專利名稱：編碼pgi基因的新核苷酸序列的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明提供了一種來自棒狀細菌的編碼pgi基因的核苷酸序列和一種通過弱化pgi基因而提高通過戊糖磷酸循環(huán)的代謝流量的方法。
核苷酸、維生素、特別是L-氨基酸，尤其是賴氨酸和色氨酸，被用于食品工業(yè)、動物營養(yǎng)、人類醫(yī)藥和制藥工業(yè)。
已知這些物質(zhì)可以通過棒狀細菌菌株發(fā)酵而獲得，尤其是谷氨酸棒桿菌。鑒于其重要性，人們已在生產(chǎn)方法的改進上做了不斷努力，方法的改進可與有關發(fā)酵技術(shù)的措施如攪拌和氧氣供應有關，或者與營養(yǎng)成分的組成如發(fā)酵過程中糖的濃度有關，或者與產(chǎn)物的處理如離子交換層析有關，或者與微生物本身生產(chǎn)特性有關。
這些微生物本身生產(chǎn)特性的改進可以通過誘變，篩選和突變篩選的方法獲得。在此方法中，獲得對抗代謝物有抗性或調(diào)節(jié)重要的中間體營養(yǎng)缺陷的并產(chǎn)生核苷酸、維生素和氨基酸的菌株。
一些年來，核酸重組技術(shù)也已經(jīng)被用于改進這些生產(chǎn)核苷酸、維生素和L-氨基酸的棒狀桿菌菌株。
用于生產(chǎn)這些化合物的一種典型原料是葡萄糖，它常以淀粉水解物的形式應用。蔗糖也是一種常用的原料。
在細胞吸收過程中，葡萄糖被磷酸化同時伴隨磷酸烯醇丙酮酸的消耗(磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng))(Malin & Bourd，Journal of AppliedBacteriology 71，517．523(1991))，然后以葡萄糖-6-磷酸的形式供細胞利用。蔗糖通過磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(Shio et al．，農(nóng)業(yè)和生物化學54，1513-1519(1990))和轉(zhuǎn)化酶反應(Yamamoto et al．，發(fā)酵技術(shù)雜志64，285-291(1986))轉(zhuǎn)化為果糖和葡萄糖-6-磷酸。
葡萄糖代謝過程中，葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(EC1．1．14．9)和葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶(EC5．3．1．9)競爭底物葡萄糖-6-磷酸。葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶催化Embden-Meyerhof-Parnas途徑或糖酵解的第一步反應，即轉(zhuǎn)化為果糖-6-磷酸。葡萄糖-6-磷酸脫氫酶催化戊糖磷酸循環(huán)的第一步氧化反應，即轉(zhuǎn)化為磷酸葡萄糖酸內(nèi)酯。
在戊糖磷酸循環(huán)的氧化反應中，葡萄糖-6-磷酸轉(zhuǎn)化為核酮糖-5-磷酸，從而產(chǎn)生NADPH形式的還原當量。隨著戊糖磷酸循環(huán)的進一步進行，戊糖磷酸，己糖磷酸和丙糖磷酸相互轉(zhuǎn)化。例如，在核酸的生物合成中需要戊糖磷酸，如5-磷酸核糖-1-焦磷酸。此外5-磷酸核糖-1-焦磷酸還是芳香族氨基酸和L-組氨酸的前體。NADPH在多數(shù)合成代謝生物合成中作為還原當量。由草酰乙酸生物合成一個L-賴氨酸需消耗四個NADPH分子。
戊糖磷酸循環(huán)在棒狀細菌的生物合成和氨基酸(尤其是L-賴氨酸)合成中的重要性已經(jīng)明確并已成為專家的興趣焦點。
Oishi和Aida(農(nóng)業(yè)和生物化學29，83-89(1965))已相應地報道了產(chǎn)氨短桿菌的“己糖單磷酸支路”。用Ishino等(普通和應用微生物雜志37，157-165(1991))的方法在谷氨酸和賴氨酸發(fā)酵過程應用13C摻入谷氨酸代謝的研究表明賴氨酸的產(chǎn)量與通過戊糖磷酸循環(huán)的代謝流量有關。
發(fā)明人的目的是提供一種提高通過戊糖磷酸循環(huán)的代謝流量的方法。
核苷酸、維生素、特別是L-氨基酸，尤其是賴氨酸和色氨酸，被用于食品工業(yè)、動物營養(yǎng)、人類醫(yī)藥和制藥工業(yè)。這些產(chǎn)物生產(chǎn)方法的改進成為普遍的研究熱點。
本發(fā)明提供了一種分離的多核苷酸，其包含選自如下一組的多核苷酸序列a)與編碼含有SEQ ID NO2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸至少70％相同的多核苷酸，b)編碼含有與SEQ ID NO2的氨基酸序列至少70％相同的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，c)與a)或b)的多核苷酸互補的多核苷酸，以及d)含有a)，b)或c)的多核苷酸序列的至少15個連續(xù)堿基的多核苷酸。
本發(fā)明還提供了根據(jù)權(quán)利要求1的多核苷酸，其優(yōu)選是能復制的DNA，包括(ⅰ)SEQ ID NO1的核苷酸序列，或(ⅱ)在遺傳密碼簡并范圍內(nèi)相應于(ⅰ)序列的至少一個序列，或(ⅲ)與(ⅰ)或(ⅱ)序列的互補序列雜交的至少一個序列，和任選地，(ⅳ)(ⅰ)中有功能的中義突變。
本發(fā)明還提供了權(quán)利要求2的多核苷酸，其含有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列，權(quán)利要求2的多核苷酸，其編碼含有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的多肽，含有權(quán)利要求1的多核苷酸序列的載體，特別是pMCl，保藏在大腸桿菌DSM12969中，以及作為宿主細胞的棒狀細菌，其含有權(quán)利要求6的載體。
“分離的”是指從其天然環(huán)境中分離出來。
“多核苷酸”一般地涉及多聚核糖核苷酸和多聚脫氧核糖核苷酸，其可以是非修飾的RNA或DNA，或修飾的RNA或DNA。
“多肽”應理解為含有經(jīng)肽鍵結(jié)合的兩個或多個氨基酸的肽或蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的多肽包括SEQ ID NO2所示的多肽，尤其是那些具有葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶生物活性多肽和那些與SEQ ID NO2的多肽具有至少70％相同性，優(yōu)選至少有80％，更優(yōu)選至少有90％-95％的相同性并具有上述活性的多肽。
此外本發(fā)明涉及一種用棒狀細菌發(fā)酵生產(chǎn)核苷酸、維生素、特別是L-氨基酸，尤其是賴氨酸和色氨酸的方法，這種棒狀桿菌尤其已產(chǎn)生上述物質(zhì)，且其中編碼pgi基因的核苷酸序列是弱化的，特別是以低水平表達的。
在此處，術(shù)語“弱化”是指例如運用一個弱啟動子或編碼相應的低活性酶或失活相應的酶(蛋白質(zhì))的基因或等位基因或?qū)⑦@些措施任意組合而使某一微生物體內(nèi)一個或多個酶(蛋白質(zhì))胞內(nèi)活性降低或被切斷，其中酶由相應的DNA編碼。
本發(fā)明提供的微生物具有利用葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、糖蜜、淀粉、纖維素，或甘油和乙醇生產(chǎn)核苷酸、維生素、特別是L-氨基酸，尤其是賴氨酸和色氨酸的能力。這些微生物可以包括棒狀細菌尤其是棒桿菌屬的代表成員。在棒桿菌屬內(nèi)谷氨酸棒桿菌可被特別提起，本領域技術(shù)人員已知它具有生產(chǎn)L-氨基酸的能力。
棒桿菌屬、尤其是谷氨酸棒桿菌種內(nèi)合適的菌株為已知的野生型菌株谷氨酸棒桿菌ATCC13032醋谷棒桿菌ATCC15860嗜乙酰乙酸棒桿菌ATCC13870嗜熱產(chǎn)氨棒桿菌FERM BP-1539黃色短桿菌ATCC14067乳發(fā)酵短桿菌ATCC13869擴展短桿菌ATCC14020以及來源于其的產(chǎn)生核苷酸、維生素、或L-氨基酸的突變體或菌株，
例如產(chǎn)生5′-肌苷酸的菌株產(chǎn)氨棒桿菌ATCC15190產(chǎn)氨棒桿菌ATCC15454和谷氨酸棒桿菌ATCC14998或例如產(chǎn)生5′-鳥苷酸的菌株谷氨酸棒桿菌ATCC21171產(chǎn)氨棒桿菌ATCC19216或例如產(chǎn)生D-泛酸的菌株谷氨酸棒桿菌ATCC13032／pECM3ilvBNCD，pEKEX2panBC和谷氨酸棒桿菌ATCC13032／pND-D2或例如產(chǎn)生L-賴氨酸的菌株谷氨酸棒桿菌FERM-P1780黃色短桿菌FERM-P1708乳發(fā)酵短桿菌FERM-P1712谷氨酸棒桿菌FERM-P6463谷氨酸棒桿菌FERM-P6464和谷氨酸棒桿菌DSM5714或例如產(chǎn)生L-色氨酸的菌株谷氨酸棒桿菌ATCC21850和谷氨酸棒桿菌KY9218(pKW9901)。
