因的兩種或多種改變形式。在自然條件下，等位基因變體通過(guò)突變產(chǎn)生，因此可導(dǎo)致種群內(nèi)的多樣性。基因突變可以是沉默的(編碼的多肽沒(méi)有改變)或者可編碼氨基酸序列發(fā)生改變的多肽。多肽的等位基因變體是指由基因的等位基因變體編碼的多肽。
同源多肽的氨基酸序列可因一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的插入或缺失和/或一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代產(chǎn)生不同的氨基酸殘基而不同于SEQ IDNO2或SEQ ID NO4的氨基酸序列。優(yōu)選，氨基酸改變是微小的，即是不會(huì)顯著影響所述蛋白質(zhì)折疊和/或活性的保守氨基酸取代；小的缺失，通常指1個(gè)-30個(gè)氨基酸；小氨基-或羧基-末端的延伸，例如氨基末端甲硫氨酸殘基的延伸；多達(dá)約20-25個(gè)殘基的小連接肽；或通過(guò)改變凈電荷或另一功能，例如聚-組氨酸區(qū)、抗原表位或結(jié)合結(jié)構(gòu)域有利于純化的小延伸。
保守取代的實(shí)例可以是堿性氨基酸(精氨酸、賴氨酸和組氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、極性氨基酸(谷酰胺和天冬酰胺)、疏水氨基酸(亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)、芳族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)以及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸)。通常不會(huì)改變比活性的氨基酸取代是本領(lǐng)域已知的，并由例如H.Neurath和R.L.Hill，1979，在《蛋白質(zhì)》(In，The Proteins，Academic Press，New York)中進(jìn)行了描述。最常見(jiàn)的交換是Ala/Ser，Val/Ile，Asp/Glu，Thr/Ser，Ala/Gly，Ala/Thr，Ser/Asn，Ala/Val，Ser/Gly，Tyr/Phe，Ala/Pro，Lys/Arg，Asp/Asn，Leu/Ile，Leu/Val，Ala/Glu和Asp/Gly及其相反的交換。
在第二個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及具有α-淀粉酶活性的分離的多肽，所述多肽由在中等嚴(yán)格，優(yōu)選中等偏高嚴(yán)謹(jǐn)條件下，更優(yōu)選高度嚴(yán)謹(jǐn)條件下，最佳極端嚴(yán)謹(jǐn)條件下與下述核酸探針雜交的核酸序列編碼，所述核酸探針在同樣條件下與(i)SEQ ID NO1或SEQ ID NO3的核酸序列，(ii)SEQID NO1或SEQ ID NO3的cDNA序列，(iii)(i)或(ii)的亞序列，或者(iv)(i)、(ii)或(iii)的互補(bǔ)鏈雜交(J.Sambrook，E.F.Fritsch，和T.Maniatus，1989，《分子克隆-實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(Molecular Cloning，A Laboratory Manual)，2d edition，冷泉港，New York)。SEQ ID NO1或SEQ ID NO3的亞序列可以至少有100個(gè)核苷酸或者優(yōu)選至少200個(gè)核苷酸。此外，所述亞序列可編碼具有α-淀粉酶活性的多肽片段。所述多肽還可以是具有α-淀粉酶活性的等位基因變體或所述多肽的片段。
可按照本領(lǐng)域熟知的方法，用SEQ ID NO1或SEQ ID NO3的核酸序列或其亞序列以及SEQ ID NO2或SEQ ID NO4的氨基酸序列或其片段設(shè)計(jì)核酸探針以鑒定和克隆來(lái)自不同屬或種的編碼具有α-淀粉酶活性的多肽的DNA。具體地說(shuō)，可用所述探針與目的屬或種的基因組或cDNA雜交，然后進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)Southern印跡以便鑒定并分離相應(yīng)的基因。所述探針可以明顯短于完整序列，但至少應(yīng)有15個(gè)，優(yōu)選至少25個(gè)，更優(yōu)選至少35個(gè)核苷酸。也可以使用較長(zhǎng)的探針。DNA和RNA探針都可以使用。通常將探針加以標(biāo)記以檢測(cè)相應(yīng)的基因(例如用32P、3H、35S、生物素或抗生物素蛋白標(biāo)記)。本發(fā)明包括所述探針。
因此，從所述其他生物制備的基因組DNA或cDNA文庫(kù)可用于篩選與上述探針雜交并編碼具有α-淀粉酶活性之多肽的DNA。通過(guò)瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳或其它分離技術(shù)可分離來(lái)自所述其他生物的基因組或其他DNA?？蓪?lái)自所述文庫(kù)的DNA或分離的DNA轉(zhuǎn)移并固定在硝酸纖維素或其他適宜的載體材料上。為了鑒定與SEQ ID NO1或SEQ ID NO3或其亞序列同源的克隆或DNA，在Southern印跡中使用載體材料。為了達(dá)到本發(fā)明的目的，雜交指在中等至極端嚴(yán)格的條件下，核酸序列與對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO1或SEQ ID NO3、其互補(bǔ)鏈或其亞序列的核酸探針雜交。用X射線膠片檢測(cè)在這些條件下與所述核酸探針雜交的分子。
在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述核酸探針是分別在大腸桿菌DSM12763或大腸桿菌DSM12762內(nèi)的質(zhì)粒pLiH1300(AAI6)或質(zhì)粒pLiH1298(AAI10)中所含的核酸序列，或者其中所述核酸序列編碼具有本發(fā)明酸性α-淀粉酶活性并分別示于SEQ ID NO2或SEQ ID NO4的多肽。
對(duì)于至少100個(gè)核苷酸的長(zhǎng)探針，中等至極端嚴(yán)謹(jǐn)條件指在42℃的5XSSPE中預(yù)雜交和雜交，0.3％SDS、200微克/毫升剪切和變性鮭精DNA，35％甲酰胺是中等和中等偏高的嚴(yán)緊度，或者50％甲酰胺是高度和極端嚴(yán)緊度，然后進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)Southern印跡。
對(duì)于至少100個(gè)核苷酸的長(zhǎng)探針，用2xSSC，0.2％SDS至少在55℃(中等嚴(yán)緊度)，優(yōu)選至少60℃(中等偏高嚴(yán)緊度)，更優(yōu)選至少65℃(高嚴(yán)緊度)，最佳至少70℃(極高嚴(yán)緊度)將載體材料最后洗滌3次，每次15分鐘。
對(duì)于約15個(gè)核苷酸至約70個(gè)核苷酸的短探針，將嚴(yán)緊度定義為在0.9MNaCl、0.09M Tris-HCl pH7.6，6mM ZDFA，0.5％NP-40，1 X Denhardt’s溶液，1mM焦磷酸鈉，1mM磷酸二氫鈉，0.1mM ATP和0.2mg/ml酵母RNA中，在比按照Bolton和McCarthy(1962，《國(guó)家科學(xué)院進(jìn)展》(Proceedings ofThe National Academy of Sciences)USA 481390)計(jì)算方法計(jì)算的Tm低5℃至10℃的溫度下，進(jìn)行預(yù)雜交、雜交和雜交后洗滌，然后進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)Southern印跡。
對(duì)于約15個(gè)核苷酸至約70個(gè)核苷酸的短探針，在低于理論Tm 5℃-10℃的溫度下，將載體材料用6 X SCC加0.1％SDS洗滌一次，15分鐘，用6 XSSC洗滌兩次，每次15分鐘。
在第三個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及具有下列物理化學(xué)特性的分離的多肽，即SEQ ID NO2或SEQ ID NO4中所示多肽。
用Phadebas方法(pH9)確定的最佳溫度(參見(jiàn)圖3)為55-65℃，更精確地說(shuō)在約60℃。
用等電聚焦確定AAI-6的pI為7-7.3，AAI-10的pI為7-8。
本發(fā)明多肽具有SEQ ID NO2或SEQ ID NO4成熟多肽的α-淀粉酶活性的至少20％，優(yōu)選至少40％，更優(yōu)選至少60％，更加優(yōu)選至少80％，更好至少90％，最佳至少100％。
可從任何屬的微生物中得到本發(fā)明多肽。為了達(dá)到本發(fā)明的目的，與給定來(lái)源一起使用的術(shù)語(yǔ)“得自”應(yīng)指由核酸序列編碼的多肽是由該核酸序列的來(lái)源或已插入了所述來(lái)源的核酸序列的細(xì)胞生產(chǎn)的。
本發(fā)明多肽可以是細(xì)菌多肽。例如所述多肽可以是革蘭氏陽(yáng)性菌的多肽，例如芽孢桿菌多肽，例如嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌或蘇云金芽孢桿菌多肽；或者鏈霉菌多肽，例如變青鏈霉菌或者鼠灰鏈霉菌多肽；或者革蘭氏陰性菌多肽，例如大腸桿菌或假單胞菌屬多肽。
在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽是芽孢桿菌屬多肽，在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽是芽孢桿菌屬DSM 12650和芽孢桿菌屬DSM 12651多肽，例如分別具有SEQ ID NO2或SEQ ID NO4的氨基酸序列。
應(yīng)理解對(duì)于前述種，本發(fā)明包括完美和不完美的狀態(tài)以及其他分類學(xué)等同物，例如無(wú)性型，而不論它們是以何種種名為人所知。本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易確定適宜等同物的同一性。
這些種的菌株很容易從各種收集中心，例如美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)、德意志微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(DSM)、真菌菌種保藏中心(CBS)和農(nóng)業(yè)研究服務(wù)專利培養(yǎng)物收集中心(Agricultural Research ServicePatent Culture Collection)、北方地區(qū)研究中心(NRRL)獲得。
此外，用上述探針可以從其他來(lái)源，包括分離自自然界(例如，土壤、堆肥、水等)的微生物中鑒定和獲得所述多肽。從自然界分離微生物的技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的。通過(guò)類似地篩選另一微生物的基因組或cDNA文庫(kù)可一得到所述核酸序列。一旦用所述探針檢測(cè)到了編碼多肽的核酸序列后，用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)(參見(jiàn)例如Sambrook等，1989，同上文)可以分離或克隆所述序列。
如文中所定義的，“分離的”多肽指基本上沒(méi)有其他非α-淀粉酶多肽的多肽，例如經(jīng)SDS-PAGE確定純度至少為約20％，優(yōu)選至少約40％，更優(yōu)選約60％，更優(yōu)選約80％，更好約90％，最佳約95％。
由本發(fā)明核酸序列編碼的多肽還包括融合的多肽或可裂解的融合多肽，其中在所述多肽或其片段的N-末端或C-末端融合另一多肽。通過(guò)將編碼另一多肽的核酸序列(或其部分)與本發(fā)明核酸序列(或其部分)融合生產(chǎn)融合的多肽。生產(chǎn)融合多肽的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，包括連接所述多肽的編碼序列以便它們位于同一讀碼框中，然后在相同啟動(dòng)子和終止子控制下表達(dá)融合多肽。
術(shù)語(yǔ)“改善的洗滌性能”指在本發(fā)明實(shí)施例9所述的洗滌條件下確定的性能，所述性能高于用于洗滌的其他α-淀粉酶，例如SP690、SP722和Termamyl_，或者本發(fā)明突變體/變體的性能高于親本α-淀粉酶，即未突變的例如未取代的α-淀粉酶骨架。
突變的α-淀粉酶本發(fā)明變體的改變的特性下面討論可以導(dǎo)入本發(fā)明AAI-6或AAI-10α-淀粉酶的突變，特別是取代和缺失間的關(guān)系，以及與親本α-淀粉酶相比在特性方面合乎要求的改變。
本發(fā)明還涉及SEQ ID NO2(AAI-10)或SEQ ID NO4(AAI-6)所示α-淀粉酶的突變體。本發(fā)明的突變體α-淀粉酶其特征在于將一個(gè)或多個(gè)甲硫氨酸殘基與除Cys和Met以外的任何氨基酸殘基交換。因此根據(jù)本發(fā)明，取代甲硫氨酸殘基得到氨基酸是Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr和Val。
本發(fā)明突變體α-淀粉酶的優(yōu)選實(shí)施方案其特征在于將一個(gè)或多個(gè)甲硫氨酸殘基與Leu、Thr、Ala、Gly、Ser、Ile或Asp交換，優(yōu)選與Leu、Thr、Ala或Gly交換。在該實(shí)施方案中，在存在氧化劑的條件下得到了非常令人滿意的活性和穩(wěn)定性。具體地說(shuō)，這是指用任何本領(lǐng)域已知的適宜的技術(shù)，特別包括定點(diǎn)誘變和基因改組(gene shuffling)取代或缺失下列位置的一個(gè)或多個(gè)甲硫氨酸。SEQ ID NO2中設(shè)想的位置是10、105、202、208、246、286、309、430、440；SEQ ID NO4中設(shè)想的位置是10、105、202、208、246、286、309、430、440、454。本發(fā)明突變體α-淀粉酶的優(yōu)選實(shí)施方案其特征在于將位置202上的甲硫氨酸殘基與除Cys和Met的任何氨基酸殘基，優(yōu)選Leu、Thr、Ala、Gly、Ser、Ile或Asp交換。
其他設(shè)想的優(yōu)選突變包括缺失氨基酸R181、G182、D183或G184、K185、G186中的一個(gè)、兩個(gè)或多個(gè)殘基，或者取代其中的一個(gè)或多個(gè)殘基。優(yōu)選的突變是缺失D183-G184。特別相關(guān)的突變是用Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr和Val取代G186。特別優(yōu)選的取代是G186R。
還設(shè)想用Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr和Val取代N195。特別優(yōu)選的取代是N195F。
上述突變的下列組合包括D183-G184+N195F的缺失、D183-G184+G186R的缺失、D183-G184+G186R+N195F和G186R+N195F的缺失。
提高的熱穩(wěn)定性導(dǎo)致本發(fā)明變體(AAI-10和AAI-6)具有例如提高的熱穩(wěn)定性，特別是在酸性pH和/或低Ca2+濃度下熱穩(wěn)定性提高的突變包括在下列位置的突變(使用AAI-10α-淀粉酶的編號(hào)，即SEQ ID NO2)R158、S174、A186、N195、N197、H210、E212、I214、N215、E216、K269、N270。
在本文中術(shù)語(yǔ)“酸性pH”指低于7.0的pH，特別是低于正常進(jìn)行工業(yè)淀粉液化的pH5.5-6.2。
在本文中，術(shù)語(yǔ)“低的鈣濃度”指低于工業(yè)淀粉液化所用的正常水平的濃度。正常濃度變化取決于谷物中游離Ca2+的濃度。通常添加相當(dāng)于1mM(40 ppm)的劑量，其與谷物中的水平一起產(chǎn)生40-60 ppm的游離Ca2+。
本文中術(shù)語(yǔ)“高溫”指95-160℃間的溫度，特別是正常進(jìn)行工業(yè)淀粉液化的95-105℃。
本發(fā)明人現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)通過(guò)將包括上述突變和/或V206的其他突變彼此組合還可以進(jìn)一步提高熱穩(wěn)定性，特別是在酸性pH和/或在低Ca2+濃度的熱穩(wěn)定性。
所述“其他”突變是指如下突變(相對(duì)于AAI-10α-淀粉酶，SEQ ID NO2)N195、E212、E216、K269和V206。
所述突變還可與WO 96/23873所述的一個(gè)，優(yōu)選兩個(gè)或更優(yōu)選三個(gè)或多個(gè)位置(即本文SEQ ID NO2中的位置R181、G182、D183、G184)的缺失結(jié)合。
根據(jù)本發(fā)明，親本AAI-10和AAI-6α-淀粉酶的變體可含有上述位置的一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)、六個(gè)、七個(gè)或更多的突變。
應(yīng)強(qiáng)調(diào)的是本發(fā)明不僅包括AAI-10和AAI-6α-淀粉酶，還包括具有如下定義的同源性(同一性)的α-淀粉酶。
在此應(yīng)提及分別在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO2或SEQ ID NO4的N195、V206、E212和E216位置上的氨基酸殘基構(gòu)成在許多Termamyl-樣α-淀粉酶，即Termamyl_(地衣芽孢桿菌α-淀粉酶)中保守的氨基酸殘基。因此，例如，在圖1的排列和下列表1和表2中可以發(fā)現(xiàn)在AAI-10和AAI-6及Termamyl的相應(yīng)位置上的殘基。
表1Termamyl樣α-淀粉酶地衣芽孢桿菌(Termamyl)N190 I201 H205 E211 N265SP690 N195 V206 H210 E216 N270SP722 N195 V206 H210 E216 N270AAI-10(SEQ ID NO2) N195 V206 H210 E216 N270AAI-6(SEQ ID NO4) N195 V206 H210 E216 N270
表2Termamyl樣α-淀粉酶SP690 R181，G182，T183，G184，K185，A186SP722 R181，G182，D183，G184，K185，A186AAI-10(SEQ ID NO2) R181，G182，D183，G184，K185，A186AAI-6(SEQ ID NO4)R181，G182，D183，G184，K185，A186這些保守氨基酸殘基的突變對(duì)于改變特性是非常重要的。
當(dāng)用SEQ ID NO2編號(hào)時(shí)，根據(jù)本發(fā)明，為了改變特性，特別是提高在酸性pH和/或低Ca2+濃度的熱穩(wěn)定性，可以在下列位置進(jìn)行兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)、六個(gè)或七個(gè)突變(相對(duì)于本文SEQ ID NO2或SEQ ID NO4)1R181*，G182*，D183*，G184*；2N195A，R，D，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；3V206A，R，D，N，C，E，Q，G，H，，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y；4E212A，R，D，N，C，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；5E216A，R，D，N，C，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；6K269A，R，D，N，C，E，Q，G，H，I，L，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V.
