專利名稱：熱休克誘導外源基因高效表達的藍藻轉基因表達系統(tǒng)及其用于表達胸腺素α1的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種基因工程。
藍藻(Cyanophyte)又稱藍細菌(Cyanobacterium)，是一種特殊的微生物。藍藻的基因組簡單，除了裸露的染色體DNA外不含葉綠體和線粒體DNA，便于進行基因分析。近年來，已克隆了大量藍藻基因，建立了一些藍藻的基因轉移系統(tǒng)以及外源基因表達系統(tǒng)。藍藻作為表達外源基因的受體菌已取得了不少研究成果。Tandeau de Marsac(Mol.Gen.Genet1987，209296～298)以pUC303為載體在單胞藻Synechococcus sp.PCC7942(簡稱Synechococcus7942，其余藻名依此類推)中表達了原核生物芽孢桿菌殺幼蚊毒素基因；Fukuda等(Biotech.Lett1994，161～6)在Synechococcus 7942中表達了植物的乙烯合成酶基因；Takeshima(Proc.Natl.Acad.Sci USA 1994，919685～9689)把合成的人過氧化物歧化酶基因(h-SOD)置于1，5-核酮糖二磷酸羧化酶基因(rbc)的啟動子下在Synechococcus 7942中表達，產(chǎn)物占總蛋白量的3％，并且有良好的胞內生物活性；Murphy(Appl.Environ.Microbiol1992，581650～1655)把枯草桿菌的cryIVD基因融合在Synechococcus sp.PCC7942的cpcB基因上表達，融合蛋白質的表達量高而且沒有明顯降解，并具有殺蚊效力；孫軍等(生物工程進展，1994，14(6)39～42)在Anabaena 7120中表達了小鼠的金屬硫蛋白基因(mt-1)。這些研究工作表明包括真核基因在內的外源基因能在藍藻中表達。
在目前的基因工程研究中，目的基因產(chǎn)物表達量一般可達細胞總蛋白量的20-30％。但存在一個問題，表達產(chǎn)物主要以無生物活性的包涵體形式存在，要得到活性產(chǎn)物必須進行體外折疊，成本高、得率低。而體內蛋白質折疊和裝配須有其它蛋白質和酶參與，其中分子伴侶(Molecular Chaperones)就是非常重要的一種。它們是一類進化上很保守的蛋白質，廣泛存在于原核與真核生物中，可催化、介導蛋白質特定構象的形成與穩(wěn)定，參與體內蛋白質的折疊、裝配與轉運。迄今為止，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)分子伴侶屬于熱休克蛋白(Heat shock protein，HSP)。熱休克蛋白具有在熱誘導后，細胞內大部分蛋白質的合成受抑制，而其則可過量表達的特性。Webb等(J.Bateriol1990，1725079～5088)對Synechococcus sp.PCC7942的熱休克蛋白GroEL與GroES的基因克隆并測序，其序列如下-240 -200GCTTCGCGAGCGCGACAACTGTCAGGAGGGCGATTTTGCCACAGTCCAGCGTATCACCGAAGGCTGCACCTTCCCGCAGC-150AAGATTCCCATTCCTGCGATCGCCGAGTTCGGGAACCCGT
“-35” “-100” “-10”ACTGAGGTCGCGTTGCCCTCCGAGAAGGCGGCCCGTACAT↓ -50TAGCACTCAGGTACTGGGAGTGCTAATCCATGCGGATCAT-1CCCGGTTGCCCTCTCCCCGTGACGACGTTTACTCAAAACT研究表明groEL與groES組成一個操縱子，經(jīng)Southern分析表明該操縱子在染色體中為單拷貝，并經(jīng)引物延伸實驗鑒定出groESL的啟動子區(qū)域。Ellis(Science，1990，250954～959)認為，由于熱休克基因groESL的啟動子屬于強啟動子，易調控，經(jīng)熱誘導后能幾十上百倍地加快轉錄。同時根據(jù)熱休克蛋白具分子伴侶的特性，如果外源基因產(chǎn)物與熱休克蛋白同時表達，可以提高活性的外源蛋白產(chǎn)量。
