專利名稱：麻疹病毒l4株融合蛋白基因的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明總的涉及基因工程技術(shù)，特別是涉及麻疹病毒的重組DNA基因工程疫苗。
麻疹是嚴重危害人類健康的傳染病，已在世界范圍內(nèi)納入兒童計劃免疫。三十多年來，麻疹減毒活疫苗的廣泛應用雖然已成功地控制了麻疹大規(guī)模流行，但始終未能徹底消滅麻疹，麻疹局部暴發(fā)流行的情況常有發(fā)生，在一些國家和地區(qū)麻疹仍是造成嬰兒死亡的重要原因。據(jù)世界衛(wèi)生組織估計，全世界每年因麻疹死亡的人數(shù)約100-150萬。造成這一情況的重要原因之一是現(xiàn)有的麻疹減毒活疫苗存在著免疫不全面，免疫持久性不夠，加強免疫效果不理想以及不能早期(出生后6個月內(nèi))使用等問題，使用基因工程麻疹疫苗是解決上述問題的重要途徑。近年來麻疹基因工程疫苗，特別是在麻疹病毒保護性抗原基因克隆及表達的研究中已獲得多方面的進展。
1986年Alkhatib等[1]首先公開了麻疹病毒Edmonston株血凝素(HA)基因的克隆與DNA序列。序列分析表明，該基因由1854個堿基對(bp)組成，編碼617個氨基酸(圖1)。同年Gerald等[2]從麻疹病毒Halle’株克隆了HA基因，并與Edmonston株的DNA序列進行了比較，結(jié)果顯示兩毒株有13個bp不同，并導致8個氨基酸變異。1986年Richardson等[3]公開了Edmonston株融合蛋白(F)基因的克隆和DNA序列，序列分析結(jié)果表明最長一個開放讀碼框架的F基因由1662個bp組成，編碼553個氨基酸(圖2)。1987年Bucklan等[4]克隆了Halle’株的F基因，并與Edmonston株的序列進行了比較，發(fā)現(xiàn)二者有4個bp不同，但未導致氨基酸的變異。
在基因工程麻疹疫苗研究中主要使用Halle’株或Edmonston株的HA和F進行。至今尚未見對麻疹病毒L4株HA和F基因進行克隆和序列分析的報導。
1988年，Drillien等[6]在痘苗病毒中分別表達了麻疹病毒HA和F基因。其特點是HA和F基因均來自Halle′毒株，載體病毒為痘苗病毒哥本哈根株，HA和F基因均使用痘苗病毒7.5K蛋白啟動子驅(qū)動，并分別在不同重組毒株的TK基因區(qū)單獨表達。表達HA或表達F的重組痘苗病毒免疫BalB/c小鼠后均能產(chǎn)生對致死劑量的亞急性硬化性腦脊髓膜炎麻疹毒株的腦內(nèi)攻擊保護。重組痘苗表達的HA和F的理化性質(zhì)及在感染細胞內(nèi)的分布與麻疹病毒細胞感染后的相似。
1992年，wild等[5]構(gòu)建了在同一區(qū)能同時表達麻疹病毒HA和F的重組痘苗病毒。其特點是HA和F基因均來自Halle′株，兩基因頭對頭相連，其上游均分別使用7.5K啟動子驅(qū)動，表達區(qū)為痘苗病毒TK區(qū)(圖3)。病毒重組使用了痘苗病毒哥本哈根株的溫度敏感突變株VVts7，先在雞胚細胞中重組，然后在Ltk細胞中根據(jù)TK性狀選擇重組痘苗病毒。與單獨表達HA或F的重組病毒的比較資料表明，每一種方式表達HA的分子量均約為80KD，F(xiàn)的分子量則有三種，60KD，40KD和20KD，分別與未裂解的F0，裂解后的F1和F2相對應。HA和F同時表達的重組痘苗病毒產(chǎn)生更好的免疫效果。
1991年，Wild等[7]已先期報導了使用上述結(jié)構(gòu)同時表達HA和F可以在感染細胞上產(chǎn)生與麻疹病毒感染后引起的類似的融合病灶。
1990年，Spehner等[8]的結(jié)果表明，在TK區(qū)使用7.5K啟動子在同一個方向順序表達Lac-Z和F基因造成F基因在病毒傳代中丟失現(xiàn)象，但將Lac-Z和F頭對頭(與上述Wild等的結(jié)構(gòu)相似)表達時(見圖4)，F(xiàn)的表達量下降約50％。目前文獻報導的同時在痘苗病毒中同一區(qū)域表達HA和F基因的結(jié)構(gòu)都存在干擾外源基因表達的不利影響。