本發(fā)明人從谷氨酸棒桿菌成功地分離了新的編碼葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶(EC5．3．1．9)的pgi基因。
為了從谷氨酸棒桿菌分離pgi和其它的基因，首先在大腸桿菌中建立了此種微生物的基因文庫?；蛭膸斓臉?gòu)建見于一般的教科書和手冊?？商岬降氖怯蒞innacker編寫的教科書基因與克隆，EineEinführung in die Gentechnologie(Verlag Chemie，Weinheim，德國，1990)或Sambrook等的手冊分子克隆實驗手冊(冷泉港實驗室出版社，1989)。一個廣為人知的基因文庫是大腸桿菌K-12 W3110株的基因文庫，它是由Kohara等(細胞50，495-508(1987))用λ載體構(gòu)建的。Bathe等(分子與普通遺傳學，252255-265，1996)描述了谷氨酸棒桿菌ATCC13032菌株的基因文庫，它是用粘粒載體SuperCos I(Wahl等，1987，美國國家科學院學報，84；2160-2164)在大腸桿菌K-12NM554株(Raleigh等，1988，核酸研究161563-1575)中構(gòu)建的。Bormann等(分子微生物學6(3)，317-326))利用粘粒pHC79(Hohn＆Collins，基因11，291-298(1980))也構(gòu)建了谷氨酸棒桿菌ATCC13032的基因文庫。O＇Donohue(谷氨酸棒桿菌四種常見芳香族氨基酸生物合成基因的克隆與分子分析，博士論文，國立愛爾蘭大學，Galway，1997)描述了用λZap表達系統(tǒng)(Short等，核酸研究，167583)對谷氨酸棒桿菌基因的克隆。
在大腸桿菌中的谷氨酸棒桿菌的基因文庫也可以用如pBR322(Bolivar生命科學，25，807-818(1979))或pUC9(Vieira等，1982，基因，19259-268)等質(zhì)粒來構(gòu)建。合適的宿主是那些特別的具有限制和重組缺陷的大腸桿菌菌株，如DH5α(Jeffrey H． Miller；“細菌遺傳學簡要過程，埃希氏大腸桿菌及相關細菌實驗手冊及指南”，冷泉港實驗室出版社，1992)。
然后基因文庫通過轉(zhuǎn)化(Hanahan，分子生物學雜志166，557-580，1983)或電穿孔法(Tauch等，1994，F(xiàn)EMS微生物通信，123343-347)插入一指示菌。指示菌區(qū)別與其它菌是含有感興趣基因的突變從而導致可檢測的表型。Kupor和Fraenkel(細菌生物學雜志1001296-1301(1969))所述的大腸桿菌突變株DF1311對本發(fā)明的用途是重要的。此菌株帶有pgi和pgl基因的突變，導致其在有葡萄糖存在時生長嚴重抑制。在用帶有pgi基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后，在葡萄糖中的生長重新建立。其中一個這樣的包含有pgi基因的載體是pAMCl(


圖1)。
在粘?；蚱渌溯d體輔助下克隆的長DNA片段接著可在常規(guī)載體上進行亞克隆以便DNA測序。
DNA測序方法依照Sanger等的方法進行(美國國家科學院學報，745463-5467，1977)。
然后將所得的DNA序列通過現(xiàn)有的算法或序列分析軟件進行分析，如Staden氏程序(核酸研究14，217-232(1986))，Butler’s GCG程序(生化分析方法39，74-97(1998))，Pearson＆Lipman’s FASTA算法(美國國家科學院學報，852444-2448(1988))或Altschul等的BLAST程序(自然遺傳6，119-129(1994))，并與在公共數(shù)據(jù)庫中提供的序列相比較。公共核酸序列數(shù)據(jù)庫例如歐洲分子生物學實驗室數(shù)據(jù)庫(EMBL，海德堡，德國)或國家生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫(NCBI，Bethesda，USA)。
這些方法用來從谷氨酸棒桿菌獲得編碼pgi基因的新DNA序列，本發(fā)明已將此序列列為SEQ ID NO1。相應蛋白質(zhì)的氨基酸序列通過上述方法進一步由上述DNA序列推導而來。SEQ ID NO2所示為pgi基因產(chǎn)物的氨基酸序列。
本發(fā)明同時提供了由于遺傳密碼的簡并由SEQ ID NO1產(chǎn)生的編碼DNA序列。同樣的，本發(fā)明也提供了與SEQ ID NO1或SEQID NO1的部分雜交的DNA序列。最后，本發(fā)明還提供了用得自SEQ ID NO1的引物經(jīng)聚合酶鏈式反應(PCR)產(chǎn)生的DNA序列。
通過雜交鑒別DNA序列的指導可參見寶靈格曼海姆有限公司的手冊“用于濾膜雜交的DIG系統(tǒng)用戶指南”(曼海姆，德國，1993)以及Liebl等(系統(tǒng)細菌學國際雜志(1991)41255-260)。用聚合酶鏈反應(PCR)擴增DNA序列的指導參見Gait的手冊寡核苷酸合成實用方法(IRL出版社，英國牛津，1984)及Newton和GrahamPCR(Spektrum Akademischer Vrlag，Heidelberg，德國，1994)。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，pgi基因弱化后，棒狀細菌提高了通過戊糖磷酸途徑的代謝量，并以一種改進的方式產(chǎn)生核苷酸、維生素、特別是L-氨基酸，尤其是L-賴氨酸和L-色氨酸。
弱化可通過降低或關閉pgi基因的表達或酶蛋白的催化活性而達到。任選地兩種方法可聯(lián)合使用。
基因表達的降低可通過對培養(yǎng)的適當控制或?qū)虮磉_的信號結(jié)構(gòu)進行遺傳修飾(突變)來獲得。基因表達的信號結(jié)構(gòu)例如是阻遏基因、激活基因、操縱子、啟動子、弱化子、核糖體結(jié)合位點、起始密碼子、終止子。本領域熟練技術(shù)人員可在下列資料中找到相關內(nèi)容，如專利申請WO96／15246、Bloyd＆Murphy(細菌學雜志1705949(1988))，Voskuil&Chambliss(核酸研究26，3548(1998))，Jensen&Hammer(生物技術(shù)和生物工程58191(1998))，Patek等(微生物學1421297(1996))以及已知的遺傳學和分子生物學教科書，如Kippers編寫的教科書(“分子遺傳學”。第六版，Georg Thieme Verlag，德國，1995)或Winnacker編寫的教科書(“基因和克隆”，VCHVerlagsgesellschaft，Weinheim，德國，1990)。
現(xiàn)有技術(shù)中已知可導致酶蛋白的催化活性的修飾或降低的突變，可提到有關例子有Qiu&Goodman的文章(生物化學雜志2728611-8617(1997))，Sugimoto等(生物科學生物技術(shù)和生物化學611760-1762(1997))，和Mockel(“Die Threonindehydratase ausCorynebacterium glutamicumAufhebung der allosterischen Regulationund Struktui des Enzyms”，F(xiàn)orschungszentrun Julich reports Jul-2906，ISSN09442952，Julich，德國，1994)。此類綜述可在已有的遺傳學和分子生物學教科書中找到，如Hagemann的教科書(“整體遺傳學”，Gustav Fischer Verlag，Stuttgard，1986)。
可考慮的突變包括轉(zhuǎn)換、轉(zhuǎn)變、插入、缺失、顛換。根據(jù)對酶活性位點的氨基酸改變的影響，突變可分為錯義突變或無義突變。基因中至少一個堿基對的插入或缺失可引起讀框的改變而導致錯誤氨基酸的插入或翻譯的提前終止。兩個或以上密碼子的缺失通常導致酶活性的完全喪失。產(chǎn)生此類突變的指導是現(xiàn)有技術(shù)并見于已有的遺傳學和分子生物學教科書，例如Kippers編寫的教科書(“分子遺傳學”，第六版，Georg Thieme Verlag，德國，1995)、Winnacker編寫的教科書(“基因和克隆”，VCE Verlagsgesellschaft，Weinheim，德國，1990)或Hagemann的教科書(“Allgemeine Genetik”，GustavFischer Verlag，Stuttgard，1986)。