胸腺(Thymus)是免疫系統(tǒng)中重要的中樞器官，負責T細胞的分化和成熟，在抗感染、抗腫瘤和抗自身免疫性疾病中起著重要作用。從胸腺素混合物中分離出的胸腺素α1，是一個二十八肽，它可以預防免疫抑制病人感染條件致病菌，提高機體的細胞免疫能力，可用于治療多種疾病如紅斑狼瘡、乙肝、艾滋病等，還可作為治療某些癌癥的輔助藥物。現(xiàn)在胸腺素制劑已廣泛應用于臨床，但均是從豬、牛的胸腺中提取的多組分胸腺肽，提取時易混入豬、牛的某些蛋白，注射后可能導致人產(chǎn)生過敏反應。采用人胚胎提取的人胸腺素雖療效不錯，但人胚胎來源困難，難以形成規(guī)模生產(chǎn)。用多肽合成儀可合成胸腺素α1，但價格太貴。王震熙等(浙江醫(yī)科大學學報，1989，18(3)106～109)把Tα1基因導入PWR590菌株，用SPA-ELISA改良法在轉化的菌株中檢測到Tα1的表達；Wetzel等(Biochemistry1980，196096～6104)根據(jù)Low和Goldstein(1979)確定的氨基酸序列人工合成了Tα1基因，與質粒pBR322連接后導入E.coli中表達，雖得到與天然Tα1活性相同的表達產(chǎn)物，但表達量低。
本發(fā)明的目的旨在提供一種包含熱休克基因groESL強啟動區(qū)、目的基因，終止子及篩選標記基因的完整的可高效表達的藍藻基因表達系統(tǒng)及以基因整合平臺系統(tǒng)和穿梭質粒系統(tǒng)進行表達胸腺素α1的方法。
下面為本發(fā)明的詳細內容。
一、藍藻基因表達系統(tǒng)的構建根據(jù)Synechococcus sp.PCC7942 groESL操縱子中翻譯起點ATG上游240bp片段兩端的序列設計一對引物P1、P2P1 5′端引物5′-TCGCGAGCTCGACAACTGTC-3′SacⅠP2 3′端引物5′-CCGCATGCTTTTGAGTAAACGTCGTCACGG-3′SphⅠ以藍藻Synechococcus sp.PCC7942基因組DNA為模板，以P1和P2引物進行特異性PCR擴增得含groESL啟動區(qū)的PCR擴增片段。用HindⅢ酶切含卡那霉素抗性基因Kmr)，MCS和rbcS polyA終止區(qū)的質粒pKYLX-71-35S，電泳回收4.9kb片段，與經(jīng)同樣酶切的pUC19連接重組，連接物轉化E.coli JM101以氨卞青霉素和卡那霉素篩選得重組質粒pUCMT1’。根據(jù)胸腺素α1基因片段兩端的序列設計一對PCR引物T1和T2T1(5′端引物)5’-GGGCATGCAAGGATCCGACGCAGCTSphⅠ BamHⅠGTTGACACCAGCTCCGAAATCACCACCAAAGACTTAAAGG-3’T2(3′端引物)5’-GGGTCGACTAGTTTTCTGCTTCTTCASalⅠ SpeⅠACAACTTCTTTTTTTTCCTTTAAGTCTTTGGTGGTGATT-3’以常規(guī)PCR擴增法進行擴增后得110bp的Tα1 DNA片段；運用pUC18多克隆位點兩端的通用引物U1和U2U1(5′端引物)5’-CGCCAGGGTTTTTCCCAGTCACGAC-3’U2(3′端引物)5’-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3’以含有人工合成的泛素基因(UB)克隆至pUC18質粒的SphⅠ/BamHⅠ位點之間所構建的質粒pUCUB為模板，按常規(guī)PCR方法擴增出含UB基因的328bp的DNA片段；純化328bp的UB DNA片段和110bp的Tα1 DNA片段，用BamHⅠ同時酶切，然后用T4DNA連接酶連接，以連接產(chǎn)物為模板，以U1和T2’為引物進行特異性擴增，得380bp的UBTα1 DNA片段。
U1(5′端引物)5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’T2’(3′端引物)5’-GGGTCGACTAGTTTTCTGCTTCTTC-3’SalⅠ SpeⅠ按


圖1所示的設計，用SphⅠ同時單酶切groESL啟動區(qū)的PCR擴增片段和UBTα1 DNA片段后連接，以連接物為模板，P1、T2’為引物按常規(guī)PCR法擴增后得ESL-UBTa1片段。再將此片段插入到質粒pUCMT1’的SacⅠ-XbaⅠ位點之間，連接物轉化受體菌E.coli JM101，在具有Ap與Km的培養(yǎng)基上篩選出雙抗的克隆子，獲得包含有熱休克基因groESL的強啟動區(qū)、目的基因UBTα1，終止區(qū)以及Km標記基因的完整表達載體質粒pEUTMT1。