1992年，Taylor等[9]報導了在金絲雀痘病毒不同區(qū)，同時表達麻疹病毒HA和F的重組病毒。其特點是HA和F基因均來自麻疹病毒Edmonston株，兩基因均分別受痘苗病毒H6啟動子控制，并同時在金絲雀痘病毒基因組pVUII的3.4K片段和0.9K片段兩個區(qū)獲得表達。病毒重組在雞胚細胞中進行，首先將F基因送到金絲雀痘病毒基因組pVUII的3.4K片段，獲得表達F基因的重組vCP40，再用vCP40與HA基因重組，將HA送到該病毒pVUII的0.9K片段，獲得HA和F同時表達的重組病毒vCP57，在使用該病毒免疫時，獲得了與表達HA和F的重組痘苗病毒免疫后產(chǎn)生的相同的免疫保護效果。該病毒已開始進行小劑量人體免疫觀察。
如前所述，近年來麻疹基因工程疫苗的研究已取得很大進展，特別是使用痘苗病毒為載體進行的基因工程麻疹疫苗的研究展現(xiàn)了較好的前景。但是現(xiàn)有麻疹病毒HA和F基因克隆的免疫效果不夠好，同時表達HA和F基因的結(jié)構(gòu)不合理，重組病毒的篩選與純化方法較復雜，痘苗病毒株的選用亦尚待確定。
為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)中的不足之處，本發(fā)明的目的1、選擇麻疹病毒L4株為出發(fā)株，以獲得更好免疫效果的麻疹病毒HA和F基因。
2、組建新的表達結(jié)構(gòu)，以獲得麻疹病毒HA和F基因在重組痘苗病毒同一區(qū)域中高效表達。3、建立一套簡單有效的獲得同時表達麻疹病毒HA和F基因的重組痘苗病毒人用疫苗株的重組、篩選、純化和毒種制備方法。4、使用痘苗病毒天壇株為親本株，構(gòu)建同時表達麻疹病毒HA和F基因并能夠用于人體免疫觀察的安全、有效的重組痘苗病毒人用疫苗株。
本發(fā)明的目的能通過以下方法來實現(xiàn)從麻疹病毒L4株中克隆具有良好生物學性狀及免疫效果的HA和F基因，構(gòu)建能夠?qū)A和F基因轉(zhuǎn)入重組痘苗病毒同一個區(qū)域尾對尾高效表達的重組質(zhì)粒，利用融合性狀建立一套簡單有效的適用于麻疹病毒HA和F基因同時在重組痘苗中表達的病毒重組、篩選、純化及制備方法，并通過該方法將重組質(zhì)粒與痘苗病毒人用疫苗株-天壇株重組，獲得能夠高效、穩(wěn)定表達麻疹病毒HA和F基因的安全、有效的重組痘苗病毒疫苗毒株。
本發(fā)明的優(yōu)點在于獲得的表達麻疹病毒HA和F的重組痘苗病毒在外源基因、表達結(jié)構(gòu)、重組病毒的篩選與純化方法及選用的痘苗病毒毒株四個主要方面比現(xiàn)有技術(shù)有明顯的改進，具有刨造性和實用價值。它簡化了重組病毒篩選和純化的方法，提高了獲得重組病毒的機率，所獲得的表達HA和F基因的重組痘苗病毒天壇株表達水平高，免疫效果好，毒力低，遺傳性狀穩(wěn)定，是可用于人體免疫觀察的基因工程麻疹疫苗毒株。
下面結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一步詳述(一)麻疹病毒L4株血凝素(HA)和融合蛋白(F)基因克隆的DNA序列特點1、麻疹病毒L4株。該毒株是在中國廣泛應用的麻疹減毒活疫苗株“長-47”的親本株，在蘇聯(lián)列寧格勒分離獲得，并于五十年代引入中國。該毒株先用人胚腎細胞傳26代后，再在人羊膜細胞上傳代，是部分減毒毒株，比Edmonston等毒株具有更好的血凝和血溶活性(表一)。本發(fā)明使用的毒種為人羊膜72代，由中國藥品和生物制品檢定所提供。