7R181A，N，D，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V。
根據(jù)本發(fā)明構(gòu)想的是組合三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)、六個(gè)或七個(gè)突變。
根據(jù)本發(fā)明具體的雙突變是(用SEQ ID NO2或SEQ ID NO4進(jìn)行編號(hào))-R181*/G182*/N195A，R，D，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；-G182*/T183*/N195A，R，D，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；-T183*/G184*/N195A，R，D，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；-T183*/G184*/R181A，N，D，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；-R181*/G182*/V206A，R，D，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y；-G182*/T183*/V206A，R，D，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y；-T183*/G184*/V206A，R，D，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y；-R181*/G182*/E212A，R，D，N，C，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；-G182*/T183*/E212A，R，D，N，C，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；
-T183*/G184*/E212A，R，D，N，C，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V-R181*/G182*/E216A，R，D，N，C，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；-G182*/T183*/E216A，R，D，N，C，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；-T183*/G184*/E216A，R，D，N，C，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；-R181*/G182*/K269A，R，D，N，C，E，Q，G，H，I，L，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；-G182*/T183*/K269A，R，D，N，C，E，Q，G，H，I，L，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；-T183*/G184*/K269A，R，D，N，C，E，Q，G，H，I，L，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；-N195A，R，D，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V/V206A，R，D，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y；-N195A，R，D，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V/E212A，R，D，N，C，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；-N195A，R，D，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V/E216A，R，D，N，C，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；-N195A，R，D，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V/K269A，R，D，N，C，E，Q，G，H，I，L，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；-V206A，R，D，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y/E212A，R，D，N，C，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；-V206A，R，D，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y/E216A，R，D，N，C，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；-V206A，R，D，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y/K269A，R，D，N，C，E，Q，G，H，I，L，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；-E212A，R，D，N，C，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V/E216A，R，D，N，C，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；E212A，R，D，N，C，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V/K269A，R，D，N，C，E，Q，G，H，I，L，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；-E216A，R，D，N，C，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V/K269A，R，D，N，C，E，Q，G，H，I，L，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，變體包括下列突變?cè)赟EQ ID NO2或SEQ IDNO4或本文定義的85％同源α-淀粉酶的相應(yīng)位置的N195F/K264S。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的變體包括下列突變?cè)赟EQ ID NO2或SEQ IDNO4或另一同源α-淀粉酶的相應(yīng)位置的R181*/G182*/N195F。所述變體可能還包括在位置E216Q的取代。
在pH8-10.5，AAI-10和AAI-6變體的提高的Ca2+穩(wěn)定性提高的Ca2+穩(wěn)定性指在Ca2+耗盡的情況下，所述酶的穩(wěn)定性提高。本文中就達(dá)到提高在高pH的Ca2穩(wěn)定性而言，重要的突變(包括氨基酸取代和缺失)包括在上述“提高的熱穩(wěn)定性”節(jié)中公開(kāi)的突變和/或缺失。
本發(fā)明的一般突變優(yōu)選本發(fā)明的變體在上述突變外還含有一個(gè)或多個(gè)修飾。因此，有利的是在α-淀粉酶變體被修飾的部分中一個(gè)或多個(gè)脯氨酸被任何天然非脯氨酸殘基取代，優(yōu)選被丙氨酸、甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、纈氨酸或亮氨酸取代。
類似地，優(yōu)選將用以修飾親本α-淀粉酶的氨基酸殘基中的一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸用非半胱氨酸殘基例如絲氨酸、丙氨酸、蘇氨酸、甘氨酸、纈氨酸或亮氨酸取代。
此外，可以對(duì)本發(fā)明變體進(jìn)行修飾，可以僅僅進(jìn)行某一修飾或者與上述修飾組合進(jìn)行修飾，以便使對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO2或SEQ ID NO4的氨基酸片段190-214的氨基酸片段分別被Asn和/或Gln取代。在α-淀粉酶中，還可以用Arg取代對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO2或SEQ ID NO4的氨基酸片段190-214中的一個(gè)或多個(gè)Lys殘基。
應(yīng)理解本發(fā)明包括摻入兩個(gè)或多個(gè)上述修飾的變體。
此外，還可以在本文所述的任何變體中導(dǎo)入點(diǎn)突變。
本發(fā)明的突變適宜地包括在下列位置的突變Y135、V17、M202、I214。
克隆編碼α-淀粉酶的DNA序列用本領(lǐng)域熟知的各種方法，從生產(chǎn)所述α-淀粉酶的任何細(xì)胞或微生物中可分離編碼上述親本α-淀粉酶的DNA序列。首先應(yīng)用來(lái)自產(chǎn)生所述α-淀粉酶的生物體的染色體DNA或信使RNA構(gòu)建基因組DNA和/或cDNA文庫(kù)。然后，如果所述α-淀粉酶的氨基酸序列是已知的，則可合成同源、標(biāo)記的寡核苷酸探針并用于從制備自所研究生物的基因組文庫(kù)中鑒定編碼α-淀粉酶的克隆?；蛘撸幂^低嚴(yán)緊度的雜交和洗滌條件，可用含有與已知α-淀粉酶基因同源之序列的標(biāo)記的寡核苷酸探針作為探針鑒定編碼α-淀粉酶的克隆。
用于鑒定編碼α-淀粉酶克隆的另一種方法是將基因組DNA片段插入到表達(dá)載體，例如質(zhì)粒中，用所得基因組DNA文庫(kù)轉(zhuǎn)化α-淀粉酶陰性菌，然后將轉(zhuǎn)化的細(xì)菌鋪在含α-淀粉酶底物的瓊脂上，由此鑒定標(biāo)的α-淀粉酶的克隆。
或者，通過(guò)已確立的標(biāo)準(zhǔn)方法，例如通過(guò)S.L.Beaucage和M.H.Caruthers所述的亞瞵酰胺法(1981)或者M(jìn)atthes等(1984)所述的方法合成制備編碼所述酶的DNA序列。在亞瞵酰胺方法中，用例如自動(dòng)DNA合成僅合成寡核苷酸，純化、退火、連接，然后克隆到適宜的載體中。
最后，所述DNA序列可以是按照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)通過(guò)連接合成的、基因組的或cDNA序列而制備的基因組和合成序列的混合序列、合成序列與cDNA序列的混合序列或者基因組和cDNA的混合序列(根據(jù)需要，對(duì)應(yīng)于完整DNA序列各部分的片段)。還可通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，用特定的引物，例如按US4683202或R.K.Saiki等(1981)所述制備DNA序列。
定點(diǎn)誘變分離了編碼α-淀粉酶的DNA序列并鑒定了合乎要求的突變位點(diǎn)后，用合成的寡核苷酸導(dǎo)入突變。這些寡核苷酸含有位于所需突變位點(diǎn)側(cè)的核苷酸序列；在寡核苷酸合成的過(guò)程中插入突變核苷酸。在具體的方法中，在攜帶α-淀粉酶基因的載體中產(chǎn)生跨編碼α-淀粉酶序列的單鏈DNA缺口。然后，將攜帶所需突變的合成核苷酸與單鏈DNA的同源部分退火。用DNA聚合酶I(Klenow片段)填平剩余缺口，用T4連接酶連接構(gòu)建體。Morinaga等(1984)描述了該方法的具體實(shí)施例。US4760025公開(kāi)了通過(guò)對(duì)表達(dá)盒進(jìn)行微小改變來(lái)導(dǎo)入編碼多個(gè)突變的寡核苷酸。但是，通過(guò)Morinaga方法可以在任何時(shí)間導(dǎo)入更多種的突變，因?yàn)榭梢詫?dǎo)入不同長(zhǎng)度的眾多寡核苷酸。
Nelson和Long(1989)描述了另一種將突變導(dǎo)入編碼α-淀粉酶的DNA序列的方法。該方法包括經(jīng)3步產(chǎn)生PCR片段，該片段含有通過(guò)用化學(xué)合成的DNA鏈作為PCR反應(yīng)中的一個(gè)引物而導(dǎo)入的所需突變。通過(guò)用限制核酸內(nèi)切酶裂解從PCR-產(chǎn)生的片段中分離攜帶突變的DNA片段，然后再插入到表達(dá)質(zhì)粒中。
隨機(jī)誘變?cè)诜g成所需氨基酸序列的基因的至少3個(gè)部分中或整個(gè)基因內(nèi)按照定位或區(qū)域特異性隨機(jī)誘變適宜地完成隨機(jī)誘變。
用本領(lǐng)域已知的任何方法均可方便地完成對(duì)編碼親本α-淀粉酶的DNA序列的隨機(jī)誘變。
就上述而言，本發(fā)明的另一方面涉及產(chǎn)生親本α-淀粉酶之變體的方法，例如其中所述變體與所述親本相比具有改變或提高的熱穩(wěn)定性，所述方法包括(a)對(duì)編碼親本α-淀粉酶的DNA序列進(jìn)行隨機(jī)誘變，(b)在宿主細(xì)胞中表達(dá)步驟(a)中得到的突變DNA序列，和(c)篩選表達(dá)與親本α-淀粉酶相比具有改變之特性(例如熱穩(wěn)定性)的α-淀粉酶變體的宿主細(xì)胞。
本發(fā)明上述方法的步驟(a)優(yōu)選用摻雜的(doped)引物完成。
例如，用適宜的物理或化學(xué)誘變劑、適宜的寡核苷酸或者使DNA序列經(jīng)PCR產(chǎn)生的誘變可以完成隨機(jī)誘變。此外，利用這些誘變劑的任何組合也可以完成隨機(jī)誘變。誘變劑例如可以是誘導(dǎo)產(chǎn)生轉(zhuǎn)換、顛換、倒置、轉(zhuǎn)頻(scrambling)、缺失和/或插入的那些。
存在所選誘變劑的情況下，在適宜發(fā)生誘變的條件下，然后篩選具有所需特性的突變DNA。
當(dāng)用寡核苷酸完成誘變時(shí)，在合成所述寡核苷酸的過(guò)程中，在待改變的位置，所述寡核苷酸可摻雜或摻加(spike)3個(gè)非親本核苷酸。可以進(jìn)行摻雜或摻加以便避免不想要氨基酸的密碼子。通過(guò)任何公開(kāi)的技術(shù)，例如用PCR、LCR或任何適宜的DNA聚合酶和連接酶可將摻雜或摻加的寡核苷酸摻入編碼α-淀粉酶的DNA中。
優(yōu)選用“恒定隨機(jī)摻雜”完成摻雜，其中預(yù)先確定在各位置的野生型和突變百分比。此外，摻雜可以是直接優(yōu)先導(dǎo)入特定核苷酸，因此而優(yōu)先導(dǎo)入一種或多種特異性氨基酸殘基。摻雜可以是例如使得在各位置導(dǎo)入90％野生型和10％突變。在選擇摻雜方案時(shí)的其他考慮是基于遺傳和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的限制?？衫肈OPE程序(參見(jiàn)“材料和方法”節(jié))設(shè)計(jì)摻雜方案，特別是確保避免導(dǎo)入終止密碼子。
當(dāng)使用PCR-產(chǎn)生的誘變時(shí)，可在增加核苷酸錯(cuò)誤摻入的條件下，對(duì)經(jīng)化學(xué)處理或未經(jīng)處理的編碼親代α-淀粉酶的基因進(jìn)行PCR(Deshler 1992；Leung等，技術(shù)，Vol.1，1989，pp.11-15)。
可使用大腸桿菌(Fowler等，Molec.Gen.Genet.，133，1974，pp.179-191)，釀酒酵母或任何其它微生物的增變株對(duì)編碼α-淀粉酶的DNA進(jìn)行隨機(jī)誘變，誘變方法包括例如將含有親代糖基酶的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至增變株，培養(yǎng)含有質(zhì)粒的增變株，從增變株中分離突變的質(zhì)粒。隨后，將突變的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至表達(dá)生物。
待誘變的DNA序列可以方便地存在于基因組或cDNA文庫(kù)中，所述文庫(kù)生產(chǎn)自表達(dá)親代α-淀粉酶的生物?；蛘撸珼NA序列可以存在于適當(dāng)?shù)妮d體，如質(zhì)粒或噬菌體上，再與誘變劑一起保溫或要不然暴露于誘變劑中。待誘變的DNA也可存在于宿主細(xì)胞中，或者整合于所述細(xì)胞的基因組中，或者存在于細(xì)胞所攜帶的載體上。最后，待誘變的DNA也可以是分離的形式。應(yīng)理解接受隨機(jī)誘變的DNA序列優(yōu)選為cDNA或基因組DNA序列。
在某些情況下可于實(shí)施表達(dá)步驟b)或篩選步驟c)前方便地?cái)U(kuò)增突變的DNA序列?？筛鶕?jù)本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行擴(kuò)增，本發(fā)明優(yōu)選的方法是使用根據(jù)親代酶的DNA或氨基酸序列生產(chǎn)的寡核苷酸引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
與誘變劑保溫或暴露于誘變劑之后，通過(guò)在允許發(fā)生表達(dá)的條件下培養(yǎng)攜有突變DNA序列的適當(dāng)宿主細(xì)胞來(lái)表達(dá)突變的DNA。用于此目的的宿主細(xì)胞可以是被突變的DNA序列(任選其存在于載體上)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，或者是在誘變處理的過(guò)程中攜有編碼親代酶的DNA序列的宿主細(xì)胞。適當(dāng)宿主細(xì)胞的例子如下革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，如枯草芽孢桿菌，地衣芽孢桿菌，遲緩芽孢桿菌，短芽孢桿菌，嗜熱脂肪芽孢桿菌，嗜堿芽孢桿菌，解淀粉芽孢桿菌，凝結(jié)芽孢桿菌，環(huán)狀芽孢桿菌，燦爛芽孢桿菌，巨大芽孢桿菌，蘇云金芽孢桿菌，淺青紫鏈霉菌或鼠灰鏈霉菌；和革蘭氏陰性細(xì)菌，如大腸桿菌。
突變的DNA序列可進(jìn)一步含有能使突變的DNA序列表達(dá)的DNA序列。
定域隨機(jī)誘變隨機(jī)誘變可有利地定域于所述親代α-淀粉酶的一部分。例如，當(dāng)酶的某些區(qū)域被鑒定為對(duì)酶的給定特性特別重要時(shí)，以及當(dāng)預(yù)期修飾能導(dǎo)致具有改良特性的變體時(shí)，定域隨機(jī)誘變較為有利。當(dāng)親代酶的三級(jí)結(jié)構(gòu)已被闡明，且所述結(jié)構(gòu)與酶的功能相關(guān)時(shí)，一般可鑒定出所述區(qū)域。
通過(guò)使用上述的PCR產(chǎn)生的誘變技術(shù)或本領(lǐng)域已知的任何其它適當(dāng)?shù)募夹g(shù)，可以方便地進(jìn)行定域的或區(qū)域-特異性的隨機(jī)誘變?；蛘?，通過(guò)例如插入適當(dāng)?shù)妮d體來(lái)分離編碼待修飾的DNA序列部分的DNA序列，隨后可使用上述任何誘變方法對(duì)所述部分進(jìn)行誘變。
提供α-淀粉酶變體的其它方法提供α-淀粉酶變體的其它方法包括本領(lǐng)域已知的基因改組方法，所述方法包括例如WO 95/22625(Affymax Technologies N.V.)和WO96/00343(Novo Nordisk A/S)所述的方法。
表達(dá)本發(fā)明的α-淀粉酶變體根據(jù)本發(fā)明，可使用表達(dá)載體，以酶的形式表達(dá)通過(guò)上述方法，或通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何其它方法產(chǎn)生的編碼變體的DNA序列，所述表達(dá)載體一般包括編碼啟動(dòng)子，操縱子，核糖體結(jié)合位點(diǎn)，翻譯起始信號(hào)的控制序列，并任選包括阻抑基因或多種激活基因。
攜有編碼本發(fā)明α-淀粉酶變體的DNA序列的重組表達(dá)載體可以是能對(duì)其方便地進(jìn)行重組DNA操作的任何載體，載體的選擇經(jīng)常取決于導(dǎo)入該載體的宿主細(xì)胞。因此，載體可以是自我復(fù)制的載體，即作為染色體外實(shí)體存在的載體，所述載體的復(fù)制獨(dú)立于染色體的復(fù)制，所述載體包括例如質(zhì)粒，噬菌體或染色體外元件，微型染色體或人工染色體?；蛘撸d體可以是當(dāng)導(dǎo)入宿主細(xì)胞時(shí)可以整合至宿主細(xì)胞基因組，并與整合了該載體的染色體一起復(fù)制的載體。