二、藍藻轉基因表達胸腺素α1的方法1．藍藻基因整合平臺表達系統(tǒng)根據(jù)藍藻Synechococcus sp.PCC7942的isiAB操縱子中1.5kb DNA片段兩端的序列設計一對PCR引物I1、I2Ⅰ1 5′端引物5′-GGAAGCTTCCCAGAAGTCACTTACGACTGG-3′HindⅢⅠ2 3′端引物5′-CTTCTAGAATGCCCATAGC-3′XbaⅠ以Synechococcus sp.PCC7942的染色體DNA為模板，按常規(guī)的PCR技術進行擴增得1．5kb的isiAB部分片段；回收isiAB操縱子1.5kb的PCR擴增片段，按圖2設計，用HindⅢ和XbaⅠ雙酶切質粒pUC19和擴增片段，用T4 DNA連接酶連接，連接物轉化受體菌E.coli JM101，用X-gal篩選出白色克隆子，得含有整合靶位的同源片段isiAB基因片段質粒pISIAB。用HindⅢ酶切回收表達載體pEUTMT1’的包含了groESL啟動區(qū)、目的基因UBTα1、rbcS終止區(qū)和Km標記基因在內的完整表達元件的4.21kb的DNA片段，將其插入到質粒pISIAB的HindⅢ酶切位點當中，連接物轉化受體菌E.coli JM101，在具有Ap與Km的培養(yǎng)基上篩選出雙抗的克隆子，得供體質粒pEUTISI，該質粒大小為8.37kb。
2．藍藻穿梭質粒表達系統(tǒng)從織線藻Plectonema boryanum中提取出的內源小質粒pPBS1，其序列被測定并已收入于DNA數(shù)據(jù)庫，編號為Genbank Accession No.AF176225，將質粒pPBS1克隆進質粒pBR322的ClaⅠ位點上，構建成穿梭質粒載體pPRS-1；按圖3設計，用HindⅢ酶切下含有熱休克基因groESL的強啟動區(qū)、目的基因UBTa1、終止區(qū)以及Km標記基因的表達載體pEUTMT1的4.21kb的完整表達元件的DNA片段，再通過電泳分離回收，并插入到穿梭質粒載體pPRS-1的HindⅢ位點上，連接物轉化受體菌E.coli JM101，在具有Km的培養(yǎng)基上篩選出克隆子，得到10.08kb大小的藍藻穿梭表達質粒pPREUT。
3．重組質粒分別轉化Synechococcus sp.PCC7942將構建好的供體質粒pEUTISI和藍藻穿梭表達質粒pPREUT分別轉化藍藻Synechococcussp.PCC7942，轉化后，將藍藻細胞與DNA混合液涂布于Millipore濾膜上，先在不含Km的BG-11固體培養(yǎng)基上恢復培養(yǎng)20hr，然后轉移濾膜至含Km 15μg/ml的BG-11固體培養(yǎng)基上進行篩選培養(yǎng)。一周后，轉化組的濾膜上出現(xiàn)抗Km的綠色單藻落，即為轉化藻株。
為了證明外源基因已轉化入藍藻細胞中，提取轉化藻株總DNA進行Southern雜交鑒定。以外源基因片段為探針，結果發(fā)現(xiàn)穿梭質粒組的轉化子的雜交信號存在于藍藻質粒中，表明外源基因是以質粒的形式存在于藍藻細胞中的；而對整合平臺系統(tǒng)的轉化組而言，以isiAB基因區(qū)的1.5kb PCR片段為探針模板制備探針，雜交結果出現(xiàn)了比原對照雜交帶更大的條帶，證明供體質粒已通過同源序列交換定位整合到轉化藻株的染色體整合靶位isiAB的DNA片段上。另外，通過蛋白質SDS-PAGE凝膠電泳和Wesstem印跡法對轉化藻株進行表達產(chǎn)物的檢測鑒定。由于groESL啟動子是熱休克啟動子，對轉化藻株進行40℃ 30min熱誘導，然后提取其水溶性蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳，結果在11KD的位置上轉化藻株出現(xiàn)了一條特異帶，而野生藻株不見此帶。為了驗證這條帶就是目的蛋白，進行了Western Blotting檢測。結果轉化藻株均出現(xiàn)了特異性雜交帶，而野生藻株不出現(xiàn)此雜交帶，說明目的蛋白UBTα1在藍藻中得到了表達。為了初步確定表達量，我們應用凝膠掃描成像系統(tǒng)對蛋白電泳圖譜進行分析，可知轉化藻的藻株中UBTα1的表達量分別占其水溶性蛋白總量的17.6％和10％。因此可以認為胸腺素α1在藍藻中已得到高效表達。