表一、不同麻疹毒株血溶和血凝活性比較毒株 血溶活性血凝滴度(以O.D540m表示)L4 0.529 1∶128Edmonston0.143 1∶15CAM -0.025 1∶1長47 -0.017 1∶1滬191 0.003 1∶1細胞對照 0.000 -2、麻疹病毒L4株HA和F基因的克隆和DNA序列特點用麻疹病毒L4株克隆到HA和F基因(詳細程序見實施例1)，進行了基因DNA序列測定，并與Edmonston株的相應序列進行了比較(見圖1、2和表二)。HA基因的DNA序列全長1854個堿基對(bp)，編碼617個氨基酸，其中第1080、1474、1655及1799位的四個bp與現(xiàn)有技術(shù)的Edmonston株的HA基因的相應的四個bp不同，并導致三個氨基酸變異，分別為第492位的谷氨酸(Glu)變異為賴氨酸(Lys)；第552位的苯丙氨酸(Phe)變異為絲氨酸(Ser)；第600位的谷氨酸(Glu)變異為纈氨酸(Val)；HA基因在痘苗病毒中表達的產(chǎn)物具有良好的血凝活性，免疫后能產(chǎn)生較高的中和抗體及血凝抑制抗體。F基因的DNA序列全長1662個bp，，編碼553個氨基酸，其中第194、255、734、966、1098、1311、1575位的七個bp與Edmonston株相應的bp不同，并導致二個氨基酸變異，分別為第65位的異亮氨酸(Ile)變異為蘇氨酸(Thr)，第245位的異亮氨酸(Ile)變異為蘇氨酸(Thr)。該基因在痘苗病毒中表達后，表達產(chǎn)物被正常切割成F1和F2蛋白亞單位，免疫家兔后產(chǎn)生高滴度的麻疹抗體該抗體具有較強的中和作用和血溶抑制作用，表明克隆的L4株基因能在痘苗中有效表達，并具有較好的免疫原性。
表二 二株麻疹病毒HA及F蛋白基因的核苷酸和氨基酸變異序列比較病毒株基因及大小核苷酸變 氨基酸變(bp) 異位置 異位置 Edmonston L4(code-aa) (code-aa)HA(1854)1080360 GAT-Asp GAC-Asp*1474492 GAA-Glu AAA-Lys*1655552 TTT-Phe TCT-Ser*1799600 GAG-Glu GTG-ValF(1662)*194 65ATA-Tle ACA-Thr255 85ACT-Thr ACA-Thr*734 245 ATC-Ile ACA-Thr966 352 GTC-Val GTT-Val1098366 ACT-Thr ACC-Thr1311437 AGC-Ser AGT-Ser1575525 AAT-Asn AAC-Asn(二)能在重組痘苗病毒同一區(qū)域同時表達麻疹病毒L4株HA和F基因的重組質(zhì)粒pJML11HA75F的構(gòu)建及特點(該質(zhì)粒的構(gòu)建見實施例2)，該重組質(zhì)粒的主要特點是①麻疹病毒L4株HA和F基因分別由串聯(lián)在一起但啟動活性相反的痘苗病毒11KD蛋白基因啟動子(P11)和7.5KD蛋白基因啟動子(P7.5)控制，從串聯(lián)啟動子兩端分別向兩側(cè)不同方向表達，因此兩基因在RNA轉(zhuǎn)錄水平上無干擾現(xiàn)象，這與文獻5，7采用的非串聯(lián)啟動子結(jié)構(gòu)明顯不同，文獻結(jié)構(gòu)會引起RNA轉(zhuǎn)錄水平的干擾，影響HA和F基因的表達率，降低約50％。②在HA和F基因兩側(cè)分別連接了痘苗病毒J片段的TK基因左側(cè)及右側(cè)同源重組序列，以便通過同源重組將其送到TK基因區(qū)進行表達。同源重組序列可以根據(jù)需要更換，因而能將HA和F基因送到其他區(qū)域進行表達。pMMLHA75F就是在表達結(jié)構(gòu)HA和F基因兩側(cè)分別含有M片段同源重組序列的質(zhì)粒，該質(zhì)粒除同源重組序列不同外，HA和F的表達結(jié)構(gòu)與pJML11HA75F的完全相同，可將HA和F基因送到痘苗病毒天壇株M片段進行表達。