在載體中，DNA序列應(yīng)該與適當(dāng)?shù)膯?dòng)子序列可操作相連。啟動(dòng)子可以是在選定宿主細(xì)胞中顯示出轉(zhuǎn)錄活性的任何DNA序列，啟動(dòng)子可以得自編碼與宿主細(xì)胞同源或異源之蛋白質(zhì)的基因。介導(dǎo)編碼本發(fā)明α-淀粉酶變體之DNA序列轉(zhuǎn)錄，尤其是在細(xì)菌宿主中的轉(zhuǎn)錄的適當(dāng)啟動(dòng)子的例子是大腸桿菌lac操縱子的啟動(dòng)子，天藍(lán)色鏈霉菌瓊脂酶基因dagA啟動(dòng)子，地衣芽孢桿菌α-淀粉酶基因(amyL)啟動(dòng)子，嗜熱脂肪芽孢桿菌產(chǎn)麥芽糖淀粉酶基因(amyM)啟動(dòng)子，解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶(amyQ)啟動(dòng)子，枯草芽孢桿菌xylA和xylB基因的啟動(dòng)子等。為了在真菌宿主中轉(zhuǎn)錄，有用的啟動(dòng)子的例子是得自編碼下列酶的基因的啟動(dòng)子米曲霉TAKA淀粉酶，米赫根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶，黑曲霉中性α-淀粉酶，黑曲霉酸穩(wěn)定的α-淀粉酶，黑曲霉葡糖淀粉酶，米赫根毛霉脂肪酶，米曲霉堿性蛋白酶，米曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶或構(gòu)巢曲霉乙酰胺酶。
本發(fā)明的表達(dá)載體也含有適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄終止子，在真核生物中，還含有與編碼本發(fā)明α-淀粉酶變體的DNA序列可操作相連的聚-腺苷酸化序列。終止和聚腺苷酸化序列可適當(dāng)?shù)氐米耘c啟動(dòng)子相同的來(lái)源。
載體可進(jìn)一步含有能使載體在所述宿主細(xì)胞中復(fù)制的DNA序列。所述序列的例子是質(zhì)粒pUC19，pACYC177，pUB110，pE194，pAMB1和pIJ702的復(fù)制起點(diǎn)。
載體也可含有選擇標(biāo)記，例如其產(chǎn)物可以補(bǔ)償宿主細(xì)胞缺陷的基因，如枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌的dal基因，或能賦予抗生素抗性的基因，所述抗生素抗性如氨芐青霉素，卡那霉素，氯霉素或四環(huán)素抗性。另外，載體可含有曲霉屬選擇標(biāo)記，如amdS，argB，niaD和sC，產(chǎn)生潮霉素抗性的標(biāo)記，或者可通過(guò)WO 91/17243中所述的共-轉(zhuǎn)化來(lái)完成選擇。
盡管細(xì)胞內(nèi)表達(dá)在某些方面(例如當(dāng)使用某些細(xì)菌作為宿主細(xì)胞時(shí))有利，但一般優(yōu)選在細(xì)胞外進(jìn)行表達(dá)。通常，本文所述的芽孢桿菌α-淀粉酶含有允許表達(dá)的蛋白酶分泌至培養(yǎng)基的前區(qū)。必要時(shí)，該前區(qū)可被不同的前區(qū)或信號(hào)序列取代，通過(guò)取代編碼各個(gè)前區(qū)的DNA序列可以方便地實(shí)現(xiàn)此目的。
分別連接編碼α-淀粉酶變體的本發(fā)明DNA構(gòu)建體，啟動(dòng)子，終止子和其它元件，并將它們插入含有復(fù)制所需信息的適當(dāng)載體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的(參見(jiàn)例如Sambrook等，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第2版，冷泉港，1989)。
含有上文所定義的本發(fā)明DNA構(gòu)建體或表達(dá)載體的本發(fā)明細(xì)胞可以有利地用作宿主細(xì)胞，以重組產(chǎn)生本發(fā)明的α-淀粉酶變體?？梢苑奖愕赝ㄟ^(guò)將編碼變體的本發(fā)明DNA構(gòu)建體(一個(gè)或多個(gè)拷貝)整合至宿主染色體，用所述DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化細(xì)胞。一般認(rèn)為整合是有利的，因?yàn)檎虾驞NA序列可以在細(xì)胞中更加穩(wěn)定地維持。根據(jù)常規(guī)方法，例如通過(guò)同源或異源重組可以將DNA構(gòu)建體整合至宿主染色體?；蛘撸捎门c不同類型的宿主細(xì)胞有關(guān)的上述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化細(xì)胞。
本發(fā)明的細(xì)胞可以是高等生物，如哺乳動(dòng)物或昆蟲的細(xì)胞，但優(yōu)選其為微生物細(xì)胞，例如細(xì)菌或真菌(包括酵母)細(xì)胞。
適宜細(xì)菌的實(shí)例是革蘭氏陽(yáng)性菌例如枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、緩慢芽孢桿菌、短芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、變青鏈霉菌或鼠灰鏈霉菌，或革蘭氏陰性菌例如大腸桿菌。例如通過(guò)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化或用本身已知的方法用感受態(tài)細(xì)胞完成細(xì)菌的轉(zhuǎn)化。
酵母生物最好是選自糖酵母屬或裂殖糖酵母屬，例如啤酒酵母。絲狀真菌有利的是屬于曲霉屬，例如米曲霉或黑曲霉。用本身已知的方法通過(guò)與原生質(zhì)體形成和原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化然后使細(xì)胞壁再生的過(guò)程可以轉(zhuǎn)化真菌細(xì)胞。在EP238023中描述了用于轉(zhuǎn)化曲霉宿主細(xì)胞的適宜方法。
在另一方面，本發(fā)明涉及生產(chǎn)本發(fā)明α-淀粉酶變體的方法，該方法包括在有利于所述變體生產(chǎn)的條件下培養(yǎng)上述宿主細(xì)胞，然后從細(xì)胞和/或培養(yǎng)基中回收所述變體。
用于培養(yǎng)所述細(xì)胞的培養(yǎng)基可以是適宜所研究的宿主細(xì)胞生長(zhǎng)并使本發(fā)明α-淀粉酶變體表達(dá)的任何常規(guī)培養(yǎng)基。適宜的培養(yǎng)基可從供應(yīng)商處購(gòu)買或按照公開(kāi)的方法(例如按美國(guó)典型培養(yǎng)物收集中心目錄中所述)制備。
用熟知的方法，包括離心或過(guò)濾從培養(yǎng)基中分離細(xì)胞，然后用鹽例如硫酸銨沉淀培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)組分，然后用層析例如離子交層析、親和層析等可以從培養(yǎng)基中方便地回收從宿主細(xì)胞分泌的α-淀粉酶變體。
核酸庫(kù)列本發(fā)明還涉及編碼本發(fā)明多肽的分離的核酸序列。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述核酸序列列于SEQ ID NO1。在另一更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述核酸序列是分別在質(zhì)粒pLIH1300(AAI6)或質(zhì)粒LiH1298(AAI10)中所含的序列，所述質(zhì)粒分別含于大腸桿菌DSM12763和大腸桿菌DSM12762中。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述核酸序列是SEQ ID NO1或SEQ ID NO3的成熟多肽編碼區(qū)。本發(fā)明還包括編碼具有SEQ ID NO2或SEQ ID NO4之氨基酸序列的多肽的核酸序列，該核酸序列因遺傳密碼簡(jiǎn)并性而與SEQID NO1或SEQ ID NO3有所不同。本發(fā)明還涉及分別編碼SEQ ID NO2或SEQ ID NO4之片段的具有α-淀粉酶活性的SEQ ID NO1或SEQ IDNO3的亞序列。
SEQ ID NO1或SEQ ID NO3的亞序列是由SEQ ID NO1或SEQ IDNO3所包括的核酸序列，不同的是已缺失了5’和/或3’末端的一個(gè)或多個(gè)核苷酸。
本發(fā)明還涉及在SEQ ID NO1或SEQ ID NO3成熟多肽的編碼序列中包括至少一個(gè)突變的突變核酸序列，其中突變核酸序列編碼一種由SEQID NO2或SEQ ID NO4的1至485位氨基酸組成的多肽。
用于分離或克隆編碼多肽的核酸序列的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的并且包括從基因組DNA中分離、由cDNA生產(chǎn)或其組合。從所述基因組cDNA中克隆本發(fā)明核酸序列可以通過(guò)，例如，采用已知的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)或用抗體篩選表達(dá)文庫(kù)來(lái)檢測(cè)具有共享結(jié)構(gòu)特征的克隆的DNA片段。見(jiàn)，例如Innis等，1990，PCR方法及應(yīng)用指南，學(xué)院出版社，紐約?？梢圆捎闷渌暮怂釘U(kuò)增方法如連接酶鏈反應(yīng)(LCR)，連接激活轉(zhuǎn)錄(LAT)和基于核酸序列的擴(kuò)增反應(yīng)(NASBA)。核酸序列可以從芽孢桿菌的菌株或另外一種或有關(guān)的生物克隆，因此，例如，其可以是核酸序列的多肽編碼區(qū)域的等位變體或種特異性變體。
本文所述的術(shù)語(yǔ)“分離的核酸序列”指基本不含其它核酸序列的核酸序列，例如，由瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定的至少約20％的純度，優(yōu)選至少約40％的純度，更優(yōu)選至少約60％的純度，甚至更優(yōu)選至少約80％的純度，最優(yōu)選至少約90％的純度。例如，通過(guò)基因工程中使用的標(biāo)準(zhǔn)克隆方法獲得一種分離的核酸序列，以便將所述核酸序列從它的天然位置重新定位到它將被復(fù)制的另一位點(diǎn)上?？寺》椒òㄇ懈詈头蛛x含有編碼所述多肽之核酸序列的所需核酸片段，將該片段插入載體分子，將重組載體摻入宿主細(xì)胞，使所述核酸序列的多拷貝或克隆在該宿主細(xì)胞中復(fù)制。核酸序列可以是基因組、cDNA、RNA、半合成的、合成來(lái)源或其任意組合。
編碼所述酶的DNA序列的同源性本發(fā)明還涉及與SEQ ID NO1(即核苷酸1-1458)或SEQ ID NO3(即核苷酸1-1458)的成熟多肽編碼序列在DNA水平上有至少約85％同源性、優(yōu)選約90％、更優(yōu)選約93％、更優(yōu)選約95％、甚至更優(yōu)選約97％，最佳約99％同源性并編碼活性多肽的核酸序列。
根據(jù)表明第一個(gè)序列衍生于第二個(gè)序列的兩個(gè)序列間的同一性程序可以確定DNA序列同源性。用本領(lǐng)域已知的計(jì)算機(jī)程序例如在GCG程序包中提供的GAP(上述)可適當(dāng)?shù)卮_定同源性。因此，可將Gap GCGv8與下列缺省參數(shù)一起使用5.0的GAP產(chǎn)生罰分和0.3的GAP延伸罰分，缺損評(píng)分矩陣。GAP使用Needleman/Wunsch/Sellers的方法產(chǎn)生排列。
編碼本發(fā)明的多肽的核酸序列的修飾對(duì)于合成與所述多肽基本類似的多肽可能是必需的。術(shù)語(yǔ)與所述多肽“基本類似”指所述多肽的非天然存在形式。這些多肽的某些改造方式不同于從其自然來(lái)源分離到的多肽，例如，比活性、熱穩(wěn)定性、PH最適值等方面不同的變體?？梢愿鶕?jù)SEQ ID NO1或SEQ ID NO3的多肽編碼部分例如，其亞序列，的核酸序列來(lái)構(gòu)建變體序列，和/或通過(guò)引入不產(chǎn)生所述核酸序列編碼多肽的另一種氨基酸序列，但對(duì)應(yīng)于用來(lái)生產(chǎn)所述酶的宿主生物的密碼子利用特點(diǎn)的核苷酸置換，或者通過(guò)引入產(chǎn)生另一種氨基酸序列的核苷酸置換。關(guān)于核苷酸置換的一般描述，例見(jiàn)，F(xiàn)ord等，1991，蛋白質(zhì)表達(dá)和純化295-107。
本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)，這種置換可以在對(duì)分子功能關(guān)鍵的區(qū)域外進(jìn)行并且仍能產(chǎn)生活性肽。本發(fā)明分離的核酸序列所編碼多肽的活性必需的，因而優(yōu)選不進(jìn)行置換的氨基酸序列，可以按照本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行鑒定，如定點(diǎn)誘變或丙氨酸-掃描誘變(例見(jiàn)，Cunningham和Wells，1989，科學(xué)2441081-1085)。在后一技術(shù)中，在分子中的每一個(gè)帶正電荷的殘基處引入突變，并檢測(cè)所得突變體分子的[酶]活性來(lái)鑒別對(duì)該分子活性起關(guān)鍵作用的氨基酸殘基。底物-酶相互作用的位點(diǎn)還可以通過(guò)三維結(jié)構(gòu)的分析來(lái)測(cè)定，所述三維結(jié)構(gòu)是通過(guò)諸如核磁共振分析、結(jié)晶學(xué)或光親和標(biāo)記技術(shù)測(cè)定的(例見(jiàn)，de Vos等，1992，科學(xué)255306-312；Smith等，1992，分子生物學(xué)雜志244899-904；Wlodaver等，1992，F(xiàn)EBS Letters 30959-64)。
本發(fā)明還涉及分離的編碼本發(fā)明多肽的核酸序列，該核酸序列在中等嚴(yán)謹(jǐn)條件下，優(yōu)選在中等偏高嚴(yán)謹(jǐn)條件下，更優(yōu)選在高度嚴(yán)謹(jǐn)條件下，和最優(yōu)選非常高度的嚴(yán)謹(jǐn)條件下與在同樣條件下與本文所定義的SEQ ID NO1或SEQ ID NO3的核酸序列或其互補(bǔ)鏈；或其等位變體及其亞序列雜交的核酸探針雜交(Sambrook等，1989，出處同上)。
本發(fā)明還涉及分離的編碼本發(fā)明多肽或其本文所述的等位基因變體和其亞序列的核酸序列，該核酸序列在中等嚴(yán)謹(jǐn)條件下，優(yōu)選在中等偏高嚴(yán)謹(jǐn)條件，更優(yōu)選高嚴(yán)謹(jǐn)條件，最佳很高嚴(yán)謹(jǐn)條件下與核酸探針雜交，所述探針在相同的條件下與SEQ ID NO1或SEQ ID NO3或其互補(bǔ)鏈的核酸序列雜交(Sambrook等1989，同上文)。
本發(fā)明還涉及通過(guò)(a)在中、中等偏高、高或很高嚴(yán)謹(jǐn)條件下DNA與SEQID NO1或SEQ ID NO3的序列或其互補(bǔ)鏈或其亞序列雜交；和(b)分離核酸序列而產(chǎn)生的分離的核酸序列。所述亞序列優(yōu)選甚至少100個(gè)核苷酸的序列，例如編碼具有α-淀粉酶活性的多肽片段的序列。
產(chǎn)生突變核酸序列的方法本發(fā)明進(jìn)一步涉及生產(chǎn)突變的核酸序列的方法，包括將至少一個(gè)突變引入SEQ ID NO1或SEQ ID NO3的成熟多肽編碼序列或其亞序列中，其中突變的核酸序列編碼一種由SEQ ID NO2或SEQ ID NO4的1至485位或其具有α-淀粉酶活性的片段組成的多肽。
為了將突變引入核酸序列以便使一個(gè)核苷酸換為另一個(gè)核苷酸，可以通過(guò)本領(lǐng)域中任何已知方法經(jīng)定點(diǎn)誘變來(lái)完成。特別有用的是利用具有所需插入片段的超螺旋雙鏈DNA載體和兩個(gè)具有所需突變的合成引物的方法。每一與載體的相對(duì)鏈互補(bǔ)的寡聚核苷酸引物在采用了pfu DNA聚合酶的循環(huán)變溫過(guò)程中延伸。通過(guò)引物的結(jié)合，產(chǎn)生了含有交錯(cuò)切口的突變質(zhì)粒。循環(huán)變溫后，用對(duì)甲基化和半甲基化DNA特異的DpnI處理產(chǎn)物，以便消化親代DNA模板并選出含有突變的合成DNA。也可以采用本領(lǐng)域其它已知的方法。其它那些方法包括基因改組，例如，WO95/22625所述(來(lái)源于Affymax Technologies N.V.)和WO96/00343所述(來(lái)源于Novo NordiskA/S)。
核酸構(gòu)建體本發(fā)明還涉及含有本發(fā)明核酸序列并使其可操作性地連接一個(gè)或多個(gè)控制序列的核酸構(gòu)建體，所述控制序列指導(dǎo)編碼序列在與控制序列相匹配地條件下于合適的宿主細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。表達(dá)應(yīng)當(dāng)理解為包括任何多肽產(chǎn)生的步驟，其包括，但不限于，轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾和分泌。
本文中“核酸構(gòu)建體”被定義為單鏈-或雙鏈的核酸分子，其分離自天然基因或經(jīng)修飾而含有以非天然方式組合和連接的核酸片段的基因。當(dāng)核酸構(gòu)建體含有本發(fā)明編碼序列的表達(dá)所需的全部控制序列時(shí)，術(shù)語(yǔ)“核酸構(gòu)建體”是術(shù)語(yǔ)“表達(dá)盒”的同義詞。術(shù)語(yǔ)“編碼序列”在本文中被定義為核酸序列的一部分，其直接確定了其蛋白產(chǎn)物的氨基酸序列。編碼序列的界限通常通過(guò)核糖體結(jié)合位點(diǎn)(原核生物)或通過(guò)緊鄰mRNA 5’端開(kāi)放讀框上游的ATG起始密碼子(真核生物)和緊鄰mRNA 3’端開(kāi)放讀框下游的轉(zhuǎn)錄終止子序列來(lái)確定。編碼序列可以包括，但不限于，DNA、cDNA和重組核酸序列。
編碼本發(fā)明多肽的核酸序列可用多種方式處理以便多肽表達(dá)。根據(jù)表達(dá)載體的不同，有時(shí)優(yōu)選或必需在插入載體前對(duì)核酸序列進(jìn)行操作。利用重組DNA方法修飾核酸序列的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的。
術(shù)語(yǔ)“控制序列”在本文中被定義為包括表達(dá)本發(fā)明多肽所需或有利的所有組件。每一控制序列可以是編碼所述多肽之核酸序列固有的或外來(lái)的。這種控制序列包括，但不限于，前導(dǎo)序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動(dòng)子、信號(hào)肽序列和轉(zhuǎn)錄終止子。至少，所述控制序列包括啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號(hào)?？刂菩蛄锌梢院杏糜谝胩囟ㄏ拗莆稽c(diǎn)的接頭，以便于控制序列與編碼多肽的核酸序列的編碼區(qū)進(jìn)行連接。術(shù)語(yǔ)“可操作性地連接”在這里被定義為一種構(gòu)型，其中控制序列被置于相對(duì)于DNA序列的編碼序列的適當(dāng)位置，以便于控制序列能指導(dǎo)多肽的表達(dá)。
啟動(dòng)子序列控制序列可以是適當(dāng)?shù)膯?dòng)子序列，即由表達(dá)所述核酸序列的宿主細(xì)胞識(shí)別的核酸序列。啟動(dòng)子序列含有介導(dǎo)所述多肽表達(dá)的轉(zhuǎn)錄控制序列。啟動(dòng)子可以是在所選宿主細(xì)胞中顯示轉(zhuǎn)錄活性的任何核酸序列，包括突變型、截短型和雜交型啟動(dòng)子，并且可以從編碼與宿主細(xì)胞同源或異源的胞外或胞內(nèi)多肽的基因中獲得。
指導(dǎo)本發(fā)明核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)錄，尤其是在細(xì)菌宿主中的轉(zhuǎn)錄的適當(dāng)啟動(dòng)子有大腸桿菌lac操縱子的啟動(dòng)子，天藍(lán)色鏈霉菌瓊脂糖酶基因(dagA)，枯草芽孢桿菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、地衣芽孢桿菌α-淀粉酶基因(amyL)、嗜熱脂肪芽孢桿菌產(chǎn)麥芽淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢桿菌青霉素酶基因(penp)、枯草芽孢桿菌xylA和xylB基因，和原核生物β-內(nèi)酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等，1978，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào)753727-3731)的啟動(dòng)子，以及tac啟動(dòng)子(DeBoer等，1983，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào)8021-25)。其它啟動(dòng)子見(jiàn)“來(lái)源于重組細(xì)菌的有用蛋白質(zhì)”，Scientific American，1980，24274-94；和在Sambrook等，1989，出處同上。
終止子序列控制序列也可以是適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄終止子序列，其被宿主細(xì)胞識(shí)別后終止轉(zhuǎn)錄。終止子序列可操作性地連接到編碼所述多肽的核酸序列的3’端。在所選宿主細(xì)胞中具有功能的任何終止子都可用于本發(fā)明。