插入誘變的一個例子是質(zhì)粒pMCl(圖2)，通過它pgi基因得以突變。質(zhì)粒pMCl由質(zhì)粒pBGS8組成，質(zhì)粒pBGS8的描述見Spratt等的文章(基因41337(1986))，在其中插入了一個pgi基因的內(nèi)部片段，見SEQ ID NO3。通過轉(zhuǎn)化和與pgi基因的同源重組(插入)，此質(zhì)粒導致了酶活性的全部喪失。有許多有關插入誘變的說明與解釋，例如Achwarzer＆Pühler(生物技術(shù)9，84-87(1991))或Fitzpatrick等(應用微生物和生物技術(shù)42，575-580(1994))。
除了pgi基因的弱化，為生產(chǎn)核苷酸、維生素、特別是L-氨基酸，尤其是L-賴氨酸和L-色氨酸，有利的是還可以擴增，尤其是超量表達這個特定生物合成途徑中的一個或多個酶。
例如，當生產(chǎn)核苷酸時，可以·同時超量表達編碼谷氨酰胺-PRPP酰胺轉(zhuǎn)移酶的purF基因和／或·同時超量表達編碼氨甲酰磷酸合酶的carAB基因。
例如，當生產(chǎn)L-賴氨酸時，可以·同時超量表達編碼二氫2，6-吡啶二羧酸合酶的dapA基因(EP-B0197335)，和／或·同時超量表達編碼谷氨酸脫氫酶的gdh基因(Bormann等，分子微生物學6，317-326(1992))，和／或
·同時擴增賦予S-(2-氨基乙基)半胱氨酸抗性的DNA片段(EP-A0088166)。
例如，當生產(chǎn)L-色氨酸時，可以·同時超量表達編碼轉(zhuǎn)羥乙醛酶的tkt基因，和／或·同時超量表達編碼磷酸核糖焦磷酸合酶的prs基因。
除pgi基因的弱化外，在生產(chǎn)核苷酸、維生素、特別是L-氨基酸，尤其是L-賴氨酸和L-色氨酸過程中終止不需要的二級反應也是有益的(Nakayama“產(chǎn)氨基酸微生物的培養(yǎng)”，見微生物產(chǎn)品的過量生產(chǎn)，Krumphanzl，Sikyta，Vanek(eds)，學術(shù)出版社，倫敦，英國，1982)。
本發(fā)明也提供了包含如權(quán)利要求1所述的多核苷酸的微生物，其可以連續(xù)培養(yǎng)或間斷培養(yǎng)，運用分批方法或補料分批方法或重復補料分批方法以生產(chǎn)核苷酸、維生素、特別是L-氨基酸，尤其是L-賴氨酸和L-色氨酸。現(xiàn)有培養(yǎng)方法的概述見于Chmiel(Bioprozesstechnik l．Einführung in die Bioverfahrenstechnik(GustavFischer Verlag，Stuttgart，1991))或Storhas編寫的手冊(Bioreaktoren undperiphere Einrichtungen(Vieweg Verlag，Braunschweig／Wiesbaden，1994))。
所用培養(yǎng)基必須以適當方式符合各菌株的需求，關于各種微生物培養(yǎng)基的闡述見于，美國細菌學會的“細菌學通用方法手冊”(華盛頓D．C．，USA，1981)。可使用的碳源包括糖及碳水化合物，例如葡萄糖，蔗糖，乳糖，果糖，麥芽糖，糖蜜，淀粉和纖維素，油和脂肪如豆油，葵花油，落花生油和椰子油，脂肪酸如棕櫚酸，硬脂酸和亞油酸，醇如甘油和乙醇，及有機酸如乙酸，這些物質(zhì)可單獨或混合使用，可使用的氮源包括含氮的有機化合物如胨，酵母提取物，肉膏，麥芽提取物，玉米浸液、大豆粉和尿素，或無機化合物如硫酸銨，氯化銨，磷酸銨，碳酸銨和硝酸銨。氮源可單獨或混合使用，可使用的磷源包括磷酸，磷酸二氫鉀或磷酸氫二鉀，或相應鈉鹽培養(yǎng)基另外還必須含有為生長所需的金屬鹽如硫酸鎂或硫酸鐵。最后，除了上述物質(zhì)之外，可使用生長必需物質(zhì)如氨基酸和維生素，此外，可將適當前體加入培養(yǎng)基中上述物質(zhì)可以單批形式或在培養(yǎng)期間以適當方式加入培養(yǎng)物中。
可以適當方式加入堿性化合物如NaOH，KOH，氨或氨水，或酸性化合物如磷酸或硫酸，以調(diào)節(jié)培養(yǎng)物的PH值，抗泡沫劑例如脂肪酸聚乙二醇酯可用于控制泡沫產(chǎn)生。適當?shù)倪x擇性作用物質(zhì)例如抗生素，可加入培養(yǎng)基中以保持質(zhì)粒的穩(wěn)定性。氧氣或含氧混合氣，例如空氣，可充入培養(yǎng)物中以保持有氧條件。培養(yǎng)溫度通常在20℃～45℃，優(yōu)選25℃～40℃，持續(xù)培養(yǎng)直至L-賴氨酸形成最大量。此目的通常在10～160小時范圍達到。
通過戊糖磷酸途徑的代謝流量可以用如C-1標記的13C葡萄糖作為碳源來測定。這種分析方法是基于已知的事實當葡萄糖通過戊糖磷酸途徑代謝時，C-1位轉(zhuǎn)化為二氧化碳，然而通過糖酵解途徑代謝時13C-1標記轉(zhuǎn)移到丙酮酸的C-3位。丙酮酸C-3位13C的量可以在恰當?shù)臅r間通過核磁共振或質(zhì)譜分析研究其胞外代謝物比如乳酸尤其是賴氨酸來確定。或者，氨基酸可由生物量被酸水解后獲得，然后確定在特定氨基酸中各個碳原子中的13C含量。本領域熟練技術(shù)人員可在Sonntag等(歐洲生物化學雜志213，1325-1331(1993))，Sonntag等(應用微生物和生物技術(shù)44，489-495(1995))，Marx等(生物技術(shù)與生物工程49，489-495(1995))和Marx等(生物技術(shù)與生物工程56，168-180(1997))的文章中找到詳細說明，尤其是與所研究的代謝物中不同碳原子的13C含量的計算機輔助數(shù)據(jù)分析有關方面的說明。
現(xiàn)有技術(shù)中已敘述了有關核苷酸、維生素和L-氨基酸的分析方法。L-氨基酸可用如陰離子交換層析聯(lián)合水合茚三酮衍生化法進行分析，見Spackman等(分析化學，30，(1958)，1190)，或者還可以通過反相HPLC來分析，見Lindroth等(分析化學(1979)511167-1174)。
以下微生物根據(jù)布達佩斯條約，已保藏在德意志微生物保藏中心(DSMZ，不倫瑞克，德國)·大腸桿菌菌株DH5α／pMCl，保藏號DSM12969實施例以下實施例將進一步說明本發(fā)明。所用的分子生物學技術(shù)如質(zhì)粒DNA提取，限制性內(nèi)切酶分析，連接，大腸桿菌的標準轉(zhuǎn)化等(除非其他敘述)，見于Sambrook等(分子克隆實驗手冊(1989)，冷泉港實驗室，美國)。
實施例1谷氨酸棒桿菌菌株AS019基因文庫的構(gòu)建用λZap ExpressTM系統(tǒng)(Short等，(1988)核酸研究，167583-7600)構(gòu)建了谷氨酸棒桿菌菌株AS019(Yoshihama等，細菌生物學雜志162，591-597(1985))的DNA文庫，如O′Donohue所述(O＇Donohue，M．(1997)，谷氨酸棒桿菌四種常見芳香族氨基酸生物合成基因的克隆與分子分析，博士論文，國立愛爾蘭大學，Galway)。λZap ExpressTM系統(tǒng)試劑盒購自Stratagene(Stratagene，11011 North Torrey Pines Rd．，La Jolla，California 92037)并按說明書使用。AS019-DNA用限制性內(nèi)切酶Sau3A消化后連接到用BamHI消化并去磷酸化的λZap ExpressTM臂上。
實施例2pgi基因的克隆和測序1．克隆將大腸桿菌菌株DF1311，其攜帶有突變的pgi和pgl基因，見Kupor&Fraenkel(細菌學雜志1001296-1301(1969))，用大約500ng的如實施例1所述的AS019λZap ExpressTM質(zhì)粒文庫轉(zhuǎn)化。用含有50mg／ml卡那霉素的M9基本培養(yǎng)基(Sambrook等，(1989)分子克隆實驗手冊，冷泉港實驗室，美國)37℃培養(yǎng)48小時對轉(zhuǎn)化子進行篩選。根據(jù)Bimboim＆Doly(核酸研究71513-1523(1979))從一個轉(zhuǎn)化子中提取質(zhì)粒并命名為pAMCl(
圖1)。
2．測序用Sanger等(美國國家科學學報74，5463-5467(1977))的方法用經(jīng)不同色熒光標記的引物對克隆到pAMCl的基因進行測序。用Perkin Elmer應用生物系統(tǒng)公司(Perlin Elmer Corporation，Norwalk，Connecticut，U．S．A)的ABI prism 310基因分析儀和ABI prism BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction試劑盒進行測序。