(三)同時表達麻疹病毒HA和F基因的重組痘苗病毒的重組、篩選、純化及制備病毒毒種的方法。
目前重組痘苗病毒人用疫苗株的重組和篩選大多在疫苗生產(chǎn)許可的細胞中進行重組，然后使用雜交與表達產(chǎn)物檢測相結(jié)合的方法進行篩選和純化，程序比較復雜，而且效率不高。
本發(fā)明的研究結(jié)果表明麻疹病毒HA和F基因在重組痘苗病毒中同時表達后在一些細胞中產(chǎn)生明顯的融合病灶，但在產(chǎn)生融合病灶的細胞中重組病毒HA和F表達不穩(wěn)定，而在不產(chǎn)生融合性狀的細胞中HA和F表達比較穩(wěn)定的特點。本發(fā)明建立了適合于同時表達麻疹病毒HA和F基因的重組痘苗病毒的重組、篩選、純化及毒種制備的方法。(具體程序見實施例3)。
本方法的基本特點是在可引起融合病灶的細胞中進行病毒重組，通過產(chǎn)生明顯的融合病灶判定并篩選重組病毒(性狀不穩(wěn)定)，然后在不產(chǎn)生明顯融合病灶的細胞中純化并增殖重組病毒(性狀穩(wěn)定)，其純度再使用產(chǎn)生融合性狀的細胞檢測。
(四)使用痘苗病毒天壇株及其衍生毒株構(gòu)建的同時表達麻疹病毒L4株HA和F基因的重組痘苗病毒。
1、重組使用的痘苗病毒毒株和細胞。
①痘苗病毒天壇株該毒株是曾在中國廣泛用于種痘預防天花的疫苗株，由中國藥品和生物制品檢定所提供，批號7601。
②痘苗病毒天壇株的衍生體RVJ123毒株RVJ123毒株是痘苗病毒天壇株在其基因組J片段TK基因區(qū)插入了adr亞型乙肝表面抗原基因(S)構(gòu)建而成，該毒株除在TK區(qū)含有乙肝S基因外，其余基因組結(jié)構(gòu)與天壇株完全一致。RVJ123在鼠及兔皮內(nèi)的毒力均較天壇株降低約1個對數(shù)左右。進行了小劑量人體免疫觀察，人體毒力與其親本株(天壇株)差別不顯著。
③痘苗病毒天壇株的衍生體RVJ123KIL2毒株RVJ123KIL2毒株是天壇株的衍生毒株RVJ123在其基因組K片段右側(cè)第一個BglII位點插入人白細胞介素2(IL-2)基因構(gòu)建而成(圖6)，該毒株除基因組含IL-2基因外，基因組其余結(jié)構(gòu)均與RVJ123完全一致。該毒株除鼠腦內(nèi)毒力與RVJ123相近外，兔皮內(nèi)及裸鼠內(nèi)毒力均較天壇株及RVJ123毒株明顯減弱。進行了小劑量人體免疫觀察，人體毒力較RVJ123明顯減弱，(RVJ123人體毒力與天壇株相近)。
④重組用細胞人胚肺細胞(2BS)，綠猴腎細胞(Vero)和原代雞胚細胞(CEF)，均為痘苗生產(chǎn)許可細胞，購自北京生物制品研究所，其中2BS和Vero細胞在感染表達麻疹病毒HLA和F基因的重組病毒時產(chǎn)生融合病灶，而CEF不產(chǎn)生融合病灶。
2、同時表達麻疹病毒L4株HA和F基因的重組痘苗病毒的構(gòu)建以RVJ123KIL2毒株作為重組用病毒，pJML11HA75F為重組用質(zhì)粒，通過本發(fā)明的方法進行病毒重組、篩選、純化和毒種制備，獲得同時表達麻疹L4株HA和F基因的重組痘苗病毒人用疫苗毒株RVJMLHAFKIL2(該毒株含有IL-2基因)；使用痘苗病毒天壇株為重組用病毒，與pJML11HA75F或pMML11HA75F進行重組分別獲得了痘苗病毒天壇株TK區(qū)和M片段同時表達麻疹病毒L4株HA和F基因的重組痘苗病毒實驗毒株RVJMLHAF和RVMMLHAF(兩毒株均不含IL-2基因)。