通過構建了包含熱休克基因groESL的強啟動區(qū)、目的基因UBTα1、終止區(qū)以及Km篩選標記基因的的完整的可高效表達的藍藻基因表達系統(tǒng)，并運用基因整合平臺系統(tǒng)和穿梭質粒系統(tǒng)進行藍藻的轉基因表達胸腺素α1。本發(fā)明利用熱休克基因groESL的啟動子屬于強啟動子，易調控，經(jīng)熱誘導后能幾十上百倍地加快轉錄，同時利用泛素融合表達技術，使目的基因UBTα1得到高效表達，表達量分別達到17.6％和10％，且工藝簡單、成本低，具有很大的開發(fā)前景，為產(chǎn)業(yè)化開發(fā)轉胸腺素α1基因藍藻開辟一條新的途徑。
圖1為熱休克表達載體pEUTMT1’的構建2為整合平臺表達系統(tǒng)供體質粒pEUTISI的構建3為藍藻穿梭表達質粒pPREUT的構建圖下面通過實施例對本發(fā)明做進一步說明。實施例1、藍藻基因表達系統(tǒng)的構建藍藻Synechococcus sp.PCC7942 groESL操縱子的啟動子在熱誘導下屬強啟動子，并且其核苷酸序列已被測定。藍藻啟動區(qū)序列一般位于轉錄起始點上游50bp以內。因此，為了克隆groESL啟動區(qū)，就根據(jù)ATG上游240bp片段兩端的序列設計一對引物P1、P2。P2的5端設計了一個SphⅠ酶切位點，其切點為GCATG↓C，可以保證不破壞ATG起始的閱讀框以及ATG上游幾個堿基的序列。GroESL啟動區(qū)引物如下P1 5′端引物5′-TCGCGAGCTCGACAACTGTC-3′SacⅠP2 3′端引物5′-CCGCATGCTTTTGAGTAAACGTCGTCACGG-3′SphⅠ將10ml培養(yǎng)至對數(shù)后期的Synechococcus sp.PCC7942藍藻細胞離心沉淀并重懸浮于0.5m裂解液中。在1.5ml微離心管中經(jīng)多次凍融步驟后，加5mg溶菌酶，充分漩渦振蕩，37℃培養(yǎng)約30min。加SDS至1％，并加入蛋白酶K至100ug/ml，50℃培養(yǎng)至少2小時。進行2-3次酚仿和2次氯仿抽提。加1/3體積10.5mol/L乙酸銨和2體積2-丙醇到抽提后的水相中，置于-20℃至少15min，然后4℃離心20min。用70％乙醇洗沉淀2次，每次洗后離心5min。減壓干燥沉淀，重懸于0.3ml TE緩沖液中。待作為PCR模板。
在0.5ml無菌離心管中依次加入ddH2O 36ul；10×Taq酶緩沖液5ul；4×dNTP(2.5mmol/L)5ul；P1引物1ul；P2引物1ul；模板(藍藻G-DNA)1ul；Taq酶(3U/ul)1ulPCR反應參數(shù)首先94℃預變性5min；接著94℃變性30S；50℃復性45S；72℃延伸50S；35個循環(huán)；最后72℃再延伸5min。
反應結束后，取5ml進行2％瓊脂糖凝膠電泳鑒定，在電泳圖譜上出現(xiàn)一條略0．2kb片段，表明被擴增的片段是預期要克隆的片段，包含了groESL啟動區(qū)。
除了啟動區(qū)以外，還應含有相應的終止區(qū)以及報告基因、多克隆位點(Multiple CloningSites，MCS)等元件。質粒pKYLX-71-35S含有上述元件，因此將其進行亞克隆，把卡那霉素抗性基因(Kmr)，MCS和rbcS polyA終止區(qū)的4.9kb HindⅢ酶切片段亞克隆至pUC19中。
用HindⅢ酶切pKYLX-71-35S，電泳回收4.9kb片段，與經(jīng)同樣酶切的pUC19連接重組。連接物轉化E.coli JM101以氨卞青霉素和卡那霉素篩選，挑出一系列克隆子，進一步提取克隆子質粒用一系列內切酶酶切鑒定，篩選得到重組質粒pUCMT1’，它分別可被SacⅠ和XbaⅠ酶切成一個片段，被HindⅢ酶切成兩個片段。并且通過分子大小估算，正好是4.9kb和2.7kb之和7.6kb，證明此質粒為預期設計的重組質粒pUCMT1’，含有pKYLX-71-35S的Kmr、MCS和rbcS polyA諸元件。