用Pharmacia Biotech(Ast．Albans，Herts，AL13AW，UK)公司的通用正向引物和M13反向引物進行初始測序分析通用正向引物GTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG CM13 反向引物GGA AAC AGC TAT GAC CAT G然后根據(jù)所得序列設計的內(nèi)部引物進行全長pgi基因的測序。內(nèi)部引物的序列如下內(nèi)部引物1GGA AAC AGG GGA GCC GTC內(nèi)部引物2TGC TGA GAT ACC AGC GGT所得的序列用蘋果麥金托什機DNA Strider程序1．0版(Marck，(1998)．核酸研究161829-1836)進行分析。這一程序可以進行限制性位點使用、開放讀框分析和密碼子使用分析。使用BLAST程序(Altschul等，(1997)核酸研究，253389-3402)在所得序列和EMBL和Genbank中的序列進行查詢。DNA和蛋白質(zhì)序列比較使用ClustalV和Clustal W程序(Higgins and Sharp，1998基因73237-244)。
所得的序列如SEQ ID NO1所示。經(jīng)核酸序列分析所得的1650個堿基的開放閱讀框架命名為pgi基因。其編碼一個550個氨基酸的蛋白質(zhì)如SEQ ID NO2所示。
實施例3pgi基因的誘變1．pgi破壞載體的構(gòu)建用谷氨酸棒桿菌AS019的基因組DNA作模板采用聚合酶鏈式反應(PCR)擴增了pgi基因的一內(nèi)部片段(Heery＆Durican，(1993)應用與環(huán)境微生物學59791-799)。所用的引物為正向引物ATG GAR WCC AAY GGH AA反向引物YTC CAC GCC CCA YTG RTC其中R=A+G；Y=C+T；W=A+T；H=A+T+CPCR的程序如下35個循環(huán)94℃1分鐘47℃1分鐘72℃30秒1．5mM MgCl2約150-200ngDNA模板。
所得的PCR產(chǎn)物克隆到Promega公司(Promega英國，南開浦敦)的商業(yè)化的pGEM-T載體上，使用的宿主菌是大腸桿菌JM109(Yanisch-Perron等，1985，基因，33103-119)。PCR產(chǎn)物序列如SEQ ID NO3所示?？寺〉牟迦肫谓?jīng)EcoRⅠ切下后連接到預先用EcoRI處理的質(zhì)粒pBGS8(Sprstt等，基因41337-342(1986))上。所用的內(nèi)切酶來自Boehringer Mannheim UK Ltd．(Bell Lane，Lewes，East Sussesx BN7 1LG UK)并按照說明書使用。用連接的混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109菌株，電轉(zhuǎn)化子的選擇是在含有1mM IPTG(異丙基硫代-β-D-半乳糖苷)、0．02％XGAL(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)和50mg／ml卡那霉素的Luria瓊脂上進行。瓊脂平板在37℃放置12小時。從一個轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒并用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、BamHI和SacⅠ進行分析鑒定，命名為pMCl。(圖2)2．在DSM5715菌株中pgi基因的插入誘變用電穿孔法(Liebl等，F(xiàn)EMS微生物學通信，53299-303(1989))將pMCl轉(zhuǎn)化到DSM5715菌株中。轉(zhuǎn)化子篩選在LBHIS瓊脂(其組成為18．5g／l腦心浸出肉湯、0．5M山梨醇、5g／lBacto蛋白胨、2．5g／lBacto酵母提取物、5g／lNaCl和18g／lBacto瓊脂，補加15mg／l卡那霉素和1％果糖)上進行。33℃溫育2天。獲得了轉(zhuǎn)化子1，2，3。
從所獲得的轉(zhuǎn)化子用PCR方法鑒定。為此，如Eikmanns等(微生物1401817-1828(1994))所述，從所獲得的轉(zhuǎn)化子和DSM5715菌株分離染色體DNA。根據(jù)如SEQ ID NO1所示的pgi基因的DNA序列設計下列引物寡核苷酸進行PCR擴增pgi-15′ACC CAC GCT GTC CTA CCT TA 3′pgi-25′TGT CCC AAA TCA CGC CCT AG 3′pgi-35′gat gat agc ggc cag tgc at 3′上述引物由MWG生物技術(shù)公司(Ebersberg，德國)合成，PCR依照Innis等(PCR-方案，方法與應用指南，1990，學術(shù)出版社)的標準方法進行。以轉(zhuǎn)化子的染色體DNA為模板，以DSM5715菌株的染色體DNA為對照。每一模板均用于兩組PCR反應，一組使用引物pgi-1／pgi-2，另一組使用pgi-1／pgi-3。
以0．8％的瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物。使用引物pgi-1／pgi-2的四個PCR反應均產(chǎn)生了0．5kb的DNA片段。使用pgi-1／pgi-3的PCR反應，只有對照組DSM5715 DNA擴增出了0．7kb的DNA片段，以轉(zhuǎn)化子染色體DNA為模板的反應未能檢測到擴增片段。
以此方式鑒定的轉(zhuǎn)化子3命名為菌株DSM5715pMCl實施例4賴氨酸的形成將實施例3所得的谷氨酸棒桿菌DSM5715pMCl在適當?shù)挠糜谏a(chǎn)賴氨酸的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，測定上清中的賴氨酸含量。
為此，首先在33℃在具有相應的抗生素的瓊脂板(具有卡那霉素(25mg／l)的腦心瓊脂)上培養(yǎng)菌株24小時。用這一瓊脂板培養(yǎng)物接種預培養(yǎng)物(10ml培養(yǎng)基于100ml錐形瓶)。用于預培養(yǎng)的培養(yǎng)基是完全培養(yǎng)基CgⅢ(Kase＆Nskayama，農(nóng)業(yè)和生物化學36(9)1611-1621(1972))，向這一預培養(yǎng)物中加入卡那霉素(25mg／l)。在搖床上于33℃以240rpm振蕩培養(yǎng)預培養(yǎng)物24小時。以此預培養(yǎng)物接種主培養(yǎng)物，從而主培養(yǎng)物的起始OD(測量波長660nm)是0．1。培養(yǎng)基CGC用作主培養(yǎng)物。培養(yǎng)基CGC(NH4)2SO45g／l尿素 5g／l玉米漿(CSL)5g／l葡萄糖(單獨高壓滅菌) 36g／lKH2PO4／K2HPO4各0．5g／lMgSO4·7H2O 0．25g／lCaCl2·2H2O 10mg／l生物素(過濾滅菌) 0．2mg／lFeSO4·7H2O 10mg／lMnSO4·H2O 10．0mg／lCuSO40．2mg／lZnSO4·7H2O 1mg／lNiCl2·6H2O 0．02mg／l亮氨酸 0．15g／l硫胺素·HCl0．2mg／l(過濾滅菌)用氨水將CSL和鹽溶液調(diào)至pH7并高壓滅菌。然后加入無菌的底物維生素溶液。
以在具有檔板的100ml錐形瓶中的10ml體積進行培養(yǎng)，加入卡那霉素(25mg／l)。在33℃和80％大氣濕度下進行培養(yǎng)。
48小時后，利用Biomek 1000(Beckmann儀器Gmbh，Munich)測定培養(yǎng)液660nm波長處的OD值。用Eppendorf-BioTronik公司(Hamburg，Germany)的氨基酸分析儀通過離子交換層析和柱后用水合茚三酮衍生化檢測所獲得的賴氨酸的濃度。
實驗結(jié)果見表1表1
實施例5流經(jīng)戊糖磷酸途徑(PPP)的代謝量的增加細胞在10mlCGⅢ(Menkel等，1989，應用與環(huán)境微生物學55684-688)中預培養(yǎng)。用有擋板的100ml搖瓶在搖振直徑50mm的搖床上以250轉(zhuǎn)／分鐘在33℃、初始pH7的條件下進行培養(yǎng)。用9g／L的NaCl洗滌細胞，并用于接種主培養(yǎng)基，使660nmOD值為0．1(Biochrom Novaspec 4049，LKB Instrument Gmbh，Grafelfng，德國，池寬10mm)。主培養(yǎng)物在加入5g／L玉米浸出液的10ml的CGL(Schrumpf等，1991，細菌學雜志1734510-4516)進行培養(yǎng)。而且，在培養(yǎng)基中加入30g／L[1-13C]的右旋糖(實驗A)或15g／L未標記的右旋糖加15g／L[6-13C]右旋糖的混合物(實驗B)。[1-13C]右旋糖(99％富集)和[6-13C]右旋糖(99％富集)購自Cambridge IsotopeLaboratories，Cambridge，MA，USA。使用有擋板的100ml搖瓶，在搖振直徑50mm的搖床上以250轉(zhuǎn)／分鐘在33℃、初始pH7的條件下培養(yǎng)72小時。發(fā)酵結(jié)束時測定660nm光密度及鹽酸賴氨酸含量(氨基酸分析儀，Eppendorf-BioTronik，Hamburg，德國)。15000g離心除去生物量，無細胞上清進行凍干。