3、同時表達麻疹病毒L4株HA和F基因的重組痘苗病毒人用疫苗株RVJMLHAFKIL2的主要特征及免疫效果①HA和F的表達，產(chǎn)物的生物學活性及表達穩(wěn)定性經(jīng)免疫酶斑檢測重組病毒RVJMHAFKIL2的HA表達滴度為1∶16-1∶64，F(xiàn)滴度為1∶16，Western blot顯示HA分子量約為90KD和80KD兩種，分別為糖化和非糖化形式，F(xiàn)分子量則有60KD，44KD和23KD三種，分別為未裂解的前體F0，裂解后的F1和F2的分子量相對應；重組病毒RVJMLHAFKIL2同時具有良好的血凝活性(1∶8)和血溶活性(OD540nm＝0.370)，明顯高于現(xiàn)有麻疹減毒活苗(表三)，該重組病毒表表三.麻疹重組痘苗病毒HA及F的生物學活性檢測病毒 血凝效價 血溶活性RVJHA 1/8 NDRVJMLHAFKIL21/80.370vvTK+- 0.00HA標準品1/32ND注RVJHA病毒是單表達麻疹病毒HA的重組痘苗病毒達HA和F的上述特點經(jīng)傳15代后未見明顯變化。
②IL-2表達產(chǎn)物活性及表達穩(wěn)定性Western blot檢定表明重組病毒RVJMLHAFKIL2表達的IL-2有糖化和非糖化兩種，分子量分別為17KD和14kD，與天然IL-2類似，毒種連續(xù)傳15代后，經(jīng)Western blot檢查，IL2表達水平穩(wěn)定。
③重組病毒的毒力(1)兔皮內(nèi)毒力RVJMLHAFKIL2與RVJ123(結(jié)構(gòu)類似，但無IL-2)，相比，免皮內(nèi)紅腫和皮損反應減弱，反應時間縮短2-4天，毒力明顯降低(表四)。
表四.重組痘苗兔皮毒力比較病毒 皮膚紅腫范圍 發(fā)痘高峰期 紅腫消退RVJ123破損，潰爛較大6-7天 慢RVJMLHAFKIL2不破損 較小 4天 快(2)小鼠腦內(nèi)毒力RVJMLHAFKIL2與RVJ123相比，毒力略有降低(表五)。表五. 重組痘苗病毒接種Balb/c裸鼠尾根部3周后不同組織中病毒滴度病毒 pfu/皮 pfu/尾 pfu/肝 pfu/腎pfu/腦RVJ123 2.1×1071×1082.5×1031×1036.8×104RVJHFKIL2ND6.5×10 0 0 0
(3)裸鼠毒力裸鼠脊柱兩側(cè)及尾根部接種后，RVJMLHAFKIL2僅表現(xiàn)為局部結(jié)節(jié)，無明顯紅腫潰爛，亦不發(fā)生擴散，而RVJ123局部紅腫潰爛外，還向遠處皮膚及肝、腦、腎等臟器擴散(表六)。
表六.重組痘苗病毒接種Balb/c裸鼠尾根部3周后觀察結(jié)果病毒平均體重皮膚 皮損部位查出病毒存在的器官RVJ12318g 皺褶尾，爪，頭，背，臀 腦，肝，腎RVJHFKIL2 23g 平滑無 無(4)重組病毒的免疫效果a、小鼠刮尾免疫效果使用107pfu/ml病毒刮尾免疫C57小鼠，RVJMLHAFKIL2免疫后4周抗體陽轉(zhuǎn)?？贵w具有較高的ELISA(1∶6400)、中和(NT，1∶128)、血凝抑制(HI，1∶160)及血溶抑制(HLI，1∶60)抗體滴度(或效價)(表七)。
表七. 重組病毒RVJMLHAFKIL2免疫效果動物免疫方式 采血期 ELISANT HI HLI免前- - - -C57鼠刮尾 4周 ＞640100 160 320-6406周 6400 128 160 320-640新西蘭兔免前- - - -皮內(nèi) 4周 ＜40 - - -B號兔 6周 1600 25680-160 640C號兔 6周 1600 51280-160 640D號兔 6周 6400 2048 640-12802560
b、兔皮內(nèi)免疫效果106pfu/ml病毒兔皮內(nèi)免疫RVJMLHAFKIL2免疫6周后，血清抗體陽轉(zhuǎn)，抗體具有較高的ELISA(1∶1600)，中和(NT，1∶256-512)、血凝抑制(HI，1∶80-160)及血溶抑制(HLI，1∶640)抗體滴度(或效價)。免疫后抗體既能有效地中和L4株，也能有效地中和麻疹疫苗株滬-191，以及中國和日本新分離的麻疹流行株(表七)。