信號(hào)肽控制序列也可以是編碼連接到多肽氨基末端之氨基酸序列并指導(dǎo)該編碼多肽進(jìn)入細(xì)胞分泌途徑的信號(hào)肽-編碼區(qū)。核酸序列的編碼序列5’端可天然含有與編碼區(qū)片段天然連接于一個(gè)翻譯讀框中的信號(hào)肽-編碼區(qū)，其編碼分泌型多肽。或者，編碼序列5’端可以含有一個(gè)相對(duì)該編碼區(qū)外來(lái)的信號(hào)肽-編碼區(qū)。當(dāng)編碼序列并非天然含有信號(hào)肽-編碼區(qū)時(shí)，就需要外來(lái)的信號(hào)肽-編碼區(qū)。另外，可將外來(lái)信號(hào)肽-編碼區(qū)簡(jiǎn)單地取代天然信號(hào)肽-編碼區(qū)以增強(qiáng)多肽的分泌。然而，任何指導(dǎo)表達(dá)的多肽進(jìn)入所選細(xì)胞分泌途徑的信號(hào)肽-編碼區(qū)都可用于本發(fā)明。
對(duì)細(xì)菌宿主細(xì)胞有效的信號(hào)肽-編碼區(qū)是從枯草桿菌NCIB 11837產(chǎn)麥芽淀粉酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶、地衣芽孢桿菌枯草蛋白酶、地衣芽孢桿菌β-內(nèi)酰胺酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)和枯草芽孢桿菌prsA的基因中獲得的信號(hào)肽-編碼區(qū)。另外的信號(hào)肽如Simonen和Palva，1993，微生物學(xué)綜述(Microbiological Reviews)57109-137中所述。
調(diào)控系統(tǒng)此外還優(yōu)選添加調(diào)控序列，其可調(diào)節(jié)所述多肽相對(duì)于宿主細(xì)胞之生長(zhǎng)的表達(dá)。調(diào)控系統(tǒng)的實(shí)例是使基因應(yīng)答化學(xué)或物理刺激，包括調(diào)控化合物的存在而開(kāi)啟或關(guān)閉表達(dá)的那些。原核系統(tǒng)中的調(diào)控系統(tǒng)包括lac、tac、和trp操縱子系統(tǒng)。在酵母中，可以使用ADH2系統(tǒng)或GAL1系統(tǒng)。在絲狀真菌中，TAKA α-淀粉酶啟動(dòng)子、黑曲霉葡糖淀粉酶啟動(dòng)子、和米曲霉葡糖淀粉酶啟動(dòng)子可作為調(diào)控序列使用。調(diào)控序列的其它實(shí)例是允許基因擴(kuò)增的那些。在真核系統(tǒng)中，這些包括在有氨甲蝶呤存在時(shí)被擴(kuò)增的二氫葉酸還原酶基因，和有重金屬時(shí)被擴(kuò)增的金屬硫蛋白基因。在這些情況下，編碼多肽的核酸序列與調(diào)控序列可操作性地連接。
表達(dá)載體本發(fā)明還涉及含有本發(fā)明的核酸序列、啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄及翻譯終止信號(hào)的重組表達(dá)載體?？蓪⑸鲜龈鞣N核酸和調(diào)控序列連接在一起以生產(chǎn)一種重組表達(dá)載體，使其包含一個(gè)或多個(gè)方便的限制位點(diǎn)，所述位點(diǎn)能允許編碼多肽的核酸序列在這類位點(diǎn)插入或置換?；蛘?，本發(fā)明的核酸序列可以通過(guò)將該核酸序列或含有該核酸序列的核酸構(gòu)建體插入適當(dāng)表達(dá)載體來(lái)表達(dá)。在創(chuàng)建表達(dá)載體的過(guò)程中，可使編碼序列在表達(dá)載體中與適當(dāng)調(diào)控序列可操作性地連接以便表達(dá)。
重組表達(dá)載體可以是任何載體(例如，質(zhì)?；虿《?，其可方便地進(jìn)行重組DNA操作并且能使核酸序列表達(dá)。載體的選擇將主要決定于載體與引入了該載體的宿主細(xì)胞之間的相容性。載體可以是線性或閉合環(huán)狀質(zhì)粒。
載體可以是自主復(fù)制載體，即以染色體外實(shí)體形式存在的載體，其復(fù)制獨(dú)立于染色體的復(fù)制，例如質(zhì)粒，染色體外元件，小染色體(minichrmosome)或人工染色體。載體可含有任何確保自我復(fù)制的手段?；蛘?，載體可以是引入宿主細(xì)胞后整合到基因組中并與其整合的染色體一起復(fù)制的那種。此外，可使用單個(gè)載體或質(zhì)粒，或一起含有待引入宿主細(xì)胞基因組中的全長(zhǎng)DNA的兩個(gè)或更多個(gè)載體或質(zhì)粒，或轉(zhuǎn)座子。
本發(fā)明的載體優(yōu)選含有一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)記，其能容易地選擇出轉(zhuǎn)化細(xì)胞。一個(gè)選擇性標(biāo)記是一種基因，其產(chǎn)物能提供對(duì)殺生物劑或病毒的抗性、對(duì)重金屬的抗性、原養(yǎng)型至營(yíng)養(yǎng)缺陷型的轉(zhuǎn)變等。細(xì)菌選擇性標(biāo)記的實(shí)例是來(lái)源于枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌的dal基因，或賦予了抗生素抗性如氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素或四環(huán)素抗性的標(biāo)記。適合于酵母宿主細(xì)胞的標(biāo)記是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于在絲狀真菌細(xì)胞中使用的可篩選標(biāo)志可以選自，但不限于，amdS(乙酰胺酶)、argB(鳥氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶)、bar(膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶)、hygB(潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶)、niaD(硝酸還原酶)、pyrG(乳清苷-5′-磷酸脫羧酶)、sC(硫酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶)和trpC(鄰氨基苯甲酸合成酶)，及它們的等同物。優(yōu)選用于曲霉細(xì)胞中的為構(gòu)巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因以及吸水鏈霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar基因。
本發(fā)明的載體優(yōu)選含有使所述載體可以穩(wěn)定整合到宿主細(xì)胞基因組中或者可以在細(xì)胞中不依賴于細(xì)胞的基因組而自我復(fù)制的元件。。
為了整合到宿主細(xì)胞基因組中，所述載體可依賴于編碼多肽的核酸序列或載體上任何其他元件來(lái)通過(guò)同源或非同源重組而穩(wěn)定整合到基因組中?；蛘撸d體可能含有其它核酸序列，這些序列可指導(dǎo)通過(guò)同源重組整合進(jìn)入宿主細(xì)胞基因組。其他核酸序列能夠在染色體的精確位置使載體整合到宿主細(xì)胞基因組中。為了提高在精確位置整合的可能性，整合元件應(yīng)優(yōu)選含有足夠量的與相應(yīng)靶序列高度同源的核酸，例如100-1500個(gè)堿基對(duì)，優(yōu)選400-1500個(gè)堿基對(duì)，最佳800-1500個(gè)堿基對(duì)，以便提高同源重組的可能性。整合元件可以是與宿主細(xì)胞基因組中的靶序列同源的任何序列。此外，整合元件還可以是非編碼的或編碼的核酸序列。另一方面，通過(guò)非同源重組可將載體整合到宿主細(xì)胞的基因組中。
為了進(jìn)行自主復(fù)制，所述載體還可含有能夠使載體在所研究的宿主細(xì)胞中自主復(fù)制的復(fù)制原點(diǎn)。細(xì)菌復(fù)制原點(diǎn)是實(shí)例是使載體可以在大腸桿菌中復(fù)制的質(zhì)粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的復(fù)制原點(diǎn)，使載體可以在芽孢桿菌中復(fù)制的pUB110、pE194、pTA1060和pAMβ1的復(fù)制原點(diǎn)。用于酵母細(xì)胞的復(fù)制原點(diǎn)的實(shí)例是2μ復(fù)制原點(diǎn)、ARS1、ARS4、ARS1和CEN3的組合，ARS4和CEN6的組合。復(fù)制原點(diǎn)可以是帶有突變的復(fù)制原點(diǎn)，所述突變可以使其在宿主細(xì)胞中發(fā)揮溫度敏感性的作用(參見(jiàn)例如Ehrlich，1978，Proceedings of the National Academy of Sciences USA751433)。
可將多于一個(gè)拷貝的本發(fā)明核酸序列插入到宿主細(xì)胞中以提高基因產(chǎn)物的產(chǎn)率。通過(guò)將至少一個(gè)以上其它拷貝的序列整合到宿主細(xì)胞基因組中或者通過(guò)包括可擴(kuò)增選擇性標(biāo)記基因與所述核酸序列，其中通過(guò)在存在適宜選擇性標(biāo)記的條件下列培養(yǎng)含擴(kuò)增拷貝的選擇性標(biāo)記基因，由此增加了核酸序列的拷貝數(shù)的細(xì)胞可篩選所述細(xì)胞，這樣可以使核酸序列拷貝數(shù)增加。
用于連接上述元件以構(gòu)建本發(fā)明重組表達(dá)載體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的(參見(jiàn)例如Sambrook等，1989，同上文)。
宿主細(xì)胞本發(fā)明還涉及含有本發(fā)明核酸序列的重組宿主細(xì)胞，其優(yōu)選在多肽的重組生產(chǎn)中使用。將含有本發(fā)明核酸序列的載體引入宿主細(xì)胞中，使載體以上述染色體整合體的形式或自我復(fù)制的染色體外載體的形式維持。術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”包括親代細(xì)胞的因在復(fù)制過(guò)程中發(fā)生突變而不同于親代細(xì)胞的任何子代。對(duì)宿主細(xì)胞的選擇很大程度上決定于編碼所述多肽的基因和它的來(lái)源。
宿主細(xì)胞可以是單細(xì)胞微生物，例如原核生物，或非單細(xì)胞微生物，例如真核生物。
有用的單細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞如革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌包括，但不局限于，芽孢桿菌，例如嗜堿性芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、Bacillus clausii、凝結(jié)芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌；或鏈霉菌細(xì)胞，例如，淺青紫鏈霉菌或鼠灰鏈霉菌，或革蘭氏陰性細(xì)菌如大腸桿菌和假單胞菌。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，細(xì)菌宿主細(xì)胞是遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌細(xì)胞。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，芽孢桿菌細(xì)胞是嗜堿性芽孢桿菌。
將表達(dá)載體引入細(xì)菌宿主細(xì)胞可通過(guò)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(例見(jiàn)，Chang和Cohen，1979，分子普通遺傳學(xué)168111-115)，通過(guò)利用感受態(tài)細(xì)胞(例見(jiàn)，Young和Spizizin，1961，細(xì)菌學(xué)雜志81823-829，或Dubnau和Davidoff-Abelson，1971，分子生物學(xué)雜志56209-221)，通過(guò)電穿孔(例見(jiàn)，Shigekawa和Dower，1988，生物技術(shù)6742-751)，或通過(guò)接合作用(例見(jiàn)，Koehler和Thorne，1987，細(xì)菌學(xué)雜志1695771-5278)而實(shí)現(xiàn)。
生產(chǎn)方法本發(fā)明還涉及生產(chǎn)本發(fā)明多肽的方法，其包括(a)培養(yǎng)在野生型時(shí)能產(chǎn)生所述多肽的菌株以產(chǎn)生含有所述多肽的上清液；和(b)回收所述多肽。優(yōu)選所述菌株為芽孢桿菌屬的菌株。
本發(fā)明還涉及生產(chǎn)本發(fā)明多肽的方法，其包括(a)在益于產(chǎn)生所述多肽的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞；和(b)回收所述多肽。
本發(fā)明還涉及生產(chǎn)本發(fā)明多肽的方法，其包括(a)在益于產(chǎn)生所述多肽的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞，其中該宿主細(xì)胞含有在SEQ ID NO1或SEQ IDNO3的成熟多肽編碼區(qū)有至少一個(gè)突變的突變性核酸序列，其中該突變型核酸序列編碼SEQ ID NO2或SEQ ID NO4的1至485位氨基酸組成的多肽；和(b)回收所述多肽。
組合物另一方面，本發(fā)明涉及含有本發(fā)明的α-淀粉酶或其變體的組合物。優(yōu)選所述組合物富含本發(fā)明的α-淀粉酶或其變體。在本文中，術(shù)語(yǔ)“富含”表示組合物的α-淀粉酶活性增加了，例如，具有1.1的增強(qiáng)系數(shù)。
該組合物可含有本發(fā)明的多肽作為主要酶組分，例如，單組分組合物。或者，該組合物可含有多種酶活性，如氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過(guò)氧化氫酶、纖維素酶、殼多糖酶、角化酶、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-糖苷酶、β-糖苷酶、鹵過(guò)氧化物酶(haloperoxidase)、轉(zhuǎn)化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果膠分解酶、肽谷氨酰胺酶(peptidoglutaminase)、過(guò)氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶或木聚糖酶。附加酶可利用下列微生物來(lái)生產(chǎn)，所述微生物屬于曲霉屬，優(yōu)選棘孢曲霉、泡盛曲霉、黑曲霉或米曲霉，或木霉屬，腐質(zhì)霉屬，優(yōu)選Humicola insolens，或鐮孢屬，優(yōu)選桿孢狀鐮孢、Fusarium cerealis、Fusarium crookwellense、大刀鐮孢、禾谷鐮孢、禾赤鐮孢、異孢鐮孢、合歡木鐮孢、尖孢鐮孢、多枝鐮孢、玫瑰色鐮孢、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、硫色鐮孢、Fusarium toruloseum、Fusariumtrichothecioides或Fusarium venenatum。
所述多肽組合物可以按照本技術(shù)領(lǐng)域已知的方法來(lái)生產(chǎn)并且可以是液體或干組合物的形式。例如，多肽組合物可以是粒狀或微粒狀的形式。含在組合物中的多肽可以按照本技術(shù)領(lǐng)域已知的方法使之穩(wěn)定。
下面給出了本發(fā)明多肽組合物的優(yōu)選用途實(shí)例。本發(fā)明多肽組合物的用量和使用組合物的其它條件可以根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法來(lái)確定。
工業(yè)應(yīng)用性由于在堿性pH時(shí)的活性，本發(fā)明的α-淀粉酶能良好適用于各種工業(yè)方法，尤其是所述酶發(fā)現(xiàn)了作為洗滌劑成分，例如，洗衣、洗碗和堅(jiān)硬表面洗滌劑組合物的潛在用途，但它也可以用于使紡織品、織物和衣服退漿，啤酒制作或釀造，在紙漿和紙生產(chǎn)中應(yīng)用，并進(jìn)一步在從淀粉或全谷物中生產(chǎn)增甜劑和乙醇(如燃料、飲料和工業(yè)酒精)的過(guò)程中應(yīng)用。
淀粉轉(zhuǎn)化常規(guī)的淀粉-轉(zhuǎn)化方法，如液化和糖化方法在，例如美國(guó)專利3912590和歐洲專利申請(qǐng)252730和63909中進(jìn)行了描述，此處引入作為參考。
紙漿和紙的生產(chǎn)本發(fā)明的堿性α-淀粉酶也可在從淀粉增強(qiáng)的廢紙和紙板生產(chǎn)木質(zhì)素纖維素材料如紙漿、紙和硬紙板的過(guò)程中應(yīng)用，尤其當(dāng)在pH7以上發(fā)生再制漿以及當(dāng)?shù)矸勖竿ㄟ^(guò)增強(qiáng)型淀粉的降解而促進(jìn)廢料的分解時(shí)。本發(fā)明的α-淀粉酶尤其適用于由淀粉-涂裹的印刷紙生產(chǎn)造紙紙漿的過(guò)程。所述過(guò)程可以按照WO95/14807所述進(jìn)行，包括以下步驟a)分解紙來(lái)產(chǎn)生紙漿，b)在步驟a)之前、期間、之后用-淀粉降解酶進(jìn)行處理，和c)在步驟a)和b)后從紙漿分離墨汁顆粒。
本發(fā)明的α-淀粉酶也非常適用于當(dāng)經(jīng)酶修飾的淀粉與堿性填充劑如碳酸鈣、陶土和粘土一起被用于造紙時(shí)修飾淀粉。采用本發(fā)明的堿性α-淀粉酶，使得有可能在有填充劑存在的條件下修飾淀粉，并因此允許較簡(jiǎn)單的整合方法(integrated process)。
使紡織品、織物和衣物退漿本發(fā)明的α-淀粉酶也非常適用于紡織品、織物和衣物的退漿。在紡織品加工工業(yè)中，α-淀粉酶通常作為退漿過(guò)程中的助劑使用以利于含淀粉膠料的去除，這種膠料在紡織過(guò)程中充當(dāng)緯紗的保護(hù)層。在紡織后徹底去除膠料層對(duì)于確保在后續(xù)加工(即織物的洗刷、漂白和染色)中得到最佳結(jié)果非常重要。酶解淀粉因不涉及對(duì)纖維材料的任何損壞，故為優(yōu)選。為了降低加工成本和提高工廠的生產(chǎn)能力，有時(shí)將退漿過(guò)程與洗刷和漂白步驟結(jié)合到一起。在這種情況下，通常用非酶助劑如堿或氧化劑降解淀粉，因?yàn)閭鹘y(tǒng)的α-淀粉酶與高pH值和漂白劑不能很好地相容。由于使用了破壞性強(qiáng)的化學(xué)劑，淀粉漿料的非酶性降解確實(shí)導(dǎo)致某種程度的纖維損壞。因此，由于本發(fā)明的α-淀粉酶在堿性溶液中具有改進(jìn)的性能，所以使用本發(fā)明的α-淀粉酶將是理想的。α-淀粉酶可以單獨(dú)使用或在含有纖維素的纖維或紡織品退漿時(shí)與纖維素酶結(jié)合使用。
退漿和漂白方法在本領(lǐng)域是已知的。例見(jiàn)WO95/21247，美國(guó)專利4643736，EP119920，這里引進(jìn)作為參考。
市售退漿產(chǎn)品有Novo NordiskA/S的Aquazyme_和Aquazyme_Ultra。
啤酒制作本發(fā)明的α-淀粉酶還可有效用于啤酒的制作加工；所述α-淀粉酶通常在磨碎(mashing)過(guò)程中加入。
洗滌劑組合物可將本發(fā)明的酶加入洗滌劑組合物并因此使之成為其中的組分。
本發(fā)明的洗滌劑組合物可以例如配成手洗或機(jī)洗的洗滌劑組合物，該組合物包括一種適于臟織物預(yù)處理的洗衣添加劑組合物和一種增加織物柔軟度的漂洗組合物，或者配成一種用于一般家用堅(jiān)硬表面清潔操作的洗滌劑組合物，或者配成手或機(jī)器洗碗操作中使用的洗滌劑。
在一個(gè)具體方面，本發(fā)明提供一種含有本發(fā)明的酶的洗滌劑添加劑。所述洗滌劑添加劑和洗滌劑組合物可以含有一種或多種其它的酶如蛋白酶、脂肪酶、角質(zhì)酶(cutinase)、淀粉酶、糖酶、纖維素酶、果膠酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶，例如漆酶和/或過(guò)氧化物酶。
通常所選酶的特性應(yīng)當(dāng)與所選洗滌劑相容，(即，pH最適值，同其它酶組分和非酶組分的相容性等)，并且所述酶應(yīng)當(dāng)以有效量存在。
蛋白酶合適的蛋白酶包括動(dòng)物、植物或微生物來(lái)源的蛋白酶。優(yōu)選微生物來(lái)源。化學(xué)修飾型或蛋白質(zhì)工程化的突變體也可包括在內(nèi)。蛋白酶可以是絲氨酸蛋白酶或金屬蛋白酶，優(yōu)選堿性微生物蛋白酶或胰蛋白酶樣蛋白酶。堿性蛋白酶的實(shí)例是枯草蛋白酶，尤其源自芽孢桿菌屬的枯草蛋白酶，例如枯草蛋白酶Novo、枯草蛋白酶Carlsberg、枯草蛋白酶309、枯草蛋白酶147和枯草蛋白酶168(WO89/06279所述)。胰蛋白酶樣蛋白酶的實(shí)例是WO89/06270和WO94/25583中所述的胰蛋白酶(例如，來(lái)源于豬或牛)和鐮孢屬(Fusarium)蛋白酶。