凍干粉重溶與1mlD2O(99．8％，Deutero GmbH，Kastellaun，德國)并加入3-三甲基甲硅烷基-丙酸-2，2，3，3，d4(MSD Isotopes，Montreal，Canada)作為標準。按Marx等，1996(生物技術(shù)和生物工程49111-129)，Marx等，1999(代謝工程135-48)和Wendisch等，1997(分析生物化學245196-202)的方法在AMX 400-WB光譜儀上進行包括自旋回波技術(shù)和差示光譜的核磁共振光譜實驗。檢測在賴氨酸碳原子位置上的13C的富集并且根據(jù)Marx等，1996(生物技術(shù)和生物工程49111-129)、Marx等，1997(生物技術(shù)和生物工程56168-180)、Marx等，1999(代謝工程135-48)、Sonntag等，1993(歐洲生物化學雜志2131325-1331)和Sonntag等，1995(應用微生物學與生物技術(shù)44；489-495)按如下所述的原理進行通過戊糖磷酸途徑(PPP)的代謝量評估。
核磁共振光譜實驗結(jié)果見圖3-圖6。a組顯示13C去偶光譜的積分。當b組積分用a組積分相除獲得特定碳原子位置13C的富集的積分時，獲得顯示于b組的差示積分。對于賴氨酸碳原子位置C-4(如圖3a和圖3b中的L-4)，38．286的差示光譜積分用198．867的13C去偶光譜積分相除，結(jié)果除以1．95，得到富集為9．9％。關于賴氨酸單個碳原子位置的自旋回波實驗的效果不同于Wendisch等，1997(分析生物化學245196-202)所描述的結(jié)果，使得分離系數(shù)的范圍從1．80到1．99。圖3和圖5所示的結(jié)果是培養(yǎng)基加有[6-13C]右旋糖(實驗B)的培養(yǎng)結(jié)果。圖4和圖6所示的結(jié)果是培養(yǎng)基加有[1-13C]右旋糖(實驗A)的培養(yǎng)結(jié)果。
表2父本DSM5715菌株和pgi突變的DSM5715pMCl的賴氨酸碳原子位置的13C富集。L2-L6(參見圖3到圖6)示出賴氨酸碳原子位置。最后一列示出用右旋糖攝入率校正的通過戊糖磷酸途徑的代謝流量。在第8列所示的是富集比值(B-A／B) 1富集的葡萄糖2菌株1指DSM57153菌株2指DSM5715pMCl4e．r．指富集比值(B-A)／B對于在實驗A和實驗B中生長的細胞，獲得了賴氨酸不同位置的碳原子的13C富集(表2)。尤其是實驗A中菌株DSM5715pMCl賴氨酸C3和C5碳原子的13C富集的減低說明了較高的PPP流量。PPP流量源自比值(B-A)／B，這里A指由實驗A制備的賴氨酸總的13C富集，B指由實驗B制備的賴氨酸總的13C富集(Eq．1；Eq．2；Eq．3；Tab．2)。舉例來說LYS_2_A就是實驗A中賴氨酸C2碳原子13C富集，GLC_6_B是指實驗B中右旋糖底物中C6碳原子13C富集。應用Eq．3，分別除以實驗A中右旋糖位置C1的99％和實驗B中右旋糖位置C6的49％的富集標化了富集度。對于菌株DSM5715，海藻糖13C富集揭示了胞質(zhì)中存在葡萄糖-6-磷酸和果糖-6-磷酸的總平衡，這對于確定源自比值(B-A)／B的PPP流量是非常重要的。
LYS_A=LYS_2_A+LYS_3_A+LYS_5_A+LYS_6_A-4．4Eq．1LYS_B=LYS_2_B+LYS_3_B+LYS_5_B+LYS_6_B-4．4Eq．2(B-A)／B=[LYS_B*99／(GLC_6_B-1．1)-LYS_A*99／(GLC_1_A-1．1)]／LYS_B*99／(GLC_6_B-1．1)]Eq．3利用計算機模擬和Marx等，1996(生物技術(shù)和生物工程49111-129)，Marx等，1997(生物技術(shù)和生物工程56168-180)、Marx等，1999(代謝工程135-48)，Sonntag等，1993(歐洲生物化學雜志2131325-1331)和Sonntag等，1995(應用微生物學與生物技術(shù)44；489-495)所述的代謝模型，當磷酸葡萄糖異構(gòu)酶存在并總體平衡或不存在時，在代謝網(wǎng)絡中找到了PPP流量和富集比值(B-A)／B之間相關性的一個雙曲線或直線函數(shù)(圖7)。將實驗數(shù)據(jù)如表2所示的比值(B-A)／B與計算機模擬計算數(shù)據(jù)相比較，結(jié)果顯示對于父本菌株DSM5715，摩爾PPP流量為60摩爾每100摩爾右旋糖(圖5)。這個結(jié)果與文獻(Marx等，1996．生物技術(shù)和生物工程49111-129；Marx等，1997．生物技術(shù)和生物工程56168-180；Marx等，1998，第七屆國際計算機在生化領域應用會議預印稿，大阪，日本，5月31日——6月4日，1998．387-392；Marx等，1999代謝工程135-48；Sonntag等，1995應用微生物學與生物技術(shù)44；489-495)所述的DSM5715的PPP流量相一致。而DSM5715pMCl的摩爾PPP流量為98摩爾每100摩爾右旋糖。
結(jié)果清楚地顯示pgi基因敲除突變的結(jié)果是右旋糖攝取的總的代謝流量轉(zhuǎn)向了PPP途徑。
實施例6副產(chǎn)物的減少
DSM5715和DSM5715pMCl如實施例5所示進行培養(yǎng)和分析。通過對培養(yǎng)物上清進行核磁共振光譜分析(圖3-圖6)顯示菌株DSM5715pMCl的副產(chǎn)物(如海藻糖、異丙基蘋果酸酯、乳酸鹽、酮戊二酸和纈氨酸)比其父本DSM5715明顯減少。數(shù)據(jù)總結(jié)于表3。
表3質(zhì)子核磁共振光譜確定的搖瓶發(fā)酵72小時后各種胞外化合物的濃度。核磁共振光譜的化學位移見圖5、圖6。
序列表&#60110&#62 國立愛爾蘭大學德古薩-于爾斯股份公司&#60120&#62 編碼pgi基因的新核苷酸序列&#60130&#62 990128BT&#60140&#62&#60141&#62&#60160&#62 3&#60170&#62 PatentIn Ver．2．1&#60210&#62 1&#60211&#62 2811&#60212&#62 DNA&#60213&#62 谷氨酸棒桿菌&#60220&#62&#60221&#62 CDS&#60222&#62 (373)．．(2022)&#60400&#62 1aaaacccgag gggcgaaaat tccaccctaa cttttttggg atcccctttt tccggggaat 60taattggttt gggtttcaat gggaaaacgg gaaacaatgg gccaaaggtt caaaaacccc 120aaaagggggc cgggttcaaa ttcccaaaaa aaatggcaaa aaaggggggg ccaaaaccaa 180gttggccccc aaaccaccgg ggcaacggcc cacccacaaa ggggttgggt taaaggaagg 240acgcccaaag taagcccgga atggcccacg ttcgaaaaag caggccccaa ttaaacgcac 300cttaaatttg tcgtgtttcc cactttgaac actcttcgat gcgcttggcc acaaaagcaa 360gctaacctga ag atg tta ttt aac gac aat aaa gga gtt ttc atg gcg gac 411Met Leu Phe Asn Asp Asn Lys Gly Val Phe Met Ala Asp1 5 10att tcg acc acc cag gtt tgg caa gac ctg acc gat cat tac tca aac459Ile Ser Thr Thr Gln Val Trp Gln Asp Leu Thr Asp His Tyr Ser Asn15 20 25ttc cag gca acc act ctg cgt gaa ctt ttc aag gaa gaa aac cgc gcc507Phe Gln Ala Thr Thr Leu Arg Glu Leu Phe Lys Glu Glu Asn Arg Ala30 35 40 45gag aag tac acc ttc tcc gcg gct ggc ctc cac gtc gac ctg tcg aag555Glu Lys Tyr Thr Phe Ser Ala Ala Gly Leu His Val Asp Leu Ser Lys50 55 60aat ctg ctt gac gac gcc acc ctc acc aag ctc ctt gca ctg acc gaa603Asn Leu Leu Asp Asp Ala Thr Leu Thr Lys Leu Leu Ala Leu Thr Glu65 70 75gaa tct ggc ctt cgc gaa cgc att gac gcg atg ttt gcc ggt gaa cac651Glu Ser Gly Leu Arg Glu Arg Ile Asp Ala Met Phe Ala Gly Glu