免疫結(jié)果顯示重組病毒RVJMLHAFKIL2具有良好免疫原性，其誘發(fā)機體產(chǎn)生較高滴度的HI和HLI抗體HLI與HI比值(4.0-8.0)明顯高于麻疹疫苗株人體接種后產(chǎn)生的比值(0.4-1.1)，而與人自然感染的比值(3.6-9.0)相近。
以上結(jié)果表明，麻疹重組痘苗病毒疫苗毒株RVJMLHAFKIL2免疫效果好，毒力低，遺傳性穩(wěn)定，無外源因子污染，是一株可用于人體免疫觀察的麻疹疫苗毒株。該毒株已經(jīng)衛(wèi)生部藥政局批準，開始進行小劑量人體免疫觀察。
實施例1，麻疹病毒L4株HA和F基因的克隆用麻疹病毒L4株感染Vero細胞，37℃培養(yǎng)到80-90％細胞病變后，提取胞漿RNA，對麻疹病毒mRNA進行逆轉(zhuǎn)錄及PCR擴增，克隆到HA和F基因，再進行序列測定[10]。
實施例2，能在重組痘苗病毒同一區(qū)域同時表達麻疹病毒L4株HA和F基因的重組質(zhì)粒pJML11HA75F的構(gòu)建將逆轉(zhuǎn)錄-PCR合成的麻疹L4株F基因(1662bp)用Smal酶切割，插入pJSA1175質(zhì)粒P7.5啟動子下游的Smal位點，得到重組質(zhì)粒pJSA1175LmF，將逆轉(zhuǎn)錄-PCR合成獲得的L4株HA基因克隆pJSA1175HA用Xhol酶切割，將HA基因(1854bp)插入pJSB1175質(zhì)粒P11啟動子下游的Xhol位點，得到重組質(zhì)粒pJSB11LHA75(圖5)，將pJSA1175LmF和pJSB11LHA75質(zhì)粒分別用EcoRI酶水解后，取pJSA1175LmF水解小片段及pJSB11LHA75水解大片段用T4連接酶連接，構(gòu)建成在P11啟動子下游表達HA和P7.5啟動子下游表達F的重組質(zhì)粒pJSB11LHA75LF(簡稱pJML11HA75F)。
實施例3，同時表達麻疹病毒HA和F基因的重組痘苗病毒的重組、篩選、純化及毒種制備的方法具體程序是剛剛長成單層的2BS細胞，每個細胞感染約0.1pfu的痘苗病毒，吸附1.5小時后應用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將pJML11HA75F質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細胞，37℃48小時后，原瓶凍化細胞三次，低速離心去除殘渣，上清液為重組液，重組液對數(shù)稀釋后感染2BS細胞，37℃48小時后鋪營養(yǎng)瓊脂，2小時后，挑出鏡下可見的典型的沙粒融合病毒斑(在2BS細胞中，麻疹病毒HA和F基因在痘苗病毒中同時表達可產(chǎn)生典型融合病灶)；在2BS細胞中以融合性狀為指標，連續(xù)單斑純化3代后，再在雞胚細胞中單斑純化3-5代，以獲得高純度的重組病毒；單斑重組病毒在CEF細胞上常規(guī)增殖4代，以獲得批量毒種；純化及傳代的同時取得部分毒種感染Vero細胞(可產(chǎn)生融合灶)通過鏡下觀察融合病灶與非融合病灶的比例來確定重組病毒的純度。
說明書


圖1.麻疹病毒L4株(上行)和Edmonston株(下行)血凝素(HA)基因DNA序列比較。兩基因全長均1854bp，其中有4個堿基對不同，位于第1080，1474，1655及1799位，已用長方框標出。
圖2.麻疹病毒L4株(上行)和Edmonston株(下行)融合蛋白(F)基因DNA序列比較。兩基因全長均為1662bp，其中7個堿基對不同，位于第194，255，734，966，1098，1311，1575位，已用長方框標出。
圖3.國外(Wild等[5])在痘苗病毒中表達HA和F的結(jié)構(gòu)特點，其中結(jié)構(gòu)4和結(jié)構(gòu)8含有HA和F同時表達的結(jié)構(gòu)，特點是HA和F基因頭對頭表達(HA和F基因相互干擾)。