有效蛋白酶的實(shí)例是WO92/19729、WO98/20115、WO98/20116和WO98/34946中所述變體，尤其是在一個(gè)或多個(gè)下列位置具有置換的變體27、36、57、76、87、97、101、104、120、123、167、170、194、206、218、222、224、235和274。
優(yōu)選市售蛋白酶包括Alcalase_、Savinase_、Primase_、Duralase_、Esperase_和Kannase_(Novo NordiskA/S)、Maxatase_、Maxacal_、Maxapem_、Properase_、Purafect_、Purafect OxP_、FN2_、和FN3_(Genencor InternationalInc.)。
脂肪酶合適的脂肪酶包括細(xì)菌或真菌來(lái)源的脂肪酶?；瘜W(xué)修飾的或蛋白質(zhì)工程化的突變體也包括在內(nèi)。有效脂肪酶的實(shí)例有腐質(zhì)霉屬(Humicola)(同義詞Thermomyces)的脂肪酶，如來(lái)自EP 258068和EP 305216所述H.lanuginosa(T.lanuginosus)或WO96/13580所述H.insolens；假單胞菌脂肪酶，如來(lái)自產(chǎn)堿假單胞菌或P.pseudoalcaligenes(EP 218272)、洋蔥假單胞菌(EP 331376)、司徒茨假單胞菌(GB 1372034)、熒光假單胞菌、假單胞菌屬菌株SD705(WO95/06720和WO96/27002)、P.wisconsinensis(WO96/12012)；芽孢桿菌脂肪酶，如來(lái)自枯草芽孢桿菌(Dartois等，(1993)，Biochemica et Biophysica Acta，1131，253-360)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(JP64/744992)或短芽孢桿菌(WO 91/16422)。
其它實(shí)例是脂肪酶變體，如WO92/05249、WO94/01541、EP407225、EP260105、WO95/35381、WO96/00292、WO95/30744、WO94/25578、WO95/14783、WO95/22615、WO97/04079和WO97/07202所述的脂肪酶變體。
優(yōu)選市售脂肪酶包括LipolaseTM和Lipolase UltraTM(Novo NordiskA/S)。
淀粉酶合適的淀粉酶(α和/或β)包括細(xì)菌和真菌來(lái)源的淀粉酶?；瘜W(xué)修飾的或蛋白質(zhì)工程化的突變體也包括在內(nèi)。淀粉酶包括，例如從芽孢桿菌(如GB1296839所述地衣芽孢桿菌菌株)中獲得的α-淀粉酶。有效的α-淀粉酶的實(shí)例是WO94/02597、WO94/18314、WO96/23873和WO97/43424所述變體，尤其是在一個(gè)或多個(gè)下列位置上具有置換的變體15、23、105、106、124、128、133、154、156、181、188、190、197、202、208、209、243、264、304、305、391、408和444。
市售淀粉酶有DuramylTM、TermamylTM、FungamylTM和BANTM(NovoNordisk A/S)、RapidaseTM和PurastarTM(Genencor International Inc.)。
纖維素酶合適的纖維素酶包括細(xì)菌和真菌來(lái)源的纖維素酶?；瘜W(xué)修飾的或蛋白質(zhì)工程化的突變體也包括在內(nèi)。合適的纖維素酶包括來(lái)自芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、腐質(zhì)霉屬、鐮孢屬、草根霉屬、支頂孢屬的纖維素酶，例如產(chǎn)自US4435307、US5648263、US5691178、US5776757和WO89/09259中所公開(kāi)的Humicola isolens、嗜熱毀絲霉和尖孢鐮孢的真菌纖維素酶。
特別合適的纖維素酶是具有顏色保護(hù)優(yōu)點(diǎn)的堿性或中性纖維素酶。這種纖維素酶的實(shí)例是EP0495257、EP0531372、WO96/11262、WO96/29397、WO98/08940中所述的纖維素酶。其它實(shí)例是纖維素酶變體如WO94/07998、EP0531315、US5457046、US5686593、US5763254、WO95/24471、WO98/12307和PCT/DK98/00299中所述的那些變體。
市售纖維素酶包括Celluzyme_和Carezym_(Novo Nordisk A/S)，Clazinase_和Puradax HA_(Genencor International Inc.)，及KAC-500(B)_(KaoCorporation)。
過(guò)氧化物酶/氧化酶合適的過(guò)氧化物酶/氧化酶包括植物、細(xì)菌或真菌來(lái)源的過(guò)氧化物酶/氧化酶?；瘜W(xué)修飾的或蛋白質(zhì)工程化的突變體也包括在內(nèi)。有效的過(guò)氧化物酶實(shí)例包括來(lái)自Coprinus，例如來(lái)自C.cinereus的過(guò)氧化物酶及其在WO93/24618、WO95/10602和WO98/15257中所述的變體。
市售過(guò)氧化物酶包括Guardzme_(Novo Nordisk A/S)。
洗滌劑組合物中可包含去污酶，方式是加入分別含一或多種酶的不同添加劑，或加入含所有這些酶的組合添加劑。本發(fā)明的洗滌添加劑，即獨(dú)立添加劑或組合添加劑可配制成顆粒、液體、漿等。優(yōu)選的洗滌添加劑形式是顆粒(特別是不起塵的顆粒)，液體(特別是穩(wěn)定的液體)，或漿。
不起塵的顆?？梢匀鏤S4106991和4661452中所公開(kāi)的來(lái)生產(chǎn)，并可以任選通過(guò)本領(lǐng)域已知方法加涂層。蠟涂材料的實(shí)例是平均摩爾量為1000至20000的聚(環(huán)氧乙烷)產(chǎn)物(聚乙二醇，PEG)；具有16至50個(gè)環(huán)氧乙烷單位的乙氧基化壬基酚；其中醇含有12至20個(gè)碳原子并且其中存在15至80個(gè)環(huán)氧乙烷單位的乙氧基化脂肪醇；脂肪醇；脂肪酸；及脂肪酸的單-和雙-和甘油三酯。適于通過(guò)流體床技術(shù)來(lái)應(yīng)用的成膜涂層材料的實(shí)例在GB1483591中給出。液體酶預(yù)制劑可以按已有方法通過(guò)加入多元醇如丙二醇、糖或糖醇、乳酸或硼酸而穩(wěn)定。被保護(hù)的酶可以按照EP238216中的方法來(lái)生產(chǎn)。
本發(fā)明的洗滌劑組合物可以是任何適當(dāng)?shù)男螤?，例如條狀、片狀、粉狀、顆粒狀、糊狀或液體。液體洗滌劑可以是含水型(通常含有高達(dá)70％的水和0-30％的有機(jī)溶劑)，或不含水型。
洗滌劑組合物含有一種或多種表面活性劑，其可以是非離子型(包括半極性形式)和/或陰離子型和/或陽(yáng)離子型和/或兩性離子型。表面活性劑通常占總重量的0.1％至60％。
當(dāng)包含在其中時(shí)，所述洗滌劑通常含有約1％至約40％的陰離子表面活性劑如線性烷基苯磺酸鹽、α-烯屬磺酸酯、烷基硫酸鹽(脂肪醇硫酸酯)、脂肪醇乙氧基硫酸鹽、仲鏈烷磺酸鹽(alkanesulfonate)、α-磺基脂肪酸甲酯、烷基-或鏈烯基琥珀酸或(肥)皂。
當(dāng)包括其中時(shí)洗滌劑通常含有約0.2％至40％的非離子表面活性劑如脂肪醇乙氧基化物、壬基酚乙氧基化物、烷基多苷(polyglycoside)、烷基二甲基胺氧化物、乙氧基脂肪酸單乙醇胺、脂肪酸單乙醇胺、多羥基烷基脂肪酸胺或葡糖胺的N-?；鵑-烷基衍生物(“glucamide”)。
洗滌劑可含有0-65％的洗滌助洗劑或絡(luò)合劑如沸石、二磷酸、三磷酸鹽、膦酸酯、碳酸鹽、檸檬酸鹽、氨三乙酸、乙二胺四乙酸、二亞乙基三胺五乙酸、烷基-或鏈烯基琥珀酸、可溶性硅酸鹽或分層硅酸鹽(例如來(lái)源于Hoechst的SKS-6)。
洗滌劑可含有一種或多種聚合物。實(shí)例是羧甲基纖維素、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(乙二醇)、聚(乙烯基醇)、聚(乙烯吡啶-N-氧化物)、聚(乙烯基咪唑)、聚羧化物如聚丙烯酸類、馬來(lái)酸/丙烯酸共聚物和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物。
所述洗滌劑可含有漂白系統(tǒng)，其可含有H2O2源如過(guò)硼酸鹽或過(guò)碳酸鹽，所述H2O2源可以同過(guò)酸-形成漂白激活劑如四乙?；叶坊蛉甚Ｑ醣交撬犷愡M(jìn)行混合?；蛘?，漂白系統(tǒng)可以含有過(guò)氧酸的例如酰胺、亞胺或砜形式。
本發(fā)明的洗滌劑組合物中的酶可以采用傳統(tǒng)的穩(wěn)定劑來(lái)進(jìn)行穩(wěn)定，所述穩(wěn)定劑是，例如多元醇如丙二醇或甘油、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物，例如芳香硼酸酯或苯基硼酸衍生物如4-甲酰苯基硼酸，并且所述組合物可以按照WO92/19709和WO92/19708中所述進(jìn)行配制。
洗滌劑也可含有其它傳統(tǒng)的洗滌劑成分如織物調(diào)節(jié)劑，這些有粘土、增泡劑、抑泡劑、抗腐蝕劑、污垢懸浮劑、抗污垢再沉積劑、染料、殺菌劑、增白劑、水助溶劑、抑銹劑或香料。
根據(jù)本發(fā)明的設(shè)計(jì)，任何酶，特別是本發(fā)明的酶可以以相當(dāng)于每升洗滌液0.01-100mg酶蛋白，優(yōu)選每升洗滌液0.05-5mg酶蛋白，特別優(yōu)選每升洗滌液0.1-1mg酶蛋白的量加到所述洗滌劑組合物中。
還可將本發(fā)明的酶加至WO97/07202(引入作為參考)中公開(kāi)的洗滌劑配方中。
洗碗洗滌劑組合物本發(fā)明的酶也可用于洗碗洗滌劑組合物中，包括下列1)粉狀自動(dòng)洗碗組合物
2)粉狀自動(dòng)洗碗組合物非離子型表面活性劑(例如脂肪醇乙氧基化物) 1-2％
3)粉狀自動(dòng)洗碗組合物
4)粉狀自動(dòng)洗碗組合物非離子型表面活性劑 1-2％沸石MAP 15-42％
5)粉狀自動(dòng)洗碗組合物
6)具有洗凈型表面活性劑系統(tǒng)的粉狀和液體洗碗組合物
7)無(wú)水液體自動(dòng)洗碗組合物
8)無(wú)水液體自動(dòng)洗碗組合物
9)觸變液體自動(dòng)洗碗組合物
10)液體自動(dòng)洗碗組合物
11)含有受保護(hù)的漂白顆粒的液體自動(dòng)洗碗組合物
11)如1)、2)、3)、4)、6)和10)所述的自動(dòng)洗碗組合物，其中的過(guò)硼酸鹽被過(guò)碳酸鹽所取代。
12)如1)-6)所述的自動(dòng)洗碗組合物，該組合物另外含有錳催化劑。錳催化劑可以是“用于低溫漂白的有效錳催化劑”，自然369，1994，637-639中所述的化合物之一。
應(yīng)用本發(fā)明還涉及本發(fā)明具有α-淀粉酶活性的多肽在洗滌劑，尤其洗衣洗滌劑組合物和洗碗洗滌劑組合物，堅(jiān)硬表面清潔組合物，以及使紡織品、織物或衣服退漿，生產(chǎn)紙漿和紙、啤酒制作和淀粉轉(zhuǎn)化等上述工藝中應(yīng)用的方法。
本發(fā)明進(jìn)一步通過(guò)以下實(shí)施例描述，但不應(yīng)理解為本發(fā)明限于此。
材料和方法用作緩沖劑和底物的化學(xué)試劑是至少試劑純的商品。
材料酶SP690美國(guó)專利5856164的SEQ ID NO1中公開(kāi)的α-淀粉酶。
SP722美國(guó)專利5856164的SEQ ID NO2中公開(kāi)的α-淀粉酶。
Termamyl_美國(guó)專利5830837的SEQ ID NO1中公開(kāi)的地衣芽胞桿菌α-淀粉酶。
AAI-10SEQ ID NO2所示的本發(fā)明α-淀粉酶。
AAI-6SEQ ID NO4所示的本發(fā)明α-淀粉酶。
洗滌劑型號(hào)A/P(亞洲/太平洋)型洗滌劑具有下列組分20％STPP(三聚磷酸鈉)、25％Na2SO4、15％Na2CO3、20％LAS(線性烷基苯磺酸鹽，Nansa 80S)、5％C12-C15脂肪醇乙氧基化物(Dobanol 25-7)、5％Na2Si2O5、0.3％NaCl。
Omo Multi Acao(巴西)，Omo濃縮粉(EU)(聯(lián)合利華(Unilever))Ariel Futur液體(EU)(Procter和Gamble)生物材料的保藏根據(jù)布達(dá)佩斯條約的規(guī)定，下列生物材料被保藏在德意志微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(DSMZ)，Mascheroder Weg 1b，D-38124 BraunschweigDE，并被給予下列保藏號(hào)保藏物 保藏號(hào) 保藏日期NN17562DSM126501999年1月25日NN17563DSM126511999年1月25日NN049469 DSM127631999年4月7日NN049468 DSM127621999年4月7日菌株保藏的條件是在由專利和商標(biāo)委員會(huì)根據(jù)37 C.F.R.§1.14和35U.S.C.§122決定是否授權(quán)該專利申請(qǐng)的過(guò)程中確保能夠得到該培養(yǎng)物。保藏物代表被保藏菌株的基本純的培養(yǎng)物。在進(jìn)行主體申請(qǐng)的再申請(qǐng)或它的子案進(jìn)行再申請(qǐng)的境外國(guó)家中專利法的要求下，所述寄存物應(yīng)當(dāng)能得到。然而，應(yīng)理解得到保藏物并不非許可實(shí)施所述主體發(fā)明而對(duì)由政府行為授予的專利權(quán)造成損害。
宿主生物SHa273公開(kāi)于WO95/10603。
大腸桿菌菌株SJ2(Diderichsen等，(1990)，細(xì)菌學(xué)雜志172卷，4315-4321)。
質(zhì)粒Genebank載體pSJ1678進(jìn)一步由WO94/19454(引入作為參考)公開(kāi)方法普通分子生物學(xué)方法除非另外提到，所述DNA操作和轉(zhuǎn)化都是通過(guò)采用標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)方法進(jìn)行的(Sambrook等，(1989)；Ausubel等，(1995)；Harwood和Cutting(1990))。
α-淀粉酶及其變體的發(fā)酵生產(chǎn)可以通過(guò)本技術(shù)領(lǐng)域已知的方法或按下述方法進(jìn)行發(fā)酵。
攜有相關(guān)表達(dá)質(zhì)粒的一株枯草芽孢桿菌菌株在含有-80℃貯存的10微克/毫升卡那霉素的LB-瓊脂平板上劃線接種，并在37℃下過(guò)夜培養(yǎng)。將菌落轉(zhuǎn)移到裝在500ml搖瓶中的添加有10微克/毫升卡那霉素的100ml BPX培養(yǎng)基中。
BPX培養(yǎng)基的組成馬鈴薯淀粉 100g/l大麥粉 50g/lBAN 5000 SKB 0.1g/l酪蛋白酸鈉 10g/l大豆粉(Soy Bean Meal)100g/lNa2HPO4，12H2O9g/lPluronicTM0.1g/l培養(yǎng)物在37℃下以270rpm振蕩培養(yǎng)5天。
通過(guò)4500rpm離心20-25分鐘除去發(fā)酵液中的細(xì)胞和細(xì)胞碎片。然后將上清液過(guò)濾來(lái)獲得完全澄清的溶液。濃縮濾液并在UF濾器上進(jìn)行洗滌(10000截留膜)，再將緩沖液換成pH5.5的20mM的醋酸(Acetate)。將UF濾液上樣到S-Sepharose F.F上并且在同樣的緩沖液中通過(guò)采用0.2MNaCl的逐步洗脫法進(jìn)行洗脫。洗脫液對(duì)10mM Tris pH9.0透析，上樣到Q-SepharoseF.F上，利用0-0.3M NaCl的線性梯度洗脫6個(gè)柱體積。收集具有活性(通過(guò)Phadebas分析法測(cè)定)的餾分，調(diào)節(jié)pH到pH7.5并通過(guò)采用0.5％w/v的活性碳處理5分鐘來(lái)除去殘留色素。
α-淀粉酶活性的測(cè)定1.Phadebas分析法通過(guò)以Phadebas_片為底物的方法測(cè)定α-淀粉酶活性。Phadebas片(Phadebas_淀粉酶試驗(yàn)，由Pharmacia Diagnostic提供)含有交聯(lián)的不可溶藍(lán)色淀粉聚合物，其與牛血清白蛋白和一種緩沖物質(zhì)相混合并被壓片。
每次測(cè)定時(shí)，將一個(gè)片劑懸浮在含有5ml 50mM Britton-Robinson緩沖液(50mM醋酸、50mM磷酸、50mM硼酸、0.1mM CaCl2，用NaOH將pH調(diào)到所需值)的試管中。試驗(yàn)在所需溫度的水浴中進(jìn)行。要測(cè)定的α-淀粉酶用xml的50mM Britton-Robinson緩沖液稀釋。1ml的該α-淀粉酶溶液被加到5ml 50mM Britton-Robinsond緩沖液中。淀粉被該α-淀粉酶水解并產(chǎn)生可溶的藍(lán)色片段。在620nm下分光光度法測(cè)定藍(lán)色溶液的吸光度，其是α-淀粉酶活性的函數(shù)。
重要的是經(jīng)10或15分鐘溫育(試驗(yàn)時(shí)間)后在620nm下測(cè)定的吸光度是在0.2至2.0個(gè)620nm光吸收單位的范圍內(nèi)。在這一光吸收范圍內(nèi)活性與光吸收值之間成線性關(guān)系(Lambert-Beer定律)。因此必須調(diào)節(jié)酶的稀釋度以適合這一標(biāo)準(zhǔn)。在一系列特定的條件(溫度、pH、反應(yīng)時(shí)間、緩沖液)下，1mg的給定α-淀粉酶將水解一定量的底物并產(chǎn)生藍(lán)色。在620nm下測(cè)定顏色的強(qiáng)度。測(cè)定的吸光值直接與在所述一系列特定條件下測(cè)得的目標(biāo)α-淀粉酶的比活性成比例(活性/mg純?chǔ)?淀粉酶蛋白)。
2.另一種方法(PNG-G7分析法)通過(guò)采用PNP-G7底物測(cè)定α-淀粉酶的活性。PNG-G7是對(duì)硝基苯-α，D-麥芽酚庚糖苷(maltoheptaoside)的縮寫，它能被內(nèi)淀粉酶裂解的嵌段(blocked)寡糖。裂解后，試劑盒中包括的α-葡萄糖苷酶消化底物而釋放一種游離PNP分子，該P(yáng)NP分子呈黃色因而通過(guò)在λ＝405nm(400-420nm)下的可視分光光度測(cè)定法(spectophometry)來(lái)測(cè)定。包括PNP-G7低物和α-葡萄糖苷酶的試劑盒是由Boehringer-Mannheim生產(chǎn)的(目錄號(hào)1054635)。
為了生產(chǎn)底物，將一瓶底物(BM1442309)加到5ml緩沖液(BM1442309)中。為了生產(chǎn)α-葡萄糖苷酶，將一瓶α-葡萄糖苷酶(BM1462309)加到45ml緩沖液(BM1442309)中。工作溶液通過(guò)混合5ml的α-葡萄糖苷酶溶液和0.5ml底物來(lái)制得。
分析是通過(guò)將20ul酶溶液轉(zhuǎn)到96孔微滴板中并在25℃下溫育。在25℃下加入200ul工作溶液。將所述溶液混合并預(yù)溫育1分鐘，然后每15秒在OD 405 nm下測(cè)定吸光值一次，共測(cè)3分鐘。
依賴時(shí)間的吸光值-曲線的斜率直接與所述一系列特定條件下目標(biāo)α-淀粉酶的比活性成比例(每mg酶的活性)。
鈣-和pH-依賴的穩(wěn)定性的測(cè)定為了改進(jìn)95℃-105℃時(shí)的穩(wěn)定性，標(biāo)準(zhǔn)的工業(yè)化液化處理過(guò)程是在以pH6.0-6.2為液化pH和加入40ppm的游離鈣來(lái)操作的。通過(guò)進(jìn)行本文建議的一些替換來(lái)改進(jìn)在以下條件下的穩(wěn)定性1.比pH6.2低的pH和/或2.在游離鈣濃度低于40ppm游離鈣的情況下。
利用兩種不同方法來(lái)測(cè)定通過(guò)在AA560α-淀粉酶中進(jìn)行不同的替換而得到的穩(wěn)定性的改變。
方法1一種在降低的pH即pH5.0、5ppm游離鈣的條件下測(cè)定穩(wěn)定性的分析方法。
在下列條件下溫育10μg所述變體0.1M的醋酸鹽溶液、調(diào)到pH5.0、含有5ppm鈣和5％w/w的普通玉米淀粉(不含鈣)。溫育是在95℃的水浴中進(jìn)行30分鐘。
方法2一種在不存在游離鈣和pH被維持在pH6.0的條件下測(cè)定穩(wěn)定性的分析方法。這種分析方法測(cè)定鈣敏感性的降低。
在下列條件下溫育10μg所述變體0.1M的醋酸鹽溶液、調(diào)到pH6.0并5％w/w的普通玉米淀粉(不含鈣)。溫育是在95℃的水浴中進(jìn)行30分鐘。