根據(jù)胸腺素α1基因片段兩端的序列設計一對PCR引物T1和T2T1(5′端引物)5’-GGGCATGCAAGGATCCGACGCAGCTSphⅠ BamHⅠGTTGACACCAGCTCCGAAATCACCACCAAAGACTTAAAGG-3’T2(3′端引物)5’-GGGTCGACTAGTTTTCTGCTTCTTCASalⅠ SpeⅠACAACTTCTTTTTTTTCCTTTAAGTCTTTGGTGGTGATT-3’以常規(guī)PCR擴增法進行擴增后得110bp的Tα1 DNA片段；運用pUC18多克隆位點兩端的通用引物U1和U2U1(5′端引物)5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’U2(3′端引物)5’-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3，以含有人工合成的泛素基因(UB)克隆至pUC18質粒的SphⅠ/BamHⅠ位點之間所構建的質粒pUCUB為模板，按常規(guī)PCR方法擴增出含UB基因的328bp的DNA片段；純化328bp的UBDNA片段和110bp的Tα1 DNA片段，用BamHⅠ同時酶切，然后用T4DNA連接酶連接，以連接產(chǎn)物為模板，以U1和T2’為引物進行特異性擴增，得380bp的UBTα1 DNA片段。
U1(5′端引物)5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’T2’(3′端引物)5’-GGGTCGACTAGTTTTCTGCTTCTTC-3’SalⅠ SpeⅠ如
圖1設計，將groESL啟動區(qū)的PCR擴增片段與UBTa1 PCR片段連接，再通過PCR法擴增它們的連接片段。
將UBTa1與groESL啟動區(qū)的經(jīng)回收后的PCR產(chǎn)物同時用SphⅠ做單酶切兩小時，于2％瓊脂糖凝膠上電泳，回收相應片段后14℃連接過夜。然后以P1、T2’為引物按常規(guī)PCR技術進行擴增ESL-UBTα1(570bp)在0.5ml無菌離心管中依次加入ddH2O 34μl；10×Taq酶緩沖液5μl；MgCl2(25mmol/L)3μl；4×dNTP(2.5mmol/L)4μ1；P1引物1μl；T2’引物1μl；模板(ESL-UB-Tα1連接物)1μl；Taq酶1μl；總體積50μl；最后覆蓋石蠟油30μl，防止蒸發(fā)。
PCR反應參數(shù)首先94℃預變性8min；接著94℃變性45sec；55℃復性45sec；72℃延伸45sec；35個循環(huán)；最后72℃再延伸5min。
反應結束后取5μl進行2％瓊脂糖凝膠電泳鑒定，在電泳圖譜上出現(xiàn)570bp大小的DNA亮帶，表明啟動區(qū)已經(jīng)與目的基因連接成功，獲得ESL-UBTa1片段。再將此片段插入到質粒pUCMT1’的SacⅠ-XbaⅠ位點之間，連接物轉化受體菌E.coli JM101，在具有Ap與Km的培養(yǎng)基上篩選出雙抗的克隆子。由于SpeⅠ和XbaⅠ為同尾酶，用這兩種酶酶切后連接的片段上其識別序列均會消失，因此若用XbaⅠ酶切轉化子質粒，可將克隆了外源基因的重組質粒與自身環(huán)化的載體區(qū)分開，重組質粒不能被XbaⅠ酶切，而自身環(huán)化的載體可被XbaⅠ切成線型。此外，還可用HindⅢ單酶切和以E1、T2’為引物進行PCR分析進行鑒定?？梢钥闯隹寺∽咏?jīng)HindⅢ酶切后與載體用HindⅢ酶切后不同，而且兩個片段大小符合預期設計，且克隆子用XbaⅠ酶切不能切動，為確證其是重組子pEUTMT1，在以E1、T2’為引物做PCR試圖擴增出ESL-UBTα1(570bp)片段。PCR產(chǎn)物經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳檢測，在電泳圖譜該大小位置上出現(xiàn)一條特異性亮帶，與預期相符，而以載體為模板擴增ESL-UBTα1未見有該特異性亮帶。因此就獲得了包含有熱休克基因groESL的強啟動區(qū)、目的基因UBTa1，終止區(qū)以及Km標記基因的完整表達載體質粒pEUTMT1。實施例2、藍藻轉基因表達胸腺素α1
1、藍藻基因整合平臺表達系統(tǒng)的構建藍藻Synechococcus sp.PCC7942的isiAB操縱子已定序，被確定為基因整合平臺系統(tǒng)的整合靶位。選用其中1.5kb作為整合靶位同源DNA片段。