圖4.國外(Spehner)等[8]在痘苗病毒表達HA和F的結(jié)構(gòu)特點，左下結(jié)構(gòu)(pTG2195)，為Lac-Z和F基因順序表達(F不穩(wěn)定)，右下結(jié)構(gòu)(pTG3113)為Lac-Z和F基因頭對頭表達，(F表達受一定程序抑制)。
圖5.本發(fā)明要保護的麻疹病毒L4株HA和F基因同時表達的質(zhì)粒結(jié)構(gòu)(pJSB11LHA75LF)該結(jié)構(gòu)系由EcoRI酶切原始克隆pJSB11LHA75質(zhì)粒，獲得含HA的載體，然后與EcoRI酶切原始克隆pJSA1175mF質(zhì)粒獲得的F基因重組而成。其主要特點是HA和F基因之間連接雙向串聯(lián)的痘苗病毒11k和7.5K兩個啟動子，分別由11K和7.5K串聯(lián)啟動子兩端向外驅(qū)動HA和F基因表達，HA和F基因末端分別連接有痘苗病毒J片段的TK基因左側(cè)和右側(cè)同源重組序列，可將HA和F基因送到痘苗病毒J片段TK基因處表達。
圖6.重組痘苗病毒RVJMLHAFKIL2中HA，F(xiàn)和IL2基因的位置，HA和F在J片段，IL2在K片段。
參 考 文 獻1. Alkhatib，G.and Briedis，D.J.，1986，The Predicted Primary Structure ofthe Measles Virus Hemagglutinin. Virology 150，479-490.2. Gerald.C.，Buckland.R.，Barker.R.，F(xiàn)reeman.G.，and Wild.T.F.，1986，MeaslesVirus Haemagglutinin GeneCloning，Complete Nucleotide Sequence Analysis andExpression in COS Cells.J.Gen.Virol 67.2695-2703.3. Richardson.C.，Hull.D.，Greer.P.，Hasel.K.，Berkovich.A.，Englund.G.，Bellini.W.，Rima.B.and Lazzarini.R.，1986，The Nucleotide Sequence ofthe mRNA Encoding the Fusion Protein of Measles Virus(Edmonston Strain)A Comparison of Fusion Proteins from Several Different Paramyxoviruses.Virology 155，508-523.4. Buckland.R.，Gerald.C.，Barker.R.and Wild.T.F.，1987，F(xiàn)usion Glycoproteinof Measles VirusNucleotide Sequence of the Gene and Comparison with OtherParamyxoviruses.J.Gen.Virol.68，1695-1703.5. Wild.T.F.，Bernard.A.，Spehner.D.and Drillien.R.，1992，Construction ofVaccinia Virus Recombinants Expressing Several Measles Virus Proteins andAnalysis of There Efficacy in Vaccination of Mice.Journal of GeneralVirology 73，359-367.6. Drillienm.R.，Spehner.D.，Kirn.D.，Giraudon.P.，Buckland.R.，Wild.F.，and Lecocq.J.P.