穩(wěn)定性的測(cè)定所有的穩(wěn)定性試驗(yàn)都采用相同的設(shè)置進(jìn)行。方法如下在相關(guān)條件(1-4)下溫育所述酶。在0、5、10、15和30分鐘取樣并用分析緩沖液(0.1M 50mM Britton緩沖液pH7.3)稀釋25倍(所有取樣采用相同稀釋度)，在標(biāo)準(zhǔn)條件pH7.3、37℃下采用Phadebas分析方法(Pharmacia)測(cè)定活性。
溫育前(0分)所測(cè)活性被用作參考(100％)。百分?jǐn)?shù)的下降被計(jì)算為溫育時(shí)間的函數(shù)。
比活性的測(cè)定采用Phadebas分析方法(Pharmacia)將比活性測(cè)定為活性/mg酶。
用α-淀粉酶及其變體進(jìn)行噴射蒸煮(Jet cooking)和液化液化實(shí)驗(yàn)是在微型-噴射(mini-jet)系統(tǒng)中用50 NU/g DS在pH 5.5下加入5 ppm Ca++而進(jìn)行，以便比較所配制的α-淀粉酶變體與親代α-淀粉酶的性能。反應(yīng)通過(guò)測(cè)量DE增長(zhǎng)對(duì)時(shí)間的函數(shù)(Neocuproine方法)來(lái)進(jìn)行監(jiān)控。
通過(guò)用去離子水懸浮約11.8kg的Cerestar C*pharm GL03406(89％的淀粉)至接近30kg來(lái)生產(chǎn)玉米淀粉漿。在室溫下加入0.55 g的CaCl2.2H2O后將pH調(diào)到5.5。
加入相當(dāng)于50 NU/g DS的酶，并用NaCl將電導(dǎo)率調(diào)到300mS。標(biāo)準(zhǔn)條件如下所示底物濃度 35％w/w(起始)31.6-31.9％w/w(終)溫度 105℃、5分鐘(首次液化)95℃、90分鐘(第二次液化)pH(起始) 5.5噴射(jet)后，收集液化了的淀粉并用密封的熱燒瓶從小規(guī)模的工廠轉(zhuǎn)運(yùn)到試驗(yàn)室中，在這里于95℃下繼續(xù)進(jìn)行第二次液化。
15至90分鐘內(nèi)每隔15分鐘取10ml的樣品。加入2滴1N的HCl以使酶失活。從這些樣品中稱出0.3-0.1g(根據(jù)期望的DE)并稀釋到100ml。然后，根據(jù)Neocuproine方法測(cè)定還原糖(精度改進(jìn)的還原糖測(cè)定。Dygert，Li，F(xiàn)lorida和Thomas(1965).Anal.Biochem 13，368)并測(cè)定的DE值。比較作為時(shí)間函數(shù)的DE的變化。
退漿材料標(biāo)準(zhǔn)織物TS526，斜紋織法，100％棉浸漬55℃，60 ppm CaCl2，pH6.5酶溶液 親代AA560(1g/l)用量浸漬液中0.05，0.1，0.2，0.5和2.0g/l酶溶液。
溫育在55或65℃下2小時(shí)在30℃下22小時(shí)洗滌水中10分鐘干燥室溫程序退漿結(jié)果的評(píng)估-Violet scale(TEGEWA)。
利用DOPE程序進(jìn)行隨機(jī)誘變的常規(guī)方法通過(guò)以下步驟可以進(jìn)行隨機(jī)誘變1.在親代酶中選擇用于修飾的目標(biāo)區(qū)域，2.在所選區(qū)域中決定突變位點(diǎn)和非突變位點(diǎn)，3.根據(jù)如待構(gòu)建變體的所需穩(wěn)定性和/或性能，決定突變的類型，4.選擇結(jié)構(gòu)合理的突變，5.根據(jù)步驟4調(diào)整步驟3所選殘基，6.通過(guò)采用適當(dāng)?shù)膿饺胨惴?dope algorithm)分析核苷酸的分布，7.如果需要，調(diào)整所需殘基使之符合基因密碼的真實(shí)性，如考慮基因密碼導(dǎo)致的限制因素，如為了避免引入終止密碼子；技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識(shí)到某些密碼予組合不能應(yīng)用于實(shí)踐，需要調(diào)整，8.生產(chǎn)引物，9.利用所述引物進(jìn)行隨機(jī)誘變，10.通過(guò)篩選所需要改進(jìn)的性能來(lái)選擇所得葡萄糖淀粉酶變體。
摻入算法用于步驟6的合適摻入算法為本領(lǐng)域已知。如Tomandl，D.等，1997，計(jì)算機(jī)-輔助的分子設(shè)計(jì)雜志(Journal of Computer-Aided MolecularDesign)1129-38。另一種算法是DOPE(Jensen，LJ，Andersen，KV，Svendsen，A，和Kretzschmar，T，(1998)，核酸研究26697-702)。
濾膜篩選試驗(yàn)該試驗(yàn)可用于根據(jù)對(duì)篩選溫度的設(shè)置，篩選在高pH下比親代酶穩(wěn)定性提高的AA560變體，和在高pH和中溫下比親代酶穩(wěn)定性提高的AA560α-淀粉酶變體。
高pH濾膜試驗(yàn)將芽孢桿菌文庫(kù)鋪于含有10μg/ml卡那霉素之TY瓊脂平板上醋酸纖維素(OE67，Schleicher&Schuell，Dassel，德國(guó))-硝酸纖維素濾膜(Protran-Ba 85，Schleicher&Schuell，Dassel，德國(guó))的夾心結(jié)構(gòu)上，37℃保持至少21小時(shí)。醋酸纖維素層被安置在TY瓊脂平板上。
每一濾膜夾心于鋪板后但溫育前用針做特別標(biāo)記，以便能定位濾膜上的陽(yáng)性變體，將結(jié)合了變體的硝酸纖維素濾膜轉(zhuǎn)移到盛有對(duì)羥苯基甘氨酸(glycin)-NaOH緩沖液(pH8.6-10.6)的容器中，室溫(可以變?yōu)?0℃-60℃)溫育15分鐘。將有菌落的醋酸纖維素濾膜室溫保存在TY-平板上備用。溫育后，在含有1％瓊脂糖、0.2％淀粉之對(duì)羥苯基甘氨酸-NaOH緩沖液(pH8.6-10.6)的平板上測(cè)定殘留活性。帶硝酸纖維素濾膜的試驗(yàn)板按照與濾膜夾心相同的方法標(biāo)記，室溫溫育2小時(shí)。除去濾膜后，試驗(yàn)板用10％Lugol溶液染色。淀粉降解變體為深藍(lán)背景下的白點(diǎn)，然后保存板上對(duì)其進(jìn)行鑒定。陽(yáng)性變體相同于第一次篩選的條件再篩選兩次。
低鈣濾膜試驗(yàn)將芽孢桿菌文庫(kù)鋪板于含有相關(guān)抗生素如卡那霉素或氯霉素之TY瓊脂平板上的醋酸纖維素(OE67，Schleicher&Schuell，Dassel，德國(guó))-硝酸纖維素濾膜(Protran-Ba 85，Schleicher&Schuell，Dassel，德國(guó))的夾心結(jié)構(gòu)中，37℃保持至少21小時(shí)。醋酸纖維素層被安置在TY瓊脂平板上。
每一濾膜夾心于鋪板后但溫育前用針做特別標(biāo)記，以便能定位濾膜上的陽(yáng)性變體，將結(jié)合了變體的硝酸纖維素濾膜轉(zhuǎn)移到盛有碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液(pH8.5-10)和不同EDTA濃度(0.001mM-100mM)的容器中。將有菌落的醋酸纖維素濾膜室溫保存在TY-平板上備用。溫育后，在含有1％瓊脂糖、0.2％淀粉之碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液(pH8.5-10)的平板上測(cè)定殘留活性。帶硝酸纖維素濾膜的試驗(yàn)板按照與濾膜夾心相同的方法標(biāo)記，室溫溫育2小時(shí)。除去濾膜后，試驗(yàn)板用10％Lugol溶液染色。淀粉降解變體為深藍(lán)背景下的白點(diǎn)，然后保存板上對(duì)其進(jìn)行鑒定。陽(yáng)性變體相同于第一次篩選的條件再篩選兩次。
實(shí)施例實(shí)施例1分離DSM 12560和DSM 12651菌株的基因組DNA在液體TY培養(yǎng)基(按Ausubel et al.(1995)所述)中增殖芽孢桿菌屬菌株DSM 12650(the AAI-6α淀粉酶)和芽孢桿菌屬菌株DSM 12651(the AAI-10α淀粉酶)在37℃和300rpm保溫16小時(shí)后，收獲細(xì)胞，用Pitcher等(1989)描述的方法分離基因組DNA。
基因組文庫(kù)構(gòu)建用限制酶Sau3A部分消化所述菌株的基因組DNA，然后通過(guò)在0.7％瓊脂糖凝膠上電泳大小分級(jí)分離。通過(guò)在DEAE-纖維素紙上電泳(Dretzen等(1981)分離大小為2-10kb的片段。
將分離的DNA片段與BamHI消化的pSJ1678DNA相連，然后用連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌SJ2。
轉(zhuǎn)化制備大腸桿菌SJ2宿主細(xì)胞，用BIO-RAD的基因PULSERTM電穿孔儀按供應(yīng)商的說(shuō)明通過(guò)電穿孔轉(zhuǎn)化所述宿主細(xì)胞。
鑒定陽(yáng)性轉(zhuǎn)化體在含0.5％AZCL-直鏈淀粉(Megazyme)和10μg/ml氯霉素的LB瓊脂平板(在Ausbel等(1995)中所述的)上篩選按上述構(gòu)建的大腸桿菌SJ2中的DNA文庫(kù)，然后在37℃保溫過(guò)夜。表達(dá)淀粉酶活性的克隆出現(xiàn)藍(lán)色擴(kuò)散暈。將表達(dá)AAI-6淀粉酶的一個(gè)所述克隆命名為L(zhǎng)iH1300。將表達(dá)AAI-10淀粉酶的另一個(gè)所述克隆命名為L(zhǎng)iH1298。通過(guò)將克隆的Sau3A DNA片段部分測(cè)序進(jìn)一步表征所述DNA。
實(shí)施例2確定編碼菌株DSM 12650(AAI-6)的α淀粉酶之基因的DNA序列用由大染色體片段構(gòu)成的克隆作為模板以特異性PCR擴(kuò)增淀粉酶編碼基因的內(nèi)DNA片段，所述染色體片段含有插入到質(zhì)粒pSJ1678，pLiH1300中的編碼淀粉水解活性的基因，在所述PCR中利用針對(duì)已知芽孢桿菌α淀粉酶保守區(qū)的簡(jiǎn)并引物。
簡(jiǎn)并引物針對(duì)下列區(qū)域/氨基酸序列For36GITA(L/V/I)W(I/L)(SEQ ID NO5)For97VY(G/A)D(V/F/L)V(M/L/I/F)NH(SEQ ID NO6)For227DG(F/I)R(F/L/I/V)DA(A/V)KH(SEQ ID NO7)Rev235DG(F/I)R(F/L/I/V)DA(A/V)KH(SEQ ID NO8)Rev328VTFV(D/E)NHD(SEQ ID NO9)Rev410GWTREG(SEQ ID NO10)在PCR中使用前向(For)和反向(Rev)引物的各種組合，這樣可擴(kuò)增內(nèi)DNA片段。
用QIA快速自旋柱(QUIGEN)純化DNA片段，用相同的簡(jiǎn)并引物測(cè)序。從該起始序列開(kāi)始，通過(guò)引物步行法(primers-walking approach)確定AAI-6α-淀粉酶完整編碼區(qū)SEQ ID NO2的DNA序列。
實(shí)施例3確定編碼菌株DSM 12651的α-淀粉酶(AAI-10)之基因的DNA序列用由大染色體片段構(gòu)成的克隆作為模板以特異性PCR擴(kuò)增淀粉酶編碼基因的內(nèi)DNA片段，所述染色體片段含有插入到質(zhì)粒pSJ1678，pLiH1298中的編碼淀粉水解活性的基因，在所述PCR中利用針對(duì)已知芽孢桿菌α淀粉酶保守區(qū)的簡(jiǎn)并引物。
簡(jiǎn)并引物針對(duì)下列區(qū)域/氨基酸序列For36GITA(L/V/I)W(I/L)(SEQ ID NO5)For97VY(G/A)D(V/F/L)V(M/L/I/F)NH(SEQ ID NO6)For227DG(F/I)R(F/L/I/V)DA(A/V)KH(SEQ ID NO7)Rev235DG(F/I)R(F/L/I/V)DA(A/V)KH(SEQ ID NO8)Rev328VTFV(D/E)NHD(SEQ ID NO9)Rev410GWTREG(SEQ ID NO10)在PCR中使用前向(For)和反向(Rev)引物的各種組合，這樣可擴(kuò)增內(nèi)DNA片段。
用QIA快速自旋柱(QUIGEN)純化DNA片段，用相同的簡(jiǎn)并引物測(cè)序。從該起始序列開(kāi)始，通過(guò)引物步行法確定AAI-10α-淀粉酶完整編碼區(qū)(SEQID NO4)的DNA序列(SEQ ID NO1)。
實(shí)施例4將DSM 12650(AAI-6)α-淀粉酶亞克隆到pTVB110pTVB110是在枯草芽孢桿菌中利用pUB110(Gryczan，T.J.(1978)J.Bact134318-329)的復(fù)制原點(diǎn)復(fù)制的質(zhì)粒。該質(zhì)粒還編碼得自質(zhì)粒pC194(Horinouchi，S.and Weisblum，B.(1982)，J.Bact.150815-825)的cat基因，其賦予氯霉素抗性。該質(zhì)粒含有截?cái)嗟牡匾卵挎邨U菌α-淀粉酶基因，amyL，以及含有amyL啟動(dòng)子，信號(hào)序列和轉(zhuǎn)錄終止子，但沒(méi)有amy+表型(在含淀粉瓊脂上有暈形成)。
為了表達(dá)大量AAI-6淀粉酶將成熟基因精確地與amyL信號(hào)序列融合以便由amyL啟動(dòng)子引發(fā)轉(zhuǎn)錄，由amyL信號(hào)序列指導(dǎo)轉(zhuǎn)運(yùn)。
用Pwo聚合酶在制造商(Boehringer Mannheim)推薦的條件下在質(zhì)粒pLiH1300上通過(guò)PCR用引物197cloningN和197cloningC擴(kuò)增約1480bp片段。
將所得約1480bp片段用限制核酸內(nèi)切酶PstI和SfiI消化，然后與用相同的酶消化的質(zhì)粒相連。
用連接混合物轉(zhuǎn)化蛋白酶和淀粉酶缺失的枯草芽孢桿菌菌株SHa273(公開(kāi)于WO95/10603)，然后確定amy+轉(zhuǎn)化體的DNA序列。將該質(zhì)粒命名為pTVB230。
寡核苷酸197克隆C5′CCG AGC TCG GCC GGC TGG GCC GTC GAC TTA TCGTTT CAC CCA TAC GG(SEQ ID NO11)197克隆N5′CAT TCT GCA GCA GCG GCG CAT CAC GAT GGG ACGAAC GG(SEQ ID NO12)實(shí)施例5將AAI-10α淀粉酶亞克隆到pTVB110。
DNA測(cè)序表明菌株AAI-6和AAI-10間的α-淀粉酶有相當(dāng)高的同一性。這樣可以將相同的寡核苷酸和策略用于將AAI-10α-淀粉酶克隆到表達(dá)載體pTVB110中，得到質(zhì)粒pTVB229，然后用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)發(fā)酵該質(zhì)粒。
實(shí)施例6AAI-6α-淀粉酶的純化通過(guò)加入0.01ml 50％(w/w)CaCl2，2H2O，0.ml 12％(w/w)鋁酸鈉，0.025ml10％C521和0.075ml 0.1％A130 pr.ml培養(yǎng)液使培養(yǎng)液成為絮狀。離心后得到澄清的溶液。向酶溶液中加入硫酸銨達(dá)到1.2M的終濃度，然后加到預(yù)先用1.2M硫酸銨，10mM Tris-HCl，pH7.0.平衡的Butyl Toyo Pearl柱(100ml)上。用5mM Tris-HCl，pH7.0洗脫淀粉酶，然后將洗脫液收集物用5mMTris-HCl透析過(guò)夜。然后將餾分用預(yù)先用20mM Tris-HCl，pH9.0平衡的Q-Sepharose柱(200ml)進(jìn)行離子交換層析。用平衡緩沖液洗出未吸附物質(zhì)，用0-1M NaCl，20mM Tris-HCl，pH9.0線性梯度洗脫淀粉酶。淀粉酶制品純度由SDS-PAGE判斷為高于95％。
實(shí)施例7AAI-10α-淀粉酶的純化按上述使培養(yǎng)液成絮狀。向酶溶液中加入硫酸銨達(dá)到1.2M的終濃度，然后加到預(yù)先用1.2M硫酸銨，10mM Tris-HCl，pH7.0.平衡的Butyl ToyoPearl柱(100ml)上。用5mM Tris-HCl，pH7.0洗脫20％活性，剩余的用異丙醇洗脫。將合并的餾分在Q-Sepharose柱(100ml)，pH9.7上分級(jí)分離。用平衡緩沖液洗掉未結(jié)合的物質(zhì)，用0-1M NaCl，20mM Tris-HCl，pH9.4線性梯度洗脫淀粉酶。將含淀粉酶的匯集液最后上樣至S Sepharose柱，pH5.5分級(jí)分離。經(jīng)SDS-PAGE判斷所述淀粉酶制品的純度在95％以上。
實(shí)施例8AAI-6和AAI-10α-淀粉酶的表征用上述Phadebas檢測(cè)方法(37℃，pH7.3)和另一種pNPG7檢測(cè)方法(25℃，pH7.1)測(cè)定α-淀粉酶活性。在所選的pH和溫度值制作pH-和溫度圖。在37℃測(cè)定pH圖，在pH9.0測(cè)定溫度圖。
用等電聚焦(Pharmacia，Ampholine，pH3.5-9.3)確定等電點(diǎn)。
表1.比活性和pI
AAI-6和AAI-10的E＝3.0cm-1*(g/l)-1在圖2和圖3中分別列出了最佳pH和最佳溫度的結(jié)果。
實(shí)施例9洗滌試驗(yàn)在分別含本發(fā)明AAI-6和AAI-10α-淀粉酶的洗滌劑溶液中，在25和40℃用15和30分鐘，通過(guò)洗滌有污垢的試驗(yàn)樣品來(lái)評(píng)估洗滌性能。
在下表3中公開(kāi)了所用的洗滌劑。在上述材料節(jié)中描述了A/P ModelDetergent。另一種洗滌劑是市售洗滌劑。在洗滌前通過(guò)微波使含淀粉酶的市售洗滌劑失活。
將實(shí)施例6和7的純化的重組AAI-6和AAI-10α-淀粉酶以下文所述濃度加到洗滌劑溶液中。用橙色大米淀粉弄臟試驗(yàn)樣品(CS-28樣品得自CFT，Center for Test Material，Holland).
洗滌后，用Elrepho Remission Spectrophotometer在460nm測(cè)量污垢的減少來(lái)評(píng)估樣品。將結(jié)果表示為ΔR＝用α-淀粉酶洗滌的樣品污垢的減少-在相同條件下不用α-淀粉酶洗滌的樣品之污垢的減少。
表3.洗滌劑和洗滌條件地區(qū) 洗滌劑 洗滌劑劑量 失活 酶劑量 溫度 時(shí)間 pH 水硬度 Ca∶Mgg/l mg/l℃min °dHA/P Model洗滌劑97 3- 1 2515 10.56 2∶1拉丁美洲 Omo Multi Acao 3- 1 2515 10.66 2∶1歐洲 Omo濃縮粉 4+ 0.24030 10.2154∶1歐洲 Ariel Futur液體 5+ 0.24030 9.0 154∶1圖4-7中列出了結(jié)果。結(jié)果表明本發(fā)明的α-淀粉酶在高堿性pH的兩種洗滌劑中均是有效的。
實(shí)施例10用AAI-10脫漿試驗(yàn)用TEGEWA方法(方法和標(biāo)準(zhǔn)規(guī)模得自Verband TEGEWA，Karlstrasse21，F(xiàn)rankfurt a.M.，德國(guó))，將親本AAI-10α-淀粉酶用于紡織品脫漿。在“材料和方法”節(jié)中描述了條件。
將AAI-10α-淀粉酶用于30和55℃完成的脫漿試驗(yàn)。該酶在浸透液中的劑量0.05-2g/l。通過(guò)用水洗滌紡織品-而不是用通常的熱蘇打水洗滌來(lái)完成洗滌后步驟。
用Violet Scale(TEGEWA)，TEGEWA scale1-9測(cè)定效果。
實(shí)施例11AAI-10變體的構(gòu)建按WO 99/23211的實(shí)施例4所述構(gòu)建AAI-10的變體。
實(shí)施例12檢測(cè)AAI-10變體的洗滌性能按實(shí)施例9所述檢測(cè)本發(fā)明AAI-10變體的洗滌性能。
實(shí)施例13檢測(cè)AAI-10變體的比活性按實(shí)施例8所述確定AAI-10變體的比活性。
實(shí)施例14檢測(cè)AAI-10變體的鈣穩(wěn)定性用“材料和方法”節(jié)中所述的檢測(cè)方法檢測(cè)AAI-10變體的鈣穩(wěn)定性。
本文所述和要求的本發(fā)明并不限于本文所公開(kāi)的具體實(shí)施方案的范圍，因?yàn)檫@些實(shí)施方案只是為了說(shuō)明本發(fā)明的幾個(gè)方面。任何等同實(shí)施方案均在本發(fā)明范圍內(nèi)。實(shí)際上，除本文所列和所述的外，從前文的描述中，本發(fā)明的各種改變對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的。所述改變也在本發(fā)明權(quán)利要求的范圍內(nèi)。在沖突的情況下，包括定義的本發(fā)明說(shuō)明書將起決定作用。
本文引用了各種參考文獻(xiàn)，其內(nèi)容全部引入本文作為參考。