根據(jù)isiAB操縱子中1.5kb DNA片段兩端的序列設計一對PCR引物I1，I2I1 5′端引物5′-GGAAGCTTCCCAGAAGTCACTTACGACTGG-3′HindⅢI2 3′端引物5′-CTTCTAGAATGCCCATAGC-3′XbaⅠPCR擴增isiAB 1.5kb的區(qū)段(1)除了引物改為I1，I2外，其余的PCR反應組分同實施例1(2)PCR反應參數(shù)94℃預變性5min；接著94℃變性1min；55℃復性1min；72℃延伸3min；35個循環(huán)；最后72℃再延伸5min。
(3)反應結束后，取5ul進行1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定，在電泳圖譜上出現(xiàn)唯一的1．5kb片段。表明此DNA片段是預期擴增的isiAB部分片段。
回收isiAB操縱子1.5kb的PCR擴增片段。根據(jù)預先引物設計，擴增片段兩端分別具HindⅢ和XbaⅠ酶切位點，而pUC19的MCS區(qū)也具這兩種內切酶的單一切點。按圖2設計，用HindⅢ和XbaⅠ雙酶切pUC19和擴增片段，用T4 DNA連接酶連接。連接物轉化受體菌E.coliJM101，用X-gal篩選，獲得幾十個白色克隆子。其中任選若干克隆子檢測質粒，并根據(jù)isiAB操縱子1.5kb片段中具特有的StuⅠ識別序列，用StuⅠ進行酶切分析，獲得能被StuⅠ酶單切的質粒，結果顯示，被檢測的克隆子中，所含質粒能被StuⅠ酶切，并且其分子大小為4.2kb，正好是pUC19和isiAB1.5kb片段之和，表明該質粒是預期設計的質粒pISIAB，該質粒含有整合靶位的同源片段isiAB基因片段。
利用基因整合平臺系統(tǒng)表達外源基因，需將完整的表達系統(tǒng)插入到含整合靶位同源DNA片段的質粒中。按圖2設計，用HindⅢ酶切回收表達載體pEUTMT1’的4.21kb的片段，其中包含了ESL啟動區(qū)、目的基因UBTα1、rbcS終止區(qū)和Km標記基因在內的整套表達系統(tǒng)，再插入到質粒pISIAB的HindⅢ酶切位點當中，連接物轉化受體菌E.coli JM101，在具有Ap與Km的培養(yǎng)基上篩選出雙抗的克隆子。提取質粒進一步用內切酶酶切鑒定，最終得到能有效表達目的基因的供體質粒pEUTISI，該質粒大小為8.37kb。
2、藍藻穿梭質粒表達系統(tǒng)的構建藍藻穿梭表達載體除了含有藍藻質粒和大腸桿菌源質粒的復制起始位點外，還包括抗性選擇標記、啟動區(qū)、供目的基因插入的多克隆位點(Multiple Cloning Sites，MCS)以及相應的終止區(qū)等表達元件。
從織線藻Plectonema boryanum中提取出的內源小質粒pPBS1，其序列被測定并已收入于DNA數(shù)據(jù)庫，編號為Genbank Accession No.AF176225，將質粒pPBS1克隆進質粒pBR322的ClaⅠ位點上，構建成穿梭質粒載體pPRS-1。
按圖3設計，首先，用HindⅢ酶切下表達載體pEUTMT1的4.21kb的完整表達元件的DNA片段，再通過電泳分離回收，并插入到穿梭質粒載體pPRS-1的HindⅢ位點上，經(jīng)轉化篩選及酶切分析鑒定，最后得到10.08kb大小的藍藻穿梭表達質粒pPREUT。
3、重組質粒分別轉化Synechococcus sp.PCC7942
在最適條件下培養(yǎng)藍藻Synechococcus sp.PCC 7942至OD730=0.25～0.35。離心收集藻細胞，用10ml 10mmol/L NaCl洗一次。離心并濃縮藻細胞于原1/10體積的新鮮BG-11培養(yǎng)基中。將構建好的重組質粒分別轉化藍藻Synechococcus sp.PCC7942，混勻。避光孵育過夜，供隨后篩選轉化子。
將孵育后的藍藻與DNA混合液涂布于覆蓋在BG-11固體培養(yǎng)基上的Millipore濾膜(Φ9cm，孔徑0.45μm)上，正常生長條件下培養(yǎng)20hr。轉移濾膜至含卡那霉素15μg/ml的BG-11固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)7-10天后轉化單藻落出現(xiàn)，挑取生長好的藻落移入2ml BG-11液體培養(yǎng)基中(含10～15μg/ml卡那霉素)，經(jīng)常搖動，培養(yǎng)7天。挑生長最好的藻株進行逐級擴大培養(yǎng)(加Km至15μg/ml)。