，1988，Protection og Mice from Fatal Measles Encephalitisby Vaccination with Vaccinia Virus Recombinants Encoding Either theemagglutinin or the Fusion Protein.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85，1252-1256.7. Wild.T.F.，Malvoisin.E.and Buckland.R.，1991，Measles Virusboth theaemagglutinin and Fusion Glycoproteins are required for Fusion.Journal ofGeneral Virology 72，439-442.8. Spehner.D.，Drillien.R.and Lecocq.J.P.，1990.Construction of Fowlpox VirusVectors with Intergenic InsertionsExpression of the β-Galactosidase Geneand the Measles Virus Fusion Gene.Journal of Virology 64，527-533.9. Taylor.J.，Weinberg.R.，Tartaglia.J.，Richardson.C.，Alkhatib.G.，Briedis.D.，Appel.M.，Norton.E.and Paoletti.E.，1992.Nonreplicating ViralVectors as Potential VaccinesRecombinant Canarypox Virus ExpressingMeasles Virus Fusion(F)and Hemagglutinin(HA)Glycoproteins.Virology 187，321-328.10. Sambrook J eta1Molecular Cloning，A Laboratory manual，Snd ed.，ColdSpring Harbar Laboratory Press，1989
權(quán)利要求
1.一種麻疹病毒L4株的融合蛋白F基因，其特點是基因的DNA序列全長1662個堿基對，編碼553個氨基酸，其DNA序列中第194、255、734、966、1098、1311、1575位的七個堿基與文獻報道的Edmonston株融合蛋白F基因的DNA序列不同，并導致這兩種毒株的融合蛋白氨基酸序列間兩個氨基酸不同，分別為第65位的異亮氨酸Ile變異為蘇氨酸Thr，第245位的異亮氨酸Ile變異為蘇氨酸(Thr)。
2.按權(quán)利要求1所述的麻疹病毒L4株融合蛋白F基因，其特征是由該基因表達的麻疹病毒L4株融合蛋白F的血溶活性明顯比Edmonston株的高，麻疹病毒L4株融合蛋白F基因可用于基因工程診斷試劑和疫苗研究。
全文摘要
麻疹病毒L4株比Edmonston株具有更高的血溶活性,本發(fā)明從麻疹病毒L4株克隆了融合蛋白F基因,發(fā)現(xiàn)該基因的DNA序列中有七個堿基與文獻報道的Edmonston株融合蛋白F基因的DNA序列不同,并導致這兩種毒株的融合蛋白氨基酸序列間兩個氨基酸不同,該麻疹病毒L4株融合蛋白F基因在重組痘苗病毒天壇株載體中表達后具有高滴度血溶活性,免疫后產(chǎn)生高滴度血溶抑制抗體。本發(fā)明可用于麻疹病毒生物學、分子生物學和基因工程麻疹疫苗的研究與開發(fā)。
文檔編號C12Q1/68GK1332245SQ0012466
公開日2002年1月23日 申請日期2000年9月27日 優(yōu)先權(quán)日2000年9月27日
發(fā)明者阮力, 朱既明, 楊克儉, 徐水嬋, 朱誠 申請人:中國預防醫(yī)學科學院病毒學研究所