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序列表<110>諾維信公司(Novozyme)<120>具有堿性α-淀粉酶活性的多肽及其編碼核酸<160>12<170>適用于Windows 3.0版的FastSEQ<210>1<211>1458<212>DNA<213>芽孢桿菌屬菌株(Bacillus sp.)<220><221>CDS<222>(1)...(1458)<221>mat_peptide<222>(1)...(1458)<400> 1cat cac gat ggg acg aac gga acg att atg caa tat ttt gaa tgg aac 48His His Asp Gly Thr Asn Gly Thr Ile Met Gln Tyr Phe Glu Trp Asn1 5 10 15gtt ccg aat gat gga caa cat tgg aac cgc tta cac aac aat gct cag 96Val Pro Asn Asp Gly Gln His Trp Asn Arg Leu His Asn Asn Ala Gln20 25 30aat tta aaa aat gct gga att act gcg att tgg att ccc cct gca tgg 144Asn Leu Lys Asn Ala Gly Ile Thr Ala Ile Trp Ile Pro Pro Ala Trp35 40 45aaa gga acg agc caa aat gat gta ggc tat ggt gcg tat gac ctc tat 192Lys Gly Thr Ser Gln Asn Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr50 55 60gac ctt ggt gaa ttt aat caa aaa gga aca gta cgt acg aaa tat ggc 240Asp Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly65 70 75 80aca aaa gca gaa tta gaa cga gcg att cgc tcg tta aaa gcg aac ggg 288Thr Lys Ala Glu Leu Glu Arg Ala Ile Arg 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Val Asp Met195 200 205aac cat cct gaa gtc ata aac gaa tta aac cga tgg ggc gta tgg tac 672Asn His Pro Glu Val Ile Asn Glu Leu Asn Arg Trp Gly Val Trp Tyr210 215 220gca aat acc ctt aat tta gac ggc ttt aga ctt gat gcg gtg aag cat 720Ala Asn Thr Leu Asn Leu Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Lys His225 230 235 240att caa ttc agc ttc atg cgc aac tgg ctc gga cat gtt cga gga caa 768Ile Gln Phe Ser Phe Met Arg Asn Trp Leu Gly His Val Arg Gly Gln245 250 255aca ggc aag aac ctc ttt gca gtt gca gaa tat tgg aaa aac gac tta 816Thr Gly Lys Asn Leu Phe Ala Val Ala Glu Tyr Trp Lys Asn Asp Leu260 265 270ggt gcc cta gaa aat tat tta agt aaa aca aat tgg acg atg agc gcc 864Gly Ala Leu Glu Asn Tyr Leu Ser Lys Thr Asn Trp Thr Met Ser Ala275 280 285ttt gat gtg cct ctt cat tac aac ctt tac caa gcg tca aat agc ggc 912Phe Asp Val Pro Leu His Tyr Asn Leu Tyr Gln Ala Ser Asn Ser Gly290 295 300gga aat tac gac atg aga aat ttg tta aat gga acg ctc gtt cag cgt 960Gly Asn Tyr Asp Met Arg Asn Leu Leu Asn Gly Thr Leu Val Gln 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Ser Asp420 425 430ggt cca ggt gga tcg aaa tgg atg tat gtt ggt cgt caa aaa gct ggt 1344Gly Pro Gly Gly Ser Lys Trp Met Tyr Val Gly Arg Gln Lys Ala Gly435 440 445gaa gta tgg cat gac ata act gga aac cgc agc ggc act gtg aca att 1392Glu Val Trp His Asp Ile Thr Gly Asn Arg Ser Gly Thr Val Thr Ile450 455 460aac cag gac ggc tgg gga caa ttt ttt gtc aac ggt ggt tcc gtc tcc 1440Asn Gln Asp Gly Trp Gly Gln Phe Phe Val Asn Gly Gly Ser Val Ser465 470 475 480gta tgg gtg aaa cga taa 1458Val Trp Val Lys Arg *485<210>2<211>485<212>PRT<213>芽孢桿菌屬菌株(Bacillus sp.)<400> 2His His Asp Gly Thr Asn Gly Thr Ile Met Gln Tyr Phe Glu Trp Asn1 5 10 15Val Pro Asn Asp Gly Gln His Trp Asn Arg Leu His Asn Asn Ala Gln20 25 30Asn Leu Lys Asn Ala Gly Ile Thr Ala Ile Trp Ile Pro Pro Ala Trp35 40 45Lys Gly Thr Ser Gln Asn Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr50 55 60Asp Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly65 70 75 80Thr Lys Ala Glu Leu Glu Arg Ala Ile Arg Ser Leu Lys Ala Asn Gly85 90 95Ile Gln Val Tyr Gly Asp Val Val Met Asn His Lys Gly Gly Ala Asp100 105 110Phe Thr Glu Arg Val Gln Ala Val Glu Val Asn Pro Gln Asn Arg Asn115 120 125Gln Glu Val Ser Gly Thr Tyr Glu Ile Glu Ala Trp Thr Gly Phe Asn130 135 140Phe Pro Gly Arg Gly Asn Gln His Ser Ser Phe Lys Trp Arg Trp Tyr145 150 155 160His Phe Asp Gly Thr Asp Trp Asp Gln Ser Arg Gln Leu Ser Asn Arg165 170 175Ile Tyr Lys Phe Arg Gly Asp Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Asp180 185 190Thr Glu Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Val Asp Met195 200 205Asn His Pro Glu Val Ile Asn Glu Leu Asn Arg Trp Gly Val Trp Tyr210 215 220Ala Asn Thr Leu Asn Leu Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Lys His225 230 235 240Ile Gln Phe Ser Phe Met Arg Asn Trp Leu Gly His Val Arg Gly Gln245 250 255Thr Gly Lys Asn Leu Phe Ala Val Ala Glu Tyr Trp Lys Asn Asp Leu260 265 270Gly Ala Leu Glu Asn Tyr Leu Ser Lys Thr Asn Trp Thr Met Ser Ala275 280 285Phe Asp Val Pro Leu His Tyr Asn Leu Tyr Gln Ala Ser Asn Ser Gly290 295 300Gly Asn Tyr Asp Met Arg Asn Leu Leu Asn Gly Thr Leu Val Gln Arg305 310 315 320His Pro Ser His Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Gln Pro325 330 335Gly Glu Ala Leu Glu Ser Phe Val Gln Gly Trp Phe Lys Pro Leu Ala340 345 350Tyr Ala Thr Ile Leu Thr Arg Glu Gln Gly Tyr Pro Gln Val Phe Tyr355 360 365Gly Asp Tyr Tyr Gly Ile Pro Ser Asp Gly Val Pro Ser Tyr Arg Gln370 375 380Gln Ile Asp Pro Leu Leu Lys Ala Arg Gln Gln Tyr Ala Tyr Gly Arg385 390 395 400Gln His Asp Tyr Phe Asp His Trp Asp Val Ile Gly Trp Thr Arg Glu405 410 415Gly Asn Ala Ser His Pro Asn Ser Gly Leu Ala Thr Ile Met Ser Asp420 425 430Gly Pro Gly Gly Ser Lys Trp Met Tyr Val Gly Arg Gln Lys Ala Gly435 440 445Glu Val Trp His Asp Ile Thr Gly Asn Arg Ser Gly Thr Val Thr Ile450 455 460Asn Gln Asp Gly Trp Gly Gln Phe Phe Val Asn Gly Gly Ser Val Ser465 470 475 480Val Trp Val Lys Arg485<210>3<211>1458<212>DNA<213>芽孢桿菌屬菌株(Bacillus sp.)<220>
<221>CDS<222>(1)...(1458)<221>mat_peptide<222>(1)...(1458)<400> 3cat cac gat ggg acg aac gga acg att atg cag tat ttt gaa tgg aac 48His His Asp Gly Thr Asn Gly Thr Ile Met Gln Tyr Phe Glu Trp Asn1 5 10 15gtt ccg aat gat gga caa cat tgg aac cgc tta cac aac aac gct caa 96Val Pro Asn Asp Gly Gln His Trp Asn Arg Leu His Asn Asn Ala Gln20 25 30aat tta aaa aat gcc gga att aca gca atc tgg att cca cct gcg tgg 144Asn Leu Lys Asn Ala Gly Ile Thr Ala Ile Trp Ile Pro Pro Ala Trp35 40 45aaa gga acg agc caa aat gat gta ggc tac ggt gcg tat gac ctt tat 192Lys Gly Thr Ser Gln Asn Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr50 55 60gac ctt ggt gaa ttt aac caa aaa gga acg gtc cgt acg aaa tat gga 240Asp Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly65 70 75 80aca aaa gca gaa tta gaa cga gcg att cgt tcg tta aag gcg aac ggg 288Thr Lys Ala Glu Leu Glu Arg Ala Ile Arg Ser Leu Lys Ala Asn Gly85 90 95att caa gtg tat ggc gat gtt gtt atg aac cat aaa ggc gga gct gat 336Ile Gln Val Tyr Gly Asp Val Val Met Asn His Lys Gly Gly Ala Asp100 105 110ttc acc gag cgt gtt caa gcg gtt gaa gtg aac ccg caa aac cga aac 384Phe Thr Glu Arg Val Gln Ala Val Glu Val Asn Pro Gln Asn Arg Asn115 120 125caa gaa gtg tct ggc act tat caa atc gaa gca tgg aca ggg ttc aat 432Gln Glu Val Ser Gly Thr Tyr Gln Ile Glu Ala Trp Thr Gly Phe Asn130 135 140ttt cct gga cgt ggc aat caa cat tct tcg ttt aaa tgg cgc tgg tat 480Phe Pro Gly Arg Gly Asn Gln His Ser Ser Phe Lys Trp Arg Trp Tyr145 150 155 160cat ttc gat ggg acg gat tgg gac cag tct cgc caa ctc gca aat cgt 528His Phe Asp Gly Thr Asp Trp Asp Gln Ser Arg Gln Leu Ala Asn Arg165 170 175att tat aag ttt aga gga gac gga aaa gca tgg gac tgg gaa gtt gac 576Ile Tyr Lys Phe Arg Gly Asp Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Asp180 185 190act gaa aat ggg aac tat gat tac tta atg tat gca gac gtt gac atg 624Thr Glu Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Val Asp Met195 200 205gat cat cca gaa gtg att aac gaa cta aac cgt tgg ggc gtc tgg tac 672Asp His Pro Glu Val Ile Asn Glu Leu Asn Arg Trp Gly Val Trp Tyr210 215 220gcg aat acc ctt aat tta gac ggc ttc cga ctg gat gca gtg aaa cat 720Ala Asn Thr Leu Asn Leu Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Lys His225 230 235 240att aaa ttt agc ttc atg cgt gat tgg tta ggg cat gtt cgc ggg caa 768Ile Lys Phe Ser Phe Met Arg Asp Trp Leu Gly His Val Arg Gly Gln245 250 255acg ggc aag aat ctt ttt gcc gtt gca gag tat tgg aag aat gac cta 816Thr Gly Lys Asn Leu Phe Ala Val Ala Glu Tyr Trp Lys Asn Asp Leu260 265 270ggg gct tta gaa aat tat tta agc aaa aca aat tgg acg atg agc gcc 864Gly Ala Leu Glu Asn Tyr Leu Ser Lys Thr Asn Trp Thr Met Ser Ala275 280 285ttt gat gtt ccg ctt cat tac aac ctt tat caa gcg tca aat agt agc 912Phe Asp Val Pro Leu His Tyr Asn Leu Tyr Gln Ala Ser Asn Ser Ser290 295 300gga aat tac gac atg aga aac ttg tta aat gga aca ctc gtt caa cgt 960Gly Asn Tyr Asp Met Arg Asn Leu Leu Asn Gly Thr Leu Val Gln Arg305 310 315 320cat ccg agc cat gcg gtt acg ttt gtc gat aac cac gac aca cag cct 1008His Pro Ser His Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Gln Pro325 330 335gga gaa gcc ctc gaa tcg ttc gtt caa ggc tgg ttt aaa cca cta gct 1056Gly Glu Ala Leu Glu Ser Phe Val Gln Gly Trp Phe Lys Pro Leu Ala340 345 350tat gca acg att ctt acg aga gag caa ggc tac cca caa gtg ttt tac 1104Tyr Ala Thr Ile Leu Thr Arg Glu Gln Gly Tyr Pro Gln Val Phe Tyr355 360 365ggc gat tat tat ggc atc cca agt gac ggt gtt cca agc tac cgt caa 1152Gly Asp Tyr Tyr Gly Ile Pro Ser Asp Gly Val Pro Ser Tyr Arg Gln370 375 380cag atc gac cca ctt tta aaa gct cgt caa caa tat gct tat ggt aga 1200Gln Ile Asp Pro Leu Leu Lys Ala Arg Gln Gln Tyr Ala Tyr Gly Arg385 390 395 400cag cac gat tac ttt gat cat tgg gat gta att ggc tgg aca cgt gaa 1248Gln His Asp Tyr Phe Asp His Trp Asp Val Ile Gly Trp Thr Arg Glu405 410 415gga aac gca tct cac ccg aac tca gga ctt gca acc att atg tct gat 1296Gly Asn Ala Ser His Pro Asn Ser Gly Leu Ala Thr Ile Met Ser Asp420 425 430ggt cca ggt gga tca aaa tgg atg tat gtt ggc cgt cag aaa gct ggc 1344Gly Pro Gly Gly Ser Lys Trp Met Tyr Val Gly Arg Gln Lys Ala Gly435 440 445gaa gtg tgg cat gac atg act gga aac cgc agt ggc act gtg aca att 1392Glu Val Trp His Asp Met Thr Gly Asn Arg Ser Gly Thr Val Thr Ile450 455 460aat caa gac ggc tgg gga cac ttt ttt gtc aac ggc ggc tct gtc tcc 1440Asn Gln Asp Gly Trp Gly His Phe Phe Val Asn Gly Gly Ser Val Ser465 470 475 480gta tgg gtg aaa cga taa 1458Val Trp Val Lys Arg *485<210>4<211>485<212>PRT<213>芽孢桿菌屬菌株(Bacillus sp.)