實施例3、轉化藻株的Southern雜交鑒定為了進一步證明外源基因已轉化入藍藻細胞中，提取轉化藻株總DNA進行Southern雜交鑒定。以外源基因片段為探針，結果發(fā)現(xiàn)穿梭質粒組的轉化子的雜交信號存在于藍藻質粒中，表明外源基因是以質粒的形式存在于藍藻細胞中的；而對另一組轉化子，即整合平臺系統(tǒng)的轉化組而言，以isiAB基因區(qū)的1.5kb PCR片段為探針模板制備探針，雜交結果出現(xiàn)了比原對照雜交帶更大的條帶，證明供體質粒已通過同源序列交換定位整合到轉化藻株的染色體整合靶位isiAB的DNA片段上。實施例4、轉化藻株的SDS-PAGE檢測和Western blot雜交鑒定重組質粒雖已轉化入受體藍藻細胞中，但目的基因能否表達或能否高效表達，尚不能確定，必須通過其蛋白質SDS-PAGE凝膠電泳和Wesstern印跡法對轉化藻株進行表達產(chǎn)物的檢測鑒定。
由于groESL啟動子是熱休克啟動子，我們對轉化藻株進行40℃ 30min熱誘導，然后提取其水溶性蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳，結果在11KD的位置上轉化藻株出現(xiàn)了一條特異帶，而野生藻株不見此帶。為了驗證這條帶就是目的蛋白，我們進行了Western Blotting檢測。結果轉化藻株均出現(xiàn)了特異性雜交帶，而野生藻株不出現(xiàn)此雜交帶，說明目的蛋白UBTα1在藍藻中得到了表達。為了初步確定表達量，我們應用凝膠掃描成像系統(tǒng)對蛋白電泳圖譜進行分析，可知轉化藻的藻株中UT的表達量分別占其水溶性蛋白總量的17.6％和10％。因此可以認為胸腺素α1在藍藻中已得到高效表達。
權利要求
1．熱休克誘導外源基因高效表達的藍藻轉基因表達系統(tǒng)，其特征在于根據(jù)藍藻Synechococcus sp.PCC7942的groESL操縱子中ATG上游240bp片段兩端的序列設計一對引物P1、P2P1 5′端引物5′-TCGCGAGCTCGACAACTGTC-3′SacⅠP2 3′端引物5′-CCGCATGCTTTTGAGTAAACGTCGTCACGG-3′SphⅠP2的5′端設計了一個SphⅠ酶切位點，其切點為GCATG↓C；以藍藻Synechococcus sp.PCC7942基因組DNA為模板，以p1和p2引物進行特異性PCR擴增得含groESL啟動區(qū)的PCR擴增片段；用HindⅢ酶切質粒pKYLX-71-35S，電泳回收4.9kb片段，與經(jīng)同樣酶切的pUC19連接重組，連接物轉化E.coli JM101，以氨卞青霉素和卡那霉素篩選得重組質粒pUCMT1’；根據(jù)胸腺素α1基因片段兩端的序列設計PCR引物T1、T2和T2’T1(5′端引物)5’-GGGCATGCAAGGATCCGACGCAGCTSphⅠ BamHⅠGTTGACACCAGCTCCGAAATCACCACCAAAGACTTAAAGG-3’T2(3′端引物)5’-GGGTCGACTAGTTTTCTGCTTCTTCASalⅠ SpeⅠACAACTTCTTTTTTTTCCTTTAAGTCTTTGGTGGTGATT-3’T2’(3′端引物)5’-GGGTCGACTAGTTTTCTGCTTCTTC-3’SalⅠ SpeⅠ以常規(guī)PCR擴增法進行擴增后得110bp的Tα1 DNA片段；運用pUC18多克隆位點兩端的通用引物U1和U2U1(5′端引物)5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’U2(3′端引物)5’-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3’以質粒pUCUB為模板，按常規(guī)PCR方法擴增出含UB基因的328bp的DNA片段；純化UBDNA片段和Tα1 DNA片段，用BamHⅠ同時酶切，然后用T4DNA連接酶連接，以連接產(chǎn)物為模板，以U1和T2’為引物進行特異性擴增，得380bp的UBTα1 DNA片段；用SphI同時單酶切groESL啟動區(qū)的PCR擴增片段和UBTα1 DNA片段，連接后以連接物為模板，P1、T2，為引物按常規(guī)PCR法擴增后得ESL-UBTα1片段，將ESL-UBTα1片段插入到質粒pUCMT1’的SacⅠ-XbaⅠ位點之間，連接物轉化受體菌E．coli JM101，在具有Ap與Km的培養(yǎng)基上篩選出雙抗的克隆子，獲得包含熱休克基因groESL的強啟動區(qū)、目的基因UBTα1，終止區(qū)以及Km標記基因的藍藻的完整表達載體質粒pEUTMT1。