His80 85 90ctc aac aac acc gaa gac cgc gct gtc ctc cac acc gcg ctg cgc ctt699Leu Asn Asn Thr Glu Asp Arg Ala Val Leu His Thr Ala Leu Arg Leu95 100 105cct gcc gaa gct gat ctg tca gta gat ggc caa gat gtt gct gct gat747Pro Ala Glu Ala Asp Leu Ser Val Asp Gly Gln Asp Val Ala Ala Asp110 115 120 125gtc cac gaa gtt ttg gga cgc atg cgt gac ttc gct act gcg ctg cgc795Val His Glu Val Leu Gly Arg Met Arg Asp Phe Ala Thr Ala Leu Arg130 135 140tca ggc aac tgg ttg gga cac acc ggc cac acg atc aag aag atc gtc843Ser Gly Asn Trp Leu Gly His Thr Gly His Thr Ile Lys Lys Ile Val145 150 155aac att ggt atc ggt ggc tct gac ctc gga cca gcc atg gct acg aag891Asn Ile Gly Ile Gly Gly Ser Asp Leu Gly Pro Ala Met Ala Thr Lys160 165 170gct ctg cgt gca tac gcg acc gct ggt atc tca gca gaa ttc gtc tcc939Ala Leu Arg Ala Tyr Ala Thr Ala Gly Ile Ser Ala Glu Phe Val Ser175 180 185aac gtc gac cca gca gac ctc gtt tct gtg ttg gaa gac ctc gat gca987Asn Val Asp Pro Ala Asp Leu Val Ser Val Leu Glu Asp Leu Asp Ala190 195 200 205gaa tcc aca ttg ttc gtg atc gct tcg aaa act ttc acc acc cag gag1035Glu Ser Thr Leu Phe Val Ile Ala Ser Lys Thr Phe Thr Thr Gln Glu210 215 220acg ctg tcc aac gct cgt gca gct cgt gct tgg ctg gta gag aag ctc1083Thr Leu Ser Asn Ala Arg Ala Ala Arg Ala Trp Leu Val Glu Lys Leu225 230 235ggt gaa gag gct gtc gcg aag cac ttc gtc gca gtg tcc acc aat gct1131Gly Glu Glu Ala Val Ala Lys His Phe Val Ala Val Ser Thr Asn Ala240 245 250gaa aag gtc gca gag ttc ggt atc gac acg gac aac atg ttc ggc ttc1179Glu Lys Val Ala Glu Phe Gly Ile Asp Thr Asp Asn Met Phe Gly Phe255 260 265tgg gac tgg gtc gga ggt cgt tac tcc gtg gac tcc gca gtt ggt ctt1227Trp Asp Trp Val Gly Gly Arg Tyr Ser Val Asp Ser Ala Val Gly Leu270 275 280 285tcc ctc atg gca gtg atc ggc cct cgc gac ttc atg cgt ttc ctc ggt1275Ser Leu Met Ala Val Ile Gly Pro Arg Asp Phe Met Arg Phe Leu Gly290 295 300gga ttc cac gcg atg gat gaa cac ttc cgc acc acc aag ttc gaa gag1323Gly Phe His Ala Met Asp Glu His Phe Arg Thr Thr Lys Phe Glu Glu
305 310 315aac gtt cca atc ttg atg gct ctg ctc ggt gtc tgg tac tcc gat ttc1371Asn Val Pro Ile Leu Met Ala Leu Leu Gly Val Trp Tyr Ser Asp Phe320 325 330tat ggt gca gaa acc cac gct gtc cta cct tat tcc gag gat ctc agc1419Tyr Gly Ala Glu Thr His Ala Val Leu Pro Tyr Ser Glu Asp Leu Ser335 340 345cgt ttt gct gct tac ctc cag cag ctg acc atg gag acc aat ggc aag1467Arg Phe Ala Ala Tyr Leu Gln Gln Leu Thr Met Glu Thr Asn Gly Lys350 355 360 365tca gtc cac cgc gac ggc tcc cct gtt tcc act ggc act ggc gaa att1515Ser Val His Arg Asp Gly Ser Pro Val Ser Thr Gly Thr Gly Glu Ile370 375 380tac tgg ggt gag cct ggc aca aat ggc cag cac gct ttc ttc cag ctg1563Tyr Trp Gly Glu Pro Gly Thr Asn Gly Gln His Ala Phe Phe Gln Leu385 390 395atc cac cag ggc act cgc ctt gtt cca gct gat ttc att ggt ttc gct1611Ile His Gln Gly Thr Arg Leu Val Pro Ala Asp Phe Ile Gly Phe Ala400 405 410cgt cca aag cag gat ctt cct gcc ggt gag cgc acc atg cat gac ctt1659Arg Pro Lys Gln Asp Leu Pro Ala Gly Glu Arg Thr Met His Asp Leu415 420 425ttg atg agc aac ttc ttc gca cag acc aag gtt ttg gct ttc ggt aag1707Leu Met Ser Asn Phe Phe Ala Gln Thr Lys Val Leu Ala Phe Gly Lys430 435 440 445aac gct gaa gag atc gct gcg gaa ggt gtc gca cct gag ctg gtc aac1755Asn Ala Glu Glu Ile Ala Ala Glu Gly Val Ala Pro Glu Leu Val Asn450 455 460cac aag gtc gtg cca ggt aat cgc cca acc acc acc att ttg gcg gag1803His Lys Val Val Pro Gly Asn Arg Pro Thr Thr Thr Ile Leu Ala Glu465 470 475gaa ctt acc cct tct att ctc ggt gcg ttg atc gct ttg tac gaa cac1851Glu Leu Thr Pro Ser Ile Leu Gly Ala Leu Ile Ala Leu Tyr Glu His480 485 490acc gtg atg gtt cag ggc gtg att tgg gac atc aac tcc ttc gac caa1899Thr Val Met Val Gln Gly Val Ile Trp Asp Ile Asn Ser Phe Asp Gln495 500 505tgg ggt gtt gaa ctg ggc aaa cag cag gca aat gac ctc gct ccg gct1947Trp Gly Val Glu Leu Gly Lys Gln Gln Ala Asn Asp Leu Ala Pro Ala510 515 520 525gtc tct ggt gaa gag gat gtt gac tcg gga gat tct tcc act gat tca1995Val Ser Gly Glu Glu Asp Val Asp Ser Gly