<400> 4His His Asp Gly Thr Asn Gly Thr Ile Met Gln Tyr Phe Glu Trp Asn1 5 10 15Val Pro Asn Asp Gly Gln His Trp Asn Arg Leu His Asn Asn Ala Gln20 25 30Asn Leu Lys Asn Ala Gly Ile Thr Ala Ile Trp Ile Pro Pro Ala Trp35 40 45Lys Gly Thr Ser Gln Asn Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr50 55 60Asp Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly65 70 75 80Thr Lys Ala Glu Leu Glu Arg Ala Ile Arg Ser Leu Lys Ala Asn Gly85 90 95Ile Gln Val Tyr Gly Asp Val Val Met Asn His Lys Gly Gly Ala Asp100 105 110Phe Thr Glu Arg Val Gln Ala Val Glu Val Asn Pro Gln Asn Arg Asn115 120 125Gln Glu Val Ser Gly Thr Tyr Gln Ile Glu Ala Trp Thr Gly Phe Asn130 135 140Phe Pro Gly Arg Gly Asn Gln His Ser Ser Phe Lys Trp Arg Trp Tyr145 150 155 160His Phe Asp Gly Thr Asp Trp Asp Gln Ser Arg Gln Leu Ala Asn Arg165 170 175Ile Tyr Lys Phe Arg Gly Asp Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Asp180 185 190Thr Glu Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Val Asp Met195 200 205Asp His Pro Glu Val Ile Asn Glu Leu Asn Arg Trp Gly Val Trp Tyr210 215 220Ala Asn Thr Leu Asn Leu Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Lys His225 230 235 240Ile Lys Phe Ser Phe Met Arg Asp Trp Leu Gly His Val Arg Gly Gln245 250 255Thr Gly Lys Asn Leu Phe Ala Val Ala Glu Tyr Trp Lys Asn Asp Leu260 265 270Gly Ala Leu Glu Asn Tyr Leu Ser Lys Thr Asn Trp Thr Met Ser Ala275 280 285Phe Asp Val Pro Leu His Tyr Asn Leu Tyr Gln Ala Ser Asn Ser Ser290 295 300Gly Asn Tyr Asp Met Arg Asn Leu Leu Asn Gly Thr Leu Val Gln Arg305 310 315 320His Pro Ser His Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Gln Pro325 330 335Gly Glu Ala Leu Glu Ser Phe Val Gln Gly Trp Phe Lys Pro Leu Ala340 345 350Tyr Ala Thr Ile Leu Thr Arg Glu Gln Gly Tyr Pro Gln Val Phe Tyr
355 360 365Gly Asp Tyr Tyr Gly Ile Pro Ser Asp Gly Val Pro Ser Tyr Arg Gln370 375 380Gln Ile Asp Pro Leu Leu Lys Ala Arg Gln Gln Tyr Ala Tyr Gly Arg385 390 395 400Gln His Asp Tyr Phe Asp His Trp Asp Val Ile Gly Trp Thr Arg Glu405 410 415Gly Asn Ala Ser His Pro Asn Ser Gly Leu Ala Thr Ile Met Ser Asp420 425 430Gly Pro Gly Gly Ser Lys Trp Met Tyr Val Gly Arg Gln Lys Ala Gly435 440 445Glu Val Trp His Asp Met Thr Gly Asn Arg Ser Gly Thr Val Thr Ile450 455 460Asn Gln Asp Gly Trp Gly His Phe Phe Val Asn Gly Gly Ser Val Ser465 470 475 480Val Trp Val Lys Arg485<210>5<211>7<212>PRT<213>未知<220>
<223>Xaa＝Leu，Val，Ile<223>Xaa＝Ile，Leu<223>簡(jiǎn)并引物區(qū)<400>5Gly Ile Thr Ala Xaa Trp Xaa1 5<210>6<211>9<212>PRT<213>未知<220>
<223>簡(jiǎn)并引物區(qū)<223>Xaa＝Gly，Ala<223>Xaa＝Val，Phe，Leu<223>Xaa＝Met，Leu，Ile，Phe<400>6Val Tyr Xaa Asp Xaa Val Xaa Asn His1 5<210>7<211>10<212>PRT<213>未知<220>
<223>Xaa＝Phe，Ile<223>Xaa＝Phe，Leu，Ile，Val<223>Xaa＝Ala，Val<223>簡(jiǎn)并引物區(qū)<400>7Asp Gly Xaa Arg Xaa Asp Ala Xaa Lys His1 5 10<210>8<211>10<212>PRT<213>未知<220>
<223>簡(jiǎn)并引物區(qū)<223>Xaa＝Phe，Ile<223>Xaa＝Phe，Leu，Ile，Val<223>Xaa＝Ala，Val<400>8Asp Gly Xaa Arg Xaa Asp Ala Xaa Lys His1 5 10<210>9<211>8<212>PRT<213>未知<220>
<223>簡(jiǎn)并引物區(qū)<223>Xaa＝Asp，Glu<400>9Val Thr Phe Val Xaa Asn His Asp1 5<210>10<211>6<212>PRT<213>未知<220>
<223>簡(jiǎn)并引物區(qū)
<400>10Gly Trp Thr Arg Glu Gly1 5<210>11<211>47<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物197克隆C<400>11ccgagctcgg ccggctgggc cgtcgactta tcgtttcacc catacgg47<210>12<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>197克隆N<400>12cattctgcag cagcggcgca tcacgatggg acgaacgg 38
權(quán)利要求
1.一種分離的多肽，其具有α-淀粉酶活性并具有選自下列的一種或多種特征或特性(a)具有與SEQ ID NO2或SEQ ID NO4的氨基酸1-485有至少85％同一性的氨基酸序列的多肽；(b)由在低度嚴(yán)謹(jǐn)條件下與(i)SEQ ID NO1或SEQ ID NO3的核酸序列，(ii)SEQ ID NO1或SEQ ID NO3的cDNA序列，(iii)(i)或(ii)的至少100個(gè)核苷酸的亞序列，或(iv)(i)、(ii)或(iii)的互補(bǔ)鏈雜交的核酸序列編碼的多肽；(c)(a)或(b)的等位基因變體；(d)(a)、(b)或(c)的具有α-淀粉酶活性的片段；(e)在pH9-11左右的堿性洗滌劑溶液中具有改善的洗滌性能的多肽；(f)用Phadebas方法(pH9.0)確定的最佳溫度為55-65℃的多肽；和(g)用等電聚焦(Pharmacia，Ampholine，pH3.5-9.3)確定的pI為7-8的多肽。
2.權(quán)利要求1的多肽，其具有與SEQ ID NO2或SEQ ID NO4的氨基酸1-485有至少85％同一性的氨基酸序列。
3.權(quán)利要求1的多肽，其包含SEQ ID NO2或SEQ ID NO4的氨基酸序列。
4.權(quán)利要求1的多肽，其由SEQ ID NO2或SEQ ID NO4的氨基酸序列或其片段組成。
5.權(quán)利要求1的多肽，其由SEQ ID NO2或SEQ ID NO4的氨基酸1-485組成。
6.權(quán)利要求1的多肽，由在中等嚴(yán)謹(jǐn)條件下與(i)SEQ ID NO1或SEQID NO3的核酸序列，(ii)SEQ ID NO1或SEQ ID NO3的cDNA序列，(iii)(i)或(ii)的至少100個(gè)核苷酸的亞序列，或(iv)(i)，(ii)，或(iii)的互補(bǔ)鏈雜交的核酸編碼。
7.權(quán)利要求1的多肽，由大腸桿菌DSM12769或大腸桿菌DSM 12768中分別所含的質(zhì)粒pLiH1300或pLiH1298中包含的核酸序列編碼。
8.與權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)的多肽具有相同α-淀粉酶活性的多肽。
9.一種分離的核酸序列，含有編碼權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)的多肽的核酸序列。
10.一種分離的核酸序列，其包括在SEQ ID NO1或SEQ ID NO3的成熟多肽編碼序列中含至少一個(gè)突變的核酸序列，其中所述突變核酸序列編碼由SEQ ID NO2或SEQ ID NO4的氨基酸1-485組成的多肽。
11.權(quán)利要求9或10的分離的核酸序列，其通過(guò)(a)在中等嚴(yán)謹(jǐn)條件下與(i)SEQ ID NO1的核酸序列，(ii)SEQ ID NO1的cDNA序列，(iii)(i)或(ii)的至少100個(gè)核苷酸的亞序列，或(iv)(i)，(ii)，或(iii)的互補(bǔ)鏈雜交；和(b)分離所述核酸序列而產(chǎn)生。
12.含權(quán)利要求9-11的核酸構(gòu)建體的重組表達(dá)載體。
13.含權(quán)利要求12的核酸構(gòu)建體的重組宿主細(xì)胞。
14.產(chǎn)生突變核酸序列的方法，該方法包括(a)將至少一個(gè)突變導(dǎo)入SEQID NO1或SEQ ID NO3的成熟多肽編碼序列中，其中所述突變核酸序列編碼由SEQ ID NO2或SEQ ID NO4的氨基酸1-485組成的多肽；和(b)回收所述突變核酸序列。
15.用權(quán)利要求14的方法產(chǎn)生的突變核酸序列。
16.生產(chǎn)多肽的方法，該方法包括(a)培養(yǎng)一種菌株以產(chǎn)生含所述多肽的上清液，其中該菌株含有能編碼所述多肽的權(quán)利要求15的突變核酸序列；和(b)回收所述多肽。
17.生產(chǎn)權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)的多肽的方法，所述方法包括(a)培養(yǎng)菌株以產(chǎn)生含所述多肽的上清液；和(b)回收所述多肽。
18.生產(chǎn)權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)的多肽的方法，所述方法包括(a)在適宜生產(chǎn)所述多肽的條件下培養(yǎng)含核酸構(gòu)建體的宿主細(xì)胞，其中所述構(gòu)建體含有編碼所述多肽的核酸序列；和(b)回收所述多肽。
23.生產(chǎn)多肽的方法，所述方法包括(a)在適宜生產(chǎn)所述多肽的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞攜有在SEQ ID NO1或SEQ ID NO3的成熟多肽編碼序列中含至少一個(gè)突變的突變核酸序列，其中所述突變核酸序列編碼由SEQ ID NO2或SEQ ID NO4的氨基酸1-485組成的多肽；和(b)回收所述多肽。
20.權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)的具有α-淀粉酶活性的多肽突變體，其中所述α-淀粉酶在下列位置(相對(duì)于SEQ ID NO2或SEQ ID NO4)含有至少一個(gè)或多個(gè)突變，特別是取代或缺失1R181*，G182*，D183*，G184*；2N195A，R，D，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；3V206A，R，D，N，C，E，Q，G，H，，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y；4E212A，R，D，N，C，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；5E216A，R，D，N，C，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；6K269A，R，D，N，C，E，Q，G，H，I，L，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V.7R181A，N，D，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V。
21.權(quán)利要求20的突變體，選自帶有下列突變的突變體-R181*/G182*/N195A，R，D，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；-G182*/T183*/N195A，R，D，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；-T183*/G184*/N195A，R，D，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；-T183*/G184*/R181A，N，D，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；-R181*/G182*/V206A，R，D，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y；-G182*/T183*/V206A，R，D，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y；-T183*/G184*/V206A，R，D，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y；-R181*/G182*/E212A，R，D，N，C，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；-G182*/T183*/E212A，R，D，N，C，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；-T183*/G184*/E212A，R，D，N，C，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V-R181*/G182*/E216A，R，D，N，C，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；-G182*/T183*/E216A，R，D，N，C，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；-T183*/G184*/E216A，R，D，N，C，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；-R181*/G182*/K269A，R，D，N，C，E，Q，G，H，I，L，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；-G182*/T183*/K269A，R，D，N，C，E，Q，G，H，I，L，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；-T183*/G184*/K269A，R，D，N，C，E，Q，G，H，I，L，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；-N195A，R，D，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V/V206A，R，D，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y；-N195A，R，D，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V/E212A，R，D，N，C，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；-N195A，R，D，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V/E216A，R，D，N，C，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；-N195A，R，D，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V/K269A，R，D，N，C，E，Q，G，H，I，L，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；-V206A，R，D，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y/E212A，R，D，N，C，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；-V206A，R，D，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y/E216A，R，D，N，C，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；-V206A，R，D，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y/K269A，R，D，N，C，E，Q，G，H，I，L，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；-E212A，R，D，N，C，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V/E216A，R，D，N，C，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；E212A，R，D，N，C，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V/K269A，R，D，N，C，E，Q，G，H，I，L，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；-E216A，R，D，N，C，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V/K269A，R，D，N，C，E，Q，G，H，I，L，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V。
22.權(quán)利要求20或21的突變體，進(jìn)一步在位置E216Q含有一個(gè)取代。
21.權(quán)利要求1-8的多肽或權(quán)利要求20-22的變體在洗滌劑組合物，特別是在洗衣洗滌劑組合物和洗碗洗滌劑組合物以及硬表面清潔組合物中的應(yīng)用。
24.權(quán)利要求1-8的任一項(xiàng)的多肽或權(quán)利要求20-22的變體在脫漿組合物中的應(yīng)用。
25.權(quán)利要求1-8的任一項(xiàng)的多肽或權(quán)利要求20-22的變體在淀粉液化中的應(yīng)用。
26.權(quán)利要求1-8的任一項(xiàng)的多肽或權(quán)利要求20-22的變體在乙醇生產(chǎn)中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及具有α－淀粉酶活性的分離的多肽和編碼所述多肽的分離的核酸序列。本發(fā)明還涉及核酸構(gòu)建體、載體以及含所述核酸序列的宿主細(xì)胞和生產(chǎn)并利用所述多肽的方法。
文檔編號(hào)C12N5/10GK1351657SQ00807805
公開(kāi)日2002年5月29日 申請(qǐng)日期2000年3月28日 優(yōu)先權(quán)日1999年3月31日
發(fā)明者赫利·奧特拉普, 利斯貝思·H·霍克, 比約恩·R·尼爾森, 托本·V·博徹特, 維比克·S·尼爾森, 亨里克·比斯加德-弗蘭岑, 艾倫·斯文德森, 卡斯滕·安德森 申請(qǐng)人:諾維信公司