2．如權利要求1所述的熱休克誘導外源基因高效表達的藍藻轉基因表達系統(tǒng)，其特征在于所說的質粒pUCUB為以人工合成的泛素基因UB克隆至pUC18質粒的SphⅠ/BamHⅠ位點之間所構建的質粒。
3．如權利要求1所述的熱休克誘導外源基因高效表達的藍藻基因表達系統(tǒng)用于表達胸腺素α1的方法，其特征在于以藍藻基因整合平臺表達系統(tǒng)或藍藻穿梭質粒表達系統(tǒng)進行表達胸腺素α1，其方法如下(1)藍藻基因整合平臺表達系統(tǒng)根據(jù)藍藻Synechococcus sp.PCC7942的isiAB操縱子中1.5kb DNA片段兩端的序列設計一對PCR引物I1、I2I1 5′端引物5′-GGAAGCTTCCCAGAAGTCACTTACGACTGG-3′HindⅢI2 3′端引物5′-CTTCTAGAATGCCCATAGC-3′XbaⅠ以Synechococcus sp.PCC7942的染色體DNA為模板，以Ⅰ1和Ⅰ2為引物按常規(guī)的PCR技術進行擴增得1.5kb的isiAB部分片段；回收isiAB操縱子1.5kb的PCR擴增片段，用HindⅢ和XbaⅠ雙酶切質粒pUC19和擴增片段，用T4 DNA連接酶連接，連接物轉化受體菌E.coliJM101，用X-gal篩選出白色克隆子，得含有整合靶位的同源片段isiAB基因片段質粒pISIAB；用HindⅢ酶切回收表達載體pEUTMT1的包含了groESL啟動區(qū)、目的基因UBTα1、rbcS終止區(qū)和Km標記基因在內的完整表達元件的4.21kb的DNA片段，將其插入到質粒pISIAB的HindⅢ酶切位點當中，連接物轉化受體菌E.coli JM101，在具有Ap與Km的培養(yǎng)基上篩選出雙抗的克隆子，得供體質粒pEUTISI，該質粒為8.37kb；(2)藍藻穿梭質粒表達系統(tǒng)從織線藻Plectonema boryanum中提取出的內源小質粒pPBS1，其序列被測定并已收入于DNA數(shù)據(jù)庫，編號為Genbank Accession No.AF176225，將質粒pPBS1克隆進質粒pBR322的ClaⅠ位點上，構建成穿梭質粒載體pPRS-1；用HindⅢ酶切下含有熱休克基因groESL的強啟動區(qū)、目的基因UBTa1、終止區(qū)以及Km標記基因的表達載體pEUTMT1的4．21kb的完整表達元件的DNA片段，再通過電泳分離回收，并插入到穿梭質粒載體pPRS-1的HindⅢ位點上，連接物轉化受體菌E.coli JM101，在具有Km的培養(yǎng)基上篩選出克隆子，得到10.08kb的藍藻穿梭表達質粒pPREUT；(3)重組質粒分別轉化Synechococcus sp.PCC7942將構建好的供體質粒pEUTISI和藍藻穿梭表達質粒pPREUT分別轉化藍藻Synechococcussp.PCC7942，轉化后，將藍藻細胞與DNA混合液涂布于Millipore濾膜上，先在不含Km的BG-11固體培養(yǎng)基上恢復培養(yǎng)20hr，然后轉移濾膜至含Km 15μg/ml的BG-11固體培養(yǎng)基上進行篩選培養(yǎng)，一周后，轉化組的濾膜上出現(xiàn)抗Km的綠色單藻落，即為轉化藻株。
全文摘要
涉及一種基因工程,構建了包含藍藻熱休克基因groESL強啟動區(qū)、目的基因UBTα1、rbcS終止區(qū)和Km標記基因的完整的可高效表達的藍藻基因表達系統(tǒng),并運用基因整合平臺系統(tǒng)和穿梭質粒系統(tǒng)進行轉基因表達胸腺素α1,由于利用熱休克基因groESL的強啟動子,易調控,經(jīng)熱誘導后能幾十上百倍地加快轉錄,同時利用泛素融合技術,使目的基因Tα1得到高效表達,本發(fā)明工藝簡單,可舉一反三,具有很大的開發(fā)前景,為產(chǎn)業(yè)化開發(fā)轉基因藍藻開辟一條新途徑。
文檔編號C12N1/12GK1285407SQ00124699
公開日2001年2月28日 申請日期2000年9月29日 優(yōu)先權日2000年9月29日
發(fā)明者章軍, 徐虹, 秦燕, 樓士林, 黃瀾, 李 根 申請人:廈門大學