Asp Ser Ser Thr Asp Ser530 535 540ctg att aag tgg tac cgc gca aat agg tagtcgcttg cttatagggt2042Leu Ile Lys Trp Tyr Arg Ala Asn Arg545 550caggggcgtg aagaatcctc gcctcatagc actggccgct atcatcctga cctcgttcaa 2102tctgcgaaca gctattactg ctttagctcc gctggtttct gagattcggg atgatttagg 2162ggttagtgct tctcttattg gtgtgttggg catgatcccg actgctatgt tcgcggttgc 2222tgcgtttgcg cttccgtcgt tgaagaggaa gttcactact tcccaactgt tgatgtttgc 2282catgctgttg actgctgccg gtcagattat tcgtgtcgct ggacctgctt cgctgttgat 2342ggtcggtact gtgttcgcga tgtttgcgat cggagttacc aatgtgttgc ttccgattgc 2402tgttagggag tattttccgc gtcacgtcgg tggaatgtcg acaacttatc tggtgtcgtt 2462ccagattgtt caggcacttg ctccgacgct tgccgtgccg atttctcagt gggctacaca 2522tgtggggttg accggttgga gggtgtcgct cggttcgtgg gcgctgctgg ggttggttgc 2582ggcgatttcg tggattccgc tgttgagttt gcagggtgcc agggttgttg cggcgccgtc 2642gaaggtttct cttcctgtgt ggaagtcttc ggttggtgtg gggctcgggt tgatgtttgg 2702gtttacttcg tttgcgacgt atatcctcat gggttttatg ccgcagatgg taggtgatcc 2762aaagaattca aaaagcttct cgagagtact tctagagcgg ccgcgggcc2811&#60210&#62 2&#60211&#62 550&#60212&#62 PRT&#60213&#62 谷氨酸棒桿菌&#60400&#62 2Met Leu Phe Asn Asp Asn Lys Gly Val Phe Met Ala Asp Ile Ser Thr1 5 10 15Thr Gln Val Trp Gln Asp Leu Thr Asp His Tyr Ser Asn Phe Gln Ala20 25 30Thr Thr Leu Arg Glu Leu Phe Lys Glu Glu Asn Arg Ala Glu Lys Tyr35 40 45Thr Phe Ser Ala Ala Gly Leu His Val Asp Leu Ser Lys Asn Leu Leu50 55 60Asp Asp Ala Thr Leu Thr Lys Leu Leu Ala Leu Thr Glu Glu Ser Gly65 70 75 80Leu Arg Glu Arg Ile Asp Ala Met Phe Ala Gly Glu His Leu Asn Asn85 90 95Thr Glu Asp Arg Ala Val Leu His Thr Ala Leu Arg Leu Pro Ala Glu100 105 110Ala Asp Leu Ser Val Asp Gly Gln Asp Val Ala Ala Asp Val His Glu115 120 125Val Leu Gly Arg Met Arg Asp Phe Ala Thr Ala Leu Arg Ser Gly Asn130 135 140Trp Leu Gly His Thr Gly His Thr Ile Lys Lys Ile Val Asn Ile Gly145 150 155 160Ile Gly Gly Ser Asp Leu Gly Pro Ala Met Ala Thr Lys Ala Leu Arg
165 170 175Ala Tyr Ala Thr Ala Gly Ile Ser Ala Glu Phe Val Ser Asn Val Asp180 185 190Pro Ala Asp Leu Val Ser Val Leu Glu Asp Leu Asp Ala Glu Ser Thr195 200 205Leu Phe Val Ile Ala Ser Lys Thr Phe Thr Thr Gln Glu Thr Leu Ser210 215 220Asn Ala Arg Ala Ala Arg Ala Trp Leu Val Glu Lys Leu Gly Glu Glu225 230 235 240Ala Val Ala Lys His Phe Val Ala Val Ser Thr Asn Ala Glu Lys Val245 250 255Ala Glu Phe Gly Ile Asp Thr Asp Asn Met Phe Gly Phe Trp Asp Trp260 265 270Val Gly Gly Arg Tyr Ser Val Asp Ser Ala Val Gly Leu Ser Leu Met275 280 285Ala Val Ile Gly Pro Arg Asp Phe Met Arg Phe Leu Gly Gly Phe His290 295 300Ala Met Asp Glu His Phe Arg Thr Thr Lys Phe Glu Glu Asn Val Pro305 310 315 320Ile Leu Met Ala Leu Leu Gly Val Trp Tyr Ser Asp Phe Tyr Gly Ala325 330 335Glu Thr His Ala Val Leu Pro Tyr Ser Glu Asp Leu Ser Arg Phe Ala340 345 350Ala Tyr Leu Gln Gln Leu Thr Met Glu Thr Asn Gly Lys Ser Val His355 360 365Arg Asp Gly Ser Pro Val Ser Thr Gly Thr Gly Glu Ile Tyr Trp Gly370 375 380Glu Pro Gly Thr Asn Gly Gln His Ala Phe Phe Gln Leu Ile His Gln385 390 395 400Gly Thr Arg Leu Val Pro Ala Asp Phe Ile Gly Phe Ala Arg Pro Lys405 410 415Gln Asp Leu Pro Ala Gly Glu Arg Thr Met His Asp Leu Leu Met Ser420 425 430Asn Phe Phe Ala Gln Thr Lys Val Leu Ala Phe Gly Lys Asn Ala Glu435 440 445Glu Ile Ala Ala Glu Gly Val Ala Pro Glu Leu Val Asn His Lys Val450 455 460Val Pro Gly Asn Arg Pro Thr Thr Thr Ile Leu Ala Glu Glu Leu Thr465470 475 480Pro Ser Ile Leu Gly Ala Leu Ile Ala Leu Tyr Glu His Thr Val Met485 490 495Val Gln Gly Val Ile Trp Asp Ile Asn Ser phe Asp Gln Trp Gly Val
500 505 510Glu Leu Gly Lys Gln Gln Ala Asn Asp Leu Ala Pro Ala Val Ser Gly515 520 525Glu Glu Asp Val Asp Ser Gly Asp Ser Ser Thr Asp Ser Leu Ile Lys530 535 540Trp Tyr Arg Ala Asn Arg545550&#60210&#62 3&#60211&#62 462&#60212&#62 DNA&#60213&#62 谷氨酸棒桿菌&#60400&#62 3atggagacca atggcaagtc agtccaccgc gacggctccc ctgtttccac tggcactggc 60gaaatttact ggggtgagcc tggcacaaat ggccagcacg ctttcttcca gctgatccac 120cagggcactc gccttgttcc agctgatttc attggtttcg ctcgtccaaa gcaggatctt 180cctgccggtg agcgcaccat gcatgacctt ttgatgagca acttcttcgc acagaccaag 240gttttggctt tcggtaagaa cgctgaagag atcgctgcgg aaggtgtcgc acctgagctg 300gtcaaccaca aggtcgtgcc aggtaatcgc ccaaccacca ccattttggc ggaggaactt 360accccttcta ttctcggtgc gttgatcgct ttgtacgaac acaccgtgat ggttcagggc 420gtgatttggg acatcaactc cttcgaccaa tggggcgtgg aa462
圖1質(zhì)粒pAMCl2質(zhì)粒pMCl1和圖2中用到的縮寫和名稱見如下定義Neor 新霉素／卡那霉素抗性ColEl ori 質(zhì)粒ColEl復制起點CMV 巨細胞病毒啟動子lacP 乳糖啟動子pgi 磷酸葡萄糖異構(gòu)酶基因lacZ β-半乳糖苷酶基因5′末端SV403′剪接 猴病毒403′剪接位點SV40 poly A 猴病毒40多聚腺苷酸位點f1(-)ori 絲狀噬菌體f1復制起點SV40 ori 猴病毒40復制起點kanr 卡那霉素抗性pgi插入片段 pgi基因的內(nèi)部片段ori 質(zhì)粒pBGS8復制起點AccⅠ 限制性內(nèi)切酶AccⅠ切點ApaⅠ 限制性內(nèi)切酶ApaⅠ切點BamHI 限制性內(nèi)切酶BamHI切點ClaⅠ 限制性內(nèi)切酶ClaⅠ切點DraⅠ 限制性內(nèi)切酶DraⅠ切點EcoRⅠ限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ切點HindⅢ限制性內(nèi)切酶HindⅢ切點MluⅠ 限制性內(nèi)切酶MluⅠ切點MstⅡ 限制性內(nèi)切酶MstⅡ切點NheⅠ 限制性內(nèi)切酶NheⅠ切點NsiⅠ 限制性內(nèi)切酶NsiⅠ切點
PstⅠ 限制性內(nèi)切酶PstⅠ切點PvuⅡ 限制性內(nèi)切酶PvuⅡ切點SacⅠ 限制性內(nèi)切酶SacⅠ切點SalⅠ 限制性內(nèi)切酶SalⅠ切點SmaⅠ 限制性內(nèi)切酶SmaⅠ切點SpeⅠ 限制性內(nèi)切酶SpeⅠ切點SspⅠ 限制性內(nèi)切酶SspⅠ切點圖3培養(yǎng)在[6-13C]右旋糖培養(yǎng)基中的菌株DSM5715pMCl的核磁共振光譜。縮寫L-2到L-6指從13C去偶(a)和無13C去偶自旋回波(b)測定的的結(jié)合于賴氨酸的C-2到C-6位碳原子的質(zhì)子的核磁共振。
圖4培養(yǎng)在[1-13C]右旋糖培養(yǎng)基中的菌株DSM5715pMCl的核磁共振光譜?？s寫L-2到L-6指從13C去偶(a)和無13C去偶自旋回波(b)測定的結(jié)合于賴氨酸的C-2到C-6位碳原子的質(zhì)子的核磁共振。
圖5培養(yǎng)在[6-13C]右旋糖培養(yǎng)基中的菌株DSM5715的核磁共振光譜?？s寫L-2到L-6指從13C去偶(a)和無13C去偶自旋回波(b)測定的結(jié)合于賴氨酸的C-2到C-6位碳原子的質(zhì)子的核磁共振。
圖6培養(yǎng)在[1-13C]右旋糖培養(yǎng)基中的菌株DSM5715的核磁共振光譜?？s寫L-2到L-6指從13C去偶(a)和無13C去偶自旋回波(b)測定的結(jié)合于賴氨酸的C-2到C-6位碳原子的質(zhì)子的核磁共振。
圖7
戊糖磷酸途徑中流量和富集比值(B-A)／B之間的關系。利用計算機模擬和Marx等，1996(生物技術(shù)和生物工程49111-129)；Marx等，1997(生物技術(shù)和生物工程56168-180)；Marx等，1999(代謝工程135-48)；Sonntag等，1993(歐洲生物化學雜志2131325-1331)和Sonntag等，1995(應用微生物學與生物技術(shù)44；489-495)提供的代謝模型，當磷酸葡萄糖異構(gòu)酶存在并總體平衡(□)或不存在(-)時，在代謝網(wǎng)絡中找到了PPP流量和富集比值(B-A)／B之間相關性的一個雙曲線或直線函數(shù)。PPP流量源自比值(B-A)／B，這里A指由實驗A制備的賴氨酸總的13C富集，B指由實驗B制備的賴氨酸總的13C富集(表2)。指出了DSM5715(□)和DSM5715pMCl(□)的(B-A)／B和相應的PPP流量的實驗值。PPP流量指每100摩爾右旋糖攝入率的摩爾數(shù)，富集比值(B-A)／B以百分數(shù)來表示。
權(quán)利要求
1.分離的多核苷酸，其包含選自如下一組的多核苷酸序列a)與編碼含有SEQ ID NO2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸至少70％相同的多核苷酸，b)編碼含有與SEQ ID NO2的氨基酸序列至少70％相同的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，c)與a)或b)的多核苷酸互補的多核苷酸，以及d)含有a)，b)或c)的多核苷酸序列的至少15個連續(xù)堿基的多核苷酸。
2.如權(quán)利要求1所述的多核苷酸，其中該多核苷酸為可復制的，優(yōu)選是重組的DNA。
3.如權(quán)利要求1所述的多核苷酸，其中該多核苷酸為RNA。
4.如權(quán)利要求2所述的多核苷酸，含有如SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
5.如權(quán)利要求2所述的多核苷酸，其編碼含有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的多肽。
6.包含如權(quán)利要求1所述的多核苷酸的載體，尤其是pMCl，其保藏于大腸桿菌DSM12969中。
7.包含如權(quán)利要求6所述的載體的作為宿主細胞的棒狀細菌。
8.提高棒狀細菌中通過戊糖磷酸途徑的代謝流量的方法，其中如權(quán)利要求1所述的多核苷酸被弱化，尤其是以低水平表達或不表達的，并且發(fā)酵這些細菌。
9.如權(quán)利要求8中的方法，其中發(fā)酵產(chǎn)生核苷酸、維生素、特別是L-氨基酸的棒狀細菌。
10.如權(quán)利要求8中的方法，其中如權(quán)利要求1的多核苷酸的表達被降低。
11.如權(quán)利要求8中的方法，其中如權(quán)利要求1的多核苷酸編碼的多肽(酶蛋白)的催化活性被降低。
12.如權(quán)利要求8中的方法，其中使用如圖2所示并以DSM12969保藏的質(zhì)粒pMCl通過整合誘變的方法獲得基因弱化。
13.如權(quán)利要求9中的方法，其中發(fā)酵細菌產(chǎn)生核苷酸，在所述細菌中a)編碼谷氨酰胺-PRPP酰胺轉(zhuǎn)移酶的purF基因，和／或b)編碼氨基甲酰磷酸合酶的carAB基因同時超量表達。
14.如權(quán)利要求9中的方法，其中發(fā)酵細菌產(chǎn)生L-賴氨酸，在所述細菌中·編碼二氫2，6-吡啶二羧酸合酶的dapA基因同時超量表達，和／或·編碼谷氨酸脫氫酶的gdh基因同時超量表達，和／或·賦予S-(2-氨基乙基)半胱氨酸抗性的DNA片段同時被擴增。
15.如權(quán)利要求9中的方法，其中發(fā)酵細菌產(chǎn)生L-色氨酸，在所述細菌中·編碼轉(zhuǎn)羥乙醛酶的tkt基因同時超量表達，和／或·編碼磷酸核糖焦磷酸合酶的prs基因同時超量表達。
16.生產(chǎn)核苷酸、維生素或L-氨基酸的方法，其中進行下列步驟a)根據(jù)前述一個或多個權(quán)利要求進行微生物發(fā)酵，該微生物中至少pgi基因是弱化或切斷的，任選地伴隨其它基因的擴增，b)在培養(yǎng)基或微生物細胞中積累目的產(chǎn)物，和c)分離產(chǎn)物。
17.前述一個或多個權(quán)利要求的方法，其中使用谷氨酸棒桿菌。
全文摘要
本發(fā)明提供了分離的多核苷酸,其包含選自如下一組的多核苷酸序列:a) 與編碼含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸至少70%相同的多核苷酸,b)編碼含有與SEQ ID NO:2的氨基酸序列至少70%相同的氨基酸序列的多肽的多核苷酸,c)與a)或b)的多核苷酸互補的多核苷酸,以及d)含有a),b)或c)的多核苷酸序列的至少15個連續(xù)堿基的多核苷酸。本發(fā)明還提供了一種通過弱化pgi基因而提高提供戊糖磷酸循環(huán)的代謝流量的方法。
文檔編號C12P13/04GK1288058SQ00124519
公開日2001年3月21日 申請日期2000年9月15日 優(yōu)先權(quán)日1999年9月15日
發(fā)明者阿什令·麥科麥克, 克利奧娜·斯特普爾頓, 凱文·伯克, 邁克爾·奧多諾休, 阿希姆·馬克思, 貝蒂娜·默克爾 申請人:德古薩－于爾斯股份公司, 國立愛爾蘭大學